NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC MỘT SỐ GEN THUỘC HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm vi khuẩn, virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các gen tham gia

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

HOÀNG THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC

MỘT SỐ GEN THUỘC HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ

(PENAEUS MONODON)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu sai tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn

Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2012

Tác giả luận án

Hoàng Thị Thu Yến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tôm sú và các bệnh thường gặp ở tôm sú 3

1.1.1 Giới thiệu về tôm sú 3

1.1.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm sú ở Việt Nam 5

1.1.3 Các bệnh thường gặp ở tôm sú 7

1.1.4 Phương pháp phòng và trị bệnh ở tôm sú 12

1.2 Hệ miễn dịch tôm sú 14

1.2.1 Đáp ứng miễn dịch tế bào 15

1.2.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 21

1.3 Nghiên cứu gen và tiềm năng ứng dụng trong phòng trị bệnh cho tôm sú 23

1.3.1 Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới 23

1.3.2 Nghiên cứu gen liên quan đến khả năng miễn dịch ở tôm sú 24

1.3.3 Tiềm năng ứng dụng của gen liên quan đến miễn dịch trong phòng trị bệnh ở tôm sú 28

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

2.1 Vật liệu 32

2.1.1 Thu thập mẫu 32

2.1.2 Hóa chất 32

2.1.3 Thiết bị 34

2.1.4 Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 36

2.2.2 Tinh sạch mRNA 37

2.2.3 Tổng hợp cDNA 38

2.2.4 Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn 41

2.2.5 Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 48

2.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR 49

2.2.7 Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR 49

2.2.8 Xác định trình tự gen (cDNA) 50

2.2.9 Biểu hiện gen ALFPm3 50

2.2.10 Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu 55

2.3 Địa điểm nghiên cứu 55

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Rab7 - protein liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của virus 56

3.1.1 Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam 56

3.1.2 Xác định và phân tích trình tự gen Rab7 58

3.2 Syntenin - protein liên quan đến con đường dẫn truyền tín hiệu 61

3.2.1 Phân lập đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam 62

3.2.2 Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam 64

3.2.3 Xác định và phân tích trình tự gen syntenin 65

3.3 Hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase 68

3.3.1 Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam 69

3.3.2 Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam 72

3.3.3 Phân tích trình tự gen hemoccyanin 74

3.4 Ran - protein điều khiển thực bào 76

3.4.1 Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam 77

3.4.2 Phân lập đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran 78

3.4.3 Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam 82

3.4.4 Xác định và phân tích trình tự gen Ran 83

3.5 Caspase - protein tham gia vào cơ chế apoptosis 84

3.5.1 Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam 85

3.5.2 Xác định và phân tích trình tự gen caspase 86

3.6 Hệ thống các protein kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus 90

3.6.1 Protein kháng virus PmAV 90

3.6.2 Peptide kháng khuẩn t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial peptide) 94

3.6.3 Yếu tố kháng khuẩn (ALF - antiliposaccharide factor) 99

3.7 Biểu hiện yếu tố kháng khuẩn tái tổ hợp (rALFPm3) 105

3.7.1 Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen 105

3.7.2 Xác định cấu trúc gen ALFPm3 được chuyển vào genome nấm men 108

3.7.3 Xác định đoạn peptide ALFPm3 được biểu hiện 109

3.7.4 Phân tích hoạt tính của rALFPm3 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113

1 Kết luận 113

2 Kiến nghị 114

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

5‟UTR Vùng 5‟ không dịch mã 5‟ Untranslated region

3‟UTR Vùng 3‟ không dịch mã 3‟ Untranslated region

AFLP Đa hình chiều dài DNA được

khuếch đại

Amplified fragment length polymorphism

ALFPm ALF dạng 1 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus

monodon isorform 1

ALFPm3 ALF dạng 3 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus

monodon isorform 3

apoptosis Tế bào chết theo chương trình Programmed cell death

E aerogenes Vi khuẩn Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes

EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST Đoạn trình tự gen biểu hiện Expressed sequence tag

kb Kb Kilo base

PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction

3‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái tổ hợp ở tôm sú dạng 3 từ

tôm sú

Recombinant anti-lipopolisaccharide

factor Penaeus monodon 3

RT-PCR PCR bằng enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase-PCR

SNP Đa hình các nucleotide đơn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung dịch Natri citrate Solution sodium citrate

TSV Virus gây hội chứng taura Taura syndrome virus

WSSV Virus gây bệnh đốm trắng White spot syndrome virus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thống kê các gen liên quan đến hệ miễn dịch ở tôm 26Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 34Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh tôm sú 3

Hình 1.2 Tôm sú nhiễm WSSV 10

Hình 1.3 Tôm sú nhiễm YHV 12

Hình 1.4 Tế bào máu tôm sú 17

Hình 1.5 Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin 19

Hình 1.6 Cơ chế đông máu ở tôm 21

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập gen 35

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự 42

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Invitrogen) 42

Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Clontech) 43

Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế mồi khi biết một phần trình tự đầu 5‟ của gen 43

Hình 2.6 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin 44

Hình 2.7 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin 44

Hình 2.8 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran 45

Hình 2.9 Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú 46

Hình 2.10 Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3 trưởng thành 46

Hình 2.11 Sơ đồ biểu hiện ALFPm3 51

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Rab7 57

Hình 3.2 Trình tự gen và amino acid suy diễn của Rab7 58

Hình 3.3 So sánh trình tự nucleotide ở gen Rab7 của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 59

Hình 3.4 Mô phỏng cấu trúc bậc hai và phân tích các motif chức năng của protein Rab7 60

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-syntenin 62

Hình 3.6 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-syntenin 63

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen syntenin 64

Hình 3.8 Trình tự gen và amino acid suy diễn của syntenin 66

Hình 3.9 So sánh trình tự amino acid của protein syntenin giữa các loài khác nhau 67

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-hemocyanin 70

Hình 3.11 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-hemocyanin 71

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen hemocyanin 72

Hình 3.13 Trình tự gen và amino acid suy diễn của hemocyanin 73

Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid của protein hemocyanin giữa các loài 75

Hình 3.15 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng một phần đoạn gen Ran 77

Hình 3.16 Trình tự nucleotide và amino acid đoạn gen Ran 78

Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 3‟-Ran 79

Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 5‟-Ran 80

Hình 3.19 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của gen Ran 81

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Ran 82

Hình 3.21 So sánh trình tự amino acid của protein Ran giữa các loài khác nhau 83

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen caspase 86

Hình 3.23 Trình tự nucleotide và amino acid của caspase 87

Hình 3.24 So sánh trình tự nucleotide của gen caspase của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 88

Hình 3.25 So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein caspase tôm sú với các loài tôm khác nhau 90

Hình 3.26 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen PmAV 92

Hình 3.27 Trình tự gen và amino acid suy diễn của protein PmAV 93

Hình 3.28 So sánh trình tự amino acid của protein PmAV 94

Hình 3.29 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin 96

Hình 3.30 Trình tự gen và amino acid suy diễn của gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin 96

Hình 3.31 So sánh trình tự amino acid của peptide kháng khuẩn t ương tự

crustin ở tôm 98

Hình 3.32 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen ALF 100

Hình 3.33 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm 101

Hình 3.34 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm3 102

Hình 3.35 So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 102

Hình 3.36 So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm3 ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 103

Hình 3.37 So sánh amino acid suy diễn ALF nhóm I 104

Hình 3.38 Mô hình cấu trúc biểu hiện cDNA của ALFPm3 106

Hình 3.39 Hình ảnh điện di tạo cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3 107

Hình 3.40 Xác định gen ALFPm3 trong genome nấm men ở các dòng nấm men 108

Hình 3.41 OD600nm tế bào nấm men P pastoris biến đổi qua các ngày cảm ứng biểu hiện 109

Hình 3.42 Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ hợp sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện 110

Hình 3.43 Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ hợp sau 2 ngày cảm ứng biểu hiện 110

Hình 3.44 Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng B megaterium 111

Hình 3.45 Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng E aerogenes 112

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Tôm sú là động vật thủy sản dùng làm thực phẩm mang lại lợi nhuận lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam Những năm đầu thập niên 90 của thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, “dịch bệnh” ở tôm cũng bắt đầu xuất hiện và lan rộng khắp thế giới Tác nhân gây bệnh chính phải kể đến là vi khuẩn và virus Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do các vi khuẩn

thuộc chi Vibrio spp Trong đó, loài gây bệnh phổ biến nhất là vi khuẩn phát sáng

V harvey Các tác nhân gây bệnh do virus bao gồm virus gây bệnh đầu vàng

(Yellow head virus - YHV), virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV)… được xem là các tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất và làm thiệt hại đáng kể đến nghề nuôi tôm

Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và đặc biệt là hệ thống miễn dịch ở tôm sú còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng Kích thước genome tôm sú là rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen người), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đô la Vì vậy, một trong những hướng nghiên cứu được lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm

sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vệ tinh, phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể (mtDNA), lập bản đồ gen tôm sú bằng giải mã EST/cDNA, nghiên cứu và phân tích

các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express sequence tag - EST), lựa chọn các chỉ thị

phân tử phục vụ công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan

Tôm sú không có hệ thống đáp ứng miễn dịch thích ứng thực sự (adaptive immune system), thay vào đó chúng phát triển hệ thống bảo vệ cơ thể khác được gọi

là miễn dịch tự nhiên (innate immunity) Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm vi khuẩn, virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các gen tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch Việc phát triển và ứng dụng rộng rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đã đóng vai trò quan trọng trong giải thích các quá trình phát sinh

mầm bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa, nhằm duy trì sự

ổn định của nghề nuôi tôm, kiểm soát hậu quả dịch bệnh, hạn chế thiệt hại do dịch bệnh ở tôm nuôi Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, thuốc kháng sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người Mặt khác, đối với các dịch bệnh do virus khi đã xảy ra thì chưa có biện pháp nào trị bệnh Đến nay, những đáp ứng miễn dịch của tôm đối với nguồn bệnh virus vẫn chưa được sáng tỏ Do đó, việc nghiên cứu cơ chế miễn dịch của tôm ở mức độ phân tử là cần thiết để đưa ra các giải pháp đúng đắn trong phòng trị bệnh cho tôm

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã bước đầu có các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh ở tôm Các nghiên cứu tập trung phát hiện bệnh tôm và đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm Ngoài ra, một vài cấu trúc protein tái tổ hợp của WSSV đã được tạo ra trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về các gen liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú còn ít được biết đến Do đó, để góp phần làm sáng tỏ cơ chế phân tử đáp ứng miễn dịch và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu phòng

trị bệnh ở tôm sú, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu

trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và xác định được trình tự một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú, tạo vật liệu nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ cơ chế đáp ứng miễn dịch và giải pháp trong phòng trị bệnh cho tôm sú;

- Bước đầu nghiên cứu tạo peptide kháng khuẩn rALFPm3

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú được tiến hành theo 3 hướng: các gen đã có thông tin trình tự được công bố; các gen chỉ có một phần thông tin trình tự; gen chưa có thông tin về trình tự

- Thiết kế vector mang gen mã hóa peptide kháng khuẩn, biểu hiện trong nấm men và bước đầu phân tích hoạt tính của peptide tái tổ hợp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÔM SÚ VÀ CÁC BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM SÚ

1.1.1 Giới thiệu về tôm sú

Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên

năm 1798 Ngoài ra, loài tôm này còn được gọi với tên địa phương là tôm rong [11]

Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng thuộc họ Penaeidae và được phân loại như sau [38]

Giới: Animalia

Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustatacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda

Bộ phụ: Natantia Siêu họ: Penaeoidea Họ: Penaeidae Chi: Penaeus Loài: monodon

Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1.1) Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể lên đến 330 mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thương mại quan trọng [209]

Hình 1.1 Hình ảnh tôm sú [14]

Tôm sú có nguồn gốc từ Ấn Độ Dương, phía Tây Nam Thái Bình Dương và được nuôi chủ yếu ở các nước châu Á [174] Loài tôm này sống ở nơi chất đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40m nước và độ mặn từ 5 - 34 0/00 Tôm sú có khả năng sinh trưởng nhanh, trong 3 - 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40 - 50 g Tôm sú trưởng thành tối đa đối với con cái có chiều dài từ 220 - 250 mm, trọng lượng đạt từ

100 - 300 g, con đực dài từ 160 - 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 - 200 g Tôm sú có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác

Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, từ ven bờ đến vùng có

độ sâu 40 m, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ [11]

Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và khối lượng Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá thể Tôm sú thuộc loài dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở cùng độ tuổi Có thể phân biệt con đực và cái thông qua hình dạng cơ quan sinh dục bên ngoài Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái trong tự nhiên là từ tháng thứ tám trở đi [11]

Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, sinh trưởng tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể Sau khi trứng được đẻ 14 - 15 giờ, ở nhiệt độ 27 - 280C sẽ nở thành ấu trùng Ấu trùng theo các

làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giống (juvenile) và bơi ra biển,

tiếp tục chu trình sinh trưởng , phát triển và sinh sản của chúng Ở mỗi giai đoạn trong chu kỳ sinh trưởng, tôm phân bố ở những thủy vực khác nhau như vùng cửa sông, vùng biển ven bờ hay vùng biển khơi và có tính sống trôi nổi hay sống đáy [11], [145], [174]

Thịt tôm sú là một loại thực phẩm thủy sản rất có lợi cho sức khỏe con người

và được ưa thích trên thế giới cũng như ở Việt Nam Thực phẩm từ tôm rất tốt cho

sức khỏe do chứa các protein năng lượng thấp, ít chất béo, có hàm lượng selenium, amino acid cao, ngoài ra còn là nguồn cung cấp các vitamin cho con người Nhiều vitamin ở tôm rất cần thiết cho làn da khỏe mạnh, xương và răng như B6, E, A, D

và B12 Hàm lượng vitamin B12, axit béo omega-3 cao ở tôm rất có lợi cho tim mạch, ngăn chặn sự tắc nghẽn mạch máu và bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer Các nghiên cứu trước đây cho rằng: thực phẩm từ tôm có chứa cholesterol do đó ảnh hưởng đến tim mạch Tuy nhiên, khi so sánh với các thực phẩm khác như trứng thì tôm có hàm lượng cholesterol thấp hơn Do đó, ăn tôm có thể chống lại bệnh rối loạn nhịp tim và huyết áp cao Hàm lượng các muối khoáng cao, đặc biệt là selenium ở tôm có vai trò cảm ứng tổng hợp và sửa chữa DNA, loại bỏ các tế bào bất thường, ức chế sự sinh sản tế bào ung thư và gây nên sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào Ngoài ra, selenium còn tham gia vào các vị trí hoạt động của nhiều protein quan trọng, bao gồm cả các enzyme chống oxy hóa [143], [231]

Tôm sú là loài động vật thủy sản được khai thác tự nhiên cũng như nuôi, mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có các nước châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ [174] Nghề nuôi tôm sú có ưu thế rất lớn đối với các nước này

vì đây là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, có đóng góp hết sức quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xoá đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2010, diện tích nuôi tôm sú cả nước đạt 613.718 ha, giá trị xuất khẩu tôm sú đạt 1,45 tỷ USD [16]

1.1.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm sú ở Việt Nam

Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ và biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao hồ và gần 3200 km bờ biển với thành phần giống loài thủy sản phong phú

là tiềm năng to lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc Nghề nuôi tôm ở nước ta là một thế mạnh của thuỷ sản, Việt Nam đã trở thành một trong 5 quốc gia xuất khẩu tôm lớn nhất thế giới Tôm sú Việt Nam đã được xuất khẩu sang hơn 80 nước và vùng lãnh

thổ [201] Duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm khỏe mạnh và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Một trong những vấn đề mà nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đang phải đối mặt là nguồn tôm sú bố mẹ Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng gia hóa tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm sú bố mẹ đã được gia hóa thành công, tuy nhiên tôm bố mẹ gia hóa cấp cho các trại sản xuất tôm giống chưa được nhiều Hàng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ con tôm sú giống giai đoạn PL15 (postlarva 15 - tôm giống 15 ngày tuổi) được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống [3] Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất kinh doanh tại các trại sản xuất tôm giống chi phối thường dẫn đến chất lượng tôm sú giống không được đảm bảo,

có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh và tiềm ẩn nhiều rủi ro lớn cho người nuôi tôm

Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm

sú đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm sú

có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến nay, dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do tập trung khoảng 87% diện tích nuôi tôm sú của cả nước Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 - 1994 được xác định ở tôm sú có các loại bệnh chính là bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng… [8], [10], [11]

Nước ta đã bước đầu chú ý đến các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh Các nghiên cứu bước đầu tập trung nghiên cứu đa dạng genome tôm sú [9], phát hiện bệnh tôm sú [3], [4], [13], đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm sú [2], nghiên cứu một vài protein cấu trúc tái tổ hợp của WSSV trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phòng trị bệnh cho tôm sú [1], [12], [15] Đây là những hướng nghiên cứu phù hợp và có triển vọng, đặt cơ sở khoa học,

kỹ thuật cho phép thực hiện các nghiên cứu nâng cao chất lượng của giống thủy sản

có giá trị kinh tế cao này

1.1.3 Các bệnh thường gặp ở tôm sú

1.1.3.1 Bệnh do vi khuẩn

Các vi khuẩn liên quan đến bệnh ở tôm có thể là nguồn bệnh trực tiếp hoặc gây bệnh cơ hội Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn ở tôm có thể gây chết, tổn thương kitin, hoại tử, sự đổi màu của mang, tăng trưởng chậm, lớp biểu bì lỏng lẻo, ruột trắng, trạng thái hôn mê và hấp thụ thức ăn giảm… Các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu

ở tôm nuôi là Vibrio, vi khuẩn dạng sợi, vi khuẩn màng nhày, vi khuẩn phân hủy chitin và vi khuẩn ký sinh [103]

Các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio spp là nguồn gây bệnh chính ở tôm, chúng

phân bố rộng rãi trong môi trường nước ngọt, nước lợ và biển Hơn 20 loài thuộc chi

này đã được biết đến, một số trong chúng là nguồn bệnh ở người (V cholerae, V

parahaemolyticus và V vulnificus) trong khi một số loài là nguồn bệnh của các động

vật ở nước bao gồm tôm (V harveyi, V spendidus, V penaecida, V anguillarum, V

parahaemolyticus, V vulnificus) Phần lớn các loài trong chi Vibrio spp được cho là

nguồn bệnh cơ hội, một số trong chúng có thể là nguồn bệnh chính như V harveyi V

harvey là vi khuẩn phát sáng được tìm thấy trên bề mặt cơ thể và ruột của các sinh vật

sống ở nước biển, nước lợ và cũng tìm thấy trong các ao nuôi tôm và đáy ao [95],

[189] Tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy là do Proteobacterium alpha Các vi khuẩn sợi như Leucothrix mucor, Thiothrix sp, Flexibacter sp, Flavobacterium, Cytophaga

sp có thể gây bệnh cho tôm ở giai đoạn ấu trùng Dấu hiệu của bệnh là màu mang thay đổi, tiêu thụ thức ăn thấp, sinh trưởng kém và tỷ lệ chết cao Bệnh này xuất hiện khi chất lượng nước kém và ở mật độ nhiễm cao có thể dẫn đến sự hoại tử mô mang

Các vi khuẩn gây bệnh phân hủy vỏ kitin bao gồm: Benekea, Pseudomonas,

Aeromonas, chi vi khuẩn xoắn và vi khuẩn ký sinh [103]

Sero spp Giai đoạn protozoae và mysis thường bị nhiễm với các triệu trứng bệnh

như hôn mê và gây chết do bào tử nấm và hệ sợi nhiễm vào các mô như phần phụ

và mang Bệnh nấm ở ấu trùng phổ biến ở nơi ươm giống tôm Gopalan và đtg

(1980) cho rằng, Lagenidium marina và Siro para là tác nhân nhiễm ở tôm sú [76],

chúng gây chết ở ấu trùng tôm sú giai đoạn nauplii, zoea và mysis [163] Bệnh

mang đen và Fusariosis gây ra bởi Fusarium spp có thể gây ảnh hưởng tất cả các giai đoạn phát triển của tôm penaeid Fusarium spp (F solani, F moniliformae) là

các nguồn bệnh cơ hội có thể dẫn đến tỷ lệ chết cao (90%) Bệnh được cho là do các

ao nuôi có chất lượng nước kém Sợi nấm được phát hiện ở mô động vật bị nhiễm bằng sử dụng kính hiển vi quang học [103]

Một số sinh vật ký sinh, đặc biệt là động vật nguyên sinh có thể nhiễm vào tôm ở các giai đoạn phát triển khác nhau Các động vật nguyên sinh cùng hội sinh

có thể phát hiện được ở mang, chân bơi (periopod), các phần phụ khác và các cơ quan bên trong cơ thể Ở mức độ nhiễm cao, các động vật nguyên sinh có thể gây tắc nghẽn ở mang (mang trở nên màu nâu) dẫn đến chứng biếng ăn, giảm sinh trưởng, vận động và tăng khả năng nhiễm các nguồn bệnh cơ hội khác Động vật

nguyên sinh như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Anophrys, Acineta sp,

Agenophrys và Ephelota có thể là các ký sinh trùng tác động từ bên ngoài Các ký

sinh trùng như Paranophrys spp và Parauronema sp có thể gây chết cho tôm ở giai

đoạn ấu trùng và ấu niên Các ký sinh trùng này đi vào cơ thể tôm qua vết thương

và xâm nhiễm vào máu, mang làm tăng tỷ lệ chết, đặc biệt trong trường hợp có sự

xâm nhiễm kết hợp với các ký sinh trùng khác như Leptonmonas spp Tôm bị nhiễm

các ký sinh trùng này có thể chẩn đoán bằng kiểm tra độ đục của máu, máu không đông, lượng tế bào máu giảm và số lượng ký sinh trùng tăng rất lớn Các động vật nguyên sinh kí sinh bên trong tôm thường tồn tại dưới dạng nhóm, chúng có 2 loại vật chủ là động vật thân mềm (giun đốt) và giáp xác Các nhóm động vật nguyên

sinh được phát hiện ở tôm bao gồm: Nematopsis litopenaeus, Paraphioidina

scolecoide, Caphalobolus litopenaeus, Caphalobolus petiti và Caphalobolus stenai

Các bào tử trưởng thành và giao tử được tìm thấy ở thành ruột và các khoang của cơ

thể Các bệnh do ký sinh trùng gây giảm hấp thụ thức ăn nhưng dường như ít ảnh

hưởng đến nuôi trồng thủy sản Một số ký sinh trùng khác như Agmasoma spp,

Microsporidium spp có thể xâm nhiễm vào cơ, tim, tuyến sinh dục, mang và gan

tụy Tôm bị nhiễm dẫn đến các mô bị mờ đục và uốn cong cơ thể nhưng không gây chết tôm, tôm bị bệnh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Có thể chẩn đoán bệnh này nhờ quan sát các bào tử ở mô cơ bị nhiễm [103]

1.1.3.3 Bệnh do virus

Virus là nguồn bệnh phổ biến nhất ở biển, chúng hiện diện đến 10 tỷ trong 1 lít nước biển và một số trong chúng có thể nhiễm vào nhiều sinh vật [74] Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 20 loại virus nhiễm ở tôm [126] Trong số các virus này, virus được nghiên cứu nhiều nhất ở tôm nuôi là WSSV, YHV và TSV, chúng được cho là các virus gây bệnh nghiêm trọng nhất ở tôm [59] Tuy nhiên, có rất ít hiểu biết về các virus này ở giáp xác hoang dã [34] Trong đó, tôm sú n hiễm WSSV và YHV gây nên bệnh nghiêm trọng cho tôm nuôi, kết quả dẫn đến sự thiệt hại lớn về kinh tế

Bệnh đốm trắng gây ra bởi virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) được phát hiện lần đầu tiên ở Đài Loan năm 1992, tiếp đến là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc vào năm 1993 Do nuôi tôm thâm canh, môi trường nuôi tôm không an toàn và sự thương mại sản phẩm đông lạnh trên toàn thế giới, WSSV nhanh chóng lan ra các vùng nuôi tôm ở khu vực châu Á, châu Âu

và cả châu Mỹ [64], [117] Trong số các virus gây bệnh ở tôm sú, WSSV gây thiệt hại lớn nhất và là một vấn đề lớn mà ngành thủy sản phải đối mặt cho đến hiện nay [174] Ở tôm nuôi, nhiễm WSSV có thể dẫn đến tỷ lệ chết lên đến 100% trong vòng

3-10 ngày [97] Ngoài họ tôm penaeid, WSSV lây nhiễm một loạt các động vật giáp

xác khác như cá, tôm hùm, cua và thậm chí được phát hiện ở cả côn trùng [64] Tuy nhiên, sự lây nhiễm thường không gây chết cho các loài này và do đó chúng là động vật mang virus [124], [123], [221]

Hình 1.2 Tôm sú nhiễm WSSV [119]

Các động vật nhiễm bệnh có dấu hiệu kém ăn, chuyển động chậm, màu cơ thể chuyển từ hồng sang đỏ, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy Gan, tụy thường có màu trắng hoặc hơi vàng Đặc trưng của tôm

bị nhiễm WSSV là các đốm trắng trên vỏ kitin (Hình 1.2) Những đốm trắng này là kết quả của sự vôi hóa, có kích thước từ vài mm đến 1 cm hoặc có thể hơn, vỏ mỏng lỏng lẻo có thể bóc ra khỏi lớp biểu bì một cách dễ dàng [2], [51]

Genome của WSSV là DNA sợi đôi, vòng, siêu xoắn có kích thước khoảng

300 kb Trong đó, chủng phân lập từ Thái Lan có kích thước nhỏ nhất 292967 bp, genome của WSSV ở Đài Loan có kích thước lớn nhất là 307287 bp, genome của WSSV phân lập từ tôm sú ở Trung Quốc là 307107 bp Genome WSSV phân lập từ Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan đã được phân tích, những biến đổi về trình tự nucleotide giữa các virus đã được công bố [140] Phân tích trình tự của DNA genome tôm sú và so sánh với dữ liệu trình tự đã chỉ ra rằng WSSV không có sự tương đồng với bất kỳ virus nào đã được biết đến WSSV được xếp vào một họ virus mới (Nimarividae) và một chi virus mới: Whispovirus [213]

WSSV có thể được truyền nhiễm theo cả chiều ngang và chiều dọc [66] Sự lây truyền này có thể qua nước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do tôm khoẻ ăn con bị nhiễm bệnh đốm trắng [50], [100] Các mô đông lạnh cũng có thể

là nguyên nhân lây truyền bệnh [63] Sau đó sự xâm nhiễm được cho là chủ yếu thông qua mang, nhưng có thể xảy ra thông qua bề mặt khác của cơ thể [42], [50], [51] WSSV cũng lây truyền theo chiều dọc trực tiếp từ mẹ sang con cái, duy trì qua

giai đoạn ấu trùng, tôm giống và đã được chứng minh bằng thực nghiệm mặc dù sự xuất hiện của WSSV ở trứng của tôm vẫn chưa được rõ ràng [122], [158] Kết quả theo dõi tôm sú nuôi tại Việt Nam của Bùi Quang Tề cho thấy WSSV lan truyền theo chiều ngang là chính [8] Cho đến nay, không có loài tôm nào thuộc họ tôm he được biết là có khả năng kháng WSSV [117], [127] Có nhiều phương pháp để chẩn đoán WSSV bao gồm phương pháp mô học và kính hiển vi được thực hiện bằng cách kiểm tra phần mô nhuộm màu [117]; các phương pháp miễn dịch dựa trên việc tạo ra kháng thể đơn dòng và đa dòng để chống lại các kháng nguyên virus Các kháng thể đơn dòng và đa dòng [135], [242], phân tích miễn dịch [147] Bên cạnh đó, các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng phổ biến như phương pháp Dot blot [62], [182], kỹ thuật lai phân tử [42], [230], phương pháp PCR [117], [121]

Bệnh đầu vàng gây ra do virus gây hội chứng đầu vàng (Yellow head virus – YHV) được phát hiện lần đầu tiên ở tôm sú tại Thái Lan năm 1990 Tôm nhiễm YHV thường được mô tả với màu vàng sáng ở vùng đầu ngực và cơ thể thường nhợt nhạt (Hình 1.3) Màu vàng của vùng đầu ngực là do triệu trứng bệnh ở gan tụy màu vàng [44] YHV lan rộng và nhanh trong các vùng nuôi tôm sú ở Thái Lan Tôm bị nhiễm YHV chết trong vòng vài giờ và toàn bộ tôm nuôi có thể bị thiệt hại trong vòng 3-5 ngày sau khi xuất hiện tôm nhiễm [72] với sự hoại tử ở cơ quan bạch huyết, mang, mô liên kết, tế bào máu và cơ quan tạo máu [216] Cơ quan bạch huyết

có thể là đích đầu tiên của YHV dựa trên cơ sở nghiên cứu mô bệnh và nghiên cứu thụ thể YHV [24], [130] Ngoài tôm sú, YHV gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng

(Litopenaeus vannamei) và tôm xanh Thái Bình Dương (Penaeus stylirostris) [128], tôm trắng Thái Bình dương (Penaeus sytiferus) và Acete spp [67] YHV có kích

thước rộng 40-60nm, dài 150-200nm, ở đầu tròn có chứa RNA sợi đơn (+) khoảng

26 kb Virus này thuộc chi Okavirus, Roniviridae, Nidovirales [44], [228] YHV tồn tại ít nhất 3 biến thể di truyền khác nhau [215], biến thể đầu tiên được công bố là YHV phân lập ở Thái Lan khác biệt với biến thể virus kết hợp với mang (Gill associated virus - GAV) ở Úc khoảng 15% trình tự nucleotide [53] Kiểu trung gian thứ 3 của YHV được phát hiện ở Thái Lan và Việt Nam [103]

Hình 1.3 Tôm sú nhiễm YHV [8]

Tôm nhiễm YHV có thể được chẩn đoán bằng mô bệnh học nhờ quan sát sự xuất hiện khối hoại tử lớn và thể vùi tế bào chất ở các mô ngoại bì và trung bì [35], [44] Để phát hiện nhanh YHV, đã có một số quy trình chẩn đoán được thực hiện như nhuộm [70], [71], dot blot [129], [148], kỹ thuật Western blot [147], kỹ thuật

RT - PCR [229] và mẫu dò gen [200] Các kỹ thuật miễn dịch cũng được sử dụng để phát hiện sự lây nhiễm, kháng thể kháng YHV được sản xuất ở Thái Lan [183], [184] để ứng dụng cho chẩn đoán mô bệnh của YHV và phát triển các test để chẩn đoán nhanh bệnh này

1.1.4 Phương pháp phòng và trị bệnh ở tôm sú

Bệnh truyền nhiễm là một trở ngại chính cho sự thành công, phát triển và là nguyên nhân gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn trong nghề nuôi trồng thủy sản Để phòng bệnh do vi khuẩn ở tôm trước khi nuôi thả cần làm kỹ công tác cải tạo ao, phải có bể chứa lắng để xử lý nước trước khi cấp sang ao nuôi Tôm giống thả nuôi phải được kiểm dịch, có chất lượng tốt và nuôi ở mật độ thích hợp, không nên nuôi với mật độ qúa cao dẫn đến tôm dễ nhiễm bệnh Việc quản lý môi trường tốt, không cho thức ăn dư thừa để tránh hiện tượng tảo chiếm ưu thế trong ao gây ra ô nhiễm nền đáy tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển gây bệnh Trong quá trình nuôi cần cải

thiện môi trường nuôi bằng cách thường xuyên sử dụng các loại vôi một cách hợp

lý, sử dụng máy quạt nước để gom tụ các chất thải vào giữa ao Việc tăng cường sử dụng các loại chế phẩm sinh học, bổ sung đường carbon xuống ao tạo điều kiện cho

vi khuẩn có lợi phát triển mạnh át chế vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, cần tăng cường sức khoẻ của tôm bằng cách bổ sung vitamin C vào thành phần thức ăn Các vi khuẩn có lợi cũng được các nhà khoa học nghiên cứu chế biến trong thức ăn tôm có tên gọi là probiotics Khi tôm bị nhiễm bệnh có thể sử dụng các loại thuốc kháng sinh như Furacin, Oxytetracycin… trộn vào thức ăn cho ăn liên tục 7-10 ngày [8] Phương pháp này có hạn chế là chi phí mua thuốc lớn, dư lượng kháng sinh lớn ở

cơ thể tôm ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe con người và xuất hiện các mầm bệnh kháng thuốc có thể là nguồn bệnh lây nhiễm cho con người Vì vậy, cần phải tìm ra một chất mới có thể thay thế cho thuốc kháng sinh đồng thời chống lại mầm bệnh trên thủy sản [238]

Đối với các bệnh do nấm và ký sinh trùng cần phải sử dụng giải pháp phòng

và trị bệnh tổng hợp Trong các ao trại ươm giống, nuôi tôm, thức ăn tươi sống có nguy cơ nhiễm nguồn bệnh do vậy cần phải được khử trùng Đáy ao phải thường xuyên được xử lý bằng các hóa chất để diệt nguồn bệnh trong phân trước khi nuôi Một số hóa chất đã được sử dụng như formalin, xanh malachite và trelafan [8]

Hiện nay, chưa có phương pháp hiệu quả để xử lý các bệnh do virus gây ra

Do vậy, chiến lược chính để giảm bệnh ở tôm là phòng tránh Để phòng bệnh tôm

sú trước tiên phải kiểm nghiệm và chọn con giống sạch bệnh trước khi thả nuôi bằng các phương pháp khác nhau, trong đó PCR là phương pháp tương đối hiệu quả Thêm vào đó ao nuôi tôm cần được tháo cạn nước và xử lý bằng hóa chất, nước được đưa vào ao nuôi cũng phải được xử lý bởi các hóa chất cho phép để loại

bỏ các tác nhân có thể gây bệnh Tiếp theo, người nuôi tôm phải chọn mùa vụ thích hợp để thả tôm, tránh thả tôm vào giữa và cuối mùa mưa do nhiệt độ không khí và lượng nước thấp Mưa lớn có thể là một nguyên nhân đưa nước chưa được xử lý vào

ao nuôi Hạn chế không cho nước chưa được xử lý vào ao nuôi đồng nghĩa với việc hạn chế được tác nhân mang mầm bệnh cho tôm như các loài giáp xác hoang dã Đồng thời trong quá trình nuôi, ao nuôi tôm cũng phải xử lý formol định kỳ nhằm loại bỏ những cá thể bị nhiễm virus đốm trắng ra khỏi quần đàn một cách kịp thời Việc nuôi tôm cần có các ao chứa để xử lý việc lan tràn nguồn bệnh khi dịch bệnh bắt đầu xảy ra Ngoài ra, trong quá trình nuôi tôm việc sử dụng một chế độ ăn thích hợp cũng góp phần tạo môi trường an toàn [2], [117]

Có nhiều bằng chứng cho rằng tôm không có khả năng bảo vệ cơ thể khi tiếp xúc lần đầu tiên với các tác nhân gây bệnh mới xuất hiện Điều này chỉ ra tôm không có hệ miễn dịch thích ứng Tuy nhiên, một số tôm vẫn có khả năng tồn tại và phát triển tương đối khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh [68] Mặt khác, tôm khỏe mạnh thường bị nhiễm virus ở mức độ thấp [90], [215] và tôm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh virus đã được chứng minh có khả năng kháng khi tiếp xúc virus ở lần tiếp theo [212] Do vậy, một trong các giải pháp đã được nghiên cứu sử dụng để tăng cường khả năng miễn dịch cho tôm là các chất chiết xuất từ các loài sinh vật và các chất kích thích miễn dịch Nhiều chất chiết xuất từ các loài sinh vật khác nhau được kết hợp trong chế độ ăn của tôm trước và sau khi nhiễm WSSV, đã chứng minh cải thiện khả năng miễn dịch và làm giảm tỷ lệ tử vong của tôm bị nhiễm WSSV Các

chất đó là Fucoidan chiết xuất từ tảo biển Sargassum polycystumwas [49], methylheptyl chiết xuất từ lá Pongamia pinnata [164] và một số chất khác chiết xuất

2-khác [29], [52] Ngoài ra, chế độ ăn có các các chất kích thích miễn dịch như β-1, glucan [40], [41], lipopolysaccharide [199], peptidoglycan [110] có khả năng kích thích miễn dịch bẩm sinh giúp tôm có khả năng sống sót cao hơn khi nhiễm WSSV

3-1.2 HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ

Động vật không xương sống, trong đó có tôm chỉ phát triển hệ miễn dịch tự nhiên (innate immunity) [88], [91] Hệ miễn dịch tự nhiên chia ra làm hai hệ thống bảo vệ chính: miễn dịch tế bào (cellular barriers) và miễn dịch dịch thể (Humoral

barriers) Miễn dịch tế bào bao gồm hệ thống thực bào (phagocytocis), tạo thể bao (encapsulation), thể hạch (nodulation) bao vây vật thể lạ xâm nhập và sau đó phá hủy thông qua hệ thống hoạt hóa Pro-phenoloxidase (proPO activating system) Ngoài ra, trong đáp ứng miễn dịch kháng virus còn có cơ chế apoptosis Miễn dịch dịch thể bao gồm các hệ thống: bổ thể (complement system), đông máu (hemolymph coagulation system), yếu tố dính kết tế bào (agglutinin - lectin system)

và quá trình tổng hợp các loại peptide kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus [98], [119], [202], [235] Các hệ thống bảo vệ cơ thể của động vật không xương sống được thể hiện ở bảng 1.1 Ngoài ra,vỏ kitin ở tôm là rào cản vật lý có vai trò trong các quá trình sinh lý khác nhau liên quan đến các phản ứng miễn dịch [146]

1.2.1 Đáp ứng miễn dịch tế bào

1.2.1.1 Thành phần tế bào

Động vật giáp xác có hệ thống tuần hoàn mở với máu màu xanh lá cây, tuần hoàn qua mạch máu và đưa đến các mô Các tế bào máu (hemocytes) và thành phần dịch thể được vận chuyển trong máu giúp chúng tiếp xúc dễ dàng với các phân tử từ bên ngoài Sự tạo máu hình thành nên các tế bào trưởng thành của hệ thống miễn dịch tự nhiên, số lượng tế bào máu thể hiện vai trò bảo vệ vật chủ và sự cân bằng

Sự hình thành tế bào máu được điều khiển bởi các tín hiệu bên trong và ngoài tế bào, kết quả dẫn đến sự hoạt hóa của hàng loạt tín hiệu đặc trưng Mô tạo máu (hematopoietic tissue - HPT) ở động vật giáp xác là một mạng lưới của tiểu thùy nằm ở hai bên lưng và mặt trên của dạ dày, gần động mạch dâu và ở gốc hàm Các

tế bào máu được tạo ra trong thành của các ống này và giải phóng vào trong các khoang mạch HPT của tôm sú và tôm penaeid khác nằm trong các vùng khác nhau của dạ dày, hàm và tuyến râu [80]

Các tế bào máu ở họ tôm Penaeid nói chung và ở tôm sú nói riêng có đặc tính sinh học và chức năng tương tự với các đại thực bào, bạch cầu hạt và tế bào giết tự nhiên của động vật có xương sống [208] Những tế bào này thực hiện các

quá trình thực bào, hình thành thể hạch, thể bao, melanin, hoạt hóa proPO và apoptosis Chúng cũng tạo ra các yếu tố dính kết tế bào (agglutinin-lectin system),

hệ thống đông máu (hemolymph coagulation system), hệ thống bổ thể (complement system), và peptide kháng khuẩn (AMP) [98], [119], [202], [235] Các tế bào máu giải phóng các enzyme ức chế cần thiết để điều khiển phân giải nhiều protein, ngăn chặn sự biểu hiện quá nhiều protein và các mô bị phá hủy [99], [209]

Có ba loại tế bào máu (hemocytes) ở tôm: bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt

và bạch cầu bán hạt [7], [80] (Hình 1.4) Các bạch cầu đơn nhân chiếm 5 - 15% tế bào máu lưu thông, là những tế bào nhỏ không khúc xạ, có nhân nhỏ, trong tế bào chất có ít hoặc không có hạt tế bào chất Bạch cầu đơn nhân không có hoạt động thực bào và dễ dàng bám vào các bề mặt kính, giống như các đại thực bào ở cá và động vật có vú Vai trò chính của các tế bào này có liên quan đến quá trình đông máu và thực bào [247] Bạch cầu hạt chiếm 10-20% tế bào máu lưu thông, nhân nhỏ nhất trong số các tế bào máu Loại tế bào này có thể bị kích thích bởi β-1,3-glucans, peptidoglycans (PG) và lipopolysaccharides (LPS) để gây nên sự xuất bào (exocytosis) và giải phóng enzyme Ngoài ra, trong tế bào chứa lượng lớn hạt tế bào chất (hạt có chiều rộng 0,8M), các hạt sẽ giải phóng ra các protein bám β-glucan; lipopolysaccharide; peptidoglican, các yếu tố đông máu (transglutaminase), các yếu

tố liên quan đến enzyme prophenoloxidase (proPO; ppA; peroxinectin), các chất ức chế proteinase (-macroglobulin; karazl; serpin; pacifastin) và các chất kháng khuẩn (penaeidin; lectin) Chức năng của chúng là hình thành thể bao, khởi động hệ thống proPO và thực bào Các bạch cầu bán hạt chiếm 75% tế bào máu lưu thông,

có một số lượng lớn các hạt nhỏ (hạt có chiều rộng 0,4 micromet) giống như bạch cầu hạt ở động vật có xương sống Các tế bào này chứa các thụ thể cho β-1,3-glucans và hoạt động chức năng chủ yếu của chúng liên quan đến thực bào, tạo thể bao để bao bọc các vật thể lạ và đông máu [142], [247]

A

B

Hình 1.4 Tế bào máu tôm sú

A Tế bào máu tôm sú chụp dưới kính hiển vi: H (Hyaline cell - Bạch cầu đơn nhân; S

(Semigranular cell - bạch cầu bán hạt); L (Large granular cell - Bạch cầu hạt), B Mô phỏng các

loại tế bào máu ở giáp xác [194]

1.2.2.2 Các quá trình đáp ứng miễn dịch tế bào

Thực bào là cơ chế miễn dịch tế bào chính ở tôm liên quan đến sự thu nhận các vật thể lạ từ bên ngoài Cơ chế này được thực hiện bởi bạch cầu bán hạt và bạch cầu hạt Quá trình thực bào bao gồm các bước: hướng hóa, bám chặt, tiêu hóa, phá hủy tác nhân gây bệnh và xuất bào [106], [210] Nhìn chung, quá trình thực bào ở động vật không xương sống nói chung và tôm nói riêng tương tự như ở động vật có xương sống Tuy nhiên, sự tiếp xúc miễn dịch luôn được thực hiện có tính ngẫu nhiên, rất hiếm chủ động theo kiểu hóa hướng động ở động vật có xương sống [5] Ngoài ra, bạch cầu bán hạt có khả năng nhận biết các tác nhân xâm nhập và hoạt động như là một sự opsonins hóa kết hợp với hệ thống hoạt hóa proPO [166] Các thể hạch phân giải tế bào máu phát hiện trong gan tụy và mang, được hình thành bởi nhiều tế bào máu cùng hoạt động hỗ trợ để bẫy các vi sinh vật hoặc các kháng nguyên lớn mà không thể loại bỏ bởi cơ chế thực bào Sau đó, các thể hạch này trải qua sự hoạt hóa của hệ thống proPO, sự melanin hóa và phá hủy vi khuẩn [208], [219]

Tế bào tạo máu (prohaemocytes)

Bạch cầu hạt (Granular cell)

Bạch cầu đơn nhân (Hyaline cell)

Bạch cầu bán hạt (Semigranular cell)

Tế bào tạo máu (prohaemocytes)

Bạch cầu hạt (Granular cell)

Bạch cầu đơn nhân (Hyaline cell)

Bạch cầu bán hạt (Semigranular cell)

Các yếu tố chống oxy hóa bảo vệ tôm khỏi những tác động gây độc tế bào gây ra bởi trao đổi chất tế bào và stress oxy hóa tạo ra bởi sự mất cân bằng của các chất phản ứng ôxy trung gian (reactive oxygen intermediates - ROIs) và chất phản ứng nitơ trung gian (reactive nitrogen intermediates - RNIs) Để ngăn chặn sự phá hủy này, chiến lược bảo vệ chất chống oxy hóa đã được phát triển bao gồm các enzyme (catalase, glutathione peroxidase (GPX), SOD) và các thành phần khác (ascorbate, β-carotene, flavonoid, α-tocopherol và vitamin E) có thể trung hòa ROIs hoặc sửa chữa sự phá hủy ở mức độ phân tử cho tế bào [151] Bằng thực nghiệm Down và đtg (2001) đã đưa ra kết luận các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò như các chất điều khiển đáp ứng miễn dịch [61] Hoạt động của enzyme superoxide dismutase (SODs) là một trong những cơ chế bảo vệ chính chống lại stress oxy hóa gây ra bởi ô nhiễm, lây nhiễm bệnh, tình trạng thiếu oxy (hypoxia), quá nhiều oxy (hyperoxia), nhiệt độ và các chất kích thích miễn dịch [153] Một phân tử SOD

ngoại bào (EC-SOD) đã được công bố ở tôm hùm (Homarinus capensis), nó kết

hợp với sự thực bào, sự hình thành thể bao, sự opsonin hóa và tạo ra các hợp chất diệt khuẩn [89] Tuy nhiên, việc tạo ra các hợp chất oxy hóa có tác dụng kháng khuẩn đã được nghiên cứu trong các tế bào máu ở động vật không xương sống Sự đáp ứng tế bào của các chất oxy hóa là rất nhanh và được tạo ra trong suốt quá trình thực bào vi khuẩn Những hợp chất này bao gồm anion superoxide (O2-), gốc tự do hydroxyl (OH-), H2O2, ROIs và RNIs [80]

Bạch cầu hạt tổng hợp, lưu trữ và bài tiết hệ thống prophenoloxydase (proPO) được hoạt hóa bởi β-glucans nấm, PG và LPS Các phân tử này cảm ứng bạch cầu hạt tiết proPO không hoạt động và chuyển đổi chúng thành proPO enzyme Enzyme này oxy hóa phenol thành quinon, có thể giúp tiêu diệt mầm bệnh

và được sử dụng để tạo ra melanin [85], [110] Ngoài ra, các protein tương tác với các thành phần trong quá trình proPO có liên quan với sự nhận biết và sự trao đổi của các tế bào máu (Hình 1.5)

Hình 1.5 Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin [98]

Melanin hóa là một quá trình hóa sinh phức tạp, ít được biết đến, có liên quan tới các protease khác nhau (trypsine như serine, serine protease) có sự tham gia của

hệ thống phenoloxidase [157], [170] Sự melanin hóa đóng một vai trò quan trọng trong các cơ chế bảo vệ động vật không xương sống [169], trong đó một bao dày của hắc tố melanin được tạo ra xung quanh tác nhân từ bên ngoài [32] Melanin, một sản phẩm của hệ thống proPO, là một sắc tố màu nâu tối với đặc tính kháng khuẩn [89] Đặc tính diệt khuẩn của melanin và các tác nhân khác như O2-, các gốc hydroxyl được tạo ra trong quá trình hình thành quinon [85], [210]

Lectin là một họ glycoprotein hoặc protein có một hoặc nhiều vùng chức năng, nhưng có chung 1 vùng bám carbonhydrat Lectin được sắp xếp thành nhiều loại khác nhau [92] Chức năng của lectin có thể tham gia vào hàng rào đầu tiên chống lại nguồn bệnh, điều khiển miễn dịch và ngăn chặn sự tự miễn [105] Kuhlman và đtg (1989) cho rằng lectin có vai trò như là một protein bổ thể làm tăng quá trình thực bào [108] Ở tôm sú, lectin đã được tạo dòng và xác định trình tự [132], [134]

Apoptosis là một quá trình tế bào chết theo chương trình xảy ra ở các cơ thể sinh vật đa bào và được bảo thủ qua tiến hóa Nó đóng vai trò quan trọng trong duy trì hoạt động bình thường của nhiều mô và cơ quan ở cơ thể sinh vật đa bào bằng cách loại bỏ các tế bào đã bị phá hủy, đặt không đúng chỗ hoặc trở nên không cần thiết Apoptosis đóng vai trò quan trọng trong các quá trình kháng virus ở nhiều sinh vật bằng cách loại bỏ những tế bào nhiễm virus [155] Do đó, apoptosis như là một cơ chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên để hạn chế sự sinh sản virus và có thể làm giảm hoặc loại bỏ sự lây lan của virus trong cơ thể vật chủ Tuy nhiên, nhiều virus đã có các gen

mã hóa protein có khả năng ngăn chặn hiệu quả hoặc trì hoãn quá trình apoptosis để sinh sản với số lượng lớn Một số virus có gen mã hóa protein có thể ức chế vào các caspase - protein trung tâm trong hoạt động của apoptosis Mặt khác, số lượng virus tăng dẫn đến apoptosis hoạt động mạnh Quá trình apoptosis có thể hoạt động như là một bước cuối cùng và quan trọng trong sự lây truyền virus đến tế bào lân cận Số lượng các phân tử DNA của virus tăng trong tế bào máu dẫn đến hiện tượng apoptosis ở tôm nhiễm WSSV hoặc YHV Các caspase là protein trung tâm trong quá

trình apoptosis Ở tôm thẻ Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus) nhiễm WSSV gen

caspase bị „im lặng‟, apoptosis bị ức chế đáng kể dẫn đến sự gia tăng các bản sao của

WSSV, điều này chỉ ra rằng có thể apoptosis đóng vai trò trong cơ chế kháng virus ở tôm nuôi Tỷ lệ các tế bào máu thực hiện apoptosis trong tôm nhiễm WSSV là rất thấp, nhưng cao hơn đáng kể hơn so với tôm càng tiêm WSSV vào ngày 3 hoặc 5 sau nhiễm Apoptosis cũng được cho là có vai trò loại bỏ TSV ở tôm trong tự nhiên [119]

Ở tôm sú, gen mã hóa caspase cũng đã được tạo dòng và xác định trình tự [227]

1.2.3 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Ngoài chức năng tham gia hoạt động trong sự opsonin hóa, thực bào, ngưng kết và đóng gói tác nhân gây bệnh, các lectin ở động vật không xương sống còn được coi là phân tử nhận biết nguyên thủy có khả năng phát hiện carbohydrate, thúc đẩy hệ thống hoạt hóa proPO Các protein nhận biết mô hình (PRP) là lectins đã phát hiện các phân tử như LPS, PG, lipoteichoic acid của vi khuẩn, β-1,3-glucans ở nấm và RNA virus giúp hoạt hóa các cơ chế bảo vệ vật chủ Các chức năng sinh học của PRPs là khởi đầu của sự hình thành một loạt các protein hoặc dấu hiệu của cơ chế bảo vệ và loại bỏ những tác nhân xâm nhiễm hệ thống máu Khi PRPs phát hiện kháng nguyên, các tế bào máu di chuyển đến vị trí của chúng bằng hướng hóa, tạo

ra một phản ứng viêm Kết quả là một cơ chế bảo vệ nhanh và hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh [80] Thụ thể Toll receptor (TLRs) cũng là một họ PRRs cổ xưa

có ở các động vật khác nhau có thể phát hiện tất cả các loại tác nhân gây bệnh [93], [171] TLRs được hoạt hóa bởi sự lây nhiễm vi khuẩn và virus và đã được công bố

ở tôm thẻ Trung Quốc và tôm thẻ chân trắng [43], [115] Ở tôm sú, một số protein được cho rằng có thể đóng vài trò là thụ thể nhận biết mô hình: Rab7, Cyclic AMP-regulated protein, kazal-type proteinase [192]

Hình 1.6 Cơ chế đông máu ở tôm [98]

Quá trình đông máu được sử dụng để ngăn chặn sự mất máu do tổn thương ở

vỏ kitin và làm bất động các tác nhân gây bệnh xâm nhập [144] Ở động vật giáp xác, quá trình đông máu được điều khiển bởi các protein đông máu (Hình 1.6) Các protein đông máu trong huyết tương hình thành nên dạng polymer cộng hóa trị nhờ transglutaminase phụ thuộc Ca2+ được tiết bởi các tế bào máu [220] Các protein đông máu của tế bào có thể được hoạt hóa bởi LPS hoặc β-1,3-glucan và có liên quan đến hệ thống hoạt hóa proPO [176] Đáp ứng miễn dịch dịch thể còn có sự tham gia của các phân tử như cytokine có khả năng hoạt hóa các đáp ứng kháng khuẩn [150]; peroxynectin thực hiện chức năng phân tán tế bào máu, thực bào, hình thành thể bao, thể hạch và ngưng kết mà kết quả là sự hoạt hóa peroxide và tiêu hủy tác nhân xâm nhiễm [187], [188]; Protein sốc nhiệt (heat shock protein -HSP) hoặc chaperonins ở động vật không xương sống có khả năng bảo vệ và phục hồi cấu trúc của protein [73] Năm 2004, mối liên hệ giữa các protein sốc nhiệt, stress và các đáp ứng miễn dịch của tôm đã được thực hiện bởi Lo và đtg [125], nhóm nghiên cứu đã tách dòng và mô tả cDNA của gen HSP70 ở tôm sú Phân tử HSP70 gồm 652 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 71,4 kDa Sự biểu hiện mRNA của HSP70 ở tế bào máu tôm tăng 2 đến 3 lần sau một giờ sốc nhiệt và trở lại trạng thái bình thường sau 30 phút

Một yếu tố quan trọng chống tác nhân gây bệnh ở động vật không xương sống

là các peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptides - AMPs) Đây là những protein

có trọng lượng phân tử thấp, cần thiết ở các cơ thể sinh vật thiếu khả năng miễn dịch thích ứng [141] AMPs có phổ hoạt tính rộng, sự đặc hiệu thấp và gây độc yếu đối với

tế bào động vật Những peptide này tác động lên màng tế bào của vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, màng bao bọc virus và thậm chí cả tế bào ung thư, gây nên sự bất ổn định của các ion và năng lượng dẫn đến sự hình thành các lỗ trên màng tế bào [36], [83] Lysosome là một thành phần tham gia vào quá trình thực bào, trong lysosome có chứa nhiều enzyme gọi chung là lysozyme Lysozyme có vai trò làm giảm các polysaccharide ở màng nhày của thành tế bào vi khuẩn Gram (-), thay đổi cấu tạo

phân tử của bề mặt tế bào, cho phép các tế bào thực bào dễ dàng nhận biết chúng Hầu hết các lysozyme tham gia vào sự phá hủy các vi sinh vật bên trong và bên ngoài

tế bào máu, một số còn đóng vai trò của sterases và chitinases [55]

1.3 NGHIÊN CƢ́U GEN VÀ TIỀM NĂNG Ƣ́NG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH CHO TÔM SÚ

1.3.1 Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới

Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính kháng bệnh, tính chống chịu đối với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản phẩm của tôm Do kích thước genome tôm sú là rất lớn [107] nên việc giải mã, lập bản đồ gen tôm sú và các loài tôm kinh tế quan trọng khác, như tôm he/thẻ chân trắng, được tiến hành bằng việc giải mã từng phần Năm 2000, Wilson và đtg đã phân tích trình

tự đầy đủ genome ty thể (mtDNA) của tôm sú, với kích thước khoảng 15,9 kb, trong

đó có 13 gen mã hóa cho 13 protein, 22 tRNA, 2 rRNA và vùng điều khiển với kích thước khoảng 1 kb [223]

Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm đến

sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về genome của chúng Một trong các hướng đi quan trọng của nghiên cứu genome tôm sú là phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử DNA để lập bản đồ gene, phục vụ công tác chọn giống và nuôi Bằng phương pháp AFLP, Wilson và đtg (2002) đã công bố bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú Tuy nhiên, bản đồ này có mật độ thấp, chỉ bao gồm 20 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 1,412 cM [224] Năm 2005, Wuthisuthimethavee và đtg đã lập bản đồ liên kết di truyền dựa trên các chỉ thị DNA vệ tinh (microsatellite marker) Bản đồ này bao gồm 9 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 103,6 cM [234] Nghiên cứu gần đây nhất, You và đtg (2010) đã xây dựng bản đồ di truyền dựa trên 256 chỉ thị microsatellite maker và 85 AFLP marker Kết quả đã phát hiện ra 43 nhóm liên kết

ở tôm đực và 46 nhóm liên kết ở tôm cái Bản đồ di truyền của tôm đực gồm 176

microsatellite marker và 49 AFLP marker cách nhau ~11,2 cM với tổng chiều dài genome là 2033,4 cM Bản đồ di truyền của tôm cái gồm 171 microsatellite marker

và 36 AFLP marker cách nhau ~13,8 cM với tổng chiều dài genome là 2182 cM [243] Các microsattelite marker tiếp tục được nghiên cứu, phát triển để lập bản đồ

di truyền liên kết và ứng dụng trong chọn giống tôm sú

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử hiện đại, nhiều nghiên cứu về gen và genome tôm, đặc biệt là những phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express Sequence Tag - EST) đã đạt được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh Một trong những dự án giải mã genome tôm sú lớn nhất cho đến nay là dự án giải mã EST/cDNA genome tôm sú của Thái Lan do Trung tâm Công nghệ Sinh học (BIOTEC, Thái Lan) thực hiện trong 5 năm (từ năm 2003 đến 2008) Cơ sở dữ liệu EST của tôm sú sẽ tạo ra nguồn thông tin di truyền quan trọng để xác định các marker phân tử như: microsattelite và SNP, lập bản đồ di truyền liên kết phục vụ cho mục đích chọn tạo giống tôm Kết quả của dự án này cho đến nay đã thiết lập được hơn 10.000 dòng EST từ 15 thư viện cDNA từ các loại mô khác nhau của tôm sú trong các điều kiện bình thường và bất lợi để xác định các gen đặc hiệu mô và các gen đáp ứng với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (bị nhiễm bệnh, tác động của các yếu tố nhiệt độ, môi trường ) Trong

đó, nhóm nghiên cứu cũng đã xác định được 997 EST có chứa các microsattelite marker của tôm sú, 74 locus được xác định nằm trong vùng các gen đã biết chức năng [203]

1.3.2 Nghiên cƣ́u gen liên quan đến khả năng miễn dịch ở tôm sú

Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Expressed sequence tag, EST/ cDNA) là một trong các phương pháp sinh học phân

tử hiện đại nhằm tập chung nghiên cứu các gen chức năng Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của genome tôm sú đã đạt được một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản

và khả năng kháng bệnh Từ năm 1999, Lehnert và các tác giả khác đã thiết lập thư viện EST từ các bộ phận đầu ngực, cuống mắt và chân bơi của tôm sú và xác định được 60 gen mới [111] Sau đó, hàng loạt gen liên quan đến miễn dịch của tôm sú cũng được phân lập và xác định trình tự bằng phương pháp phân tích cDNA/EST [195], [196] Dự án giải mã cDNA/EST của các nhóm nghiên cứu ở Thái Lan đã tạo

cơ sở dữ liệu EST quan trọng từ 15 thư viện cDNA ở các mô khác nhau của tôm sú thường và tôm sú bị gây nhiễm virus [203]

Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các nhân tố tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch [26], [27], [172] Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu liên quan đến hệ miễn dịch ở tôm cũng đạt được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ cơ chế phân tử của quá trình này Từ các chương trình

giải mã cDNA/ EST của một số loài tôm như tôm thẻ chân trắng (P vanamei) và tôm sú (P monodon) đã xác định được trình tự của hàng loạt gen liên quan đến hệ

miễn dịch [79], [195], [196] Ở tôm sú, nhiều gen liên quan đến miễn dịch đã được phân lập và xác định trình tự bằng cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR [195], [197], [227] Trong đó , một số gen liên quan đến cơ chế miễn dịch đã được quan tâm nghiên cứu như : protein Rab7 liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của virus ; syntenin tham gia vào con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào ; hemocyanin có hoạt tính phenoloxidase liên quan đến khả năng kháng khuẩn , kháng nấm ; protein Ran có chức năng liên quan đến cơ chế thực bào ; protein caspase được cho là tác nhân trung tâm điều khiển cơ chế apoptosis , nhiều hệ thống prote in kháng virus , kháng khuẩn cũng đã được phân lập như gen mã hóa protein kháng virus (PmAV), gen mã hóa các yếu tố kháng khuẩn như anti - lipopoysacharide (ALF), penaeidin, crustin…Những gen này đã và đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm chứng minh chức năng và vai trò của chúng trong cơ chế bảo vệ cơ thể (Bảng 1.1.)

B ảng 1.1 Thống kê các gen liên quan đến hệ miễn dịch ở tôm

Protein liên

quan đến cơ

chế nhận biết

- Roux và đtg (2002) [176]

Protein tham

gia con đường

dẫn truyền tín

hiệu

Syntenin AF335106 Bangrak và đtg (2002) [31];

Tonganunt và đtg (2005) [207] Signal transducer and

activator of transcription (STAT)

AY327491 Chen và đtg (2008) [46]

Eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A)

AF521948

Sritunyalucksana và đtg (1999) [191]

Peoroxinectin AF188840 Sritunyalucksana và đtg

(2001) [193]

Chƣ́c năng Tên gen Mã số (*) Nhóm nghiên cứu

Melanization inhibition protein (PmMIP)

AY680836 Chotigeat và đtg (2007) [48]

interacting protein 2-interacting protein 1)

X/ALG-DQ787160 Sangsuriya và đtg (2007)

[179]

Translationally controlled tumor protein (TCTP )

AY186580 Bangrak và đtg (2004) [30];

Tonganunt và đtg (2008) [206] Inhibitor of apoptosis

proteins (IAPs)

EF114675 Leu và đtg (2008) [113]

Protein liên quan

Tassanakajon và đtg (2010) [202]

FJ686018, AY326471, AF475082

Tassanakajon và đtg (2010) [202]

Yếu tố kháng khuẩn lipopolysacharide factors)

(anti-EU617325,

EF523559, EF523560

Tassanakajon và đtg (2010) [202]

Chƣ́c năng Tên gen Mã số (*) Nhóm nghiên cứu

Lysozyme EF434406 Ye và đtg (2009) [237] Ferritin EF523241 Zhang và đtg (2006) [244] Centaurin alpha 1 - Wang và đtg (2009) [217] Enzyme oxy

hóa

Enzyme superoxide dismutase (Manganese Superoxide dismutases - MnSOD)

AAW50395 Nayak và đtg (2010) [152]

Glutathione peroxidase (GPX) GQ996722 Liu và đtg (2010) [120] Protein sốc nhiệt (HSP -

heat shock protein)

proteinase (Kazal-Type Serine proteinase inhibitor)

+ Jarasrassamee và đtg (2005)

[94]

Chú thích: (*) chỉ mã số trình tự các gen phân lập ở tôm sú

(-) chỉ gen chưa chưa có mã số trình tự công bố trên Genbank

(+) chỉ gen đã có trình tự nhưng chưa công bố trên Genbank

1.3.3 Tiềm năng ƣ́ng dụng của gen liên quan đến miễn dịch trong phòng trị bệnh ở tôm sú

Phương pháp phòng và điều trị các bệnh ở tôm sú do vi khuẩn , vi nấm, ký sinh trùng và virus được sử dụng phổ biến là điều khiển môi trường nuôi tôm , sàng lọc tôm giống , sử dụng các hóa chất, chất kháng sinh và các chất kích thích miễn dịch Hiện nay , công nghệ sinh học trong thủy sản phát triển , nhiều gen liên quan đến miễn dịch ở tôm sú đã được phân lập và nghiên cứu ứng dụ ng trong điều trị bệnh Các giải pháp được các nhà khoa học quan tâm đó là việc tạo ra các peptide kháng khuẩn tái tổ hợp, sử dụng kỹ thuật RNAi và tạo các protein vỏ của WSSV tái

tổ hợp

Peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptide - AMP) là các phân tử tự nhiên

có phổ hoạt tính rộng chống lại nhiều vi sinh vật, dễ tạo ra và rất ít tạo nên sự kháng Một vài AMP đã được dùng trị bệnh và sử dụng trong thương mại [167] Các AMP

có hoạt tính tiềm năng chống lại nhiều nguồn bệnh của động vật dưới nước, sử dụng các peptide này để điều khiển và ngăn chặn bệnh Ở loài giáp xác, một số AMPs đã

được xác định như ở cua biển (Carcinus maenas), peptide kháng khuẩn này có kích

thước khoảng 11,5 kDa và có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram (+) Một số họ AMPs chính được phát hiện ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng, tôm thẻ Đại tây dương

(Litopenaeus setiferus) và tôm thẻ Trung Quốc (Fenneropenaeus chinensis) là

penaeidin, crustin và yếu tố kháng khuẩn (anti-lipopoysacharide factor - ALF) có khả năng kháng nấm, kháng vi khuẩn và virus Các họ AMP này lại có nhiều lớp, isoform, khác nhau [202]

Hoạt tính sinh học của ALF ở tôm đã được mô tả theo khía cạnh hoạt động kháng khuẩn chống lại biên độ rộng của các vi sinh vật Hoạt tính kháng khuẩn của ALFPm2 (ALF ở tôm sú isoform 2) tái tổ hợp (recombinant ALFPm2 - rALFPm2)

được kiểm tra là kháng E.coli và B megaterium [202] ALFPm3 tái tổ hợp

(recombinant ALFPm3 - rALFPm3), một loại ALF ở tôm sú dạng (isoform) 3 thuộc nhóm I bộc lộ hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (-) và (+) cũng như nấm Đáng chú ý, rALFPm3 có phổ hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm bao

gồm cả V.harvey - một vi khuẩn gây bệnh cho tôm nuôi rALFPm3 giết chết

V.harvey ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - minimum inhibitory contrentration) là

0,78-1,56M, trong khi đó kháng sinh được tổ chức thực phẩm và thuốc (FDA - Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là oxytetracyline, có thể giết chết vi khuẩn ở MIC 72,1-90,3M [162], [168]

Họ crustin có 3 lớp đều có các peptide được nghiên cứu tái tổ hợp CrustinPm1 (Crustin ở tôm sú dạng 1) có hoạt động kháng khuẩn chống lại vi khuẩn

Gram (+) bằng sự ức chế mạnh mẽ chống lại Staphylococcus aureus và

Staphylococcus iniae [197] Crus-likePm (Crustin-like antimicrobial peptide -

peptide kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú) tái tổ hợp cũng cho thấy hoạt động

kháng khuẩn đối với cả vi khuẩn Gram (+) và (-) bao gồm cả V harveyi [21]