Phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi

Lê Viết Tùng Tên đề tài: Phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi khoá luận tốt nghiệp đại học Hệ đà

Lê Viết Tùng

Tên đề tài:

Phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi

khoá luận tốt nghiệp đại học

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2010 - 2014

Thái Nguyên - 2014

Lê Viết Tùng

Tên đề tài:

Phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi

khoá luận tốt nghiệp đại học

Hệ đào tạo : Chính quy

1 GS.TS Nguyễn Quang Tuyên - Viện Khoa học Sự sống

2 TS Nguyễn Văn Duy - Khoa CNSH & CNTP

3 ThS Đỗ Bích Duệ - Viện Khoa học Sự sống

Thái Nguyên - 2014

Để hoàn thành khóa luận này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

GS.TS Nguyễn Quang Tuyên – Phó viện trưởng Viện Khoa học Sự sống -

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực tập

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy - Phó trưởng khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Đỗ Bích Duệ cán bộ Bộ môn Công nghệ

Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm, cũng như cán bộ và nhân viên Viện Khoa học Sự sống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ, động viên tinh thần của tất cả người thân và bạn bè trong suốt thời gian qua

Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2014

Sinh viên

Lê Viết Tùng

Bảng 2.1 Thành phần các chất vô cơ (%) của một số loại vật 4

Bảng 2.2 Khối lượng chất thải rắn chăn nuôi ở Việt Nam 5

Bảng 2.3 Tính chất của nước thải chăn nuôi lợn 6

Bảng 2.4 Ước tính chất thải rắn chăn nuôi trong năm 2007 7

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi trong phản ứng PCR 18

Bảng 3.2 Dụng cụ thí nghiệm 19

Bảng 3.3 Thiết bị thí nghiệm 20

Bảng 4.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn trong đất và phân ủ hoai mục 28

Bảng 4.2 Đặc điểm của các chủng xạ khuẩn phân lập 29

Bảng 4.3 Kết quả xác định hoạt tính enzyme của các chủng XK phân lập được 30

Bảng 4.4 Hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau 48h 32

Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn T1 và T4 33

Bảng 4.6 Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng xạ khuẩn T1 và T4 35

Bảng 4.7 Khả năng đồng hóa đường 36

Bảng 4.8 Khả năng chống chịu muối của chủng XK T1 và T4 37

Bảng 4.9 HTKS của chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37

Bảng 4.10 Kết quả so sánh trình tự gen của chủng T1 với gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 39

Bảng 4.11 Kết quả so sánh trình tự gen của chủng T4 với gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 39

Trang

Hình 4.1 Hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn 31

Hình 4.2 Hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau 48 giờ 32

Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc và CSBT chủng xạ khuẩn T1 và T4 34

Hình 4.4 Điện di đồ 37

Hình 4.5 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR 38

Hình 4.6 Cây phân loại thể hiện mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces T1 và T4 với các chủng khác thuộc chi Streptomyces 40

Từ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ

BOD Nhu cầu oxi sinh hóa

CFU Colony Forming Unit

COD Nhu cầu oxi hóa học

CSBT Cuống sinh bào tử

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.2 Tổng quan về chất thải chăn nuôi 3

2.2.1 Đặc điểm của chất thải chăn nuôi 3

2.2.2 Tình hình ô nhiễm môi trường do chất thải chăn nuôi ở Việt Nam 6

2.2.3 Khả năng gây ô nhiễm của chất thải chăn nuôi 8

2.3 Xạ khuẩn 9

2.3.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 9

2.3.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 10

2.3.4 Phân loại xạ khuẩn 14

2.3.5 Enzyme ngoại bào phổ biến từ xạ khuẩn 16

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.3 Hóa chất và thiết bị 19

3.3.1 Hóa chất 19

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị 19

3.3.3 Môi trường nghiên cứu 20

3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 21

3.5.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn 21

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 23

3.5.3 Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào [10] 23

3.5.5 Kiểm tra tính kháng một số loại vi sinh vật gây bệnh [10], [11] 24

3.5.6 Phương pháp xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA 25

3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 27

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn 28

4.1.1 Kết quả phân lập các chủng XK trong đất và phân ủ hoai mục 28

4.1.2 Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc của 14 chủng xạ khuẩn phân lập được 29

4.2 Kết quả tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme ngoại bào 30

4.3 Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng phân lập 31

4.4 Kết quả xác định một số đặc điêm sinh học của chủng XK T1 và T4 33

4.4.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy 33

4.4.2 Kết quả xác định một số đặc điểm sinh học của chủng XK T1 và T4 35

4.5 Kết quả xác định tính kháng các vi sinh vật kiểm định 37

3.6 Kết quả định danh bằng sinh học phân tử 37

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam, có vai trò quan trọng trong chiến lược ổn định và phát triển kinh tế - xã hội Hằng năm ngành này đóng góp khoảng 18% tổng GDP cả nước [3] Trong cơ cấu ngành Nông Nghiệp nước ta, ngành chăn nuôi đóng vai trò hết sức quan trọng Sản phẩm của ngành là những nhu yếu phẩm, mặt hàng rất cần thiết đối với cuộc sống hằng ngày của con người Đây cũng là ngành kinh tế giúp người nông dân tăng thu nhập, giải quyết được nhiều công ăn việc làm cho người lao động Tuy nhiên, bên cạnh việc sản xuất và cung cấp một số lượng lớn sản phẩm quan trọng cho nhu cầu của con người, ngành chăn nuôi cũng đã gây nên nhiều hiện tượng tiêu cực về môi trường Ngoài chất thải rắn và chất thải lỏng, chăn nuôi hiện đóng góp khoảng 18% hiệu ứng nóng lên của trái đất do thải ra các khí gây hiệu ứng nhà kính, trong đó có 9% tổng số khí CO2 sinh ra, 37% khí mêtan (CH4) và 65% oxit nitơ (N2O) [25]

Ngày nay, xã hội phát triển kèm theo đó là sự gia tăng dân số diễn ra không ngừng dẫn tới nhu cầu đối với sản phẩm ngành chăn nuôi ngày càng lớn Để đáp ứng được yêu cầu ngày càng lớn đó ngành chăn nuôi cần phải có những thay đổi tích cực Đó là mở rộng quy mô sản xuất, thay đổi phương thức sản xuất hay ứng dụng các biện pháp khoa học kỹ để làm tăng năng suất, chất lượng, sản lượng các sản phẩm của ngành Và việc mở rộng quy mô sản xuất chăn nuôi cũng đồng nghĩa với lượng chất thải do chăn nuôi thải ra sẽ tăng lên Từ đó làm nảy sinh thêm nhiều những vấn đề về môi trường và những hệ lụy của nó có thể tác động tiêu cực tới con người

Đối với những hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, không tập trung thông thường những nguồn chất thải từ chăn nuôi gia súc, gia cầm chỉ được thu dọn sơ sài không xử lý triệt để gây ô nhiễm nguồn nước, không khí là môi trường sống của chúng ta Hầu hết những trang trại chăn nuôi người ta chưa quan tâm đúng mức đến vấn đề xử lý chất thải do quá trình chăn nuôi tạo ra Điều này gây thiệt hại lớn về kinh tế và đe doạ sức khoẻ dân cư, là nguyên nhân phát sinh nhiều dịch bệnh nguy hiểm ở gia súc, gia cầm cũng như ở người (sốt xuất huyết, viêm não nhật bản, cúm do virut …) [8]

Thành phần trong chất thải chăn nuôi có chứa nhiều hợp chất hữu cơ như tinh bột, cellulose, protein… [25] Đây là nguồn hữu cơ phong phú nếu được đem xử lý và tái sử dụng phục vụ sản xuất nông nghiệp Như vậy, vừa

có giá trị kinh tế mà quan trọng hơn là giảm thiểu được nguy cơ gây ô nhiễm môi trường

Hiện nay, có nhiều phương pháp xử lý chất thải chăn nuôi như phương pháp ủ hoai mục thông thường, công nghệ biogas, sử dụng làm phân bón, … [25] Nhưng các phương pháp này thường cần phải có kinh phí đầu tư cao, yêu cầu kỹ thuật, mất nhiều thời gian xử lý cho nên chưa thực sự tiện dụng với bà con nông dân Sử dụng phương pháp sinh học để xử lý môi trường đang ngày càng trở nên phổ biến bởi những ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, có thể kết hợp với những biện pháp khác để nâng cao hiệu

quả xử lý Từ thực tiễn đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập một số

chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh

- Nghiên cứu được đặc điểm sinh học, khả năng sinh enzyme ngoại bào

để làm cơ sở cho việc sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn tại Thái Nguyên

có khả năng sinh enzyme ngoại bào

- Bổ sung cơ sở dữ liệu về nghiên cứu xạ khuẩn

- Bổ sung thêm dữ liệu về khả năng sử dụng xạ khuẩn trong xử lý chất thải chăn nuôi

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Xác định được các chủng xạ khuẩn phân giải chất thải trong chăn nuôi ứng dụng vào thực tế sản xuất chế phẩm vi sinh nhằm làm đơn giản và rút ngắn quá trình phân giải chất thải chăn nuôi

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2 Tổng quan về chất thải chăn nuôi

2.2.1 Đặc điểm của chất thải chăn nuôi

Chăn nuôi được xác định là một trong những ngành sản xuất tạo ra một lượng chất thải nhiều nhất ra môi trường Chất thải chăn nuôi là một tập hợp phong phú bao gồm các chất ở tất cả các dạng rắn, lỏng hay khí phát sinh trong quá trình chăn nuôi, lưu trữ, chế biến hay sử dụng chất thải [15]

Các chất thải chăn nuôi được phát sinh chủ yếu từ [15]:

- Chất thải của bản thân gia súc, gia cầm như: phân, nước tiểu, lông, vảy da và các phủ tạng loại thải của gia súc, gia cầm

- Nước thải từ quá trình tắm gia súc, rửa chuồng hay rửa dụng cụ và thiết bị chăn nuôi, nước làm mát hay từ các hệ thống dịch vụ chăn nuôi

- Thức ăn thừa, các vật dụng chăn nuôi, thú y bị loại ra trong quá trình chăn nuôi

2.2.1.1 Chất thải chăn nuôi rắn [15]

- Chất thải rắn: là hỗn hợp các chất hữu cơ, vô cơ, vi sinh vật và trứng

ký sinh trùng có thể gây bệnh cho người và gia súc Chất thải rắn gồm phân, thức ăn thừa của gia súc, gia cầm vật liệu lót chuồng, xác súc vật chết Chất

thải rắn có độ ẩm từ 56 - 83% tùy theo phân của các loài gia súc, gia cầm khác nhau và có tỉ lệ chất hữu cơ cao

+ Xác súc vật chết do bệnh, do bị dẫm đạp, đè chết, do sốc nhiệt, cần được thu gom và xử lý triệt để

+ Thức ăn dư thừa và vật liệu lót chuồng có thành phần đa dạng gồm cám, bột ngũ cốc, bột cá, bột tôm, khoáng, chất bổ sung, các loại kháng sinh, rau xanh, cỏ, rơm rạ, bao bố, vải vụn, gỗ…

+ Phân là sản phẩm loại thải của quá trình tiêu hóa thức ăn của gia súc, gia cầm bị bài tiết ra ngoài qua đường tiêu hóa Chính vì vậy phân gia súc là sản phẩm dinh dưỡng tốt cho cây trồng hay các loại sinh vật khác như cá, giun Thành phần hoá học của phân bao gồm: Các chất hữu cơ (protein, carbonhydrate, chất béo và các sản phẩm trao đổi của chúng), các chất vô cơ (khoáng đa lượng, vi lượng), nước (chiếm 65 – 80% khối lượng của phân), các men tiêu hóa của vật nuôi, các mô và chất nhờn tróc ra từ niêm mạc đường tiêu hoá, các yếu tố gây bệnh như các vi khuẩn hay ký sinh trùng bị nhiễm trong đường tiêu hoá gia súc hay trong thức ăn Do hàm lượng nước cao, giàu chất hữu cơ cho nên phân là môi trường tốt cho các vi sinh vật phát triển nhanh chóng và phân hủy các chất hữu cơ tạo nên các sản phẩm có thể gây độc cho con người và các sinh vật khác

Thành phần các chất trong phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần dưỡng chất của thức ăn và nước uống, độ tuổi của vật nuôi Mỗi độ tuổi

có khả năng tiêu hóa và nhu cầu cá thể khác nhau

Bảng 2.1 Thành phần các chất vô cơ (%) của một số loại vật [28] Loại

Lợn 82,0 0,80 0,41 0,26 0,09 0,10 Trâu bò 83,1 0,29 0,17 1,00 0,35 0,13 Ngựa 75,7 0,44 0,35 0,35 0,15 0,12

Gà 56,0 1,63 1,54 0,85 2,40 0,74 Vịt 56,0 1,00 1,40 0,62 1,70 0,35

Theo Cục Chăn nuôi năm 2011 [4], ở nông thôn Việt Nam có khoảng 8.5 triệu hộ chăn nuôi với gần 6 triệu con bò, gần 3 triệu con trâu, 27 triệu con lợn, 300 triệu con gia cầm Lượng chất thải do chăn nuôi gia súc, gia cầm

trong một số năm gần đây được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Khối lượng chất thải rắn chăn nuôi ở Việt Nam [4]

vật nuôi

Tổng số đầu con (triệu con) Bình quân CTR

(kg/ngày/

mỗi con)

Tổng chất thải rắn (triệu tấn/năm)

2.2.1.2 Chất thải chăn nuôi lỏng

Chất thải chăn nuôi lỏng bao gồm: nước tiểu, nước rửa chuồng, tắm rửa gia súc, vệ sinh lò mổ Nước tiểu là chất lỏng được thải ra sau quá trình trao đổi chất sinh vật; các chất dinh dưỡng trong thức ăn trải qua quá trình tiêu hóa được hấp thụ và hòa tan vào máu, sau quá trình trao đổi chất phân và nước tiểu được bài tiết ra ngoài Thành phần của nước tiểu gia súc tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng và khí hậu Đặc tính chung của nước tiểu gia súc là loại phân bón giàu đạm và kali, hàm lượng lân ít hoặc không đáng kể [1], [2]

Trong nước thải, hợp chất hữu cơ chiếm 70 - 80% gồm cellulose, protein, acid amin, chất béo, hydrat carbon và các dẫn xuất của chúng Hầu hết các chất hữu cơ dễ phân hủy, các chất vô cơ chiếm 20 - 30% gồm cát, đất, muối, urê, muối clorua Quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong điều kiện

hiếu khí sẽ cho các sản phẩm CO2, H2O, NO2-, NO3-, trong quá trình kị khí là

và khí hậu nước ta và có thể tồn tại được 2 - 5 tháng Nhiều loại mầm bệnh có

khả năng xâm nhập vào mạch nước ngầm như: Salmonella, E coli [13]

2.2.2 Tình hình ô nhiễm môi trường do chất thải chăn nuôi ở Việt Nam

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê Cục Chăn nuôi hiện trạng ô nhiễm

do chăn nuôi gây ra đang ngày một gia tăng ở mức báo động [7] Chỉ tính riêng năm 2007, lượng chất thải do chăn nuôi gây ra ở nước ta như sau:

Bảng 2.4 Ước tính chất thải rắn chăn nuôi trong năm 2007 [7]

STT Loại vật nuôi ĐVT

Tổng số đầu vật nuôi (triệu con)

Chất thải rắn bình quân (kg/con/ngày)

Tổng chất thải rắn/năm (triệu tấn)

Ước tính, hơn 61 triệu tấn phân các loại vật nuôi được thải ra trong năm

2007 nhưng chỉ khoảng 40% số chất thải này được xử lý, còn lại thường được

xả thẳng trực tiếp ra môi trường Số chất thải không được xử lý và tái sử dụng lại chính là nguồn cung cấp phần lớn các khí nhà kính (chủ yếu là CO2, N20) làm trái đất nóng lên, ngoài ra còn làm rối loạn độ phì đất, nhiễm kim loại nặng, ô nhiễm đất, gây phì dưỡng và ô nhiễm nước Chưa kể nguồn khí thải

CO2 phát tán do hơi thở của vật nuôi (ước chừng 2,8 tỷ tấn/năm/tổng đàn gia súc thế giới)

Theo kết quả điều tra của Cục Chăn nuôi năm 2006 [7] về chăn nuôi lợn

ở 8 vùng sinh thái thì số gia trại, trang trại chăn nuôi lợn có áp dụng các biện pháp xử lý chất thải chiếm khoảng 74%, còn lại không xử lý chiếm khoảng 26%; trong các hộ, các cơ sở có xử lý thì 64% áp dụng phương pháp sinh học (Biogas, ủ v.v ), số còn lại 36% xử lý bằng phương pháp khác Chăn nuôi nước ta thời gian qua chủ yếu vẫn là phân tán nhỏ lẻ, quy mô hộ gia đình ở các vùng nông thôn Đa phần các hộ chăn nuôi chưa có biện pháp xử lý chất thải mà đổ trực tiếp ra môi trường, sông suối, ao hồ

Ô nhiễm do chăn nuôi không chỉ làm hôi tanh không khí mà còn ảnh hưởng nặng tới môi trường sống dân cư, nguồn nước và tài nguyên đất và ảnh hưởng chính đến kết quả sản xuất chăn nuôi Các hoạt động gây ô nhiễm do chăn nuôi vẫn đang tiếp tục diễn ra ở nhiều nơi trên cả nước Tình trạng chăn nuôi thả rông, chăn thả trên đất dốc, đầu nguồn nước còn khá phổ biến đã góp phần làm tăng diện tích đất xói mòn, suy giảm chất lượng đất, nước, giảm thiểu khả năng sản xuất nông nghiệp trên vùng rộng lớn

Ô nhiễm môi trường còn làm phát sinh dịch bệnh, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chăn nuôi Một số loại bệnh dịch nghiêm trọng như lở mồm long móng, dịch cúm gia cầm H5N1, bệnh tai xanh Diễn biến của các dịch bệnh khá phức tạp, khó kiểm soát Dịch bệnh đã gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi, gây mất an toàn thực phẩm và còn có nguy cơ lây nhiễm sang người rất nguy hiểm như bệnh cúm gia cầm

2.2.3 Khả năng gây ô nhiễm của chất thải chăn nuôi

Hiện nay, do còn nhiều hộ, trang trại chăn nuôi hàng ngày thải ra một lượng lớn chất thải không được xử lý và đổ trực tiếp vào hệ thống thoát nước, kênh mương làm nhiều hộ dân không có nước sinh hoạt (nước giếng trong vùng có váng, mùi hôi tanh), tỷ lệ người dân bị mắc bệnh tiêu chảy, mẩn ngứa

và ghẻ lở cao Trong chất thải chăn nuôi luôn tồn tại một lượng lớn vi sinh vật hoại sinh Ô nhiễm do chất thải chăn nuôi không chỉ ảnh hưởng nặng tới môi trường sống dân cư mà còn gây ô nhiễm nguồn nước, môi trường không khí, tài nguyên đất và ảnh hưởng lớn đến kết quả sản xuất chăn nuôi Chất thải chăn nuôi khi chưa xử lý mang đi sử dụng cho trồng trọt như tưới, bón cho cây rau, củ, quả sau đó các sản phẩm này dùng làm thức ăn cho người và động vật là không hợp lý Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng tồn tại của mầm bệnh trong đất, cây, cỏ có thể gây bệnh cho người và gia súc, đặc biệt là các bệnh về đường ruột như thương hàn, phó thương hàn, viêm gan, giun đũa, sán lá [15]

Các hoạt động gây ô nhiễm do chăn nuôi vẫn đang tiếp tục diễn ra ở nhiều nơi trên cả nước Tình trạng chăn nuôi thả rông, chăn thả trên đất dốc, đầu nguồn nước còn khá phổ biến đã làm tăng diện tích đất xói mòn, suy giảm

chất lượng nước, giảm thiểu khả năng sản xuất nông nghiệp trên vùng rộng lớn Ô nhiễm môi trường còn làm phát sinh dịch bệnh, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chăn nuôi Trong mười năm qua, từ 1997 đến nay, dịch lở mồm, long móng trên gia súc đã diễn ra thường xuyên và đến nay chưa được khống chế triệt để Từ cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm đã bùng phát Từ năm 2003 đến nay, dịch đã tái phát 5 đợt, đã phải tiêu huỷ trên 51 triệu gia cầm các loại, thiệt hại ước tính lên đến hàng ngàn tỷ đồng [17]

Từ đầu năm 2007 đã bùng phát hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (bệnh tai xanh) trên lợn, gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi, gây mất an toàn thực phẩm và còn có nguy cơ lây nhiễm sang người, nguy hiểm không kém bệnh cúm gia cầm, bệnh lở mồm long móng [9]

Rõ ràng ngành chăn nuôi phát triển nếu không đi kèm với các biện pháp

xử lý chất thải sẽ làm môi trường sống của con người xuống cấp nhanh chóng Môi trường bị ô nhiễm lại tác động trực tiếp vào sức khoẻ vật nuôi, phát sinh dịch bệnh, gây khó khăn trong công tác quản lý dịch bệnh, giảm năng suất không thể phát triển bền vững

Tuy nhiên phân gia cầm và gia súc vẫn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tận dụng do hàm lượng các chất dinh dưỡng trong phân khá cao Nếu không được quản lý và sử dụng đúng đắn, chất thải chăn nuôi là nguồn gây tiêu tốn cho các cơ sở chăn nuôi, ngược lại nếu được tận dụng đúng cách nó lại trở thành nguồn tài nguyên

2.3 Xạ khuẩn

2.3.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc ngành Tenericutes (gồm có vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, dưới lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm

10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm xạ

khuẩn hiếm Xạ khuẩn mang đặc điểm như sau: có cấu tạo đơn bào và đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu

hạch, vách tế bào không chứa cellulose hoặc kitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), sống hoại sinh và ký sinh [16], [32], [12]

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật rất đa dạng phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầu hết các môi trường: đất, nước, không khí

Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác và khả năng che phủ của thảm thực vật Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớp đất tơi, xốp, có độ

ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khoáng Số lượng xạ khuẩn có thể đạt khoảng 29.000 - 24.000.000 CFU (Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm, độ

pH của môi trường Xạ khuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có pH khoảng 6,8 – 7,5 Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp xạ khuẩn và càng hiếm gặp hơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 45oC và pH trung tính là điều kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển Vi sinh vật ưa nhiệt sinh trưởng tốt nhất là khoảng 33

- 65oC và vi sinh vật ưa lạnh có thể sinh trưởng ở 0oC, sinh trưởng tốt nhất ở

15oC hay thấp hơn, nhiệt độ cao nhất chỉ khoảng 20oC Độ ẩm thích hợp từ 40

- 55% Xạ khuẩn thường sống trong đất có nồng độ muối NaCl (0,5-1 g/l) [10], [30], [36]

2.3.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

2.3.2.1 Đặc điểm hình thái

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết dính với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám, Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm quan trọng để ta có thể phân loại chúng Đường kính sợi của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5µm Có hai loại sợi khác nhau: Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại rất dễ tách toàn

bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường [10] [34]

Hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ) Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 - 2mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1cm hoặc lớn hơn nữa, đường kính khuẩn lạc thường lớn gấp 10 lần đường kính của khuẩn ty Khuẩn lạc thường

có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, không trơn ướt hay trong suốt như của vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, xù xì có dạng vôi với nhiều màu sắc khác nhau và có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ bám vào thạch [10], [11], [12]

2.3.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối nitrat, muối amon, ure, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay chủng khác nhau Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm, một số

ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 25 – 45oC Độ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 – 55%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 – 7,5 Xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme và các chất kháng sinh nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống [6], [18], [19]

Ngoài ra, xạ khuẩn có hệ enzyme vô cùng phong phú Chúng có khả năng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axit humic trong đất đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng xạ khuẩn phải có khả năng sinh những hệ enzyme tương ứng trong quá trình sống Xạ khuẩn còn sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như một số vitamin nhóm B, một số axit hữu cơ như các axit lactic, axit axetic, axit sucxinic… các axit amin như axit glutamic, metionin, alanin, valin chất kích thích sinh trưởng và sắc tố melanin [45]

Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh, độc tố, enzyme… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào hay được tiết ra môi trường nuôi cấy KTCC có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [10], [46]

2.3.2.3 Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự các vi khuẩn G+ Dưới kính hiển

vi điện tử có thể thấy rõ các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, dày khoảng

10 - 20nm, gồm có 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120Ao, lớp giữa dày khoảng 50Ao, lớp trong dày khoảng 50Ao Thành tế bào có tác dụng duy trì hình dạng khuẩn ty và bảo vệ tế bào Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào Màng tế bào chất dày khoảng 50nm và có cấu trúc tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn, vách

tế bào không chứa cellulose hoặc kitin, giống với vi khuẩn Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể và nhân không có màng rõ rệt [10]

Khuẩn ty:

- Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn có đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 - 1µm đến 2 - 3µm, chiều dài có thể đạt tới 1cm [13] Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30µm một nhánh Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển là 11µm [47]

- Khuẩn ty xạ khuẩn bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành

bó gọi là ty thể Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy [41]

- Trên môi trường cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản Một số xạ khuẩn không chỉ có sợi khí sinh mà có sợi cơ chất, làm cho bề mặt

xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền Loại chỉ có sợi khí sinh thì

ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường [34] [10]

tổ ong Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh, độc

tố, enzyme có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường lên men Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen có sắc tố chỉ tan trong nước

có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [11]

2.3.3 Bào tử và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh ( gọi là cuống sinh bào tử) Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 – 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử cũng có khi chỉ có một hoặc hai bào tử (chi

Saccharomonosprora, chi Microbispora) Hình thái, cuống sinh bào tử và bào

tử là đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn Một số trường hợp

do chịu tác động cơ học hệ sợi của xạ khuẩn có thể bị đứt thành những đoạn ngắn giống như bào tử nếu gặp điều kiện thuận lợi cũng có thể phát triển thành cơ thể mới [10]

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau như: thẳng, lượn sóng thẳng, lượn sóng, vòng hở có móc hoặc xoắn Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que, với mép nhẵn hoặc

xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông

Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysacharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400 Ao chia làm 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH Hình dạng cấu trúc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [6]

2.3.4 Phân loại xạ khuẩn

Phương pháp phân loại truyền thống [10]:

Phân loại theo phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào những đặc điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được kết hợp để định danh xạ khuẩn một cách chính xác tên loài Các đặc điểm sinh

lý sinh hóa thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ khả năng sinh enzyme Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với các chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh

Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do vậy, ngày nay những nguyên tắc trong việc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại xạ khuẩn có sự thay đổi

Ngày nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nghiên cứu phân loại vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng nhưng không có phương pháp nào tỏ ra vạn năng, thích hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật Vì vậy để đảm bảo chính xác cần phải sử dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau, trong đó đặc biệt quan tâm đến các phương pháp phân loại mới khi phân loại vi sinh vật

Phân loại theo phương pháp hiện đại

Trong một số trường hợp, phương pháp phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số các đặc tính dùng cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại không

có ý nghĩa với các nhóm vi sinh vật khác Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Mặt khác đối với loài có

độ tương đồng cao về mặt hình thái thì phương pháp truyền thống sẽ khó đạt hiệu quả Nhược điểm này của phân loại truyền thống có thể bổ sung nhờ phương pháp sinh học phân tử Ngày nay, phần lớn các nhà khoa học đều thống nhất rằng, phân loại học phải dựa vào rất nhiều tiêu chí phân loại kết hợp cả phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại hiện đại, trong

đó nhấn mạnh vai trò của phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử [35]

Hiện nay phân loại xạ khuẩn được tiến hành dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với các đặc điểm khác theo phân loại cổ truyền Các nhà phân loại học thường lấy ngưỡng 98% trong độ tương đồng về trình tự 16S rRNA để phân biệt hai loài khác nhau Bên cạnh đó, phép lai DNA genome cũng thường được tiến hành như một thí nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại tới mức độ loài Hai chủng xạ khuẩn được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng có mức độ tương đồng về DNA genome thấp hơn 70% Dựa trên mức độ tương đồng về trình tự 16S rRNA người ta có thể dựng cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) thể hiện mối tương quan của loài đang tiến hành nghiên cứu với các loài có họ hàng gần và tổ tiên của chúng Đa số trường hợp, các phân tích về hóa phân loại và sinh lý, sinh hóa

có sự tương đồng cao so với phân loại theo trình tự 16S rRNA [31]

Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu nên được ưu tiên lựa chọn trong phân loại prokaryotes Thêm vào đó, trên gen 16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi - conserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, loài [33] Do vậy, gen 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng

và đã thiết lập được rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật PCR Ngoài ra, người ta còn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rRNA và 23S rRNA để nghiên cứu đa dạng của prokaryotes [38], [40]

2.3.5 Enzyme ngoại bào phổ biến từ xạ khuẩn

Vi sinh vật sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi Vi sinh vật có hệ enzyme đa dạng và phong phú Tuy nhiên không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau, ngay cả những chủng cùng một loài cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme [24] Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn là cần thiết

Một số enzyme phổ biến

Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhưng cũng chỉ các enzyme thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau đó là các enzyme amylase, cellulase và protease Lượng enzyme sản xuất hàng năm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease từ nấm mốc

là 10 tấn/năm, pectinase là 10 tấn/năm [22] Các enzyme này có nhiều ứng dụng trong nông nhiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn các enzyme được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới

- Enzyme amylase: Amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật, thực vật, vi sinh vật Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo [24] Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế khác Các enzyme amylase này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột Mặc

dù amylase được sản xuất chủ yếu từ nguồn nấm mốc và vi khuẩn, tuy nhiên việc sử dụng xạ khuẩn để sản xuất enzyme gần đây cũng được quan tâm nghiên cứu Nhìn chung, trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít như loài xạ khuẩn ưa nhiệt

Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ amylase hoạt

động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác [43]

- Enzyme cellulase: Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân cellulase ngày càng được quan tâm Sự quan tâm này là do các enzyme cellulase có

khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phầm giàu năng lượng khác

Trong cấu trúc của cellulose chủ yếu là liên kết β-(1-4) glucoside Tuy nhiên, việc thủy phân cellulose cần tới một hệ enzyme bao gồm các cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt Chính vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu

đề cập đến việc sản xuất các chế phẩm bao gồm một số enzyme để xử lý phế thải là các polysaccharide thực vật [24]

- Enzyme protease: Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptide tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ Chính vì tính chất này mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để

xử lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối [24]

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Gồm các chủng xạ khuẩn phân lập được từ 6 mẫu đất, phân ủ hoai mục được thu thập tại khu vực Trường Đại học Nông Lâm và địa bàn Thành phố Thái Nguyên

- Sử dụng các chủng vi sinh vật kiểm định là: Escherichia coli,

Salmonella sp do Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Trình tự cặp mồi được sử dụng để nhân đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn T1 và T4:

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi trong phản ứng PCR Tên đoạn

Ghi chú: Cặp mồi 341F (mồi xuôi) và 907R (mồi ngược) do hãng Alpha

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ 7/12/2013 đến 07/06/2014

- Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Viện khoa

học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3 Bình tam giác, các loại cốc đong Đức

Bảng 3.3 Thiết bị thí nghiệm

Nồi khử trùng ướt Sturdy – Tawain

Tủ sấy khô Sellab – Mỹ

Tủ ấm ổn nhiệt Sellab – Mỹ

Tủ lạnh Sanyo – Hàn Quốc

Tủ lạnh sâu 4oC Sanyo – Hàn Quốc

Máy đo pH Hana - Italia

Máy khuấy từ IKA – Đức

Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 Euroclone S.pa - Bio Air Division - Italia Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản

Cân phân tích Shinko – Nhật Bản

Lò vi sóng Daewoo – Hàn Quốc

Máy lắc ổn nhiệt Sellab – Mỹ

3.3.3 Môi trường nghiên cứu

Môi trường dinh dưỡng được sử dụng để phân lập, nuôi cấy, và thử các hoạt tính hoá lý của các chủng vi sinh vật được sử dụng trong báo cáo: Gause, môi trường cellulose, môi trường casein, môi trường tinh bột, môi trường ISP1, môi trường ISP9, môi trường MPA Thành phần các môi trường được

trình bày chi tiết trong phần phụ lục

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng

sinh enzyme ngoại bào mạnh

- Nội dung 2: Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý –

sinh hóa và phân loại của một số chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn được

- Nội dung 3: Kiểm tra đặc tính kháng một số loại vi sinh vật gây bệnh

của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được

- Nội dung 4: Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử các chủng

xạ khuẩn tuyển chọn được

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu

Thu thập mẫu đất và mẫu phân ủ hoai mục tại khu vực Trường Đại học Nông Lâm và Thành phố Thái Nguyên để sử dụng phân lập xạ khuẩn Mẫu thí nghiệm cần phải được lấy theo nguyên tắc ngẫu nhiên, nên khi tiến hành lấy mẫu ta lấy ở các vị trí, độ sâu khác nhau sau đó trộn đều với nhau Khối lượng cần thu thập của mỗi mẫu khoảng 50g, đem chứa vào các túi nilon đã khử trùng và ghi nhãn cẩn thận những thông tin cần thiết: tên mẫu, ký hiệu, ngày lấy, địa điểm lấy mẫu, người lấy Mẫu lấy về được phân lập ngay hoặc bảo quản lạnh ở 0 - 4oC trong 24 giờ

3.5.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn

Phân lập và tuyển chọn theo phương pháp của Vinogradski [14]: Tiến hành pha loãng mẫu: cân 10g mẫu cho vào 90 ml nước muối sinh lý lắc đều đến khi thu được dung dịch đồng nhất (nồng độ pha loãng 10-1

), tiếp tục dùng pipet hút 10ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1 vào 90ml nước muối sinh lý ta được nồng độ pha loãng 10-2

Tiến hành tương tự ta thu được các nồng độ pha loãng tiếp theo 10-3,10-4,10-5

Chuẩn bị môi trường Gause, hấp khử trùng ở 121oC(1atm) trong 30 phút sau đó đổ ra các đĩa petri trong box cấy vô trùng; đến khi môi trường đông lại thì đem ra để ở điều kiện bình thường 1 ngày nhằm loại bỏ các đĩa bị tạp nhiễm Lấy lần lượt 100µl mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-5 nhỏ vào trong đĩa thạch Gause đã chuẩn bị, dùng que chang vô trùng chang đều đến khi bề mặt thạch khô Sau đó đem nuôi ở tủ nuôi 28oC - 30oC trong vòng 5 - 7 ngày bỏ ra quan sát nhận diện khuẩn lạc thông qua màu sắc, hình dạng, kích thước Từ những khuẩn lạc đó cấy chuyển sang đĩa petri mới bằng phương pháp cấy ria để tạo ra dòng thuần