Khảo sát môi trường nuôi cấy và hiệu quả của xạ khuẩn streptomyces sp chủng sỏi 1 đối với bệnh do nấm fusarium solani trên chanh volka ( citrus volkarmeriana)

solani trén cay chanh Volka trong ly nhựa ở điều kiện phòng thí nghiệm bằng cách chúng xạ khuẩn và nắm cùng lúc hay ngâm xạ khuẩn vào hat 5 gid trước khi chủng nắm, kết quả cho thấy xạ k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẢN THƠ

ĐẶNG THỊ KIM UYÊN

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜN G NUÔI CẤY VÀ HIEU

QUA CUA XA KHUAN Streptomyces sp CHUNG

SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM Fusarium

solani TREN CHANH VOLKA

(Citrus volkarmeriana)

LUAN VAN CAO HOC CHUYEN NGANH BAO VE THUC VAT

MA SO: 10 08 26

Luận án kèm theo đây, với đề tựa là “KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI

CAY VA HIỆU QUA CUA XA KHUAN Streptomyces sp ching

SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM Fusarium solani TREN CHANH

VOLKA (Citrus volkarmeriana)”, do DANG TH] KIM UYEN thuc hién va

báo cáo, và đã được Hội đồng chấm luận án thông qua

yd

PGS.TS Trần Thị Thu Thủy TS Nguyễn Thị Thu Nga

=ố

Cần Thơ, ngày 27 tháng I1 năm 2010

Chủ Tịch Hội Đồng

PGS.TS Trần Văn Hai

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình

bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Đặng Thị Kim Uyên

LY LICH KHOA HOC

I LY LICH SO LUOC:

Ho va tén: Dang Thi Kim Uyén _ Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 09/08/1979 Nơi sinh: Cái Bè — Tiền Giang

Quê quán: Hậu Thành — Cái Bè — Tiền Giang Dân tộc: Kinh Chức vụ, đơn vị công tác trước khi đi học tập, nghiên cứu: Viện Cây ăn quả

miền Nam

Chỗ ở riêng hoặc địa chỉ liên lạc: Ấp Đông — xã Long Dinh — Chau Thanh —

Tién Giang

Điện thoại cơ quan: 073.3893129 Điện thoại riêng: 097.331.657

Fax: 0733.893129 E-mail: hoauyen28052005(@yahoo.com

II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO

1 Trung học chuyên nghiệp:

Hệ đào tạo: Thời gian đào tạo từ / đến /

Nơi học (trường, thành phố):

Ngành học:

2 Đại học:

Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 09/2000 dén 04/2004

Nơi học (trường, thành phố): Đại học Dân Lập Cửu Long

Ngành học: Nông học

Tên đồ án, luận án hoặc môn thi tốt nghiệp: HIỆU QUA MOT SO LOAI

'THUÓC TRONG VIỆC PHÒNG TRỪ BỆNH THÁN THU (Colletotrichum

gloeosporiodes) TREN XOAI CAT HOA LOC TRONG DIEU KIEN NHA

LUOI VA NGOAI DONG

Ngày và nơi bảo vệ đồ án, luận án hoặc thi tốt nghiệp:

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hòa

3 Thạc sĩ:

Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 09/2008 đến 09/2010

Noi học (trường, thành phố): Đại học Cần Thơ

Tên luận văn: KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁY VÀ HIỆU QUÁ

CUA XA KHUAN Streptomyces-SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM

Fusarium solani TREN CAY CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)

Ngày và nơi bảo vệ luận văn: tại Hội trường Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học

Ứng Dụng

Người hướng dẫn: PGs.TS Trần Thị Thu Thủy

5 Trình độ ngoại ngữ (biết ngoại ngữ gì, mức độ): C Anh Văn

ili

6 Học vị, học hàm, chức vụ kỹ thuật được chính thức cấp; số bằng, ngày và nơi

câp: Kỹ sư nông học

II QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC CHUYÊN MÔN KỂ TỪ KHI TÓT NGHIỆP ĐẠI

HỌC:

05/2004 - đến nay | Viện Cây ăn Quả miền Nam | Nghiên cứu viên

IV CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BÓ:

iv

LOI CAM TA

Để hoàn thành luận văn này, Chúng tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của quý thầy cô và xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGs.TS Trần Thị Thu Thủy, Trưởng Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông

nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn và giúp

tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

TS Nguyễn Văn Hòa, Phó viện trưởng, Viện Cây Ăn Quả miền Nam đã truyền

đạt những kinh nghiệm và giúp đỡ tôi để hoàn thành luận văn này

PGs.IS Phạm Văn Kim Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Công nghệ sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt những

kinh nghiệm vô cùng quí báu trong nghiên cứu

TS Nguyễn Minh Châu, Viện trưởng Viện Cây Ăn Quả miền Nam đã cho phép

và tạo điều kiện cho tôi được đi học

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban chủ

nhiệm Khoa nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Phòng Quản lý Khoa học và Đào tạo

Sau Đại học, Bộ môn Bảo vệ thực vật; đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi tiến

hành nghiên cứu và thực hiện luận văn

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị em của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện cây ăn quả miền Nam

Xin tỏ lòng biết ơn đến Lãnh đạo Viện, các anh chị, em của các phòng ban Viện Cây ăn quả miền Nam, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này

Các anh, chị và các bạn lớp Cao học Bảo Vệ Thực Vật khóa 15 và bạn Phan Hà lớp Cao học Bảo Vệ Thực Vật khóa 14 đã cùng tôi chia sẽ những khó khăn, động viên,

giúp đỡ trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Cần Thơ

Cuối cùng, tôi xin bảy tỏ lòng biết ơn đến gia đình, anh chị đồng nghiệp và

những bạn bè thân thiết đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực

hiện luận văn này

Tiền Giang, ngày tháng năm 2010

Tác giả luận văn

TÓM LƯỢC

Trong những năm qua, cây có múi ở Đồng bằng sông Cửu Long đang bị nhiễm

bệnh vàng lá thối rễ nặng, tác nhân gây bệnh là do nắm Ƒsarim solani gây ra cùng VỚI SỰ ngập úng nước hệ thống rễ (Phạm Văn Kim, 1998; Dương Minh va ctv, 2003)

Xa khuan Streptomyces spp duge biết là vi khuẩn hoại sinh co kha nang đối kháng nắm tốt, đặc biệt là nấm Ƒsariưm solani, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Trong nghiên cứu này chúng tôi đã khảo sát được môi trường thích hợp cho Streptomyces — SOFRI 1 la YCEDM (Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar Modified) va pH

thích hợp cho xạ khuẩn này phát triển là từ pH= 6,5 - 7,5 va pH thich hop nhat là pH

=7 Khi khảo sát khả năng đối kháng cho thấy ở điều kiện phòng thí nghiệm bằng 2

phương pháp là chủng xạ khuẩn 1⁄2 đĩa, rồi cay nam ở giữa của đĩa Petri và phương pháp khác là pha xạ khuẩn vào môi trường và cây nắm vào giữa đĩ ia, thi cả hai phương

pháp đều cho kết quả khi có sự hiện diện xạ khuẩn thì khống chế tốt sự phát triển của

nắm #Ƒ' solani Khi khảo sát ảnh hưởng cia xa khudn Streptomyces - SOFRI 1 đối với

khả năng gây hai nam F solani trén cay chanh Volka trong ly nhựa ở điều kiện phòng

thí nghiệm bằng cách chúng xạ khuẩn và nắm cùng lúc hay ngâm xạ khuẩn vào hat 5 gid trước khi chủng nắm, kết quả cho thấy xạ khuẩn có khả năng ảnh hưởng rất tốt đến

tỷ lệ nây mầm của hạt chanh Volka, ngay cả trong trường hợp có chủng nắm gây bệnh

F solani, kết quả thấy rằng xạ khuẩn có sự ảnh hưởng tốt đến khả năng phát triển của cây con cả chiều cao thân, chiều dài rễ, đặc biệt là xạ khuẩn còn làm cho cây có số

lượng rễ phụ nhiều hơn, trong lượng rễ tươi cao hơn đối chứng và nghiệm thức chỉ ching F solani Trong nghién cứu khác chúng tôi cũng đã đánh giá ảnh hưởng của xạ

khuẩn đối với bệnh thối rễ do nắm Ƒsariưm solani gây ra trên cây cam sành phép trên gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới, kết quả cho thấy là SfrepfOmyces có ảnh hưởng tốt làm giảm chỉ số bệnh, tăng khả năng phát triển chiều cao cây, rễ, số lượng rễ mới, chiều dài rễ, đặc biệt là giảm số lượng rễ thối so với nghiệm thức chỉ chủng #ˆ so/ani Cho nên có thể nói /repfomyces — SOERI 1 không chỉ có tác dụng

tốt trong việc khống chế nắm Ƒ so/ani phát triển và gây bệnh trên cây chanh mà còn

có tác dụng kích thích khả năng nây mắm và phát triển của cây chanh Volka, thích hợp

cho việc sử dụng chúng như một vi sinh vật đối kháng trong việc quản lý bệnh thối rễ

do F solani gay ra

Mái

Abstract

Recently, in the Mekong River Delta, citrus trees have been heavily infected by yellow decline disease, which caused by Fusarium solani, especially under water logging conditions (Pham Van Kim, 1998, Duong Minh et al., 2003) Streptomyces

spp., the rhizosphere microorganism, was well known as an affective antagonistic

agent to fungal pathogens, particularly Fusarium solani In this investigation, we

aimed to determine the suitable media for laboratory culture of Streptomyces — SOFRI

1 and result shown that YCEDM (Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar

Modified), was best medium and on this medium, we determined that the pH of 6,5 —

7,5 was the best range and pH 7 was the most suitable one for it culture When it tested

for antagonic ability under laboratory conditions by two different methods, one was

streaked Streptomyces on one side of the plate and a piece (0.5 cm’) of PDA medium containing actively growing Fusarium mycelium on the center of the plate, the second method was to dilute Streptomyces solution to melting media just before pouring to the plate and then inoculate a pieces of F solani on the center of the plate, both the two

gave similar results that Streptomyces could control the growth of F solani We also

observed the antagonic ability of Streptomyces - SOFRI 1 to the growth and infection ability of F solani to Citrus volkameriana seedlings grown in plastic pots under

laboratory conditions, two experiements were carried out, one inoculated both

Streptomyces and F solani at the same time, another one which Streptomyces was soaked to citrus seeds 5 hours before, results shown that at both the two expriements,

the Streptomyces could provide better germination ratio for citrus seeds event at the

present of F solani In addition, Streptomyces gave much better effect to the growth

of the seedlings, it root system, especially the fine root system of citrus trees in

comparison that of the check and the F solani treatment In another experiment, we

tested for antagonistic capacity of Streptomyces — SOFRI | to root rot disease caused

by Fusarium solani on King Mandarin grafted on C volkameriana in pots under

greenhouse conditions, we found that Streptomyces provided good effect to the tree growth, number of fine roots, length of the roots, particularly reduced number of rotted

roots in comparison with that of the treatment of F solani In this study, we found that

Streptomyces — SOFRI | not only gave good effect to reduce the infection propotion

of F solani, but also stimulated the germination percentage of seeds and plant growth

of Volka trees This microorganism is suit to promote to be the F solani antagonic

agent

Vii

MUC LUC

Trang

Trang phu bia

1.1 SOLUGQC VE BENH HAI RE TREN CAY CO MUI 3

1.2.1 Dac điểm hình thái của ndm Fusarium solani 4

1.2.2 Đặc điểm và điều kiện gây hại của nắm Ƒsarium đối 5

1.3.2 Vai trò có lợi của xạ khuẩn Streptomyces 9

1.3.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của Xạ 14

khuẩn 1.4 BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ BỆNH HAI RE TREN CAY 14

1.5 SƠ LƯỢC VE CHANH VOLKA (Citrus volkarmer iana) 17

2.2.1 Khảo sát môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự De

phát triển của xạ khuẩn Streptomyces —SOFRI 1

2.2.2 Xác định pH thích hợp trong điều kiện môi trường 22

YCEDM

223 Khao sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với 23

nam Fusarium solani trong dia Petri ở điều kiện

phòng thí nghiệm

Vili

2.2.4 Khao sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn

Sfreptomyces — SOFRI 1 đối với nẫm Fusarium

solani trên cây chanh Volka con trong ly nhựa ở điều

kiện phòng thí nghiệm

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối

rễ do nắm Fusarium solani gay ra trén cay cam sanh ghép trên gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

Chương 3 - KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của xạ

khuẩn Streptomyces —SOFRI 1

3.1.1 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn trên các môi

trường khác nhau 3.1.2 Khả năng phát triển khuẩn lạc của xạ khuẩn trên các

môi trường khác nhau

Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn /rzepfomyces LÌ SOERI

1 trên các mức pH khác nhau

3.2.1 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn trên các mức độ

pH khác nhau 3.2.2 Khả năng sinh trưởng khuẩn lạc trên môi trường

'YCEDM với các mức pH khác nhau Khả năng đối kháng của Srepfomyces — SOFRI 1 đối với nam Fusarium solani

3.3.1 Mite d6 déi khang cia Streptomyces 0 SOFRI I déi

với nấm Fusarium solani theo phương pháp Zarandi

va ctv, 2009

3.3.2 Đường kính khuẩn lạc của ndm F solani trong điều

kién pha dung dich chtra Streptomyces — SOFRI 1

vào môi trường trước khi đỗ vào đĩa

Khảo sát ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1

đối với khả năng gay hai nam F solani trên cay chanh Volka 6 diéu kién phong thi nghiệm

3.41 Ảnh "hưởng của mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI

1 đối với nấm F solani trén cây chanh Volka sau khi

chủng

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-

SOFRI 1 đối với nắm Fusarium solani trên cây chanh

Volka ở điều kiện ngâm hạt 5 giờ trước khi gieo

Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do

nam Fusarium solani gay ra trên cây cam sành ghép trên

gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

Chương 5 - KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ

5.1 5.2 Kết luận Đê nghị

ps Sr Ss

DANH SÁCH HÌNH

3, Su phat triên của xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau ở thời điểm 30

96 giờ sau khi cấy; (a) mặt trên đĩa; (b) mặt dưới đĩa

32 Khuân lạc của S/repfomyces phát triển trên môi trường YCEDM ở thời 30

l điểm 96 giờ sau khi cấy (a) mặt trên đĩa; (b) mặt dưới đĩa

33 Sự sinh trưởng xạ khuẩn trên môi trường pHE= 7 ở 96 giờ sau khi nuôi cây 32

l (a) Mặt trên đĩa, (b) mặt dưới đĩa

34 Khuẩn lạc phát triển tốt ở môi trường có pH khác nhau ở 120 giờ sau khi 33

` chủng;

3.5 Mứcc độ đối kháng của xạ khuẩn với ndm Fusarium solani ở 48 giờ 34

, SKC(nủa phải cấy Srepformyces)

3.6 Đối kháng véi F solani (a) Đối kháng xạ khuẩn 10” ở 96 giờ; (b) Đối chứng 35

3.7 Khả năng ức chế ndm Fusarium solani 6 cdc mat s6 khdc nhau 6 96 gid SKC 37

3.8 Ucchénam Fusarium solani so d6i chứng ở 120 giờ 37

3.9 Khả năng ức chế nam Fusarium solani ở các mật số khác nhau & 120 gis SKC 38

3.10 Khả năng sinh trưởng của chanh Volka; (a) Chủng xạ khuẩn 10° 41

" CFU/ml (b) Đối chứng

3.11 Thân và rễ cây chanh Volka (a) Chủng xạ khuẩn (b) Đối chứng 42

3.12 Trọng lượng thân và rễ (a) trước khi sấy (b) sau khi sấy 43

3.13 Ngâm hại trước khi gieo (a) Strep 10” (b) Strep 10° (c) F solani 10° 46

3.15 _ Sinh trưởng của cây ở mật độ Streptomyces 105 CFU/ml 47

3.16 Chanh Volka có xử lý hạt (a) trước khi sấy (b) sau khi sấy 49

3.18 _ Nhiễm nắm lá bị vàng của NT 6 và NT 1 lá khỏe 51

3.20 Sự hiện diện của rễ (a,c) rễ thối; (b,đ) rễ tươi 54

DANH SACH BANG

2.1 Chất kháng sinh do một số loài xạ khuẩn tiết ra 10

31 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 trên 28

` một số loại môi trường khác nhau 3.2 Số lượng khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces -SOFRT 1 trên các 29

3.5 Mức độ đối kháng của xạ khuẩn Streptomyces - SOFRI 1 1 déi 34

` voi nam Fusarium solani

3.6 Đường kính khuẩn lạc của nắm F solani trong sự đối kháng của 36

l Streptomyces - SOFRI 1

37 Ảnh hưởng của mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 40

1 va nam F solani déi với cây chanh Volka

Anh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces - SOF RI 1 va nam

3.8 Fusarium solani đối với trọng lượng thân và rễ cây chanh 43

Volka con trồng trong ly nhựa

Ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-SOFRI 1 được ngâm 3.9 5 giờ trước gieo đối với khả năng gây hại của ndm Fusarium 45

solani trén su sinh truéng của trên cây chanh Volka co

Ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-SOFRI 1 được ngâm 5 gid 3.10 trước khi chủng nắm #i usarium solani đối với trọng lượng thân và 48

rễ cây chanh Volka con trồng trong ly nhựa Hiệu quả xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 đối với bệnh thối rễ 3.11 do nam Fusarium solani gây ra trên cây cam sành ghép trên gốc 50

chanh Volka trong diéu kién nhà lưới Hiệu quả xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do nam Fusarium solani 3.12 gay ra trén cay cam sanh ghép trên gốc chanh Volka trong điều 53

kiện nhà lưới thông qua số lượng TẾ, trọng lượng thân và rễ

xi

Chương 1

MO DAU

Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm qua, cây có múi ở Đồng bằng sông Cửu Long đang bị nhiễm bệnh

vàng lá thối rễ nặng, bệnh gây thiệt hại đáng kế đến các vùng trồng cây có múi Nhiều

nghiên cứu về tác nhân gay bénh cho rang bénh do ném Fusarium solani gay ra cung với sự ngập úng nước hệ thong ré (Pham Van Kim, 1998; Duong Minh va ctv, 2003)

Việc sử dụng nông dược trong phòng trừ tỏ ra kém hiệu quả và làm ô nhiễm môi

trường đất và nước, ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sản xuất

Xạ khuẩn Actinomycetes, dic biét 1a Streptomyces spp được biết là vi khuẩn hoai sinh có thể phân hủy chất hữu cơ, các polymer chuyên biệt như lignocellulose, tỉnh

bột và kitin trong đất (Crawford và chy, 1993) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ

khuẩn có khả năng đối kháng với nắm tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Các

loài S/repfomyces và một số xạ khuẩn khác cho thấy có thể bảo vệ nhiều loại cây trồng

tránh khỏi nhiều loại nấm đất gây bệnh cây trồng, cả đối với các thí nghiệm trong nhà

lưới và ngoài đồng ruộng, (Tahvonen, 1982) Cac loai Streptomyces spp co thé ky sinh

hoặc tấn công các nấm gây thối rễ như Fusarium, Rhizoctonia, Pythium,

Phytophthora, Phytomatotricum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria,

Sclerotinia, Verticillium, Geotrichum Dich tiét tir ré cay cé thé kich thich su tăng

trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khong chế nắm bệnh, trong khi đó xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp hợp chất kháng nắm Ngoài ra, xạ khuẩn còn tổng hợp nhiều loại men phân giải như chitinases (Blaak và c#w, 1993), glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases (Ramachandra va ctv, 1988) va nhitng men phan gidi khac có thể phân hủy nắm hại

Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu: “ Khảo sát môi trường nuôi cấy và hiệu quả của ca

xạ khudn Streptomyces - SOFRI 1 déi với bệnh do nấm Fusarium solani trên cây

Chanh VOLKA (Cirus volkarmeriana” đã được tiễn hành nhằm mục đích tìm hiểu

đặc tính sinh học của chủng Streptomyces — SOFRI 1, kha nang déi khang cia chúng

với nắm Ƒsarium solani trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới trên cây chanh Citrus volkameriana (Volka) va tim môi trường thích hợp để nhân mật số xạ khuẩn

* Nội dung nghiên cứu

v Khảo sát môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn Sfrepfomyces — SOFRI 1

v⁄_ Xác định pH thích hợp trên môi trường YCED đã được sửa đổi (YCEDM)

v Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nắm Ƒsariưm solani ở

điêu kiện phòng thí nghiệm

v Khảo sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn $/zepfomyces-SOFRI 1 đối với

nam Fusarium solani trén cây chanh Volka con ở điều kiện phòng thí nghiệm

Vv Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do nắm Ƒsarium solani gây ra trên cây cam sành ghép trên gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

Chương 1

MO DAU

Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm qua, cây có múi ở Đồng bằng sông Cửu Long đang bị nhiễm bệnh

vàng lá thối rễ nặng, bệnh gây thiệt hại đáng kể đến các vùng trồng cây có múi Nhiều

nghiên cứu về tác nhân gay bénh cho rang bénh do nam Fusarium solani gay ra cùng

với sự ngập úng nước hệ thống rễ (Phạm Văn Kim, 1998; Dương Minh và cty, 2003)

Việc sử dụng nông dược trong phòng trừ tỏ ra kém hiệu quả và làm ô nhiễm môi

trường đất và nước, ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sản xuất

Xạ khuẩn Actinomycetes, đặc biệt là S/repfomyces spp được biết là vi khuẩn hoại

sinh có thể phân hủy chất hữu cơ, các polymer chuyên biệt như lignocellulose, tỉnh

bét va kitin trong dat (Crawford va crv, 1993) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Các

loai Streptomyces va mét sé xa khudn khác cho thấy có thể bảo vệ nhiều loại cây trồng

tránh khỏi nhiều loại nắm đắt gây bệnh cây trồng, cá đối với các thí nghiệm trong nhà

lưới và ngoài đồng ruộng, (Tahvonen, 1982) Cac loai Streptomyces spp cé thé ky sinh hoặc tấn công các nấm gây thối rễ như Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Phytomatoficum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria,

Sclerotinia, Verticillium, Geotrichum Dich tiét tir ré cây có thể kích thích sự tăng

trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khống chế nấm bệnh, trong khi đó xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp hợp chất kháng nấm Ngoài ra, xạ

khuẩn còn tổng hợp nhiều loại men phân giải như chitinases (Blaak và cv, 1993),

glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases

(Ramachandra vd ctv, 1988) va nhiing men phân giải khác có thể phân hủy nấm hại

Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu: “ Khảo sát môi trường nuôi cấy và hiệu quả của của

xạ khuẩn Streptomyces - SOFRI 1 đối với bệnh do nấm Fusarium solani trén cây Chanh VOLKA (Cirus volkarmeriana” đã được tiễn hành nhằm mục đích tìm hiểu dac tinh sinh hoc cua ching Streptomyces — SOFRI 1, kha năng đối kháng của chúng với nắm Fusarium solani trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới trên cây chanh Citrus volkameriana (Volka) và tìm môi trường thích hợp để nhân mật số xạ khuẩn

* Nội dung nghiên cứu

vKhảo sát môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn

Streptomyces — SOFRI 1

v Xác định pH thích hợp trên môi trường YCED đã được sửa đổi (YCEDM)

v Khao sat kha nang d6i khang cia xa khuan déi véi ndm Fusarium solani 6 diéu kién phong thi nghiém

v Khảo sát khả năng ảnh hưởng cia xa khudn Streptomyces-SOFRI 1 đối với

nam Fusarium solani trén cay chanh Volka con 6 diéu kién phong thi nghiém

v4 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do nắm Fusarium solani

gây ra trên cây cam sành ghép trên gốc chanh Volka trong điêu kiện nhà lưới

Chuong 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIEU

1.1 SƠ LƯỢC VÉ BỆNH HAI RE TREN CAY CO MUI

Hiện nay, dịch bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi đã và đang gây hại trầm trọng cho các vườn cây ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long Năm 2000, có khoảng trên 1.300

ha quýt Tiều tại Lai Vung, tinh Đồng Tháp bị chết do bệnh thối rễ gay ra Trong các

năm 2001 đến 2004, vùng trồng Cam Mật tại hai huyện Trà Ôn và Tam Bình, tỉnh

Vĩnh Long cũng đang bị bệnh thối rễ và chết dần Theo đánh giá của cán bộ địa

phương số cây bị chết có thể lên đến 40% diện tích cam của hai huyện Tại thành phố

Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang bệnh thối rễ cũng gây hại khá nghiêm trọng ở các vườn

trồng cam và quýt Đường (Phạm Văn Kim, 2004)

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Kim và c# (1997), đã chứng minh bằng qui

tắt Koch bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam Mật và quyt Tiéu 1a do nam Fusarium

solani gay ra trong diéu kién dat bi oi nuéc trong thời gian dài Theo kết quả nghiên cứu của Dương Minh và cv (2003) cũng có kết luận Ƒsariưm solani là tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Đồng Tháp

và Tiền Giang Theo Phạm Văn Kim (2004), đất trồng bị oi nước liên tục sẽ làm rễ

non bị tồn thương và tạo điều kiện cho ndm Fusarium solani sin cé trong đất có cơ

hội xâm nhập vào cây trồng qua những vết thương trên rễ, thông thường bệnh sẽ biểu hiện triệu chứng vào đầu mùa nang, sau thoi gian ủ bệnh kéo dài trong vài tháng Theo

Lê Thị Thu Hing va ctw (2002) đã nghiên cứu bệnh vàng lá chết nhanh trên cây quýt

Tiéu tai Lai Vung, Đồng Tháp la do nam Fusarium spp., Phytophthora sp., Pythium

sp và có sự xuất hiện của tuyến trùng gay ra trong d6 Fusarium solani la tác nhân

quan trong Theo két qua diéu tra va phân lập ở các vườn tại huyện Châu Thành, Cái

Bè (Tiền Giang), huyện Tam Bình, Trà Ôn, Bình Minh (Vĩnh Long), phường Long

Tuyền (Tp Cần Thơ) và Lai Vung (Đồng Tháp) cho thấy hầu hết các vườn bị vàng lá

thối rễ do tập đoàn nấm đất gay ra nhu: Fusarium sp, Pythium sp, Phytophthora trong

dé Fusarium có tần số xuất hiện cao nhất và có sự xuất hiện của tuyến trùng Pratylenchus sp., Tylenchulus sp., Radopholus sp., Meloidogyne sp., (Nguyén Van Hoa va ctv, 2007) Theo Labuschagne va ctv (1996) nam Fusarium solani tan công và

gây hại nặng trong điều kiện bất lợi kéo dài (Stress) Bệnh thối rễ do ndm Fusarium

solani s& nang hon trong điều kiện ngập nước, bón nhiều phân urê, tính bột dự trữ

trong rễ giảm và có sự hiện diện của tuyến trùng 73 yienchulus semipenetrans Theo

nhận định của Koizumi (2006) bệnh vàng lá thối rễ do nấm Phytophthora tin céng

gây hại trước, rồi Ƒsariưm là nắm mới tấn céng va gay hai sau nhung nam Fusarium lại phát triển nhanh và mạnh hơn nắm Phytophthora nén gay hai chu luc lam cay suy

kiét va biéu hién triéu chimg 14 do nim Fusarium

_ 1.2 DAC DIEM CUA NAM FUSARIUM

_ Theo Vũ Triệu Man, Lé Ivong Té (1998), Pham Van Kim (2003) Nấm Fusarium

solani Link Berl thuéc: Nganh nam Mycota, Lớp nắm bất toàn Deuteromycetes, B6

nam béng Moniliales, ho T; uberculariaceae, Chi Fusarium Link ex Fr., Loai Fusarium

solani Link Berl

1.2.1 Đặc điểm hinh thai cia nam Fusarium solani

Vii Trigu Man va Lé Luong Té (1998) báo cáo rằng bệnh do nam Fusarium gây ra xuất hiện khắp nơi từ đồng bằng đến trung du và miền núi Nắm gây hại suốt thời kỳ sinh trưởng của cây nhưng chủ yêu tân công ở giai đoạn cây con

Nam Fusarium solani (Mart) được biết có giai đoạn hữu tính (teleomorph) là Wecfria

haeimatococca Berk & Br (Burgess, 1994) Nam Fusarium solani c6 3 dạng bào tử

thường thấy là tiểu bào tử, đại bào tử và bào tử áo Kích thước tiểu bào tử là 18,1 x 4,0

(micromet), đại bào tử có 3-5 vách ngăn có kích thước trung bình là 29,4 x 3,9

(micromef) (Barreto và c/v, 2003), bào tử áo là bào tử có vách dầy, nhìn chung cả 3

dang bao tir chia nam Fusarium được sinh ra trong môi trường nuôi cấy và môi trường

đất (Agrios, 1997) Theo Bùi Xuân Đồng (1986) nắm Fusarium solani (Mart) (Nectria

haemaftococca Berk) mọc trên môi trường thạch - khoai tây ở 27 ”C trong 7 ngày tuổi

có đường kính khuẩn ty 3-4cm, hệ khuẩn ty xốp bông màu trắng xám, bào tử trần có 3-4 vách ngăn ngang, bào tử hình trứng có kích thước 4-5,5um x 32-56um Nam

Fusarium spp đặc trưng bởi khả năng tiết ra chất nhày trong suốt , bào tử dang hình liềm, có vách ngăn (đại bào tử) Hình dạng bào tử là một chỉ tiêu quan trọng giúp phân bi¢t chinh xac cac loai Fusarium (Seifert, 1996)

Trên môi trường PDA thi tan ndm Fusarium solani có màu trắng tới màu kem còn trên

môi trường CLA bào tử nhỏ có kích thước lớn, thường có 1 đến 3 vách ngăn và được

hình thành trong bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất dài hoặc trên các cành bào

tử phân sinh phân theo nhánh (Burgess, 2008) Theo Cook và Baker (1983) cho rằng

nguồn carbon rất cần thiết cho sự mọc mam cua dai bao tir va bao tit Ao cla Fusarium

solani, nén ham lugng glucose dap tmg dé gia tang su mọc mầm của nắm và mầm của mét s6 ching Fusarium solani mọc trong khoảng 10-20 giờ sau khi bỗ sung năng

lượng Nhiệt độ ảnh hưởng đến nắm Fusarium solani, theo nghiên cứu của Burgess

(1994) nhiệt độ nuôi cấy nắm có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm và đường kính

khuẩn lạc nắm Fusarium solani chỉ 2,1-2,9 cm & 25°C, nhưng ở 30C có đường kính

2,6-3,6 cm Phạm Văn Kim (2003), nắm F solani dé tan công và gây hại nghiêm

trọng khi pH đất thấp (4,3 — 4,5) kết hợp với tình trạng cây trồng bị Stress kéo dài

Nguồn đạm (Nitrogen) là yếu tố giới hạn, nitrogen cần thiết cho quá trình sinh trưởng

và phát triển bình thường của nam Fusarium solani vì đạm cần cho sự mọc mầm và sự thâm thấu của tế bào nắm (Dasgupta, 2000; Mehrotra 2000)

1.2.2 Đặc điểm và điều kiện gây hại của nẫm Fusarium déi véi cay tréng

Nam F solani hién dién khắp nơi trong dat va la nam ky sinh cơ hội Khi rễ cây trồng

bị tổn thương, chúng có thể tấn công và gây hại nặng nề (Phạm Văn Kim, 1998)

Điều kiện đất và nước rất đặc trưng cho vùng ĐBSCL giữ vai trò rất quan trọng

đối với bệnh thối rễ cây ăn trái Đất có thành phần sét cao trong sa cấu tạo ra tình

trạng tế không trong đất rất nhỏ, làm cho đất khó thoát nước sau các đợt mưa dài ngày vào giữa và cuối mùa mưa Đất bị nước chiếm các tế không lâu dài nên rơi vào tinh

trạng yếm khí do oi nước Tình trạng này kéo dài làm cho rễ cây trồng cạn phải hô hấp yếm khí lâu dài, các chất độc do các tiến trình sinh hóa trong tế bào rễ sinh ra, không được oxít hoá để giải độc, tích lãy trong tế bảo và gây ngộ độc cho tế bào Từ đó các

tế bao & phan rễ non, nơi các tiến trình sinh hóa diễn ra mạnh nhất, sẽ bị chết dần từng

tế bào và tạo ra các mảng thối ở rễ non (Phạm Văn Kim, 2004) Olsen va ctv (2000) cho rang bénh xay ra khi cây bị suy yếu và điều kiện do ngập úng và các điều kiện bất lợi kéo dài (tress) khác như thừa phân, tuyến trùng và kèm theo nhiệt độ khá cao (> 25°C) 1a điều kiện nấm Ƒsarium phát triển mạnh Nắm Ƒsarium solani gây hại trên cây ăn trái ở mức độ nặng làm héo cây, phá hủy chồi non, gây thối rễ và biểu hiện rõ nhất là vùng vỏ rễ bị lột (Elad, 2000) Nắm này tấn công chủ yếu vào bộ rễ (Agios,1997) nắm gây hại tấn công mạch nhựa của rễ cây ký chủ và tiết ra độc tố làm

hỏng mạch nhựa (Phạm Văn Kim, 1999) Theo Olsen va ctv, 2000 Fusarium solani la

tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên diện rộng đối với đậu, cà chua

Bệnh gây hại ở rễ và cổ rễ giáp mặt đất Trên cổ rễ lúc đầu là một chấm nhỏ

màu nâu sau chuyển sang nâu đen và lan rộng bao quanh phần vỏ cỗ rễ, vỏ bị thối khô, nứt và bong tróc ra để trơ phần gỗ phía trong Nấm có thể ăn sâu vào thân làm

thân bị khô đen, các rễ phía dưới cũng bị thối đen Cây mới bị bệnh có biểu hiện sinh

trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần dần, cây còn nhỏ có thể bị chết khô hoàn toàn

Cây bệnh dễ bị đỗ ngã do bộ rễ đã bị hại Rễ bị thối, vỏ rễ dễ dàng tuột khỏi phần gỗ,

mạch gỗ của rễ hóa nâu lan dần lên phần rễ chính Lá vàng từ thịt đến gân, gân lá có

màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đó rụng đi Lúc đầu chỉ có vài

cành bị bệnh sau đó toàn bộ tán lá bị vàng và rụng (Nguyễn Thị Thu Cúc và ctv,

2002) Chính vì vậy bệnh làm cho cây còi cọc và lá thưa thớt, các cành nhánh bị khô

và chết dần Khi cây ra trái, trái rất dé bị rụng vì vậy làm giảm năng suất rất lớn (Lê Thị Thu Hồng, 2002) Bệnh vàng lá thối rễ cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên

mức độ bệnh ít hơn so với cam sành và quýt tiêu

1.2.3 Độc tính và điều kiện gây hại của nấm Fusarium déi với cây trồng

Theo Agrios (2005) có 3 nhóm độc tố do Fusarium spp tiết ra là Zearelenones, Trichothecenes (thường được biết ở các dang vivotoxin hay Deoxynivalenol (DON), HT-2,T-2) va Fumonisins, nhttng độc tỗ này thường gây hại phô biến trên cây trồng, động vật hoang dã, gia cẦm và ngay cả trên người (Burgess và cv, 2009) Riêng đối

v6i loai Fusarium solani, có nhiều chủng sinh ra nhiều loại độc tố khác nhau như

Diacetoxyscirpenol, Furanoterpenoids, Fusaric acid, đôc tổ H-T2, T2, Neosolaniol,

Zearalenone va cac loai sac t6 nhu marticin, isomarticin, fusarubin (Marasas va ctv,

1984) Vũ Triệu Mân và Lương Lê Té (1998) cho biết độc tố Fusarinic, Fumonisis BI,

Fumonisis B2 do Fusarium tiết ra đã kiềm hãm hoạt động của hệ thống enzyme và

hoạt động hô hap, phá vở quá trình trao đổi chất, giảm tính thấm của màng tế bào và

làm giảm sức đề kháng của cây trồng Các độc tố của Ƒsarium cũng ức chế nây mầm

của hạt cây cải và cam quýt, ức chế sự sinh trưởng của cây quýt con (JingJing va ctv,

1993) Ƒsarium cũng có khả năng tiết ra độc tố Naptharazin như dihydrofusarubin,

marticin và methyljavanicin Loại độc tố này có khả năng làm thay đổi hoạt động trao

đổi chất trong cây, gia tăng sự tích lũy các chất biến dưỡng, gây sốc trong mạch gỗ,

phá vở hệ thống vận chuyển vận chất trong cây và cuối cùng là phá vở chức năng sinh

lý của rễ cây (Nemec,1995) Độc tính của nắm Ƒ1sarium Spp tiết ra được biết nhiều

nhất la Acid Fusaric (15-n-butyl pyridine -2 cacboxylic acid) CyyH,30,N thudc dang

déc t6 Vivotoxin (Dasdupta, 1998; Pham Van Kim, 2000), Fusaric acid con được gọi

là độc tố gây bệnh héo vì ngay khi nắm Ƒsarim còn giới hạn ở rễ nhưng lại biểu

hiện rõ triệu chứng bệnh ở bó mạch và hiện tượng héo trên lá, đó là do chất độc đã di chuyển đến các cơ quan khác xa nơi nhiễm bệnh, tạo ra một số triệu chứng ngộ độc

đặc trưng Riêng đối với loài Ƒsariưm solani, trong quá trình ký sinh chúng sinh ra nhiều loại độc tế khác nhau như Diacetoxyscirpenol, Furanoterpenoids, Fusaric acid,

déc t6 H-T2, T2, Neosolaniol, Zearalenone va cdc loai sac t6 nhu Marticin,

Isomarticin, Fusarubin (Marasas va ctv, 1984)

1.3 SO LUQC VE STREPTOMYCES VA UNG DUNG CHUNG TRONG

PHONG TRU BENH HAI RE

1.3.1 Đặc điểm và sự phân bỗ xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) Phần lớn xạ khuẩn là tế bào Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh

(khuẩn tỉ), xạ khuẩn được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên như trong đất, trong

nước, rác, phân chuồng, bùn và thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc

không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thành phần đất, điều kiện canh tác và loại thảm thực vật (Nguyễn Lân Ding va ch, 2002)

Trong số 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do

xạ khuẩn sinh ra Xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, một số vitamin và axit hữu cơ Một số ít xạ khuẩn ky khí hoặc hiếu khí có thể gây ra các bệnh

cho người, cho động vật và cho cây trồng Một số xạ khuẩn (thuộc chỉ Frankia) có thể tạo nôt sân trên rễ một số cây không thuộc họ đậu và có khả năng cô định đạm (nitơ)

Thế giới vi sinh vật có lợi trong tự nhiên như nắm, xạ khuẩn, virus thì vi khuẩn đối kháng là nhóm sinh vật đơn bào có cấu tạo đơn giản nhưng giữ vai trò vô cùng quan trọng Chúng tồn tại khắp nơi trong đât, nước, trên bề mặt cây trông v.v Chúng có khả

năng hạn chế những vi sinh vật khác bằng các cơ chế như tiết ra kháng sinh

(antibiotic), canh tranh về dinh dưỡng và nơi ở, nó hạn chế sự phát triên của nhóm vi sinh vật khác góp phần tạo cân bằng sinh thái trong tu nhién (Mukerji & Garg 1993)

Actinomycetes là nhóm không roi, dạng sợi Trước kia được xếp vào Tản thực vật

(tức nắm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes) Các loài

Streptomyces có thể tạo ra bào tử từ những ống sợi nhỏ gọi là sporophores Những

phân vách tế bào từ một ống đạng sợi, cách phân cắt này khác với sự hình thành bào

tử của vi khuẩn Theo Waksman (1961) thì trong một gam đất có khoảng 29.000 -

2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật và một đặc tính quan

trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, khoảng 60-70% xạ

khuẩn được phân lập từ đất có khả năng tiết chất kháng sinh

Khoảng 8000 chất kháng sinh được xạ khuẩn tiết ra Trong đó có trên 15 loài có

nguồn gốc từ các loài xạ khuẩn hiếm như Streptosporanggium, Micromonospora,

Actinomadura, v.v (Vi Thi Doan Chinh, 2000)

Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yéu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có rất ít

trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ

khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm Một trong những đặc tính

quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất khang sinh, 60 - 70% xa

khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh

Cac loai Streptomyces dugc tim thay rong rai 6 khap noi trong đất và nó đóng vai trò

rất quan trọng trong hệ sinh thái đất Phần lớn các đặc tính về mùi của đất xuất phát từ

các hóa chất phóng thích bởi các loài Sreptomyces goi la geosmens Streptomycetes 1a

dang trao déi chat da dạng và có thể ăn bất cứ thứ gì, bao gồm đường, rượu, amino

acids, acid hữu cơ, và cả những hợp chất thơm Chúng có thể sản sinh ra men thủy

phân (Extracellulaz hydrolytic enzymes)

Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành

2 loại là một loại cấm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất

substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề

mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ

yêu là sinh sản Nhiêu loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại chỉ có hệ sợi khí

sinh Khi đó hợp chất kháng sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh

dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và cw, 1978)

Màu sắc của khuẩn ty của xạ khuẩn hết sức phong phú Có thể có các màu trắng,

vàng, da cam, đỏ , lục, lam, tím, nâu, đen Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti

cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong

không khí thành những khuẩn tỉ khí sinh Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn

ty khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử Sợi bào tử có thể có nhiều loại hình dạng khác

nhau: thắng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng Một số xạ khuẩn có sinh nang bào

tử bên trong có chứa các bào tử nang

Khuân lạc của xạ khuân rât đặc biệt, nó không trơn ướt như ở vi khuẩn hoặc nắm men

mà thường có dạng thô ráp, dạng phân, không trong suốt, có các nêp toả ra theo hình

phóng xạ, vì vậy mới có tên xạ khuẩn Chúng là những vi sinh vật được xem như tác

nhân sinh học có tác dụng chữa bệnh - bioremediation

1.3.2 Vai trò có lợi của xạ khuẩn Streptomyces

Streptomycetes co ich rất lớn trong y học và đóng vai trò quan trọng trong các ngành

công nghiệp vì chúng có khả năng tổng hop chat khang sinh - antibiotics Có rất nhiều

giả thuyết khác nhau có thể giải thích quá trình sản sinh kháng sinh của xạ khuẩn, trong đó giả thuyết được nhiều người chấp nhận nhất là chất kháng sinh của xạ khuẩn

có khả năng giúp các vi sinh vật đối kháng lại được các vi sinh vật khác liên quan đến

việc lấy hết đinh dưỡng liên quan trong môi trường nào đó và như vậy làm giảm khả

năng cạnh tranh của đối phương Có trên 50 loại kháng sinh phổ biến khác nhau được

ly trích từ các loài xạ khuẩn Sirepfomycefes, trong đó phải kể là Streptomycin,

Neomycin, Chloramphenicol và Tetracyclines

Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp TP — A0356 bang phuong phap sac ky cét Chat khang sinh này có

khả năng kiềm hãm sự phát triển của nắm Aspergillus fumigalus va Candida albicans

Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01-

0,3 mg/ml (Đỗ Thu Hà, 2004).

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xa khuan Streptomyces sp C684 sinh chat khang sinh Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin (Yoo va ctv, 2007)

Bảng 2.1: Chất kháng sinh do một số loài xạ khuẩn tiết ra

mm _." ` ` â_ .,

Loại bệnh hay tác nhân Chất khángsinh Loài xạ khuẩn tiết kháng

sinh

Streptomyces) mediterranei

Pathogens with transmissible Clavulanic acid Streptomyces clavuligerus

penicillin resistance

Nguén: Keith F.Chater, 2006)

Kháng sinh do xa khuẩn tiết ra dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và

cây trồng Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid

amin và các acid hữu cơ Xạ khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzym (protease,

armylaze ) và trong tương lai có thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho

nắm và vi khuẩn vì nấm có thể sinh ra aflatoxin độc cho người và gia súc Những

nghiên cứu về Šzp/omyces cho thấy không có hiệu ứng có hại cho sức khỏe con

người khi sử dụng Srepfomyces iydicus Không có chứng cứ xác định có độc tính

hoặc xâm nhiễm được tìm thấy trong phòng thí nghiệm nghiên cứu động vật (Trejo-

Estrada và ctv, 1998)

1.3.3 Đặc điểm đối kháng

Sfreptoinyces violaceusniger dòng YCED-9 là 1 tác nhân kiểm soát sinh học kháng

nắm đối kháng với nhiều loại nắm gây bệnh khác nhau Dòng VYCED-9 sản xuất 3 hợp

chất kháng với hoạt tính kháng nắm Những hợp chất này đã được tỉnh lọc và định danh, bao gồm: AFA (hoạt tính kháng nắm), 1 phức hợp thuốc diệt nắm của hợp chất

10

giống với polyene tương tự như Guanidylfungin A và hoạt tính kháng lại hầu hết các nắm ngoại trừ nấm noãn; nigericin, l polyester kháng nấm; và geldanamycin, 1

benzoquinoid polyketide ức chế khá cao sự phát triển hệ sợi nắm của Pythium va

Phytophthora spp (Trejo-Estrada vd ctv, 1997)

Nhóm xạ khuẩn (Streptomyces) ciing tiét ra nhiéu men phan hiy thanh phan glucan

Có hơn 200 chủng được phân lập có tiết ra enzym befa -1,3 và beta - 1,4- glucanase phân hủy vách tế bào của nắm Phytopthora gây thối rễ trên cây ăn trái và người ta tìm

được I1 chủng có khả năng làm giảm chỉ số bệnh thối rễ do nấm này khi chủng chúng

lên cây con trong vườn ươm (Valois vd cty 1996)

Năm 2002, ở An Dé đã phân lập duge ching Streptomyces sp 201 có khả nang sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani

Cac loai Streptomyces va mét sé xa khuan khac cho thay có thể bảo vệ nhiều loại cây

trồng tránh khỏi nhiều loại nắm đất gây bệnh cây trồng, cả đối với các thí nghiệm

trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng (Tahvonen, R 1982; Rothrock và Gottlieb, 1984;

Crawford va ctv, 1993) Cac loai Streptomyces spp cé thé ký sinh hoặc tấn công các

nắm gây thối rễ như F usarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Phytomatotricum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria, Sclerotinia, Postia,

Verticillium, Geotrichum Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm có khoảng 80% kháng

sinh clla Streptomyces pulcher hoặc Strepfomyces canescens đã ức chế đáng kế khả

năng nay mầm của bào tử, sự phát triển của sợi nắm và sự hình thành bào tử Fusarium

oxysporum f.sp lycopersici (El-Abyad và cm, 1992) Nhiều loài xạ khuẩn

Actinomycetes, đặc biệt là loài thuộc chỉ Š#repfomyces, được biết đến như là một biện pháp sinh học đối kháng đối với nhiều loại nắm bệnh hại cây trồng như Scierotinia

minor (El — Tarabily va ctv, 2000), Sclerotium rolfsii gay bénh chét rap cay con trén

cu cai duong (Errakhi vd ctv, 2007), nim Phytophthora capsici gay bénh trén 6t cay

(Joo, 2005) hay nam Phytophthora gay théi géc trén cay đậu nành (Xiao, 2002) Hoặc

động đối kháng của Streptomyces d6i véi nam gây bệnh thường liên quan đến việc sản xuất các hợp chất kháng nắm như S violaceusniger strain G10 tao chất khang sinh chéng lai ndm Fusarium oxysporium f.sp.cubense race 4 (Getha va Vikineswary,

11

2002) và tương tự như vậy cũng được báo cáo bởi nhiều tác gia (Fguira vd ctv, 2005;

Ouhdouch va ctv, 2001; Taechowisan va ctv, 2005 va Trejo — Estrada va ctv, 1998) va

tao ra men thir phan ngoai bao - extracellular hydrolytic enzymes (Trejo — Estrada va

ctv, 1998;), tao men chitinase cia S lydicus WYEC 108 (Mahadevan va Crawford,

1997; Mukhejee va Sen, 2006), men glucanase (Valois va ctv, 1996) Hai loai men

Chitinase va B-1,3-glucanase duge xem như là men thủy phân quan trong trong viéc

làm tiêu hủy vách tế bào của nắm bệnh, ví dụ như, vách té bao cha Fusarium

oxysporum (Singh va ctv, 1999), Sclerotinia minor (El — Tarabily va ctv, 2000) va S

rolfsii (El — Katatny, 2001) Kết quả nghiên cứu của Benjaphorn va ctv (2008) dong

Streptomyces hygroscopicus — SRA 14 c6 hiéu qua déi khang tét voi Colletotrichum gloeosporiodes va Sclerotium rolfsii, dong SRA 14 c6 kha nang san sinh ra chitinase

va B-1,3-glucanase rat cao, chinh cdc hop chat nay lam thay đổi hình thái sợi nắm như làm sợi nắm có hình dạng bất bình thường Tiềm năng kháng việc trao đổi chất ngoại

bào của Streptomyces đối với một số nắm đã được báo cáo như Joo (2005), Fguira và

ctv (2005), Chamberlain va Crawford (1999), Elabyad vd ctv (1993), Rothrock và

Gottlieb (1984)

Theo Crawford va ctv (2005) bao cáo xạ khuẩn Streptomyces lydicus WYEC108 la vi

khuẩn gram dương sống trong đất, chúng được phân lập từ cây linseed (hạt lanh) ở

Anh Quốc Xạ khuẩn sống hoại sinh và cộng sinh trên vùng rễ cây, chúng có tác dụng

kích thích tăng trưởng và kháng nắm tốt Streptomyces lydicus WYEC 108 cé nam diac tính hoặc là chức năng phòng trừ nắm bệnh tăng cường khả năng sinh trưởng cây

trồng: (1) có tiềm năng ở vùng rễ; (2) sự kháng sinh; (3) ký sinh lên nấm; (4) tạo men

phân giải cellulose và chitin và (5) tạo vùng siderophore cô lập phân tử lượng của Sắt

(iron) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ khuẩn có khả năng đối kháng nắm tốt,

chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Dong Streptomyces lydicus WYEC108 cho thay

khả năng đối kháng mạnh mẽ chống lại nhiều tác nhân nắm gây bệnh cây trồng, trên đĩa petri trong phòng thí nghiệm bằng việc sản xuất ra những chất chuyển hóa kháng nắm ngoai bao nhu Pythium ultimum hay Rhizoctonia solani duge nudi cay trong méi trudng léng voi Streptomyces lydicus WYEC108, su tre ché sinh trưởng nắm đã được

quan sát (Yuan và Crawford, 1994) Xạ khuẩn loài Streptomyces lydicus WYEC108

thé hién kha năng đối kháng mạnh trong điều kiện phòng Lab đối với các nắm gây

12

get?

bệnh bằng cách tạo ra các chất kháng nấm ngoại bào (extracellular antifungal

metabolites) trên các dia Petri khảo sát Khi nuôi cấy Pythium ultimum hay

Rhizoctonia solani trên môi trường lỏng với S Iydicus WYEC108, sw giới hạn khả

năng sinh trưởng của nấm được quan sát Khi sử dụng bào tử hay tơ nấm của S

ÿdicus dòng WYEC108 để áo xung quanh vỏ hạt đậu, thì hạt đậu được bảo vệ chống

sự xâm nhiễm của nắm P ultimum trong khi đó 100% những hạt không được áo với S lydicus bi nhiễm P ultimum trong vòng 48 giờ sau khi trồng, có ít hơn 40% hạt được

áo bị nhiễm Khi những hạt được áo với xạ khuẩn được gieo vao trong dat 24 gid

trước khi chủng bệnh, thì ở 96 giờ sau đó, có ít hơn 30% cây nẩy mầm bị nhiễm bệnh

Một thí nghiệm khác được thực hiện trong điều kiện điều khiển ẩm, nhiệt độ, khi xạ

khuẩn WYECI08 được áp dụng dưới dạng bào tử (10% CEU/g) để chống lại P

ultimum trén hat dau va hat cay béng gon, két qua cho thay lam tăng đáng kể số cây còn đứng (không bị chết rap, chiều đài cây và trong lượng cây so với nghiệm thức không chủng xạ khuẩn ở cùng điều kiện Khuẩn ty của xạ khuẩn WYECI08 có thể

định cư và đi chuyển đến các đầu mút của các rễ cây khi rễ mọc dài ra Sau thời gian

là 30 ngày, thì mật số của xạ khuẩn WYEC108 định vị tại các rễ khi chúng nay mam

và duy trì bền vững với mật số 10” CFU/g ở vùng rễ, trong khi đó không phải vùng rễ

thì mật số giảm đi 100 lần (từ 10” còn 10” CEU/g)

Ngoài ra, nó còn tắn công nấm gây bệnh mốc sương, sương mai, phấn trắng và những

bệnh trên lá khác (Walter và Crawford, 1995: Crawford và ctv, 2005) Một số loài

thuốc Actinomycetes còn cho thấy có tác dụng như một loại thuốc trir c6 (De Frank va Putnam 1985) và thuốc trir sau (Hayashi va cn, 1991) Dịch tiết từ rễ cây có thể kích thích sự tăng trưởng của xạ khuẩn Actinomycete để khống chế nấm bệnh, trong khi đó

xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tong hợp hợp chất kháng nắm

Ngoài ra, xạ khuẩn actinomycetes còn tổng hợp nhiều loại men phân giải như

chitinases (Blaak va ctv, 1993; Gupta va ctv, 1995; Mahadevan va Crawford 1996),

glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases

(Ramachandra, Crawford va Hertel, 1988) va nhitng men phân giải khác có thể phân

hủy nâm hại

13

Su dung Streptomyces griseoviridis tuéi vào đất đối với những cây giống bị bệnh Douglas-fir, giúp chống lại khả nang cu tri cua Fusarium Streptomyces griseoviridis

đã làm giảm sự nhiễm bénh Fusarium khoảng 61% (Kasten Dumroese va ctv, 1998)

Chat kháng sinh được tiết ra bởi Sirepfomyces được thử nghiệm đã làm giảm đáng kể đối với bệnh thối rễ do nắm ở cỏ linh lăng và đậu nành (Xiao và e, 2001) Theo

Crawford và cv, 1993 đã phân lập và nghiên cứu đặc tính đối kháng của xạ khuẩn

Actinomycete đối với bệnh hại trong đất, đối với việc phân lập, môi trường ít dinh

dưỡng được xác định là môi trường phân lập tốt nhất, giảm nhiễm tạp, pH thích hợp

nhất cho xạ khuẩn phát triển là 6,5 — 8,0 Trong môi trường thích hợp, xạ khuẩn có khả năng đối kháng rất tốt với nắm Pythium ulfimum, khi chủng vào hạt giống trước

khi gieo cho thấy không anh hưởng xấu đến khả năng nây mầm mà lại có tác dụng

phòng bệnh cao

Rafik và c/ (2007) đã nghiên cứu khả năng đối kháng của 10 dong Streptomyces spp

đối với nắm ®$ciefofium roj/Sii trên cây củ cải đường cho thấy khả năng đối kháng tốt

và xạ khuân phát triên rât tôt với mật sô cao ở vùng rể của củ cải đường

1.3.4 Các điêu kiện ảnh hưởng đền sự phát triển của Xạ khuẩn

Xạ khuẩn có thể sống được trong một khoảng biến động của điều kiện môi trường

trong các hệ thống sản xuất nông nghiệp với độ pH biến động từ 4 đến 8, nhiệt độ biến

động từ 45 đến 140 °F ( 7 đến 60 °C) điều kiện môi trường bắt lợi xạ khuẩn sẽ hình

thành bảo tử Tuy nhiên, chúng sẽ chết nếu nhiệt độ vượt quá 160 °E (80 °C) Xạ

khuẩn thuộc chỉ Streptomyces hiéu khi, di dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu

thường là 25 — 30°C, pH tối ứu là 6.8-8, riêng xạ khuẩn ưa nhiệt hay ưa lạnh có thể

phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn Chất kháng sinh chúng tạo ra ức chế vi

khuẩn, nắm sợi, các tế bào ung thư V.V

1.4 BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ BỆNH HAI RE TREN CAY CO MUI

Việc quản lý bệnh trong đất thường rất khó và kém hiệu quả, trong khi đó trên cây có

múi lại có nhiều bệnh khác nhau với nhiều tác nhân được nhiêu tác giả báo cáo rất

khác nhau, vì vậy việc quản lý bệnh chưa đồng bộ và hiệu quả chưa thật thuyết phục

14

Muốn phòng trừ bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani tt thi biện pháp rất quan trọng

là phải giảm Stress cho cây, tạo điều kiện đất thích hợp cho cây phát triển, tránh để đất

quá dẻ chặt vì bệnh nặng thường do có sự tác dong gitta ndm Fusarium solani, tuyén tring va Phytophthora, nén viéc khéng ché cac tac nhan khac cũng sẽ làm giảm được

bénh do F; usarium solani gay ra va tao déu kién thuận lợi cho tác nhân gây bệnh trên

cây có múi

1.4.1 Biện pháp hóa học

Để phòng trừ bệnh thối rễ do ndm Fusarium solani, Labuschange va ctv (1996) báo cáo rằng việc sử dụng thuốc Prochloraz và Thiabendazole để xử lý đất cho cây con trong bầu đất có tác dụng phòng trừ bệnh lên đến 92 và 80% Tuy nhiên ngoài đông việc sử dụng thuốc không mang lại hiệu quả cao

Đề phòng trừ bệnh hại rễ trên cây có múi như đối với bệnh do nấm Ewsariưm

‘solani, Timmer vd ctv (2003) dai khuyến cáo sử dụng Benomyl để tưới vào đất, tuy

nhiên hiệu quả xử lý không cao

Kết quả nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh thối rễ trên cây có múi của

Nguyễn Ngọc Anh Thư vờ cứ (2005) trong phòng thí nghiệm cho cả 3 loại thuốc Nustar, Bendazol, Ridomyl và nắm đối khang Trichoderma déu ngăn cản được sự

phát triển của đại bào tử và tiểu bào tử của nắm Ƒ1sarimm solani Kết quả thử nghiệm ngoài vườn cây cam sành cho kết quả số khuẩn lạc của nim Fusarium solani cé trong

1g đất sau khi xử lý thuốc giảm rất nhiều so với trước khi xử lý thuốc Ở các nghiệm

thức xử lý thuốc, số khuẩn lạc có trong 1g đất giảm rất nhiều so với đối chứng và sự

khác biệt này rất có nghĩa Cả 3 loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm như: Nustar, Bendazol, Ridomyl đều có tác dụng gia tăng số rễ tươi giúp cây có khả năng phục hồi

nhanh khi kết hợp thuốc với bón 7ichoderma, kết quả cũng cho thấyT*ichoderma và

phân hữu cơ nên xử lý sau khi xử lý thuốc trừ nằm từ 20 -30 ngày thì mới có hiệu quả

cao

1.4.2 Biện pháp giỗng

Để phòng bệnh thối rễ do Ƒsarium, Labuschange và cv (1996) báo cáo là giống gốc

ghép như Carrizo có khả năng chống chịu bệnh tốt Graham (1990) đã nghiên cứu sử

15

dụng gốc ghép kháng nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ cho thấy nhóm gốc ghép như cam chua, cam pineapple, quít Cleopatra và Carrizo citrange có khả năng chống

chịu bệnh nhưng không bằng khả năng chống chịu bệnh của gốc ghép thuộc nhóm

Trifoliate orange va Swingle citromelo

1.4.3 Si dung Trichoderma

Chaurasia va Bhatt (2000) bao cdo rang nắm Phytopthora parasitica var piperina va Fusarium solani gay ra 1a nhitng loai bénh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế

khá cao Bộ rễ bị thối dẫn đến thân cây bị khô héo và lá bị thối sẽ huỷ hoại bộ lá của

cây Nhưng khi giải quyết bằng cách sử dụng chất hoá học thì rất nguy hiểm đến sức

khoẻ con người nên kể từ đó quản lý bệnh bằng biện pháp sinh học được thực hiện bang cach sit dung Trichoderma viride Nam duoc nhan én trong hữu cơ và được

cung cấp trước và sau gió mùa và khoảng 3 tháng cung cấp 1 lần Điều này đã cải

thiện bệnh một cách đáng kể

Trichoderma harzianum được phân lập, sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học

và quản lý bệnh héo rũ trên cây tiêu, bệnh thối rễ cây gừng, bệnh thối rễ cây cam

Coorg, Ân Độ, bệnh trong vườn ươm và bệnh trên nhiều loại hạt và trong đất bị nhiễm

bệnh 7 harzianum được nhân lên nhiều lần trong đĩa lớn để dùng phân huỷ vỏ cây cà

phê và khoảng 4 tấn loại thuốc sinh học này được tiêu thụ trên thị trường trong những

nam gan day Trichoderma được cung cấp dưới dạng hỗn hợp, phối trộn giữa bánh

dầu neem hoặc chất hữu cơ từ vườn ruộng lkg/100kg và được ủ trong 2 ngày Cung

cấp hỗn hợp này khoảng 5kg/cây cho những cây dưới 10 năm tuổi và 10kg/cây cho

những cây trên 10 năm tuổi thì quản lý rất tốt bệnh thối rễ trên cây cam Coorg Trộn

Trichoderma harzianum v6i bánh đầu neem có nhiều ích lợi trong việc quản lý bệnh thối rễ do nắm 7: harzianum duge nhân lên nhiều lần trong bánh dau neem, khi phân tích về đinh dưỡng trong khoáng chất đã thấy rằng sự tăng lên trong N, K, Ca, Mg, S,

Fe, Mn, Zn và Cu với sự tăng lên của pH Sử dụng 7: 2arziawm như là tác nhân

phòng trừ sinh học thì bên cạnh đó việc cung cấp tác nhân bảo vệ hệ thống rễ cũng

như cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho cây là điều cần thiết Chất nền bằng xơ dừa

cũng kích thích sự phát triển nắm 7: #arzianum tắt t6t (Girija va ctv, 2000)

16

Đặng Thùy Linh & Nguyễn Văn Hoà (2004) Đã sử dụng chế phẩm nắm Trichoderma

trộn chung với phân hữu cơ (tỉ lệ 1:100) để phòng trừ bệnh hại trong đất trên cây sầu

riêng, cây nhãn và cây cam sành, kết hợp với biện pháp canh tác và bón hai lần trong

năm (trước và sau mùa mưa) cho kết quả phòng trừ bệnh tốt Trường hợp bệnh trong

vườn đã bộc phát nặng nên tưới thuốc hoá học trước 2-3 lần để giảm thiểu mật số mầm bệnh trong đất cũng như chặn đứng bộc phát bệnh trước sau đó 20- 30 ngày mới

sử dụng chế phẩm nắm Trichoderma két hợp phân hữu cơ

Theo Dương Minh (2010) nghiên cứu sử dụng sản phẩm Tricô — ĐHCT trên 11 ha

Cam sành tại huyện Tam Bình và 8,5 ha cam sành tại Trà Ôn — Vĩnh Long đã giúp nhà

vườn phục hồi 60-70% rễ tùy theo điều kiện canh tác, cây cho năng suất ổn định và

đạt chất lượng và phẩm chat tét NAm Trichoderma c6 tac động chặn đứng bệnh thối

rễ trén cam sanh do ndm F solani gây ra, giúp rễ phục hồi nhanh sau 3 tuần

I 4.4 Sie dung Streptomyces

Theo Nguyễn Văn Hòa và Nguyễn Ngọc Anh Thư (2006), việc sử dụng thuốc hóa học

trong đất có thể làm ảnh hưởng không tốt đến môi trường và hiệu quả không cao Chính vì vậy việc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học Antino — vate và Antino — lron (có chứa S/zepfomyces spp) có ý nghĩa thực tiển rất lớn trong sản xuất nông

nghiệp bền vững, kết quả khảo nghiệm trên cây cam soàn để phòng trừ bệnh thối rễ

cho thấy việc sử dụng hai sản phẩm này cho kết quả phòng trừ không thua kém gi so

với sử dụng thuốc Ridomyl Gold mà nó còn giúp hệ thống rễ phát triển tốt hơn

1.5 SO LUQC VE CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)

Giéng géc ghép Volkameriana (Citrus Volkameriana) là giỗng lai giữa chanh lemon

và cam chua, có nguồn gốc từ Ý Chanh Volkamer gần đây được quan tâm như là một

giống gốc ghép triển vọng nhờ tính chống chịu bệnh malsecco và tính chống chịu

bénh théi ré Phytophthora (do P parasitica) Cây có múi ghép trên gốc ghép Volka

có sinh trưởng mạnh, cho năng suất cao nhưng phẩm chất trái không ngon bằng ghép trên chanh nhám mặc dù chịu lạnh tốt hơn Gốc Volka cũng chống chịu được virus

tristeza và ít nhiều chịu mặn Tương tự như cam chua, chanh Volka mọc tốt trên đất

kiềm, tuy nhiên nó rất mẫn cảm với tuyến trùng (James và ctv, 1990)

17

Ban dau, loai gốc ghép này được chú ý do khả năng kháng bệnh Malsecco của nó

Đây là loại gốc ghép “đa năng” nhất là khi ghép với chanh, chanh lime và một vài loại cây có múi khác Gốc ghép được chọn vì đây là gốc ghép sinh trưởng tốt, dễ

ghép, dễ nhân giống, tỷ lệ nầy mầm cao và phải dễ giâm cành, Gốc ghép phải tạo nên

tô hợp với giống được ghép, độ đồng dều cao: giống phải đa phôi; thích ứng điều

kiện nơi trồng như đất đai, nguồn nước, thời tiết và cuối cùng là kháng và chống chịu với một số dịch hại nguy hiểm (Castle vờ ctv, 1989)

Theo Laduschagne va ctv (1992) Chanh Volka 1a giống rất mẫn cảm với nấm

Fusarium solani, day 1a nam c6 chira nhiều độc tố nhưng chủ yếu là fusaric acid,

độc tố này kềm hãm hoạt động của hệ thống Enzyme cây ký chủ phá vở độ thẩm thấu

của màng tế bào và kềm hãm hoạt động hô hấp của cây làm giảm mức độ đề kháng của cây

Các giống cây có múi thuộc nhóm chanh, quýt và cam có khả năng tiếp hợp rất tốt

với gốc ghép Volka với điểm kiểu hình tiếp hợp trung bình là 4 (Aubert và Vullin,

1998) Các kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Hữu Thoại và cộng

sự năm 2004 khi sử dụng phương pháp đánh giá nhanh khả năng tiếp hợp cam quýt

trên một số gốc phép bằng cách ghép trao vòng vỏ, nhóm tác giả khang định Gốc

ghép Volka tiếp hợp tốt với nhóm cam và quít Các giống cây có múi thuộc nhỏm

bưởi và tangelo có khả năng tiếp hợp khá tốt với gốc ghép Volka với điểm kiểu hình

tiếp hợp là 3-4, mức độ tiếp hợp này vẫn có thể chấp nhận được cho các giống bưởi

sinh trưởng tốt trên gốc ghép Volka (Nguyễn Thanh Bình và ctv, 2005)

Citrus voikarmeriana có khả năng chịu đựng muối Clorua, thích ứng tốt với vùng đất

khô hạn nhưng cần các loại đất thoáng khí Nó chịu đựng trung bình ở đất nặng và

chịu đựng kém các loại đất yếm khí, không thông thoáng Hạt nây mầm dễ dang, cay

con dồi dào sinh lực và khả năng đâm rễ tốt Ghép dễ và trồng lại khá tốt Đây là một

gốc ghép đáng quan tâm trong trường hợp các nước chưa phát triển hệ thống nghiêm

ngặt cấp giấy chứng nhận hoặc gặp phải các vấn đề về đá vôi hoặc nhiễm mặn, như

trường hợp ở các nước như Ai Cập hay là các quốc gia vùng Trung Đông

Thông thường trong một vườn cây, các cây có múi được trồng cách nhau 6m x 4m,

với mật độ trung bình khoảng 400cây/ha Một số đữ liệu về các năng suất hạt/quả và

18

nang suat quả trên cây ghi nhận được trong điều kiện khí hậu Á nhiệt đới vùng Địa Trung hải tại đảo Corse: Năng suất đạt 60kg/cây, hạt 0,7kg/cây, có khoảng 10 — 12

hạt /cây Tuy nhiên những quả đầu tiên xuất hiện vào năm thứ 3 hoặc thứ 4 sau khi trồng và nếu các cây được nhân giống bằng lối gieo hạt thì đến khoảng năm thứ 15 sẽ

có vụ thu, hoạch đầy đủ Tuy nhiên, nếu những cây dùng lấy hạt giống gốc phép là

những cây trồng bằng ghép thì cho quả sớm (Nguyễn Minh Châu và ctv, 1990)

19

Chuong 2

PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP THUC HIEN

2.1 PHUONG TIEN THUC HIEN

- Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2010 đến tháng 10/2010 |

- Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm và nhà lưới Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây

Ăn Quả Miền Nam

- Vật liệu và thiết bị:

+ Đĩa Petri, ống nghiệm, micropippet, lam đếm bao tử Thoma, nước cất khử

trùng, bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, bông gòn không thấm nước, bông gòn thấm nước, ống chích y tế, viết, thước, số theo dõi thí nghiệm, dụng cụ đo nhiệt độ,

âm độ, ly nhựa, hạt chanh Volka, hỗn hợp đất, cây cam sành, chậu nhựa K;HPO¿,

MgSO,, tinh bot tan, CaCO v.v

+ Tủ cấy vi sinh, máy lắc đều có điều chỉnh nhiệt độ, tủ lạnh dùng trữ mẫu, tủ

sấy, nồi hấp tiệt trùng, máy xay sinh tố, cân 4 số, cân điện tử, máy do pH, kính hiển vi soi nổi, kính hiểm vi huỳnh quang, kính hiển vi cho ảnh ngược, máy đếm khuẩn, máy khuấy từ, lò vi ba, cân bàn, máy nước cất, tủ điều chỉnh nhiệt độ âm độ, cân kỹ thuật 2

số lẻ,

- Môi trường sử dụng:

a PDA (Potato Dextrose Agar)

b Low Nutrient Mineral Salts Agar Modified (LNMSM) (Kuster vd ctv, 1964)

c Inorganice Salt Starch agar medium ISS (Yoshida va ctv, 1994)

d Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar Modified (YCEDM) (Hardission

va ctv, 1978)

e Water Yeast Extract Agar (WYE) (Williams vd ctv, 1982)

f MSSCM (Mineral Salts Starch Casein Agar Modified) Yoshida vd ctv, 1994)

g CYD (Casamino acids Yeast Extract Glucose Agar) (Hardission va ctv, 1978)

20

- Nguồn vi sinh vat: Dong xa khudn STREPTOMYCES — SOFRI 1 va Fusarium

solani được Bộ Môn BVTV, Viện CAQ miền Nam phân lập và tồn trữ — Viết tắt là Streptomyces — SOFRI 1

(b) Hinh dang bao tir

Hình 2.2: Nguén nam Fusarium solani - (a) nguén ném được tôn trữ,

(b) Bao tir nam Fusarium solani

- Các công thức môi trường:

* Môi trường PDA: Khoai tây - 200g; Thạch — 18g; đường — 20g: H;O - 1 lít

* Moi truong WYE: Yeast Extract — 0,25g; Agar — 18g; KsHPO, — 0,5 g; H,O - 1 lit

* Méi truong YCEDM: Yeast Extract — 0,3g; Casamino Acid — 0,3g; D-glucose —

0,3g; Agar — 18g; KzZHPO, — 2g; H20 - 1 lit

* Môi trường LNMS: NaCL — 0,2g; MgSO,.7H20 — 0,05g; CaCO; — 0,02g;

_ FeSO,4.7H,0 — 0,01g; tinh bét tan — 0,1g; Yeast extract — 0,1g; Agar — 18g; K,HPO,-—

2g; HạO - 1 lít

21

* Môi trường MSSCM: NaCL — 2g; MgSO,.7H20 — 0,05g; CaCO; — 0,02g; EFeSOx.8HO — 0,01g; KNO; — 2g; Tỉnh bột tan — 10g; Casein ~0,3g; Agar — l8g;

K;HP0a _ 2g; HạO - 1 lit

* Môi trường ISS: Tỉnh bột tan — 10g; (NH4) ;SO;— 2g; KạHPOx-— 1,0g; MgSO¿ 7

HạO - lg; NaCL — lg; CaCO; - 2g: FeSO¿ 7HạO ~ lg; MnCl, 4H,O — 1g; ZnSO,

7HO - lg; Agar — 12g HạO - 1 lít

* Môi trường CYD: Casamino Acids — 0,5g; Yeast extract — 0,8g; D-glucose — 0,4g;

K HPO, — 0,5g va KH,PO, — 0,5g; H20 - 1 lit

2.2 PHUONG PHAP THUC HIEN

2.2.1 Khảo sát môi trường dinh dưỡng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của

xạ khuẩn Streptomyces —SOFRI 1

* Muc dich: Nham xac định môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho việc nhân mật

số xạ khuẩn Streptomyces ~ SOFRI 1, tir dé cd thé ap dung dé nhan mật số phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo

* Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức

tương ứng 6 loại môi trường với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại được thực hiện trên 3 đĩa

Petri

* Chuẩn bị Xạ khuẩn: (Theo phương pháp của Aoki và cív, 2007):

Lay 10ml nước cất đổ vào đĩa Petri chứa Streptomyces đã được nuôi cấy 10 ngày

trước đó, bào tử và sợi khuẩn ty được cạo khỏi môi trường nuôi cấy Dung dịch này

được lọc qua 2 lớp bông gòn thấm nước thông qua áp lực bơm của xi lanh Dung dịch cuối cùng được sử dụng cho các thí nghiệm sau

* Cách thực hiện: Cho 0,2 ml huyền phù chứa xạ khuẩn ở nồng độ 105CFU/ml vào

đĩa petri chứa 8 ml môi trường như trên (6 loại) đã chuẩn bị sẵn, dùng que thủy tinh

chà đều trên bề mặt môi trường rồi đặt tất ca dia petri trong tủ úm ở 28C và điều kiện

sáng tối xen kẻ nhau trong 120 giờ

* Chỉ tiêu ghỉ nhận: Ghi nhận mức độ phát triển của khuẩn lạc ở các thời điểm 24,

48, 72 và 96 giờ sau khi nuôi cấy theo phương pháp của Crawford và cfv (1993) và

điểm số lượng khuẩn lạc ở 48, 72 và 96 giờ sau khi chủng

> Đánh giá mức độ phát triển khuẩn lạc:

(-): Không có sự sinh trưởng; (+): Sinh trưởng rất yếu; (++): Một số khuẩn lạc sinh

trưởng; (+++): Sinh trưởng khuẩn lạc tốt

> Đếm số lượng khuẩn lạc: Đếm khuẩn lạc mọc riêng lẻ rõ ràng trên môi trường

nuôi cây

22

2.2.2 Xác định pH thích hợp cho xạ khuẩn phát triển trên môi trường YCEDM

* Mục đích: Nhằm xác định pH nào thích hợp nhất cho việc nhân mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1, tir đó có thể áp dụng để nhân mật số phục vụ cho những

nghiên cứu tiếp theo

* Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức

tương ứng với 6 mức độ pH khác nhau (5,5 — 6,0 — 6,5 — 7,0- 7,5 và 8,0), với 3 lần lập

lại và mỗi lần lặp lại thực hiện trên 3 đĩa

* Các bước tiến hành:

- Pha và điều chỉnh pH của môi trường: Tất cả thành phần môi trường được

hòa tan đều, sau đó chia làm 6 phần để chỉnh về 6 mức độ pH khác nhau (5,5 — 6,0 — 6,5 — 7,0- 7,5 và 8,0), sao cho thành phần dinh dưỡng giống nhau giữa các nghiệm

thức Sau đó đo và điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N để đạt mức pH theo yêu

cầu và sau đó đem thanh trùng bằng Aufoclave ở 121°C trong 20 phút

- Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường với pH

=7,0trong 10 ngày trong tủ úm có điều chỉnh sáng tối xen kẽ nhau ở 28°C

- Cách thực hiện: Cho 0,2 mÌ huyền phù chứa xạ khuẩn ở nồng độ 10°CFU/ml

cho vào đĩa petri chứa 8 ml môi trường YCED (ở 6 mức pH khác nhau) đã chuẩn bị

sẵn, dùng que thủy tính chà đều trên bề mặt môi trường rồi đặt đĩa petri trong tủ úm

trong 120 giờ có điều chỉnh sáng tối xen kẻ nhau ở 28°C

* Chỉ tiêu ghi nhận: Mức độ phát triển của khuẩn lạc ở các thời điểm 24giờ, 48 giờ,

72 giờ, 96 giờ sau khi nuôi cây theo phương pháp của Crawford va ctv (1993) va đếm

mật số khuẩn lạc hiện diện ở thời điểm 48giờ, 72giờ, 96 giờ và 120 giờ sau khi nuôi cay

>_ Đánh giá mức độ phái triển khuẩn lạc:

(-): Không có sự sinh trưởng; (+): Sinh trưởng rất yếu; (++): Một số khuẩn lạc sinh truéng; (+++): Sinh trưởng khuẩn lạc tốt

> Đếm số lượng khuẩn lạc: Đếm khuẩn lạc mọc riêng lẻ rõ ràng trên môi trường

nuôi cấy

2.2.3 Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nắm Fusarium solani

trong điều kiện phòng thí nghiệm

* Mục đích: Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 với

nam Fusarium solani trong dia Petri

* Chuẩn bị nấm Fusarium solani: Nam Fusarium solani dugc chuan bj sẵn trên môi

trường PDA sẵn sàng để sử dụng

23

* Chuan bj nguén xa khuan: Xa khuan Streptomyces — SOFRI 1 dugc nhan nudi va tạo bào tử trên mơi trường YCEDM, nuơi được 10 ngày, tiếp theo thu thập bào tử theo

phương pháp của Aoki va ctv (2007), sau đĩ được pha lỗng ở các nồng độ thích hợp

khác nhau 10Ỷ, 10%, 10°, 10°CFU/ml

* Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức

tương ứng 4 nồng độ xạ khuẩn (10, 10', 10”, 105 CFU/ml) và 1 nghiệm thức đối

chứng chủng nước sạch với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 3 đĩa

* Phương pháp thực hiện:

+ Cách thực hiện I Phương pháp Zarandi va ctv, 2009: Cho 0,1 m1 huyền

phù chứa xạ khuẩn ở mỗi nồng độ (10”, 10f, 107, 10” CEU/ml) cho vào 1 bên đĩa petri

chứa § ml mơi trường PDA đã chuẩn bị sẵn, chà đều trên 1⁄2 bề mặt mơi trường, ủ ở

28°C trong 5 ngày sau đĩ đục khoanh khuẩn ty nấm #⁄sarim solani (đã được nuơi

cấy 7 ngày trên mơi trường PDA ) và đặt vào giữa đĩa petri chứa xạ khuẩn

Các chỉ tiêu ghỉ nhận: Khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối véi ndm Fusarium

solani ở các thời điểm 24giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ sau khi chủng thơng qua sự phát triển của tơ nắm Ghi nhận đối kháng theo phương pháp của Zarandi và cứv, 2009:

(-): Khơng giới hạn sự phát triển của nam = Nắm phát triển khơng khác biệt

so với đối chứng: (+): Sự ức chế yếu: Bán kính tản nắm từ 5-9mm; (++): $w ức chế trung bình: Bán kính tản nắm từ 1-4mm; (+++): Sự ức chế hồn fồn = Nam khơng mọc được

+ Cách thực hiện 2: Mơi trường PDA đã được chuẩn bị sẵn, đưa vào lị viba

khoảng 3 — 5 phút cho mơi trường lỗng và chờ, lấy ra và đợi đến khi nhiệt độ hạ xuống cịn khoảng 50°C, sau đĩ cho 2ml bào tử S/zèfomyces — SOFRI 1 ở các nồng

d6 nhu 10° CFU/ml; 10* CFU/ml; 10° CFU/ml; 10° CFU/ml vao méi binh méi trudng,

dùng tay lắc nhẹ sau đĩ đỗ ra đĩa Petri, tiếp theo đục khoanh khuẩn ty nấm Fusarium

soÏani (đã được nuơi cấy 7 ngày trên mơi trường PDA ) và đặt vào giữa đĩa petri chứa

xạ khuẩn

Ghi nhận chỉ tiếu: Đo đường kính của nắm Ƒsarium solani ở các thời điểm 24

gid, 48 gid, 72 gid, 96 gid va 120 giờ sau khi chủng

2.2.4 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn ,S/repømyces - SOFRI1 đối

với nấm Fusarium solani trên cây chanh Volka ở điều kiện phịng thí

- Khao sat kha nang doi khang cia xa khudn déi voi ndm Fusarium solani gay

bệnh trên chanh Volka ở các mật độ khác nhau

* Chuẩn bị: Ly nhựa có đường kính miệng 9cm có đục lỗ xung quanh đáy ly, hỗn

hợp đất đã được khử trùng, hạt chanh Volka đã được thu thập và được xử lý sạch sẽ,

Xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 chuẩn bị ở mật số 10', 105, 10° CFU/ml, Fusarium solani c6 mat s6 10° bao ti/ml

* Phuong phap: Thi nghiém duoc bé tri hoan toan ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức trong đó, 3 nghiệm thức tương ứng với 3 mật số xạ khuẩn 10', 10°, 10° véi cung mot nong d6 Fusarium solani mật số 10 bào tử/ml; một nghiệm thức chỉ chủng Ƒsarium

solani 10°bao tit/ml; một nghiệm thức chỉ chủng xạ khuẩn với nồng độ 10”CFU/ml

và nghiệm thức đối chứng chủng nước sạch, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 1 ly

nhựa

+ Cách thực hiện 1: (Theo phương pháp ctia Lynch vd ctv, 1992)

Cho hỗn hợp đất vào từng ly nhựa, hạt chanh Volka sau khi được khử trùng bề mặt Ca(CLO) 1% và rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng 9 hạt chanh Volka được tưới

với 18 ml xạ khuẩn ở các mật sé (10*, 10°, 10° CFU/ml), sau đó gieo hạt đều trên bề

mặt ly và phủ 1 lớp hỗn hợp đất mõng lên trên, tưới 18 ml huyền phù chứa F1sariưm

solani 10° bao té/ml, một nghiệm thức chỉ chủng Ƒsariưmn solani 10° bao tử/ml, một

nghiệm thức chỉ chủng xạ khuẩn 10 CFU/ml cũng được thực hiện tương tự, riêng

nghiệm thức đối chứng thực hiện tương tự nhưng chỉ sử dụng nước sạch

+ Cách thực hiện 2: Thực hiện giỗng như cách thực hiện 1 nhưng khác là hạt chanh

Volka được ngâm với các mật số xạ khuẩn khác nhau khoảng 5 giờ sau đó mới thực

hiện các bước tiếp theo

Tat ca cdc ly nhựa được đặt trong phòng đến 25 ngày

* Ghỉ nhận chỉ tiêu ở thời điểm 25 ngay sau khi gieo:

> Tỷ lệ hạt nây mầm thành cây (%)

> Chiều cao cây, chiều dài rễ, số lượng rễ tươi, rễ phụ (cm)

> Trọng lượng tươi, trọng lượng khô của thân, lá cây (g)

> Trọng lượng tươi, trọng lượng khô của rễ cây (g)

* Trọng lượng khô thân và rễ được ghỉ nhận bằng cách: Sau khi cân trọng lượng

tươi xong, để từng phần vào giấy bạc có ký hiệu rõ ràng gói lại và sau đó đem tất cả

để vào tủ sấy (sấy ở 60°C đến khi nào lấy ra cân mà trọng lượng của nó không thay

đổi là được)

235

Hình 2.3: Hình bồ trí thí nghiệm trong ly nhựa (a) khơng ngâm hạt (b) cĩ ngâm hạt

5 giờ sau khi gieo

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do ndm Fusarium

soÏani trong điều kiện nhà lưới

* Mục đích:

Xác định mật số và đánh giá hiệu quả phịng trừ nắm Fusarium solani trén cam

sành ghép trên gơc ghép chanh Volka ở điều kiện nhà lưới

* Chuẩn bị cây: Cây cam sành được ghép trên gốc ghép Chanh Volka 4 tháng tuổi

trong chậu cĩ kích thước cao 60 cm, đường kính gốc ghép 1.2 phân, mỗi chậu 1 cây

* Chuẩn bị xạ khuẩn: Dịng xạ khuẩn được nuơi và tạo bào tử trên mơi trường YCED sau đĩ thu thập và được pha lỗng ở các mật số khác nhau 10', 10°, 105

-_ 10CFƯ/mI

_ * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên

` với?7 nghiệm thức tương ứng 4 ngiệm thức chủng xạ khuẩn với mật số 10, 10°, 105

_ 10’CFU/ml cing véi Fusarium solani mat số 105 bào tử/ml, một nghiệm thức chủng

‘ Streptomyces — SOFRI 1 mat sé 10°CFU/ml, mét nghiém thirc tao Stress và cuối cùng

4 là một nghiệm thức đối chứng chủng nước sạch (khơng tạo Stress) và 4 lần lặp lại mỗi

lần lặp lại 3 cây

* Cách thực hiện:

Tạo Síress: Dùng tay lắc nhẹ cây cam sành theo 4 hướng của chậu Các chậu cam

sành (trừ nghiệm thức đối chứng) đặt trong điều kiện oi nước với mỗi chậu cho vào túi

nylon, cho thêm vào mỗi chậu là 3lít nước cất vơ trùng lấy dây thắt túi nylon lại và để

khoảng 10 ngày lấy túi nylon ra sau đĩ lần lượt lấy ống xi lanh loại lớn bơm 200ml

Streptomyces — SOFRI 1 vao 4 huéng của mỗi chậu gần gốc cây ở các mật số khác

nhau tương ứng với các nghiệm thức khác nhau, khoảng 15 ngày sau tiếp tục bơm

;

26