Bài dịch kỹ thuật chuyển đổi bacillus subtilis cho sản xuất ethanol lactate dehydrogenase đóng vai trò chìa khóa trong chuyển hóa lên men

Bài dịch kỹ thuật chuyển đổi bacillus subtilis cho sản xuất ethanol lactate dehydrogenase đóng vai trò chìa khóa trong chuyển hóa lên men

Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh

Khoa Sinh Học Ngành Công Nghệ Sinh Học

******

BÁO CÁO VI SINH

Bài Dịch:

KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS

CHO SẢN XUẤT ETHANOL

Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trò Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa

Lên Men

Susana Romero,1 Enrique Merino,2 Francisco Bolívar,1 Guillermo Gosset,1 and

Alfredo Martinez1

Giáo viên hướng dẫn: TS Võ Minh Trí

Nhóm 2

Thành phố Hồ Chí Minh

KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS

CHO SẢN XUẤT ETHANOL

Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trò Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa Lên Men

TÓM TẮT

Dạng hoang dại của Bacillus subtilis lên men 20g/l glucose trong 48 giờ, sản

xuất lactate và butanediol, nhưng không có ethanol và acetate Để xây dựng một

chủng B subtilis sản xuất ethanol, tái tổ hợp tương đồng được sử dụng làm gián đoạn gen (ldh) tự nhiên tổng hợp enzyme dehydrogenase lactate (LDH) bằng cách gắn chèn vào bộ nhiễm sắc thể B subtilis gen decacboxylase pyruvate (pdc)

và gen dehydrogenase II ancohol (adhB) của Zymomonas mobilis dưới sự điều khiển của promoter gen ldh tự nhiên Giá trị hoạt động của enzym PDC và ADHII nội bào trong chủng B subtilis BS35 được thiết kế giống như trong chủng

E.coli sản xuất ethanol BS35 sản xuất được ethanol và butanediol Tuy nhiên, sự

tăng trưởng tế bào và mức tiêu thụ glucose bị giảm còn 70 và 65%, tương ứng, so với trong chủng ban đầu Để loại bỏ sự sản xuất butanediol, gen acetolactate

synthase (alsS) bị làm bất hoạt Trong chủng BS36 (BS35_alsS), sản xuất ethanol

đã được nâng cao, với năng xuất cao (89% theo lý thuyết), tuy nhiên, sự tăng trưởng tế bào và mức tiêu thụ glucose còn thấp Điều thú vị, đặc tính động học

của enzyme LDH từ B subtilis cho thấy nó có khả năng oxi hóa NADH và NADPH Sự biểu hiện của transhydrogenase được mã hóa bởi gen udhA từ

E.coli đã cho phép khôi phục một phần tốc độ tăng trưởng tế bào và một khởi

đầu sớm sản xuất ethanol Ngoài sự chuyển đổi pyruvate thành lactate và quá trình oxi hóa NADH, một bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý của LDH cho quá trình tiêu thụ glucose dưới điều kiện lên men được đề nghị Nuôi cấy liên tục

chỉ ra rằng 8,9g/l có thể đạt được khi sử dụng chủng BS37 (BS37-alsS udhA).

Cho đến nay, đây là hàm lượng và sản lượng ethanol cao nhất được báo cáo với

một chủng B subtilis.

GIỚI THIỆU CHUNG

Ethanol sản xuất từ nguồn tái tạo, chẳng hạn như sinh khối, là một sự lựa chọn đầy hứa hẹn để cạnh tranh và dần dần thay thế các nhiên liệu hóa thạch không thể phục hồi; nó có lợi thế đáng kể về tính bền vững, phát thải khí nhà kính thấp hơn, và

nghiệt khác nhau, nên có thể được dùng để phát triển một chất xúc tác sinh học tiên tiến và nâng cao khả năng cạnh tranh thương mại của nhiên liệu sản xuất ethanol Một

số nhóm đã cố gắng phát triển các vi khuẩn gram dương sản xuất ethanol, nhưng với

sự thành công còn bị hạn chế

Những operon pet lý thuyết khác nhau đã được xây dựng bằng cách sử dụng gen

pdc và adhB từ Zymomonas mobilis (vi khuẩn gram âm) hoặc bằng cách sử dụng gen pdc từ Sarcina ventriculy (vi khuẩn gram dương) để biểu hiện trong những vector đơn

dòng hoặc đa dòng trong vi khuẩn gram dương Trong một số trường hợp, chức năng của enzyme pyruvate decacboxylaza (PDC) và alcohol dehydrogenase (ADH) đã được phát hiện, mặc dù sản lượng ethanol tạo ra thấp hoặc không có

Bacillus subtilis nói chung được công nhận là an toàn, chuyển hóa được nhiều loại

đường và có thể tổng hợp hiệu quả nhiều proteinases, vận chuyển chúng ra ngoài bằng

hệ thống tiết Khả năng đó có tiềm năng được sử dụng để xuất cellulases, có thể phân

hủy chất thải thực vật, phóng thích cellobiose và glucose Do đó những chủng B.

subtilis được thiết kế trong tương lai có thể tiêu thụ cả carbohydrate để sản xuất

ethanol Thiết kế như vậy giúp giảm chi phí của nhiên liệu sản xuất ethanol Tuy

nhiên trong điều kiện lên men, B Subtilis sản xuất lactate, acetate, butanediol, và

lượng rất nhỏ ethanol từ glucose, amino acid, và puryvate (Hình 1)

HÌNH 1: Những con đường lên men B subtilis Con đường phát sinh đã sử dụng

trong nghiên cứu này được đánh dấu bằng hình elip nét đứt PDC và ADHII từ Z.

mobilis ALDC (acetolactate decarboxylase), AR ( acetone reductase), PDH

( pyruvate dehdrogenase), CoA ( coenzyme A), ALDH (acetaldehyde dehydrogenase), PTA ( phosphotransacetylase), ACK ( acetate kinase)

Lactate được sản xuất bằng cách khử puryvate, một phản ứng được xúc tác bằng

lactate dehydrogenase (LDH), đồng thời với quá trình oxy hóa một phân tử NADH thì mỗi phân tử puryvate bị khử Trong nghiên cứu này, các chuyển hóa lên men không

đồng nhất của B subtilis đã được cải biến để thu được một chủng vi khuẩn gram

dương sản xuất ethanol như là sản phẩm lên men chính Bằng cách bất hoạt gen

lactate dehydrogenase (ldh) thông qua sự gắn chèn vào nhiễm sắc thể gen pdc, adhB của Z mobilis và loại bỏ tổng hợp butadienol bằng cách chèn gen udhA

transhydrogenase của E.coli vào vị trí của alsS, kết quả là chủng B subtilis tái tổ hợp

sản xuất được ethanol là sản phẩm lên duy nhất

Sự bất hoạt LDH làm cho chủng B subtilis tăng trưởng không hoàn hảo bất

chấp sự bổ sung chất hóa học tương đương quá trình oxi hoa khử ( PDC- ADHII) Chúng ta nhận thấy rằng LDH oxi hóa NADH thành NAD- và NADPH thành NADP-

Giá trị Km biểu kiến của 2 cofactor được so sánh với giá trị Km cho NADH của LDH

của các vi khuẩn gram dương Do đó một bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý của LDH cho sự tiêu thụ glucose trong điều kiện lên men được đề nghị Các kết quả thu được đã chỉ ra rằng vai trò sinh lý quan trọng này của LDH cho sự tiêu thụ glucose

trong điều kiện lên men cần được xem xét trong việc phát triển những chủng B.

subtilis sản xuất ethanol mới.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các chủng B subtilis và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê

trong bảng 1, và các oligonucletide trong bảng 2

Để tránh điều kiện TRp, những tế bào B subtilis WB700 khả nạp, được biến đổi bằng cách sử dụng DNA của nhiễm sắc thể từ một chủng Trp-B.subtilis BSR1, những

dạng tổ hợp được chọn lọc trong môi trường vô cơ chứa glucose, và chủng tự dưỡng

được đặt tên CH1 (bảng 1) Chủng B subtilis CH1 đã được sử dụng để xây dựng những chủng B subtilis sản xuất ethanol Trong khi xây dựng chủng và plasmid,

chủng được phát triển trong môi trường agar Luria- Bertani (LB) có chứa kháng sinh thích hợp Các nồng độ kháng sinh cuối cùng có được như sau: 5_g/ml chloramophenicol (Cm), 5_g/ml erythromycin (Ery), 5_g/ml lincomycin (Lâm), 100_g/ml spectinomycin(SPT), 10_g/ml tetracycline (Tc), 50_g/ml Kanamycin (Km),

và 100_g/ml ampicilin( Ap)

(i) Thao tác gen

Quy trình thông thường được sử dụng cho việc chuẩn bị plasmid, cắt hạn chế,

nối, biến nạp, và điện di gel agaroses E.coli XL1- Blue được sử dụng như vật chủ cho việc xây dựng plasmids và tế bào được tăng trưởng trong môi trường LB B subtilis

được biến đổi bằng cách sử dụng phương pháp khả nạp tự nhiên Gắn chèn hay cắt đoạn nhiễm sắc thể được xác nhận bằng cách sử dụng kháng sinh đánh dấu thích hợp, phân tích PCR và xét nghiệm các sản phẩm lên men

(ii) Bất hoạt ldh và gắn chèn pdc, adhB của Z mobilis vào nhiễm sắc thể

Mồi đặc trưng được thiết kế để khuếch đại pdc và adhB (Bảng 2) Việc thiết kế mồi phải kể đến trình tự consensus Shine- Dalgarno của B subtilis và khỏang cách bảo tồn giữa motif này và codon khởi đầu của mỗi gen Gen pdc của Z mobilis được

khuếch đại từ vetor pLOI276, sử dụng mồi 1 và 2, thu được những đoạn có kích thước

1.7 kb, sau đó được tạo dòng trong pCR-TOPO, tạo thành vetor IpTOPO-pdc Gen

adhB của Z mobilis, được theo sau bởi terminator của gen cryIIIA trong chủng Bacillus thuringiensis (cryIIIAt) được khuếch đại Trong lần PCR đầu tiên, sử dụng

mồi 3 và 4, gen adhB được khuếch đại bởi vetor pLOI284, chứa 1 nửa của cryIIIAt Trong PCR lần 2, sử dụng mồi 3 và 5, gen adhB được theo sau bởi terminator hoàn

chỉnh, được khuếch đại, phân đoạn PCR này được tạo dòng trong pCR-TOPO, tạo ra

pTOPO-adh-term.

Gen pdc được thu nhận từ đoạn gen dài 1.7 kb nằm giữa EcoRV- AscI trong vetor IpTOPO-pdc Đoạn này được nối vào vị trí giữa BamHI và AscI đã xử lý đầu bằng tại

vị trí trước gen adhB trong pTOPO-adh-term, thu được vector pTOPO-pdc-adh-term Gen pdc và adhB được thu nhận từ đoạn gen 2.88-kbp giữa EcoRI và NaeI từ vector pTOPO-pdc-adh-term Đoạn này được nối vào vị trí giữa EcoRI và HincII của vector pSG- PLK, thu được vector pSG-operon Plasmid này chứa gen pdc và adhB theo sau bởi transcription terminator cryIIIAt và cassette kháng chloramphenicol (cat).

HÌNH 2: Các vector được xây dựng để bất hoạt (A) gen ldh của chủng B subtilis

(ldh Bs ) bằng cách gắn chèn gen pdc (pcd Zm ) và adhB (adhB Zm ) của Z mobilis vào nhiễm sắc thể; (B) gen alsS Bm bằng Stp cassette; (C) gen alsS Bs bằng cách gắn chèn

gen udhA và Stp cassette của E coli vào nhiễm sắc thể

Gen ldh của B subtilis được khuếch đại bằng PCR, sử dụng đoạn mồi 6 và 7, và được tạo dòng tại vị trí HindII của plasmid pUC19 để tạo thành pUC-ldh.

Gen pdc và adhB thiếu promoter, cryIIIAt, và cat được thu nhận từ đoạn gen dài

4,5-kbp nằm giữa AccI được xử lý đầu bằng từ vector operon-pSG và được nối vào

vị trí của EcoRV trên gen ldh trong ldh, thu được plasmid

pUC-ldh::operonCm(fig.2A).

Những tế bào B subtilis CH1 khả nạp được biến đổi bằng cách đưa vào vector pUC-ldh::operonCm; từ đó, gen pdc và adhB được gắn chèn vào ldh trên bộ gen của chủng B subtilis CH1 bởi việc tái tổ hợp tương đồng trên ldh vào bộ gen B subtilis dưới sự điều khiển của promoter ldh B.subtilis tái tổ hợp được chọn lọc bởi Cmr và

được nhận biết bởi việc thiếu sự sản xuất lactate dưới điều kiện lên men Chủng được tạo thành là BS35

(iii) Tạo dòng alsS và sự khử hoạt tính.

Gen alsS được khuếch đại từ bộ gen B.

subtilis bằng PCR sử dụng đoạn mồi 8 và 9.

Đoạn này được tạo dòng vào vector pCR-TOPO

để tạo thành vector pTOPO-alsS Một đoạn

1,2-kbp chứa Spt cassette được cắt ra bằng

BamHI-HindIII từ vector pCm::Spt (30) Sau đó đầu

cuối của Spt cassete được xử lý đầu bằng, Spt

cassete được nối vào vi trí SspI trên gen alsS

của alsS, tạo ra plasmid

pTOPO-alsS::Spt (fig 2B) Sự bất hoạt gen alsS, bằng

cách chèn vào Spt cassete được thu nhận trong

plasmid này, được chuyển đến vị trí alsS của B.

subtilis bằng cách tái tổ hợp 2 gen tương đồng.

Kết quả của sự thay đổi alsS được chọn lọc bởi

môi trường kháng sinh Sptr và được nhận biết

bởi sự có mặt của 2,3-butanediol sản sinh dưới

điều kiện lên men Chủng mới được đặt tên là

BS36 Chủng đột biến alsS CH1 được xây dựng

để đánh giá Km biểu kiến của LDH trong dịch

chiết tế bào của chủng B subtilis Plasmid

pTOPO-alsS::Spt được biến nạp vào những tế

bào khả nạp của chủng CH1 Chủng đột biến

alsS được chọn lọc bằng Sptr và được nhận biết

bởi sự có mặt của 2,3-butanediol sản sinh dưới

điều kiện lên men

(iv) Sự bất hoạt alsS bằng việc kết hợp với

nhiễm sắc thể transhydrogenase (udhA)

Đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại gen

udhA của E.coli bao gồm các nhân tố chuyển

đổi giống như sử dụng trong việc khuếch đại

gen pdc và adhB Sản phẩm PCR bao gồm gen

udhA được khuếch đại từ bộ gen E.coli JM101

sử dụng đoạn mồi 10 và 11, được nối vào

pTOPO-alsS::Spt tại vị trí duy nhất SalI Tạo

thành pTOPO-alsS::UdhA_Spt (fig.2C) Plasmid

này được biến nạp vào những tế bào B subtilis

BS35 khả nạp; bằng cách đó gen udhA được gắn

chèn bằng cách tái tổ hợp 2 gen tương đồng trên

alsS vào nhiễm sắc thể B subtilis BS35, dưới sự

điều khiển của mồi alsS cho phép sự biểu hiện

gen udhA Chủng biến nạp được chọn lọc trong

đĩa agar môi trường LB-Spt B subtilis BS37

(BS35_alsS udhA_) được xác định bằng phương

pháp PCR khuếch đại gen udhA từ bộ gen của

chủng đột biến gen alsS và được nhận biết việc

thiếu sản phẩm lactate và butanediol dưới điều

kiện lên men

HÌNH 3 : Đồ thị mô tả chủng B subtilis dưới điều kiện lên men trong môi

trường LB có chứa glucose (20g/l) Sự hình thành khối lượng tế bào (A), sự tiêu thụ glucose (B), lactate (C), butanediol (D), và sự sản xuất ethanol (E) từ chủng B

subtilis CH1 (□), BS35 (Δ), BS36 (Ο), BS37 (◊), B subtilis CH1 (■) thì được kể đến như mẫu đối chứng, sử dụng môi trường LB mà không bổ sung glucose

Chuẩn bị vật liệu cấy chuyền và điều kiện lên men

trong glycerol và ủ qua đêm ở 370C Những tế bào này được sử dụng để cấy vào lọ 500ml bao gồm 150ml nước cao thịt với 20g/l glucose Lọ này được ủ qua đêm ở

370C và ly tâm 100vòng/ phút (rpm) Tế bào từ lọ được ly tâm và được sử dụng để đo mật độ quang ở bước sóng 600nm(OD600) Việc nuôi cấy được thực hiện bằng cách nhân đôi trong lọ chứa nhỏ bao gồm 200ml môi trường LB bổ sung thêm 20g/l glucose Hoạt động trong điều kiện 350C, ly tâm 100vòng/phút , và pH 7 (điều chỉnh bằng cách tự động thêm vào KOH 2N) Sự tăng trưởng được giám sát bằng cách đo bước sóng 600nm (Lambda 11; Perkin Elmer, Pomona, CA) Mẫu được lấy ra một cách định kỳ và đem đi ly tâm; phần nổi trên mặt được sử dụng cho những phân tích xác định Tế bào được điều chỉnh ở bước sóng 600nm được lấy ra sau 48h lên men, ly tâm, và thử nghiệm hoạt tính của enzym

Phương pháp phân tích.

Việc đo sinh khối bằng OD600 được ghi lại để tính trọng lượng khô của tế bào (DCW) sử dụng 1 cuver chuẩn (1 OD600 _ 0.35 g DCW/liter) Hoạt tính của enzym PDC và ADHII được thử nghiệm ở 300C sau đó protocol được biểu hiện trước Hoạt tính của LDH được thử nghiệm bằng cách sử dụng pyruvate, NADH, và sử dụng dung

dịch đệm cho thử nghiệm PDC Giá trị Km biểu kiến được xác định trong dịch chiết tế bào của B subtilis CH1_alsS, những tế bào được thu nhận sau 48h lên men B.

subtilis BS35 và BS36 được xem như mẫu đối chứng âm Từ sự xác định giá trị Km

biểu kiến, nồng độ khác nhau của NADH (0-0.5mM) và NADPH (0-1.3mM) được kiểm tra, với nồng độ pyruvate luôn là hằng số (0.5mM), sử dụng chất đệm tương tự như sử dụng cho thử nghiệm của PDC ở 300C

Nồng độ protein được xác định bằng việc sử dụng thuốc thử Bradford thương mại theo sự chỉ dẫn của nhà sản xuất (Bio-Rad Laboratories, Inc., United States) Mức độ glucose, lactate, và butanediol được đo bằng sắc ký lỏng áp suất cao và mức ethanol bằng sắc ký khí như báo cáo trước đây

KẾT QUẢ

B subtilis sản xuất lactate và butanediol dưới điều kiện lên men B subtilis

chuyển hóa glucose dưới điều kiện lên men kỵ khí cho những sản phẩm khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, môi trường nuối cấy, và cuối cùng là chất nhận điện

tử cuối cùng (7, 10, 26) Việc thể hiện ranh giới của chủng sinh vật sử dụng chất vô

cơ CH1 được mô tả dưới điều kiện kỵ khí, sử dụng môi trường LB bổ sung thêm 20g/l

glucose Trong 10h đầu nuôi cấy, B subtilis CH1 phát triển theo hàm mũ, tạo ra 0.6g/l

khối lượng tế bào, sản xuất chủ yếu là lactate (4.7g/l) và 2,3-butanediol (1g/l)

Bảng 3 Những thông số về động lực học của chủng B subtilis CH1 và những

dạng biến đổi dưới sự phát triển lên men trong LB với 20g glucose/l

Bảng 3 đưa ra tóm tắt những giới hạn động học được xác định cho những môi trường nuôi cấy Trong pha ổn định, một lượng lớn lactate (14.5g/l) được tích lũy (fig

3 và bảng 3) Tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng giảm 75% so với tốc độ của pha theo hàm mũ (pha log), và glucose được dùng hết trong 48h Một lượng 0.5g/l 2,3-butanediol được tạo ra Ethanol, acetate, succinate, formate, và aceton không được tìm thấy trong quá trình nuôi cấy

B subtilis CH1 được đưa ra như mẫu đối chứng, sử dụng môi trường không có

glucose Tế bào CH1 phát triển theo hàm mũ, chỉ có 0.11g/l khối lượng tế bào và 0.8g/l lactate (fig3)

B subtilis bao gồm gen pdc và adhB sản xuất ethanol, nhưng sự phân cắt ldh

làm giảm tốc độ biểu hiện và sự tiêu thụ glucose Dựa vào khả năng sản xuất lactate

cao trong pha log và pha ổn định, promoter của ldh được xem như la 1 lựa chọn tốt sử

dụng để truyền tín hiệu cho việc biểu hiện của các gen khác nhau dưới điều kiện kỵ

khí Vì vậy, promoter này được chọn lựa để truyền tín hiệu cho gen pdc và adhB được biểu hiện trong nhiễm sắc thể của B subtilis.

Sự biểu hiện của chủng BS35 (CH1 ldh::pdc-adhB) dưới điều kiện kỵ khí chỉ ra rằng gen pdc và adhB khác loại đã được biểu hiện, chủ yếu là tổng hợp chức năng của

enzym

Bảng 4 Các hoạt tính đặc trưng của enzyme PDC, ADH, LDH trong những

chủng B subtilis

Bảng 4 đưa ra tóm tắt sự xác định hoạt tính của enzym PDC, ADHII, và LDH

trong chủng CH1 và BS35 Thật thú vị , sự gián đoạn của gen ldh làm suy yếu sự phát

triển của chủng BS35 (fig 3A), tốc độ phát triển giảm đi 70% so với chủng CH1, có thể đó là hệ quả của việc giảm 65% tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng (fig.3B và bảng 3) Trong sự so sánh với tốc độ đặc trưng và chuẩn của việc sản xuất butanediol trong chủng CH1, cuối cùng tốc độ đặc trưng và chuẩn của việc sản xuất butanediol được giảm đi ở mức không đáng kể trong chủng BS35, nhưng việc sản xuất lactate hoàn toàn bị hủy bỏ (bảng 3 và fig 3C và D) Mặc dù tốc độ phát triển và sự tiêu thụ glucose trong chủng BS35 bị làm giảm đi, nó sản xuất ethanol trong pha ổn định (fig 3E), với khả năng sản xuất đặc trưng 0.08g ethanol/g DCW/h (bảng 3) Thật thú vị, sự tích tụ ethanol trong dịch nuôi cấy được tìm thấy sau 24h lên men, và 0.95g/l được thu nhận sau 48h

Sự kìm hãm tổng hợp butanediol tăng khả năng sản xuất ethanol Sự tổng

hợp aceton từ pyruvate bao gồm 2 bước, được xúc tác bởi acetonlactate synthase (ALSS) và acetonlatate decarboxylase (fig 1) Butanediol được hình thành từ sự khử aceton (7) Theo cách đó, ALSS ngay lập tức cạnh tranh với PDC để lấy được

pyruvate trong chủng BS35 Kể từ lúc này sự tăng thêm pyruvate sẵn sàng, gen alsS

bị gián đoạn như đã được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp Thêm vào đó sự

bất hoạt gen alsS hoàn toàn hủy bỏ việc sản xuất butanediol (fig 3D) và cho phép sản

xuất mạnh mẽ ethanol trong 24h nuôi cấy (fig 3E) Tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng trong chủng BS36 tăng lên 50% so với chủng BS35 (bảng 3) Phân tích sự tiêu thụ glucose và sản xuất ethanol trong pha ổn định (từ 12-48h) cho ra 1.5g/l ethanol từ việc tiêu thụ 3g/l glucose Giá trị này phù hợp đến 98% so với sản lượng lớn nhất của lý thuyết (0.51g ethanol/g glucose) Trong sự so sánh với tốc độ của chủng CH1, tốc độ

và sự tiêu thụ glucose vẫn còn yếu

L-LDH của B Subtilis có thể dùng NADH và NADPH như là cofactor

Con đường sản xuất ethanol phát sinh trong chủng BS35 thì tương tự như con đường sản xuất lactate vốn có trong chủng CH1 trong điều kiện tái oxi hóa NADH Tuy nhiên, như trình bày ở trên, mức độ phát triển và tiêu thụ glucose bị giảm khi con đường tạo ra lactate tương ứng bị thay thế bởi con đường ethanol

Để xác định cofactor đặc trưng của LDH, chúng ta xác định NADPH có phải là

cơ chất cho enzyme LDH trong B subtilis hay không Các cuộc thử nghiệm enzyme

đã phân tích rỏ ràng rằng cả NADH và NADPH là cơ chất cho LDH Một cuộc kiểm tra được tiến hành, dùng những tế bào của BS35 và BS36, cho thấy trong sự vắng mặt của LDH, không có sự sản xuất NADPH nào được phát hiện

BẢNG 5 Xác định hoạt động enzyme của LDH ở những chủng B subtilis

hướng về 2 cofactor khác nhau

Hơn nữa, để kiểm tra rằng chỉ có hoạt động của LDH đóng vai trò cho sự oxi

hóa NADPH thì ta xác định Km biểu kiến ( Michaelis_Meten affinity constant) trong những tế bào thu nhận từ chủng B subtilis ldh_alS (chủng CH1 đột biến alsS) ( bảng 1) Giá trị Km biểu kiến của LDH là 0.13 mM dối với NADH và 0.288 mM đối với

NADPH

Sự biểu hiện của transhydrogenase làm tăng sự phát triển và giảm thời gian khởi đầu cho việc sản xuất ethanol.

Gen udhA ở E coli mã hoá cho transhydrogenase Enzyme này làm tăng tốc độ

phản ứng ngược của việc khử sự tương đương giữa NADP- va NAD- theo sự cân