CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỘNG VẬT THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

CHẨN ĐOÁN BỆNH, ĐỘNG VẬT THỦY SẢN, BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

Trang 1

TRUNG TÂM QUAN TRẮC, CẢNH BÁO MÔI TRƯỜNG VÀ BỆNH THỦY SẢN

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN I

CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỘNG VẬT THỦY SẢN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

Bắc Ninh, 2006

Trang 2

Mục Lục

Phần 1 Phương pháp PCR và Ứng dụng PCR .2

1 Nguyên tắc phản ứng PCR 2

2 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 3

3 Ứng dụng của PCR trong việc chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản 3

Phần II Trang thiết bị và hóa chất 4

1 Trang thiết bị 4

2 Hóa chất 5

3 Các loại Kít thường dùng 6

Phần III Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản bằng phương pháp PCR 7

1 Quy trình chẩn đoán 7

2 Phương pháp chẩn đoán bệnh MBV trên tôm sú 8

3 Chẩn đoán tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú và tôm Chân trắng 12

4 Chẩn đoán bệnh đầu vàng trên tôm sú bằng phương pháp RT - PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV 18

5 Chẩn đoán hội chứng Taura bằng phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV 22

5 Chẩn đoán bệnh VNN trên cá biển bằng phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000VNN 26

Trang 3

Phần 1 Phương pháp PCR và Ứng dụng PCR

1 Nguyên tắc phản ứng PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn

- Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc

Trang 4

3 Ứng dụng của PCR trong việc chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản

Hiện nay, phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, virus, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động vật và thực vật….trong Thủy sản PCR đã được áp dụng

để chẩn đoán bệnh, trong đó bao gồm: Bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV…và bệnh trên cá: VNN…

Trang 5

Phần II Trang thiết bị và hóa chất

1 Trang thiết bị

1.1 Trạm tách triết ADN và RNA

Trang thiết bị cần dùng cho trạm tách chiết ADN và RNA bao gồm các dụng cụ sau:

• Giá đựng ống nghiệm tube Eppendorf 0.2 – 1.5ml

• Hộp đựng đầu típ Micropipette các loại

Trang 7

3 Các loại Kít thường dùng

• IQ2000VNN

• Non – Stop Nested WSSV PCR kits (Nam Khoa)

• Duplex MBV – WSSV PCR mix (Nam Khoa)

• IQ2000WSSV

• IQ2000YHV

• IQ2000TSV

Trang 8

Phần III Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản bằng phương pháp PCR

Trang 9

Quy trình chẩn đoán VNN trên cá biển

2 Phương pháp chẩn đoán bệnh MBV trên tôm sú

Phương pháp chẩn đoán bệnh MBV trên tôm sú bằng phương pháp PCR sử dụng kít Duplex MBV – WSSV của Công ty Nam Khoa chủ yếu được sử dụng đối với tôm Postlarvae nhỏ (< PL8)

2.1 Thành phần bộ kít

Thông thường bộ kít Duplex MBV – WSSV có 50 mix

• Dung dịch tách chiết ADN cho 50 mẫu: R1 (50ml), R2 (300μl) và R3 (150μl) Pha dung dịch tách chiết bằng cách dùng đầu típ sạch hút 250μl R2 vào R1, lắc đều sau đó dùng típ sạch hút 125μl R3 cho tiếp vào R1, lắc đều ( chú ý dung dịch tách chiết đã pha phải để trong tối, thời hạn sử

Trang 10

• Duplex MBV – WSSV PCR mix: 1 x 50 tube PCR loại 0.2ml, mỗi ống chứa 48μl mix (bảo quản – 200C)

• Đối chứng dương và đối chứng âm (bảo quản – 200C)

• Mẫu là tôm Postlarvae, tôm giống cỡ nhỏ tiến hành lấy khoảng 50 con

• Mẫu tôm nuôi: tiến hành cắt một phần mang, chân bơi hoặc đuôi của 10 – 15 con (tổng lượng mẫu không quá 1 gr)

• Đối với tôm bố mẹ tiến hành cắt chân bơi hoặc đuôi

• Tất cả các loại mẫu trên có thể lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 95%

• Ủ mẫu: sau khi đã nghiền xong thì tiến hành chuyển vào block nhiệt khô (điều chỉnh nhiệt độ của block là 960C) và giữ trong khoảng 5 – 10 phút, sau

đó lấy ra và làm lạnh nhanh (trong đá hoặc tủ lạnh sâu) trong vài phút

• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Sử dụng phần dịch nổi để chạy PCR hoặc bảo quản trong tủ lạnh sâu

Trang 11

2.4 Quy trình tiến hành PCR

• Chuẩn bị phản ứng: Cho 2μl dung dịch tách chiết vào 1 ống PCR mix 48μl, 2μl đối chứng âm 1 ống PCR mix 48μl và 2μl đối chứng dương 1 ống PCR mix 48μl

• Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo 1 trong 2 chương trình sau tùy thuộc vào mục đích:

Trang 12

2.5 Đọc kết quả

• Chuẩn bị bản gel: Pha1,5 – 2%Agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình tam giác 250ml (lấy khoảng 45 – 50ml dung dịch đệm TAE 1X, cân khoảng 0,7 – 1gr Agarose cho vào), sau đó đun cho Agarose tan hết (không còn bọt khí), đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 600C cho vào khoảng 2 - 3μl Ethidium bromide lắc nhẹ để Ethidium bromide tan đều rồi tiến hành đổ vào bản gel ( chú ý không nên

đổ bản gel quá dầy, <0,8cm), Khi bản gel đông lại thì nhẹ nhàng gỡ bỏ các lược trên bản gel, chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm ( cùng loại với dung dịch đã dùng đun Agarose) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel là được

• Điện di: cho vào sản phẩm điện di khoảng 10 -12μl Loading buffer trộn đều ( hoặc dùng giấy Parafin rồi nhỏ khoảng 2 - 3μl Loading buffer, hút sản phẩn PCR ra nhỏ vào và trộn đều), sau đó lấy khoảng 10μl nhỏ vào 01 giếng trên bản gel Điện di ở hiệu điện thế là 100 volt, trong thời gian 35 – 40 phút

• Đọc kết quả: So sánh kết quả theo ảnh sau:

C(+): Đối chứng dương C(-): Đối chứng âm S1: Mẫu bị nhiễm MBV S2: Mẫu bị nhiễm WSSV S3: Mẫu âm tính

Trang 13

3 Chẩn đoán tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú và tôm Chân trắng

Chúng ta có thể sử dụng một trong các phương pháp sau:

3.1 Chẩn đoán tác nhân gây bệnh Đốm trắng bằng phương pháp PCR sử dụng kít Non-Stop Nested WSSV PCR của công ty Nam Khoa

2.1 Thành phần bộ kít

Thông thường bộ kít Non – Stop Nested WSSV có 50 mix

• Dung dịch tách chiết ADN cho 50 mẫu: R1 (50ml), R2 (300μl) và R3 (150μl) Pha dung dịch tách chiết bằng cách dùng đầu típ sạch hút 250μl R2 vào R1, lắc đều sau đó dùng típ sạch hút 125μl R3 cho tiếp vào R1, lắc đều ( chú ý dung dịch tách chiết đã pha phải để trong tối, thời hạn sử

• Mẫu là tôm Postlarvae, tôm giống cỡ nhỏ tiến hành lấy khoảng 50 con

• Mẫu tôm nuôi: tiến hành cắt một phần mang, chân bơi hoặc đuôi của 10 – 15 con (tổng lượng mẫu không quá 1 gr)

• Đối với tôm bố mẹ tiến hành cắt chân bơi hoặc đuôi

• Tất cả các loại mẫu trên có thể lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 95%

2.3 Tách chiết ADN

Trang 14

• Cho mẫu vào Eppendorf 1.5ml, sau đó thêm vào 100μl dung dịch tách chiết, dùng chày nghiền nhỏ, sau khi nghiền nhỏ và nhuyễn tiến hành thêm vào từ

500 – 700ml dung dịch tách chiết, sau đó tiếp tục nghiền nhuyễn hoàn toàn rồi đậy nắp lại (nếu thực hiện nhiều mẫu một lần thì cần phải để lạnh trước khi chuyển sang bước tiếp theo)

• Ủ mẫu: sau khi đã nghiền xong thì tiến hành chuyển vào block nhiệt khô (điều chỉnh nhiệt độ của block là 960C) và giữ trong khoảng 5 – 10 phút, sau

đó lấy ra và làm lạnh nhanh (trong đá hoặc tủ lạnh sâu) trong vài phút

• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Sử dụng phần dịch nổi để chạy PCR hoặc bảo quản trong tủ lạnh sâu

2.4 Quy trình tiến hành PCR

• Chuẩn bị phản ứng: Cho 2μl dung dịch tách chiết vào 1 ống PCR mix 48μl, 2μl đối chứng âm 1 ống PCR mix 48μl và 2μl đối chứng dương 1 ống PCR mix 48μl

• Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình sau:

Trang 15

2.5 Đọc kết quả

• Chuẩn bị bản gel: Pha1,5 – 2%Agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình tam giác 250ml (lấy khoảng 45 – 50ml dung dịch đệm TAE 1X, cân khoảng 0,7 – 1gr Agarose cho vào), sau đó đun cho Agarose tan hết (không còn bọt khí), đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 600C cho vào khoảng 2 - 3μl Ethidium bromide lắc nhẹ để Ethidium bromide tan đều rồi tiến hành đổ vào bản gel ( chú ý không nên

đổ bản gel quá dầy, <0,8cm), Khi bản gel đông lại thì nhẹ nhàng gỡ bỏ các lược trên bản gel, chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm ( cùng loại với dung dịch đã dùng đun Agarose) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel là được

• Điện di: cho vào sản phẩm điện di khoảng 10 -12μl Loading buffer trộn đều ( hoặc dùng giấy Parafin rồi nhỏ khoảng 2 - 3μl Loading buffer, hút sản phẩn PCR ra nhỏ vào và trộn đều), sau đó lấy khoảng 10μl nhỏ vào 01 giếng trên bản gel Điện di ở hiệu điện thế là 100 volt, trong thời gian 35 – 40 phút

• Đọc kết quả: So sánh kết quả theo ảnh sau:

C(+) C(-) S1 S2 S3 S4

C(+): Đối chứng dương C(-): Đối chứng âm S1: Mẫu bị nhiễm WSSV ở mức độ nặng

S2 và S3: Mẫu bị nhiễm WSSV ở mức độ nhẹ

S4: Mẫu không bị nhiễm WSSV

Trang 16

3.2 Chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng phương pháp PCR sử dụng kít IQ2000WSSV

3.2.1 Thành phần

Bộ kít được cung cấp cho 200 mẫu, bao gồm các thành phần như sau:

First PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 450μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và primer chuyên biệt)

Nested PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và Primer chuyên biệt)

Đối chứng dương (Positive standard) 1 ống, chứa 100μl, 104 bản sao/μl Đối chứng âm

Thang ADN 1 ống, chứa 100μl ( thang ADN có 3 vạch, 848bp, 630bp và 333bp)

Dung dịch tách chiết ADN ( Lysis buffer) 1 chai 100ml

3.2.3 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV)

• Ủ mẫu ở nhiệt độ 950C trong 10 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10 phút

• Chuyển 200μl phần dịch nổi sang 1 ống Eppendorf mới có chứa 400μl cồn 95%, lắc nhẹ nhàng

• Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm khô mẫu

Trang 17

3.2.4 Khuếch đại sản phẩm

• Điều kiện phản ứng

- Bước 1

940C 30 giây ; 620C 30 giây; 720C 30 giây, lặp lại 5 chu kỳ, sau đó

940C 15 giây; 620C 15 giây; 720C 20 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau đó

720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối

- Bước 2

940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 25 chu kỳ, Add 720C

30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối

- IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl

+ Quy trình thực hiện như sau:

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước 1 và 2 theo số mẫu chẩn đoán, 1 mẫu đối chứng dương và 1 mẫu đối chứng âm, trộn chung vào 1 ống Eppendorf

- Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf

- Cho vào mỗi ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch ADN mẫu đã tách chiết, đối chứng âm và dương

- Đậy nắp lại

Trang 18

- Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 1 trong máy PCR

- Sau khi kết thúc quá trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước 2

- Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 2

5: Mẫu không bị nhiễm WSSV

6: Mẫu nước tinh khiết

7: Đối chứng dương 2000 bản sao

Trang 19

- Nếu mẫu kiểm tra xuất hiện vạch 296bp và 550bp hoặc chỉ có vạch 550bp thì mẫu bị nhiễm WSSV

- Nếu mẫu kiểm tra chỉ xuất hiện vạch 848bp thì mẫu không bị nhiễm WSSV

Ngoài ra ta cũng có thể sử dụng kít Duplex MBV – WSSV cho việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh Đốm trắng trên tôm sú và tôm Chân trắng ( Xem phần Quy

trình chẩn đoán bệnh MBV)

4 Chẩn đoán bệnh đầu vàng trên tôm sú bằng phương pháp RT - PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV

4.1 Thành phần

RT - PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 420μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và Primer YHV/GAV chuyên biệt)

Nested PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và Primer YHV/GAVchuyên biệt)

Đối chứng dương (YHV và GAV ) 2 ống, chứa 100μl, 104 bản sao/μl

Đối chứng âm (Yeast tRAN) 1 ống 500μl, 40ng/μl

IQzyme ADN Polymerase 1 ống 2U/μl, chứa 360μl

RT Enzyme Mix 1 ống, chứa 12μl

Dung dich nhuộm (6X Loading buffer Dye) 1 ống, chứa 1500μl

Dung dịch tách chiết RNA 1 chai 100ml

Nước tinh kiết 1 chai 100ml

4.2 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV)

4.3 Tách chiết RNA

• Cho mẫu vào ống Eppendorf 1.5ml ( nếu mẫu được bảo quản trong cồn thì cần làm khô cồn ở mẫu trước khi đưa vào tách chiết)

Trang 20

• Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 - 200μl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 400 – 500μl dung dịch tách chiết và nghiền tiếp đến khi nhuyễn Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 5 phút

• Cho vào 100μl CHCl3 (Chloroform), lắc trên máy Vortex khoảng 20 giây, để

ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 phút rồi ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút

• Chuyển 200μl phần dịch nổi sang 1 ống Eppendorf mới có chứa 200μl Isopropanol, lắc nhẹ nhàng

• Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, sau đó loại bỏ Isopropanol

• Rửa với 500μl cồn 75%, ly tâm 9000 vòng/phút trong thời gian 5 phút

940C 20giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau đó

- Bước 2

940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ

• Chuẩn bị phản ứng

Trang 21

- IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl

+ Quy trình thực hiện như sau:

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước 1 và 2 theo số mẫu chẩn đoán, 1 mẫu đối chứng dương và 1 mẫu đối chứng âm, trộn chung vào 1 ống Eppendorf

- Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf

- Cho vào mỗi ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch RNA mẫu đã tách chiết, đối chứng âm và dương

- Đậy nắp lại

- Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 1 trong máy PCR

- Sau khi kết thúc quá trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước 2

- Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 2

Trang 22

Trong đó

1: Đối chứng dương YHV, 2000 bản sao

4: Đối chứng dương GAV, 2000 bản sao

7: Mẫu bị nhiễm YHV ở mức độ nặng

8: Mẫu bị nhiễm YHV ở mức độ nhẹ

9: Mẫu bị nhiễm GAV ở mức độ nặng

10: Mẫu bị nhiễm GAV ở mức độ nhẹ

Trang 23

- Nếu mẫu kiểm tra chỉ xuất hiện vạch 406bp thì mẫu đã bị nhiễm GAV ở mức

độ nhẹ

- Nếu chỉ xuất hiện vạch 680bp thì mẫu không bị nhiễm YHV và GAV

5 Chẩn đoán hội chứng Taura bằng phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV

5.1 Thành phần

RT - PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 420μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và Primer TSV chuyên biệt)

Nested PCR PreMix 4 ống, mỗi ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP và Primer TSVchuyên biệt)

Đối chứng dương (TSV ) 1 ống, chứa 100μl, 104 bản sao/μl