Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống khoai tây solanum tuberosum trong ống nghiệm

Những thành tựu mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong việc nhân nhanh và sản xuất các giống khoai tây s

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin trân thành cảm ơn TS Lê Xuân Đắc, Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ

Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin trân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Như Toản đã có những đóng góp quý báu

trong quá trình tôi thực hiện đề tài Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2, đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Tô Thị Hải

Tôi xin cam đoan kết quả trong luận văn tốt nghiệp này đều là sự thực, do tôi thu thập số liệu từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có sự sao chép hay bịa đặt.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Tô Thị Hải

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

CIP Center International Potato (Trung tâm khoai tây quốc tế)

ĐBSH Đồng bằng sông Hồng

FAO Tổ chức nông lương quốc tế

IAA Indol Acetic Acid

IBA Indol Butyric Acid

KTST Kích thích sinh trưởng

NAA α - Naphthalen Acetic Acid

CHƯƠNG 1 3

T NG QUAN TÀI LI UỔ Ệ 3

CHƯƠNG 2 22

V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ 22

CHƯƠNG 3 29

K T QU VÀ TH O LU NẾ Ả Ả Ậ 29

PH L CỤ Ụ 40

TÀI LI U THAM KH OỆ Ả 40

B ng 1 Di n tích, n ng su t, s n lả ệ ă ấ ả ượng khoai tây c a châu Âuủ 16

B ng 2 Di n tích, n ng su t, s n lả ệ ă ấ ả ượng khoai tây c a châu Áủ 17

B ng 3 Di n tích, n ng su t, s n lả ệ ă ấ ả ượng khoai tây c a Vi t Namủ ệ 17

B ng 4: nh hả Ả ưởng c a BAP ủ đế ựn s phát tri n ch i trên môi trể ồ ường đặ 29c B ng 5: nh hả Ả ưởng c a BAP ủ đế ựn s phát tri n ch i c a các gi ngể ồ ủ ố 31

khoai tây trên môi trường l ngỏ 31

B ng 6: K t qu t ng h p thí nghi m ánh giá s phát tri n ch i c a ả ế ả ổ ợ ệ đ ự ể ồ ủ 32

các gi ng khoai tâyố 32

B ng 7: nh hả Ả ưởng c a IAA ủ đến kh n ng t o r cây khoai tâyả ă ạ ễ 32

B ng 8: nh hả Ả ưởng c a IBA lên kh n ng t o rủ ả ă ạ ễ 34

B ng 9: nh hả Ả ưởng c a BAP ủ đến kh n ng t o c trong ng nghi mả ă ạ ủ ố ệ 35

B ng 10: nh hả Ả ưởng c a th i gian x lý l nh ủ ờ ử ạ đến kh n ng n y m m c a cả ă ả ầ ủ ủ .37

Hình 1: Các b ph n cây khoai tâyộ ậ 4Hình 2: Nhân nhanh khoai tây trong ng nghi m ố ệ 30Hình 3: S phát tri n c a ch i khoai tây trên môi trự ể ủ ồ ường l ngỏ 31Hình 4: nh h ng c a IAA Ả ưở ủ đến kh n ng t o r cây khoai tây sau 30 ng yả ă ạ ễ à 33Hình 4: Cây khoai tây in vitro trên môi môi trường t o r IBA sau 30 ng yạ ễ à 35Hình 5: T o c khoai tây trong ng nghi mạ ủ ố ệ 36Hình 6: C khoai tây n y m m sau khi x lý l nhủ ả ầ ử ạ 38

K T LU N VÀ KI N NGHẾ Ậ Ế Ị 38

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Khoai tây (Solanum tuberosum L) là cây lương thực, thực phẩm giá trị

được trồng ở nhiều nước trên thế giới Củ khoai tây chứa trung bình 25% chất khô, trong đó các chất dinh dưỡng quan trọng như: Tinh bột 80 - 85%, protein 3%, nhiều loại vitamin A, B1, C, B6, PP Với giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, khoai tây là một trong bốn cây lương thực quan trọng xếp sau lúa, ngô và khoai lang Ở Việt Nam, khoai tây là cây vụ đông quan trọng trong công thức luân canh lúa xuân - lúa mùa sớm - khoai tây Với điều kiện khí hậu trong vụ đông ở đồng bằng sông Hồng, cây khoai tây là cây trồng thích hợp đem lại giá trị kinh

tế cao Trên thực tế, sản xuất khoai tây nước ta gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là trong công tác giống, dẫn đến năng suất và diện tích trồng hàng năm thấp và không ổn định Việt Nam phải nhập 70% - 75% nguồn giống từ Trung Quốc, 15% nguồn giống từ châu Âu, 15% giống sản xuất trong nước Giống sản xuất trong nước chủ yếu là theo phương thức tự để, củ giống dễ bị thoái hoá, tăng tỷ

lệ nhiễm bệnh, đặc biệt là virus, làm yếu dần tính chống chịu của khoai tây qua sinh sản vô tính Nhập khẩu một lượng lớn khoai tây thương phẩm giá rẻ từ Trung Quốc làm giống sẽ lan truyền nhiều loại sâu bệnh nguy hại cho cây trồng khác Nguồn giống từ châu Âu cho chất lượng tốt nhưng giá giống đắt làm hạn chế đến hiệu quả kinh tế Khoai tây là loại cây trồng có khả năng cho năng suất cao, ở các ruộng thâm canh của nhiều nước năng suất có thể đạt đến hàng trăm tấn củ/ha Trong khi đó nước ta năng suất khoai tây chỉ đạt dưới 10 tấn/ha [3]; [23]; [25]; [29]

Như vậy, việc xây dựng hệ thống sản xuất, kiểm định, xác nhận, bảo quản

và cung ứng giống khoai tây sạch bệnh có ý nghĩa rất quan trọng để thúc đẩy sản xuất khoai tây phát triển Trong đó phát triển công nghệ sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đóng vai trò then chốt Hiện nay, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kĩ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật

Những thành tựu mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong việc nhân nhanh

và sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh phục vụ sản xuất [2]; [3]; [4]; [5]

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu

kĩ thuật nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L) trong ống nghiệm”.

Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống khoai tây thông qua việc nhân nhanh khoai

tây in vitro, tạo cây in vitro hoàn chỉnh và tạo củ in vitro để sản xuất các giống

khoai tây sạch bệnh, cho năng suất cao, phục vụ sản xuất

4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo chồi in vitro.

- Xác định công thức môi trường thích hợp để tạo cây in vitro hoàn chỉnh.

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo củ in vitro.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Nguồn gốc và phân loại cây khoai tây

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L) có nguồn gốc ở Nam Mỹ Đầu thế

kỷ XVI những nhà hàng hải người Tây Ban Nha chinh phục Nam Mỹ, đã đem

về trồng ở nước họ Vào cuối thế kỷ XVI, khoai tây được trồng ở AiLen, Anh, Italia, Đức, Pháp, Nga…từ đó khoai tây được trồng ở nhiều nước châu Âu khác Các nước ở châu Á và châu lục khác biết đến cây khoai tây muộn hơn các nước

ở châu Âu thông qua chính sách thuộc địa của người châu Âu Đến nay, khoai tây được trồng rộng rãi ở khoảng 130 nước trên thế giới từ 710 vĩ tuyến Bắc đến

400 vĩ tuyến Nam [4]; [5]; [27]; [28]

Ở nước ta, khoai tây được người Pháp mang sang trồng ở một số nơi từ năm 1890 và chủ yếu trồng ở vùng đồng bằng sông Hồng Giống khoai tây được trồng phổ biến trước đây là giống khoai tây ruột vàng Thường tín, giống này có nguồn gốc từ giống Ackersegen [5]; [30]

Cây khoai tây thuộc họ cà (Solanaceace) là cây ở thể tứ bội (Tetraploid)

(2n=4x=48), có khả năng sinh trưởng phát triển tốt và cho năng suất cao [5]

2 Đặc điểm sinh học

Đời sống của cây khoai tây có thể chia thành 4 thời kỳ: ngủ, nảy mầm, hình thành thân củ và thân củ phát triển

Thời kỳ ngủ: Củ khoai tây sau khi thu hoạch phải được cất giữ một thời

gian dài sau đó mới nảy mầm được, người ta gọi đó là thời kỳ ngủ nghỉ của củ khoai tây Thời gian ngủ nghỉ của củ khoai tây phụ thuộc vào đặc điểm của giống, điều kiện sinh thái của vùng trồng, kĩ thuật canh tác, điều kiện bảo quản

 Thời kỳ nảy mầm: Sau một thời gian ngủ nghỉ những mắt ngủ trên củ

khoai tây đều có khả năng phát triển thành mầm cây Mầm cây phát triển thành thân lá và thành cây khoai tây thế hệ mới

 Thời kỳ hình thành thân củ: Cây khoai tây con sau khi phát triển vượt

lên khỏi mặt đất từ 7 - 10 ngày thì trên các đốt thân nằm dưới mặt đất xuất hiện những nhánh con, đó chính là những nhánh thân địa sinh Nhánh địa sinh có màu trắng và mọc thẳng, đầu cuối của nhánh thường phình to tạo thành những đoạn thân ngầm, khi phát triển đến mức độ nhất định thì ngừng phát triển về chiều dài, chất dinh dưỡng tập trung vận chuyển đến các đoạn thân ngầm này và chúng phình to lên tạo thành củ khoai tây ở đầu mút thân địa sinh.

 Thời kỳ phát triển của củ: Sau khi cây sinh trưởng được 20 - 25 ngày thì

các chất dinh dưỡng tập trung vào các đầu chóp của thân địa sinh, bộ phận này của thân địa sinh bắt đầu phình to dần lên Ở những nơi có nhiều nắng vào thời gian này cây hình thành hoa và hoa bắt đầu nở, đây chính là lúc thân địa sinh phát triển mạnh nhất

- Rễ khoai tây phân bố chủ yếu ở tầng đất sâu 30cm

- Thân cây khoai tây là loại thân bò, có giống có thân đứng Thân dài 50 - 60cm Trên thân có thể mọc các nhánh

- Lá kép gồm một số đôi lá chét, thường là 3 – 4 đôi

- Hoa màu trắng, phớt tím, có 5 - 7 cánh hoa lưỡng tính, tự thụ phấn

Hình 1: Các bộ phận cây khoai tây

- Quả khoai tây tròn hoặc hơi dẹt, nhỏ, màu xanh nhạt hay tím Trong quả chứa hạt nhỏ Hạt màu vàng nhạt trong hạt có nhiều dầu Cây con sau khi mọc khỏi mặt đất 7 - 10 ngày thì trên các đốt đoạn thân, nằm trong đất xuất hiện

những nhánh con Đó là những đoạn thân địa sinh Các thân địa sinh này phát triển được dồn về tập trung ở đầu mút, ở đây thân phình to dần lên và phát triển thành củ Trên thân củ có nhiều mắt [4]; [23]; [10].

3 Giá trị của cây khoai tây

Ở nhiều nước trên thế giới, khoai tây được coi là một trong năm loài cây lương thực quan trọng: lúa mì, lúa nước, ngô, đại mạch và khoai tây So với nhiều loài cây trồng khác, khoai tây có thành phần hoá học quý và khả năng sử dụng đa dạng Củ khoai tây chứa trung bình khoảng 25% chất khô, trong đó 80 - 85% tinh bột, 3% protein, có nhiều vitamin: A, B1, B6, PPs… và nhiều nhất là vitamin C (20 - 200mg/100g khối lượng tươi) Ngoài ra, còn có các chất khoáng quan trọng, chủ yếu là kali, thứ đến là canxi, photpho, magie [4]; [5]; [24]

Bên cạnh giá trị làm lương thực, thực phẩm cho con người và thức ăn cho gia súc, khoai tây còn là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến Ước tính 1 tấn khoai tây củ có hàm lượng tinh bột 17,6% chất tươi thì sẽ cho

112 lít rượu, 55 kg axit hữu cơ và một số sản phẩm khác Từ việc chế biến ra rượu khoai tây còn là nguyên liệu để sản xuất ra cao su nhân tạo Thân, lá, hoa khoai tây còn là nguyên liệu của công nghiệp chế biến dược phẩm sản xuất thuốc chữa bệnh như thuốc giảm đau, an thần, chữa bệnh thần kinh, thấp khớp, hen xuyễn mãn tính…[27]

Ngoài giá trị dinh dưỡng và y học với con người, khoai tây còn được sử dụng làm thức ăn gia súc ở nhiều nước trên thế giới, nhất là ở các nước tiên tiến Theo Grison (1986) ở Pháp hàng năm vẫn sử dụng 1 - 1,4 triệu tấn khoai tây sử dụng cho chăn nuôi Theo FAO hàng năm khoai tây được sử dụng cho chăn nuôi chiếm khoảng 20 - 25% tổng sản lượng [24]; [30]

Bên cạnh đó khoai tây còn là nguồn nguyên liệu có giá trị cho nhiều ngành công nghiệp chế biến các loại axit hữu cơ khác (acid lactic, acid citric) và các dung môi hữu cơ khác (etanol, butanol, aceton) Thân, lá khoai tây làm nguồn

phân hữu cơ cung cấp cho đất và góp phần cải tạo đất [5]; [17].

4 Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong nhân giống in vitro

4.1 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

- Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Haberlandt G (nhà khoa học người Đức) đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tế bào thực vật Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hoà thảo trong 12 ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm Từ đó đến nay, rất nhiều công trình nghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ

sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào.

Phân hoá là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều đã phân hoá về cấu trúc và chức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi

là quá trình phản phân hoá

Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã phân hoá sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phân hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật Người ta đã tổng kết rằng: Những tế bào càng gần trạng thái của

tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

Sự phân hóa và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt động của gen Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số gen nào

đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho một tính trạng mới Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà

Sự hoạt hoá mô, cơ quan của cơ thể Khi tách riêng từng tế bào, hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [15]

Kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển phát triển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin thấp thì

mô nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo

mô sẹo [9]; [19]

4.2 Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro

Theo George (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước tiên tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ

(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh

trưởng của mẫu cấy in vitro [26].

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo

các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá,…chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…, ở súp lơ thì dùng hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để

nhân nhanh in vitro Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể sử dụng làm

mẫu cấy [32]

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:

- Bổ sung tổ hợp hooc môn sinh trưởng mới (tăng kinetin giảm auxin)

- Tăng cường ánh sáng 16 giờ/ngày tối thiểu 1000lx, ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hóa mạnh

- Bảo đảm chế độ nhiệt độ 20 - 300C

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích [21]

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng [30]

Bước 5: Thích ứng cây invtro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: Giá thể sạch, tơi xốp, thoát

nước Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [24]

4.3 Phương pháp nhân đa chồi

Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn

để chồi bên phát triển Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới

có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh [15]

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:

- Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta

sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến

- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [12]; [18]

Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước sau [9]:

Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong in vitro

4.4 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất chính là auxin, cytokinin và gibberellin

- Auxin:

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalen acetic acid (NAA) và 2,4 - diclophenoxy acid (2,4 D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện Chất này có tác dụng tăng hô hấp của

tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ Kết quả nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức đô phân tử trong tế bào theo ba

cơ chế: Cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzim và kích thích enzim hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin thích thích hoạt tính của ATPase; Cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các enzim phân giải axit

Tạo cây in vitro

hoàn chỉnh

Trồng câytrong bầuCây trồng ngoài

tự nhiên

nucleic; Cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng

tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ Làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và dẫn tới sinh trưởng Trong tế bào NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây

- Cytokinin:

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - benzyl aminopurin (BAP) Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axit nucleic Kinetin thực chất

là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạt chế sự hoá già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzim Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương

hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng

thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều kiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển.

- Gibberellin:

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là Gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp

tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn [20]; [9]

4.5 Kĩ thuật nhân giống khoai tây in vitro

Trồng khoai tây in vitro ở điều kiện vô trùng và hoàn toàn nhân tạo được gọi là nuôi cấy khoai tây in vitro Trồng khoai tây ở ngoài đồng ruộng gọi là trồng khoai tây in vivo Có loại trồng trọt trung gian giữa hai loại trên, đó là

trồng trọt khoai tây trong nhà kính hoặc nhà lưới Trồng như vậy gọi là trồng

bán in vitro (semi in vitro) hoặc bán in vivo (semi in vivo) Phương pháp cổ điển

nhân giống khoai tây là sản xuất khoai tây giống ở ngoài đồng Phương pháp này thường được gọi là chọn dòng Phương pháp chọn dòng thường tốn công sức và thời gian, tốc độ nhân giống chậm Các công nghệ nhân giống khoai tây

in vitro và bán in vitro đảm bảo nhân giống sạch bệnh với tốc độ nhanh Hiện

nay, hầu hết các chương trình nhân giống khoai tây trên thế giới dựa vào công nghệ nhân giống này Nó có thể tạo ra được giống xác nhận từ 3 - 5 năm sau vụ

trồng đầu tiên trên đồng ruộng Các phương pháp nhân giống in vitro và bán in vitro có thể được áp dụng xen kẽ vào các thời kỳ khác nhau của chương trình

nhân giống chủ yếu là để tạo ra các vật liệu giống sạch bệnh ban đầu, là nguồn giống hạt nhân hoặc giống gốc

Các vật liệu bán in vitro được trồng trong điều kiện nửa tự nhiên, nửa nhân

tạo (thường là trong nhà kính hoặc nhà lưới):

- Sản xuất các đoạn cắt mầm

- Sản xuất các đoạn cắt thân

- Sản xuất đoạn cắt chồi lá kép

- Sản xuất các củ nhỏ (minitubers)

Các củ nhỏ này có thể được sản xuất trên giá thể đông đặc (các khay nhựa hoặc bồn xi măng có chứa hỗn hợp mùn và đất sạch đã được khử trùng với tỷ lệ thích hợp) hoặc trên giá thể lỏng thường được gọi là thủy canh (hydroponic culture)

 Nhân giống tiền gốc và giống gốc:

Trên thế giới, trong một hệ thống nhân giống chuẩn càng giảm được số vụ trồng ở ngoài đồng càng nhiều càng tốt Bởi vì, nhân giống ở ngoài đồng hiệu

quả thấp (do giá chi phí cao), liên tục có sự rủi ro do các bệnh hại chủ yếu như các loại virus, vi khuẩn, nấm và các loại sâu hại.

Trong sản xuất giống khoai tây, điều mong muốn nhất là giống phải có độ sạch bệnh cao, ít sử dụng hóa chất độc hại cho môi trường và giống thương mại phải được sản xuất ra từ giống gốc tạo ra bằng điều kiện nhân tạo

Trong trường hợp nguồn củ giống của một số giống phổ biến bị thoái hóa

và cần phải được tái tạo từ một số ít vật liệu giống sạch bệnh, việc nhân nhanh giống sạch bệnh sẽ đảm bảo an toàn cho thị phần của giống Hơn nữa, trong trường hợp giống đang tồn tại được cải tiến bằng công nghệ chuyển gen, muốn nhanh chóng có đủ lượng giống thương mại, cần phải tổ chức nhân nhanh giống.Cuối cùng để sử dụng nguồn vật liệu di truyền nước ngoài hoặc đưa nhanh giống mới vào sản xuất cũng cần phải áp dụng công nghệ nhân nhanh giống [2]; [17]

5 Quy trình phục tráng, tạo cây khoai tây sạch bệnh

Ở châu Âu, khoai tây được nhân giống vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất Trong thời gian qua vệc làm sạch virus ở khoai tây mới được ứng dụng một cách chậm chạp trong quá trình duy trì giống Người ta chú ý nhiều nhất tới việc tạo ra các cây giống sạch bệnh bằng quy trình thử virus và trồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm thông qua các loại rệp lá Quy trình này có thể nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Quá trình

xử lý nhiệt ở nhiệt độ giữa 32 và 380C trong thời gian 7 ngày đến 7 tuần và sau

đó nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có thể loại trừ được virus A, xoăn lá, X và Y trong khi virus M và S cũng được giảm đi một cách đáng kể

Quy trình phục tráng và tạo cây khoai tây sạch bệnh

Các ảnh hiển vi điện tử của đỉnh sinh trưởng khoai tây có độ lớn

từ 80 - 100µm cho thấy chúng vẫn còn chứa trong tiêu bản tới 12 thể virus x Tuy vậy sau quá trình phân loại từ các đỉnh sinh trưởng đó vẫn thu được một tỷ

lệ phần trăm nhất định các cây sạch virus [1]; [18]

Cây bị nhiễm bệnh

Nuôi cấy trên môi trường thích hợp

Tái sinh cây

Trồng trên vườm ươm

Cây sạch bệnh

Người sử dụng

- Xác định virus

- Xử lý nhiệt độ cao

Nuôi cấy mô phân sinh (0,3 - 1,5mm)

- Xử lý nhiệt độ tiếp

- Xử lý hóa chất

- Điều kiện nuôi cấy thích hợp

Chăm sóc tốt

Xét nghiệm virus bằng:

- Cây chỉ thị

- Kính hiển vi điện tử

- Ghép

- Huyết thanh, ELISA

- Duy trì sự sạch bệnh (giám sát, cách ly)

- Nhân nhanh bằng nhiều phương pháp

6 Tình hình sản xuất giống khoai tây trên thế giới và Việt Nam

6.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Châu Âu có nền sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới và đang có xu hướng giảm nhẹ về diện tích, năng suất và sản lượng khá cao và ít biến động

Bảng 1 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây của châu Âu

(Triệu ha)

Năng suất(Tấn/ha)

Sản lượng(Triệu tấn)

Châu Á có nền sản xuất khoai tây lớn thứ 2 sau châu Âu, tập trung ở các nước như: Trung Quốc, Nhật Bản, Cộng hoà Dân chủ nhân dân Triều Tiên, Hàn Quốc, Myanma… Hiện nay, Trung Quốc là quốc gia trồng nhiều khoai tây nhất thế giới và đứng đầu châu Á cả về diện tích, năng suất và sản lượng [8]; [33]

Bảng 2 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây của châu Á

(Triệu ha)

Năng suất(Tấn/ha)

Sản lượng(Triệu tấn)

Sản xuất khoai tây của châu Á khá ổn định, năm 2000 có 7,96 triệu ha, năm

2002 diện tích trồng khoai tây thấp nhất 7,75 triệu ha, giảm 0,21 triệu ha, đến

2005 cả châu lục trồng được 7,86 triệu ha, gần bằng diện tích khoai tây của châu

Âu Năng suất khoai tây bình quân được tăng lên hàng năm và thấp hơn năng suất bình quân của châu Âu không đáng kể [16]; [25]

6.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Hiện nay khoai tây được coi là một trong những loại “thực phẩm sạch”, là một loại nông sản hàng hoá được lưu thông rộng rãi Với điều kiện khí hậu trong

vụ đông ở miền Bắc Việt Nam thì cây khoai tây được xem là cây trồng lý tưởng Tuy nhiên, tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam luôn biến động và phát triển không tương xứng với tiềm năng của nó

Bảng 3 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây của Việt Nam

(ha)

Năng suất(Tấn/ha)

Sản lượng(Tấn)

1991 - 1998 và đạt 11 - 12 tấn/ha vào những năm 1999 - 2002 Từ 2002 - 2005, năng suất giảm xuống chỉ còn khoảng 10 - 11 tấn/ha Năng suất khoai tây của nước ta chỉ bằng 61,3 % năng suất bình quân chung của thế giới, bằng 62,9% năng suất bình quân của châu Âu Sự tăng năng suất và diện tích khoai tây của Việt Nam là chưa đáng kể so với tiềm năng to lớn của nó So với các cây trồng

vụ đông khác như ngô, lạc, đậu tương… thì diện tích khoai tây chỉ chiếm phần nhỏ Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến năng suất khoai tây ở Việt Nam là chất lượng giống Củ giống kém chất lượng không có khả năng cho năng suất cao đồng thời bị hao hụt lớn trong quá trình bảo quản làm cho giá thành củ giống tăng, tăng chi phí đầu tư lên rất nhiều vì đầu tư giống chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng chi phí tiền mặt cho việc sản xuất khoai tây [7]

Giống khoai tây người nông dân sử dụng chủ yếu theo phương thức tự để, duy trì từ vụ này sang vụ khác, nhiều loại giống đang trồng phổ biến đã bị thoái hoá Kết quả điều tra cơ cấu giống ở một số vùng thuộc đồng bằng sông Hồng cho thấy, hầu hết các nơi còn duy trì giống Thường tín và các giống nhập nội đã

bị thoái hoá nghiêm trọng, năng suất thấp (8 - 9 tấn/ha) Trong thời gian gần đây, xuất hiện một tỷ lệ đáng kể khoai tây giống từ Trung Quốc do bà con nông dân tự nhập về với giá rất rẻ Đây là nguồn giống không được kiểm tra, kiểm dịch Qua số liệu điều tra cho thấy, khoai tây Trung Quốc mọc yếu, tỷ lệ không mọc được và thối cao, chiếm tới 20 - 30% Theo báo cáo của chương trình kinh

tế Việt - Đức (2003), tỷ lệ khoai giống nhập từ Trung Quốc để sản xuất tại Việt