Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân giống hoa lan hồ điệp phalaenopsis sp từ phát hoa bằng kỹ thuật in vitro

NGUYỄN NGỌC DOAN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG, NỒNG ĐỘ CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG HOA LAN HỒ ĐIỆP Phalaenopsis sp...

NGUYỄN NGỌC DOAN

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG, NỒNG ĐỘ CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) TỪ

PHÁT HOA BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2010 - 2014

NGUYỄN NGỌC DOAN

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG, NỒNG ĐỘ CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) TỪ

PHÁT HOA BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Tình

Khoa CNSH - CNTP , ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt

nghiệp em đã thực hiện đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường,

nồng độ chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả

năng nhân giống hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp từ phát hoa bằng kỹ thuật in vitro”

Qua 6 tháng thực tập tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài

Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em

trong thời gian thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ks Lã Văn Hiền đã chỉ bảo trong thời

gian en thực tập trên phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Do trình độ và thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Doan

Trang

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 20 ngày nuôi cấy) 26 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 20 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng KT, CR đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 35

phát hoa lan Hồ Điệp (sau 20 ngày nuôi cấy) 27 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 20 ngày nuôi cấy) 28 Hình 4.3 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 30 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hưởng của hàm lượng KT, CR đến khả năng tạo chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 34 Hình 4.6 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của hoa lan Hồ

Điệp (sau 60 ngày nuôi cấy) 36

MS : Murashige & Skoog’s

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Phân loại 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp 5

2.1.4 Điều kiện trồng lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp 8

2.1.4.1 Giá thể 8

2.1.4.2 Nhiệt độ 9

2.1.4.3 Ánh sáng 9

2.1.4.4 Nước tưới 9

2.1.4.5 Phân bón 10

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.1 Khái niệm 10

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào 11

2.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 11

2.2.3 Sự phát triển của mẫu điều khiển bởi yếu tố môi trường 12

2.3 Tình hình nghiên cứu về lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp trên thế giới và ở Việt Nam 17

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống lan Hồ Điệp ở Việt Nam 18

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 19

3.3.2 Thiết bị 19

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Cách bố trí thí ngiệm 20

3.5.2 Chỉ tiêu theo dõi 25

3.6 Xử lý số liệu 25

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp (sau 20 ngày nuôi cấy) 26

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ ĐiệpPhalaenopsis sp (sau 20 ngày nuôi cấy) 26

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ ĐiệpPhalaenopsis sp (sau 20 ngày nuôi cấy) 26

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp (sau 60 ngày nuôi cấy) 29

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp (sau 60 ngày nuôi cấy) 29

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp (sau 60 ngày nuôi cấy) 31

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp (sau 60 ngày nuôi cấy) 35

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp là một trong những giống lan rất được

yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã, không những thế hoa lan Hồ Điệp lại rất lâu tàn Chính vì vậy, nó đã nhanh chóng trở thành sản phẩm trồng trọt mang lại hiệu quả kinh

tế cao không chỉ ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ… [4],[7]

Hồ Điệp là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm [10] Để có được số lượng lớn cây giống, đồng đều

đáp ứng nhu cầu thị trường thật nan giải Trong những năm gần đây, công

nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm cho tỷ lệ nẩy mầm cao, tạo nên sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ Tuy nhiên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt mang tính ngẫu nhiên thu được cây có tính trạng yêu thích hay không và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa

Hồ Điệp có chứa các mắt ngủ phần gốc, có bề mặt nhẵn bóng dễ khử trùng, tỷ

lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng cây ổn định về di truyền

Để giải quyết khó khăn về giống trong thực tế sản xuất, kích thích sản

xuất hoa lan Hồ Điệp phát triển chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, nồng độ chất kích thích sinh

trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân giống hoa lan Hồ

Điệp Phalaenopsis sp từ phát hoa bằng kỹ thuật in vitro”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nhân nhanh được giống lan Hồ Điệp và tìm ra môi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên thích hợp nâng cao khả

năng tái sinh, nhân nhanh và ra rễ từ phát hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp

1.3 Yêu cầu nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của môi trường và chất kích thích sinh

trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp

- Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự

nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi của hoa lan Hồ Điệp bằng kỹ thuật in

vitro

- Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra

rễ của hoa lan Hồ Điệp bằng kỹ thuật in vitro

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống

hoa lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Các họ lan được đánh giá là các loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm Do đó chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải từ xích đạo đến bắc cực, từ đồng bằng tới các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác nhau Các loài lan chủ yếu sống trên cây cao sống biểu sinh lâu năm chúng được gọi chung là phong lan Các loài mọc trong đất gọi là địa lan và một số loài mọc trên núi đá gọi là thạch lan [3]

Hồ Điệp Phalaenopsis sp có tên từ chữ Hy Lạp Phalaim – bướm và

Opsis - giống, đa số loài của chi có hoa giống như con bướm

Lan Hồ Điệp là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dày có ẩm độ cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá, hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở

vùng ven biển Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp ít thích hợp với nắng hơn so

với những loại phong lan có giả hành Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng

và phát triển là 15 – 38ºC và giống này thường sống ở cao độ 200 m – 400 m [3]

Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp là một trong những loại phong lan được

trồng phổ biến trên thế giới Hồ Điệp, được mệnh danh là hoàng hậu của các loài phong lan, được phát hiện đầu tiên năm 1750, đến năm 1852 dùng từ Blume để định danh Đến nay đã phát hiện được hơn 70 loài Lan Hồ Điệp trồng thương phẩm đều là giống lai [15]

Hiện nay có nhiều chi lan khác nhau được lai với Phalaenopsis và lai

ngay trong cùng một chi, tạo ra 40.000 loài lai [13], chi lan Hồ Điệp có thể chia ra thanh 5 nhóm trong đó có 2 nhóm quan trọng đó là:

Nhóm Euphalaenopsis: chúng có đặc điểm nổi bật là cánh hoa dài và

rộng hơn lá đài, cánh môi rộng và có hai phụ bộ riêng rẽ ở phía trước, bộ lá thường có màu lục đậm hơn ở mặt trên sẫm ở mặt dưới, hoa nhiều và mảnh

mai, một vài loài tiêu biểu: phalaenopsis amabilis, P.philippinensis,

P.schilleriana

Nhóm Stauroglottis chúng có đặc điểm khác biệt như sau: lá dài và

cánh hoa cùng một cỡ, cánh môi hẹp và không có bộ phụ ở phía trước, bộ lá

có màu xanh lục nhạt ở cả hai mặt trên và dưới lá, hoa nhỏ hơn và cánh dày hơn thường có màu hoa văn, một vài loài tiêu biểu là P.giganatea theo Phạm

Hoàng Hộ, Việt Nam có 7 loài Phalaenopsis [5]:

P.amabilis (L) P.cornucervi, P.lobbi, P.gibbosa, P.mannii Reichbf, P.petelotii Mansf P.fuscata Reichhf

2.1.2 Phân loại

Theo hệ thống thực vật học mới nhất về cây hoa Lan được phân loại như sau [3]:

Giới (Kingdom): Plantae (thực vật)

Ngành (Division): Magnoliophyta (Ngọc lan)

Bộ (Order): Orchidales

Họ phụ (subfamily): Epidendroideae

Tông phụ (subtribe): Aeriadae

Nhóm (Alliance): Phalaenopsis

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp

Hồ Điệp Phalaenopsis sp là cây đơn thân nhưng rất ngắn, có lá mọc

khít nhau nên không có lóng, lá tương đối dày và mập, thường rộng ở phần trên, hẹp ở phần dưới, phát hoa ở nách lá, thường hay đứng có thể phân nhánh, hoa nhỏ hay khá to, mỗi hoa bền khoảng 2 – 3 tháng Vì vậy, cành hoa

nở liên tiếp hơn nửa năm, lá đài và cánh hoa gần như nhau, đôi khi cánh hoa lớn hơn nhưng nổi bật là cánh môi Môi gắn vào chân của trụ và không có cựa

ở đáy, ba thùy với phụ bộ hay cục u ở đáy thùy giữa, hay thùy bên, một trong

những bộ phận ấy là hai sợi râu của môi hay phiến nhỏ dựng đứng ở thùy môi Trụ tương đối dài và nhỏ, hai khối phấn tròn hay hình trứng, vĩ phấn kéo dài và rộng ở phần trên và hẹp ở phần dưới, gót dẹp, nhiều loài thường cho cây con trên cọng phát hoa và nhiều loài cho vân màu trên lá [2]

Rễ: Hệ rễ của lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp không phân chia thành rễ

chính, rễ phụ, rễ nhánh, lông hút rõ ràng mà rễ của lan Hồ Điệp thường có dạng hình tròn, to, mập, có nhánh hoặc không phân nhánh Rễ thường có màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu vàng trắng hoặc màu đỏ tối Rễ của lan Hồ

Điệp thường mọc tràn ra ngoài chậu, buông lơ lửng ra không khí, có lợi cho

việc hút O2 và nước Có những nghiên cứu cho thấy rễ cây thuộc nhóm phong lan cũng có khả năng quang hợp [15]

Phần rễ trên thường sống cộng sinh với nấm, do hạt của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không được cung cấp đủ dinh dưỡng khi nảy mầm, trong điều kiện nảy mầm tự nhiên, cần dựa vào các mầm sống cộng

sinh để hút chất dinh dưỡng Trong quá trình sinh trưởng của cây, các loài nấm này sống cộng sinh tại rễ lan để tương trợ cho nhau, vì thế rễ của hoa lan còn gọi là rễ nấm Việc tưới và bón phân cho hoa lan Hồ Điệp phải yêu cầu bón phân thật loãng, chính là vì trên rễ cây có nấm cộng sinh [15]

Thân: Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp thuộc loại lan đơn thân, tức là

thân của chúng rất ngắn không hề có giả hành, cũng không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt Lan đơn thân sinh trưởng rất chậm chạp, thân chính của nó trong môi trường thuận lợi hàng năm lại mọc ra các lá mới, chúng mọc theo hướng cao hơn theo phương thẳng đứng còn cành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc nảy ra

từ nách lá, lá mọc xếp thành hai hàng, xen kẽ nhau Theo sự sinh trưởng của cây, các lá già ở dưới gốc dần dần già héo và rụng đi, đến khi có chồi nách mọc ra nhưng thường không mọc dài ra được Vì cây lan rất khó ra chồi nhánh nên không dùng phương pháp tách cây để nhân giống Thân của lan Hồ

Điệp, ngoài tác dụng giữ cho cây thẳng đứng, còn có chức năng tích trữ chất

dinh dưỡng và nước cho cây [15],[2]

Lá: Lá của lan Hồ Điệp to dầy, đầy đặn, lá mọc đối xứng, ôm lấy thân cây Số lá trên thân cây thường không nhiều, thông thường 1 cây lan trưởng thành có từ 4 lá trở lên Trong nách lá có 2 chồi phụ, chồi phụ trên to hơn là chồi hoa sơ cấp, bên dưới là chồi dinh dưỡng sơ cấp Các chồi sơ cấp này sinh trưởng đến một mức độ nào đó thì bắt đầu đi vào giai đoạn ngủ nghỉ Màu sắc của lá gồm 3 loại: lá màu xanh; mặt trên lá và mặt dưới lá màu đỏ; mặt trên của lá đốm và mặt dưới lá màu đỏ Căn cứ vào màu sắc lá có thể phân biệt

được màu sắc hoa của chính nó, lá màu xanh thường ra hoa màu trắng hoặc

hoa nhạt màu, còn các lá màu khác thường cho hoa màu đỏ [2]

Lan Hồ Điệp để thích nghi với điều kiện sinh thái nguyên sinh, thông thường bề mặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá mới có

khí khổng Lan Hồ Điệp là loại thực vật CAM, giống như các thực vật CAM khác khí khổng mở ra vào ban đêm để thu nhận CO2 để tạo ra axit “Malic” dự trữ trong cơ thể, vào ban ngày CO2 được giải phóng, tham gia vào quá trình quang hợp Ưu điểm của loại thực vật này là khí khổng không mở ra vào ban ngày nên cây không bị mất nước, thoát hơi nước Điều kiện này đối với những cây không được cung cấp nước đầy đủ thường xuyên là rất có lợi Khi cây có

đủ nước thì khí khổng cũng có thể mở ra vào ban ngày hút khí CO2 để tiến hành quang hợp bình thường Nếu gặp phải điều kiện khô hạn nghiêm trọng thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quang hợp diễn ra chỉ vừa đủ cho lượng

CO2 tạo ra trong chu trình hô hấp Đây chính là nguyên nhân khiến cho lan

Hồ Điệp mặc dù không có giả hành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt [2]

Hoa: Cành hoa của lan Hồ Điệp mọc ra từ nách lá, thông thường đếm theo thứ tự từ trên xuống thì cành hoa bắt đầu mọc ra từ lá thứ 3 hoặc thứ 4 Các cành hoa có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh Hoa lan to thường ít phân nhánh còn lan hoa nhỏ phân nhánh rất rõ thậm chí một số giống hoa lan nhỏ có thể nở đến 200 bông hoa Cành hoa khi chưa phân hoá các đốt hoa thường ở dạng tiền chồi nách hoặc tiền chồi hoa, ở nhiệt độ dưới 15ºC và bị bấm ngọn có nảy thành chồi hoa, nhưng nếu nhiệt độ cao quá 28ºC thì chỉ có thể nảy thành chồi nách [15]

Đa số các giống hoa đơn cây chỉ ra một cành hoa, có một số giống khác

hoặc trong điều kiện tốt cho chồi hoa phân hoá có thể mọc ra 2 hoặc 3 cành hoa Nói chung, lan Hồ Điệp đơn cây nếu phân hoá số cành hoa cành nhiều hoặc cành nhánh càng nhiều do bị hạn chế về dinh dưỡng nên hoa nở ra thường nhỏ Để trồng được lan có bông hoa to đẹp, cần phải khống chế số bông trên một cành hoặc cắt bớt đi một số cành nhánh [15]

Để đánh giá và thưởng thức hoa, người ta thường dùng 2 khái niệm

"hoa đều đặn" hoặc "cực kỳ đều đặn" để hình dung Hoa đều đặn là chỉ hoa có cánh hoa đều to rộng, giữa các cánh hoa không có khe hở rất nhỏ, cánh môi trải xuống tạo dáng hình elíp, tất cả bông hoa tạo nên dáng hình tròn, còn loại

"cực kỳ đều đặn" là chỉ hoa có dáng rất tròn, các bên và cánh hoa chồng khít lên nhau, không có khe hở.Nếu giữa các cánh hoa có các khe hở hoặc khe hở khá lớn thì là "hoa không đều đặn" [15]

Quả và hạt: Hoa lan Hồ Điệp chỉ tạo quả qua thụ phấn nhân tạo hoặc thụ phấn nhờ côn trùng Vỏ quả có hình que, phát triển chậm thường qua 4 tháng mới chín và tách vỏ Số lượng hạt trong một quả khác nhau do sự khác nhau về cây bố, mẹ đem thụ phấn Những hạt của chúng thường rất nhỏ, có dạng bột, không có phôi nhũ, trong điều kiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây con, thường phải gieo hạt trong môi trường vô trùng thích hợp mới

có thể thu được cây con với số lượng lớn Khi gieo hạt trong điều kiện vô trùng, thường để thể tiền chồi (protcorm) nảy mầm thành cây [15]

2.1.4 Điều kiện trồng lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp

2.1.4.1 Giá thể

Giá thể của lan Hồ Điệp phải khá tơi xốp và thoáng khí, đồng thời phải

có khả năng giữ nước như gỗ mùn, than bùn khô, hạt đá nhỏ, rêu Dưới rễ của cây non lót một lớp rêu hoặc trồng cây lan non trực tiếp vào rêu Với những giá thể trồng khác nhau cũng phải có cách trồng và chăm sóc khác nhau đặc biệt là chế độ nước tưới, với những giá thể kém giữ nước thì phải tưới thường xuyên hơn gồm: Xơ dừa, vỏ cây, rong biển, dớn, than, vỏ sò [15]

Chậu trồng: Chậu trồng hoa lan Hồ Điệp là chậu không sâu, chậu nhỏ màu trắng và trong suốt, để có lợi cho hệ rễ của lan phát triển và quang hợp Căn cứ vào kích thước cây lớn nhỏ mà chọn chậu trồng thích hợp Cây non trồng trong chậu đường kính 8,3 cm; 3-6 tháng sau lớn thành cây trưởng

thành trồng sang chậu đường kính 12cm, tiếp tục trồng 4-6 tháng có thể tiến hành xử lý thúc ra hoa [15]

2.1.4.2 Nhiệt độ

Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp

để trồng lan Hồ Điệp tương đối cao Nhiệt độ thích hợp nhất để trồng ban

ngày là 25-28ºC, ban đêm là 18-20ºC, giai đoạn ươm cây con thì cần nhiệt độ ban đêm là 23ºC Nếu nhiệt độ nhà trồng thấp hơn 15ºC, rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng ngừng lại, thậm chí là bị lạnh hại làm cho rụng nụ và hoa hoặc khiến cho cánh hoa xuất hiện các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẻ đẹp của hoa Giai đoạn phân hoá hoa đòi hỏi phải có sự cách biệt khá cao về độ chênh lệch nhiệt độ ngày/đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là 25ºC, ban đêm 18-20ºC, kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hoá hoa [15]

2.1.4.3 Ánh sáng

Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó cần phải có biện pháp che sáng đồng thời tuỳ thuộc vào tuổi cây lớn nhỏ mà có biện pháp

điều chỉnh ánh sáng trồng cho thích hợp Thời kỳ ươm cây con nhu cầu về

ánh sáng có cường độ là 1000-1200 lux, giai đoạn bánh tẻ là 1200-2000 lux, giai đoạn thúc ra hoa là 2000-3000 lux Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và thu phải che đi 75-85% ánh sáng, cần phải có 2 lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn, chỉ cần che 40-50% ánh sáng là đủ [15]

2.1.4.4 Nước tưới

Các mùa khác nhau, lượng nước tưới cũng khác nhau Các giá thể trồng khác nhau thì lượng nước tưới cũng khác nhau Do lá của lan Hồ Điệp khá dày, lượng nước chứa trong lá khá nhiều nên lan Hồ Điệp chịu hạn tốt Mùa xuân độ ẩm không khí cao nên cách 3-7 ngày tưới nước một lần: mùa hè, thu,

nhiệt độ không khí cao, lượng nước bốc hơi mạnh, thông thường cách 1-2 ngày tưới đẫm nước một lần; còn mùa đông, nhiệt độ thấp, ẩm độ không khí cũng thấp, để đảm bảo những điều kiện nhất định về ẩm độ đồng thời tránh cho lá tích nước, nếu lá tích nước sẽ làm cho lá bị lạnh hại Vì thế thông thường vào lúc sau 10 giờ sáng và trước 15 giờ chiều thì tưới nước Nếu điều kiện cho phép sau khi tưới nước nên để cho cây được thoáng khí thông gió, để cho nước đọng trên mặt lá bị bay hơi hết sẽ giảm sự phát sinh của bệnh hại[2]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ

cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên Do đó tạo ra hàng loạt

cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống [16]

Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và

nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã

được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại [14]

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Haberlandt G đã đề xuất học thuyết về tính toàn năng của tế bào và cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy

mô tế bào dựa trên học thuyết này Theo học thuyết này, tất cả các tế bào của cây đều mang lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh Ngày nay, rất nhiều loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [16]

2.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hóa và phản phân hóa Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện chưc năng cụ thể khác nhau Các mô có được cấu trúc chuyên môn hóa nhất định là nhờ vào sự phân hóa [16]

Phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh hình thành các tế bào của mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hóa diễn ra như sau: Tế bào phôi sinh, tế bào dẫn, tế bào phân hóa chức năng [16]

Khi tế bào phân hóa thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể trở lại giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục quá trinh phân hóa, quá trình này gọi là sự phản phân hóa của tế bào [16]

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình phân hóa gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, một số gen mới lại ước chế hoạt

động Quá trình này xảy ra theo một chu trình đã được mã hóa trong cấu trúc

của phân tử ADN của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng

bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất đợi thì các gen được hoạt hóa,quá trình phân chia sảy ra theo một chương trình đã được định sẵn trong ADN của tế bào [16]

2.2.3 Sự phát triển của mẫu điều khiển bởi yếu tố môi trường

Trong nuôi cấy mô thực vật in vitro, môi trường nuôi cấy phải cung cấp

tất cả các ion khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển Các yếu tố vật

lí như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng, áp suất thẩm thấu cũng phải

được giữ trong giới hạn cho phép [16]

- Trong nuôi cấy mô có rất nhiều môi trường nuôi cấy tuy nhiên chia làm 3 loại:

Môi trường giàu dinh dưỡng

Môi trường trung bình

Môi trường nghèo dinh dưỡng

- Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều bao gồm các thành phần sau [1]:

+ Thành phần khoáng (khoáng đa lượng + vi lượng)

+ Các Vitamin

+ Nguồn cacbon

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

- Thành phần đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ

Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào, Nitơ là thành

phần quan trọng của VTM, amino acid và protein được cung cấp với số lượng lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, thường ít nhất là 0,1% trọng lượng khô của cây Ngoài ra các nguyên tố vi lượng được cung cấp vào với lượng rất ít là thành phần của một số enzyme cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên có vai trò rất quan trọng cho cây Các thành phần vi lượng chủ yếu: Mn, I, Cu, Co, Bo, Mo, Fe, Zn [1]

- Các VTM: Ảnh hưởng của các VTM đến sự phát triển của tế bào nuôi

cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau [1]

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại VTM

cơ bản nhưng với luọng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất

là bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại VTM Trong các loại VTM thì B1 được xem là VTM quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng có thể dược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [1]

- Nguồn cacbon từ các đường như: sucrose, glucose, maltose, galactose, sorbitol…

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương

thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [8]

Ngoài ra khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiên tượng caramen hóa, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sinh trưởng và phát triển của tế bào [1]

được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích sinh

trưởng [17]

+ Than hoạt tính : Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp và đu đủ

+ Độ pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô [16]

+ Tác nhân tạo gel: Môi trường nuôi cấy thực vật có thể ở dạng đặc hay lỏng Trường hợp môi trường đặc cần sử dụng các chất tạo gel Agar được sản xuất từ rong biển là dạng chất tạo gel phổ biến được sử dụng Trong nhiều trường hợp do yêu cầu của ứng dụng mà có thể sử dụng một số loại chất tạo gel như agar và agarose tinh khiết Các mô thực vật đều được cấy trên môi trường agar để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc chết vì thiếu

O2 Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho

sự phát triển của mô cấy là 6g/lít [16]

- Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật [16]: Có 5 loại chủ yếu auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene

+ Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì-nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu

bì Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [6]

Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự

từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [8]

+ Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ

hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế

đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của

cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa [6]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea…[8]

+ Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm Gibberella Fujikuroi

và được gọi là Gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Về sau, các nghiên cứu khám phá ra là trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu trúc và tác dụng Những chất này đặt đặt tên theo thứ tự là A1,A2,A3,A4 Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong

sự tương tác với các chất điều hòa sinh trưởng khác [1]

Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau

đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem [1]

+ Ethylen là chất điều hòa sinh trưởng dạng khí Ethylen có rất nhiều tác dụng đối với hoạt đọng sinh lý và trao đổi chất ở thực vật đã từ lâu vai trò của ethylen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng dụng nhiều Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethylen lên sự kéo dì thân và rễ, kích thích tế bào phát triển bề ngang, kích thích tạo mầm, tạo lông rễ, hoa ở dứa và lan [1]

2.3 Tình hình nghiên cứu về lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp trên thế giới

và ở Việt Nam

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2002, Park So Young và CS, khảo sát tối ưu hóa quá trình tạo

protocorm từ lá, đưa ra quá trình hoàn chỉnh và kiểm chứng trên nhiều giống

lan Hồ Điệp khác nhau [24]

Tanaka và Sakanishi (1977), điều kiện nuôi cấy (các chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ) và vị trí của các mầm ngủ (giai đoạn phát triển sinh lý) có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của mầm ngủ Trong đó, nhiệt độ nuôi cấy (28°C-30°C) là một yếu tố quan trọng để kích thích mầm ngủ thoát khỏi tình trạng tiềm sinh [21]

Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ protocorm chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào Tanaka và Sakanishi (1985)[22] và Tanaka (1987)[23] đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983) [19], Haas-von Schmude (1985) [20] sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từ protocorm Griesbach (1983)[18] sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây con từ protocorm

Tuy vậy, lan Hồ Điệp cũng như các cây trong họ hoa lan thường khó chuyển gen hơn các loại cây trồng khác do có đặc điểm: Phát triển rất chậm, khó thao tác trong nuôi cấy mô, chưa có quy trình tái sinh từ các dòng tế bào

đã biệt hóa, ít nhạy cảm với các loại kháng sinh chọn lọc, tiết ra môi trường

một lượng lớn các hợp chất phenol gây độc cho tế bào, cấu trúc đa tế bào của vùng mô phân sinh làm cây chuyển dễ bị khảm

2.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống lan Hồ Điệp ở Việt Nam

Bước đầu tìm hiểu về sự nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis

sp.), Võ Thị Bạch Mai và Lê Văn Hướng cho rằng dưới tác động của auxin và

cytokinin được bổ sung riêng lẻ hay kết hợp vào môi trường MS cải tiến Khi

có bổ BA 5 mg/l và 2,4 D 1 mg/l, mô cấy được kích thích tạo ra tiền củ Trong môi trường MS bổ sung BA 2 mg/l, mô cấy sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh [9]

Khi “nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Phalaenopsis” Nguyễn Quang Thạch và cs (2003)[12], đã sử dụng vật liệu nuôi cấy mô khởi đầu bằng lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh phát hoa

Theo Trần Thị Pha và cộng sự thì môi trường có nồng độ khoáng thấp (1/2 macro MS + 1/2 micro MS, bổ sung 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA) có hiệu quả tạo chồi cao nhất (2,83 chồi/mầm) ở 60 ngày sau khi cấy Môi trường (đa lượng MS + Vi lượng MS, không bổ sung chất hữu cơ) thích hợp nhất cho việc tạo rễ do có số chồi tạo rễ cao nhất (6 chồi), số rễ/chồi cao nhất (2,78 rễ) và chiều dài của rễ cao nhất (1,20 cm) [11]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp do

Khoa CNSH- CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp

- Vật liệu: Phát hoa lan Hồ Ðiệp Phalaenopsis sp được thu khi hoa đã

nở hết trên cành Chọn những phát hoa to khoẻ, cắt những đốt có chứa mắt ngủ vết cắt cách mắt ngủ 2 – 3 cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ Tình trạng mắt ngủ phải còn trắng xanh hay hơi đỏ của màu phát hoa, loại bỏ những mắt ngủ bị hoá đen và bị trày sướt

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến tái sinh, nhân nhanh

và ra rễ lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH – CNTP,

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2013 đến 5/2014

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Hóa chất

- Các muối đa lượng, vi lượng, VTM là thành phần của môi trường MS

- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, IAA,GA3, IBA,NAA (Duchefa)

3.3.2 Thiết bị

- Cân điện tử Olhous – Vietlabcu (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật

Bản), tủ sấy Memmert (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), máy ảnh Canon IXUS 115HS (Nhật Bản)

Ngoài ra còn các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh từ phát hoa lan Hồ Điệp

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Cách bố trí thí ngiệm

- Thí nghệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10

mẫu/CT Theo dõi thí nghiệm và đánh giá sau 8 tuần

- Mỗi bình cấy 1 đốt chứa 1 mắt ngủ đối với tái sinh, 5 chồi với mật độ

đồng đều đối với nhân nhanh và ra rễ

- Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi cấy có chế độ

chiếu sáng: 16h sáng/8h tối với cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 20C

- Độ ẩm không khí: 65-70%

Phương pháp vào mẫu

- Phát hoa lan Hồ Ðiệp được thu khi hoa đã nở hết trên cành, sau khi

thu hái về rửa bằng nước sạch

- Tiến hành rửa bằng nước javen loãng sau đó rửa lại bằng nước sạch

- Trong tủ cấy, mẫu được ngâm trong cồn 70o trong 1 phút, tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng, sau đó được khử trùng với dung dịch thủy ngân trong 5 phút

- Tiến hành rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng (5 lần)

- Ngâm mẫu trong nước cất 5 phút

- Loại bỏ hoại tử, cấy mẫu lên môi trường

Phương pháp tái sinh

Chọn chồi lan Hồ Điệp vào mẫu không bị nhiễm nấm, khuẩn, sau đó

cấy lên môi trường tái sinh Mỗi bình cấy 1 chồi

Phương pháp nhân nhanh

Chọn chồi lan Hồ Điệp không bị nhiễm nấm, khuẩn, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5 - 1 cm Dùng park được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi cấy vào môi trường nhân nhanh Mỗi bình cấy 5 chồi với mật độ đồng đều

Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

Sau giai đoạn nhân nhanh, chọn những chồi sinh trưởng và phát triển bình thường, chiều cao từ 1,5 - 2 cm cấy vào môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh

chồi từ phát hoa lan Hồ Điệp