Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân

Hiện nay, bệnh dịch AIDS là một trong những mối nguy hiểm lớn nhất của thế giới. Ước tính đã có khoảng 20 triệu người chết vì AIDS, và hiện đang có 39 triệu người trên thế giới đang mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (theo UNAIDS, 2007). Bệnh dịch làm tăng nhanh sự nghèo đói và hủy hoại tương lai của những người mắc bệnh do đó là mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội và chính trị đối với rất nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam 1. Trong những năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIVAIDS ở Việt Nam diễn biết rất phức tạp, số người phát hiện nhiễm tiếp tục tăng. Hầu hết những người nhiễm HIV là do tiêm chính ma tuý và đang ở độ tuổi thanh thiếu niên. Tính đến ngày 1672007, cả nước đã phát hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó 25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người đã tử vong do HIVAIDS. Theo các chuyên gia y tế, số người được phát hiện nhiễm HIVAIDS là thấp hơn nhiều so với thực tế. Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp tử vong vì HIVAIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 2030 ngàn trường hợp nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIVAIDS ở nước ta 2,3,5. Hiện chưa có biện pháp nào có thể tiêu diệt hoàn toàn được HIV. Các loại vắcxin phòng chống HIV chưa thực sự có hiệu lực cộng với sự kháng các loại thuốc kháng virut và những hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho sự lây lan dịch bệnh này càng ngày càng nhanh chóng và trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay được sử dụng để điều trị HIVAIDS hiện nay là phương pháp HAART (highly active antiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ của những người nhiễm HIV. Tuy nhiên, để sử dụng các phác đồ trị liệu một cách có hiệu quả nhất thì việc chẩn đoán sớm và chính xác là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu. Các phương pháp chẩn đoán HIV rất đa dạng, nhưng việc tạo ra các kít chẩn đoán HIV sớm, nhanh và có độ nhạy cao vẫn thu hút được nhiều mối quan tâm của các nhà nghiên cứu. Một trong các phương pháp chẩn đoán sớm và có độ chính xác cao là dựa vào việc phát hiện kháng nguyên lõi P24 của HIV và sự có mặt của kháng thể kháng kháng nguyên này trong huyết thanh bệnh nhân. Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện nhiều loại kit chẩn đoán HIV sớm nhập ngoại dựa vào kháng nguyên P24 và kháng thể của nó. Tuy nhiên, những khó khăn trong việc bảo quản cộng với giá thành cao của các loại kit này làm hạn chế việc phổ biến hóa việc xét nghiệm đối với các đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao. Trước tình hình đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: ‘Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân” với mục đích:  Tách dòng và đọc trình tự gen p24 của HIV  Bước đầu nghiên cứu sự biểu hiện gen p24 trong E. coli  Kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Đinh Duy Kháng.

MỞ ĐẦU

Hiện nay, bệnh dịch AIDS là một trong những mối nguy hiểm lớn nhất củathế giới Ước tính đã có khoảng 20 triệu người chết vì AIDS, và hiện đang có 39triệu người trên thế giới đang mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (theoUNAIDS, 2007) Bệnh dịch làm tăng nhanh sự nghèo đói và hủy hoại tương lai củanhững người mắc bệnh do đó là mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội vàchính trị đối với rất nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam [1]

Trong những năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIV/AIDS ở Việt Nam diễnbiết rất phức tạp, số người phát hiện nhiễm tiếp tục tăng Hầu hết những ngườinhiễm HIV là do tiêm chính ma tuý và đang ở độ tuổi thanh thiếu niên Tính đếnngày 16/7/2007, cả nước đã phát hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS Theo cácchuyên gia y tế, số người được phát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so vớithực tế Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợpnhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp

tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợpnhiễm mới Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ởnước ta [2,3,5]

Hiện chưa có biện pháp nào có thể tiêu diệt hoàn toàn được HIV Các loạivắcxin phòng chống HIV chưa thực sự có hiệu lực cộng với sự kháng các loại thuốckháng virut và những hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho sự lây lan dịch bệnhnày càng ngày càng nhanh chóng và trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay được

sử dụng để điều trị HIV/AIDS hiện nay là phương pháp HAART (highly activeantiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ của những người nhiễm HIV.Tuy nhiên, để sử dụng các phác đồ trị liệu một cách có hiệu quả nhất thì việc chẩnđoán sớm và chính xác là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu

Các phương pháp chẩn đoán HIV rất đa dạng, nhưng việc tạo ra các kít chẩnđoán HIV sớm, nhanh và có độ nhạy cao vẫn thu hút được nhiều mối quan tâm củacác nhà nghiên cứu Một trong các phương pháp chẩn đoán sớm và có độ chính xáccao là dựa vào việc phát hiện kháng nguyên lõi P24 của HIV và sự có mặt củakháng thể kháng kháng nguyên này trong huyết thanh bệnh nhân Trên thị trường

Việt Nam đã xuất hiện nhiều loại kit chẩn đoán HIV sớm nhập ngoại dựa vào khángnguyên P24 và kháng thể của nó Tuy nhiên, những khó khăn trong việc bảo quảncộng với giá thành cao của các loại kit này làm hạn chế việc phổ biến hóa việc xétnghiệm đối với các đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao Trước tình hình đó, chúng

tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: ‘Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân” với mục đích:

 Tách dòng và đọc trình tự gen p24 của HIV

 Bước đầu nghiên cứu sự biểu hiện gen p24 trong E coli

 Kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiêntrong huyết thanh bệnh nhân HIV

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệSinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học củaPGS.TS Đinh Duy Kháng

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HIV

1.1.1 Khái niệm HIV

Virut gây suy giảm miễn dịch ở người, viết tắt theo tiếng Anh là HIV(Human Immunodeficiency Virus) là loại virut khi xâm nhập vào cơ thể gây hộichứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), trạng thái mà tại đó, hệ thống miễndịch của người bị suy yếu, dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnhnhân dễ mắc các bệnh ung thư và phải chịu những tổn thương do chính HIV gây ra

Sự nhiễm HIV thông qua việc chuyển các chất dịch như máu, dịch âm đạo,tinh dịch hoặc sữa từ người bệnh Trong cơ thể người bệnh, HIV tồn tại ở cả dạnghạt virut tự do lẫn dạng virut đã bị nhiễm vào các tế bào của hệ thống miễn dịch [13,

14, 55]

1.1.2 Đặc điểm của HIV

1.1.2.1 Đặc điểm phân loại HIV

HIV là một thành viên của chi Lentivirus và thuộc họ Retroviridae [23,24].Retrovirus là loại virut có genom là ARN sợi đơn dương nhưng trong chutrình sống có giai đoạn tồn tại ở dạng ADN kép do có enzym phiên mã ngược màbản chất là ADN polymeraza phụ thuộc ARN ADN mới được tạo ra đều có nhữngđoạn trình tự lặp lại có kích thước khác nhau ở 2 đầu được gọi là đoạn lặp lại đầucuối (LTR), nhờ đoạn này mà ADN của virut có thể gắn ổn định trong nhiễm sắcthể của tế bào nhiễm và trở thành dạng tiền virut (provirus) [24]

Các Lentivirrus đều có đặc điểm hình thái và sinh học giống nhau Chúngđều là virut ARN sợi đơn dương có vỏ ngoài Rất nhiều động vật bị gây nhiễm bởilentivirus, Đặc tính của nó là có thời gian mắc bệnh và ủ bệnh dài [23]

HIV gồm 2 loại là HIV-1 và HIV-2, cả 2 loại đều bắt nguồn từ vùng phíaNam Camerun sau khi truyền từ tinh tinh sang người trong thế kỉ 20 Trước đây,HIV được gọi là human T-lymphotropic virus-III (HTLV-III) hoặclymphadenopathy-associated virus (LAV), hoặc AIDS-associated retrovirus (ARV)

HIV- 1 được phát hiện năm 1983, đầu tiên nó được gọi là LAV HIV -1 có độc tínhmạnh và dễ dàng lan truyền trong cộng đồng, do đó là nguyên nhân chính của đạiđịch HIV bùng phát trên khắp thế giới [18, 25].

HIV-2 phát hiện năm 1985, có độc lực yếu và khả năng truyền nhiễm ít hơn,điều này giải thích tại sao loại virut này chỉ lưu hành ở Tây Phi

Trong giới hạn của luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu HIV1 loại virut gây đại dịch thế giới và cũng là loại chủ yếu thường gặp ở Việt Nam

-1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của HIV

Virut HIV có cấu trúc hình cầu, đường kính 80-120nm Hạt virion có dạnghình khối đa diện với cấu trúc đối xứng gồm 20 mặt tam giác đều [12, 20, 46]

Hình 1: Hình thái hạt virion của virut HIV

1.1.2.3 Đặc điểm về cấu trúc của HIV

Từ ngoài vào trong có 3 lớp [55, 57]

Lớp vỏ: Lớp áo ngoài của virut, gọi là vỏ virut, bao gồm 2 lớp, được lấy từ

màng tế bào của người khi hạt virut mới nảy chồi từ tế bào Các nghiên cứu gần đâychỉ ra rằng HIV có thể đi vào và đi ra khỏi tế bào thông qua một vùng đặc biệt củamàng tế bào gọi là thảm lipid (Lipid raft) Thảm này có hàm lượng cholesterol vàglycolipid cao và có thể là một điểm đích mới trong việc nghiên cứu các loại thuốckháng virut HIV

Bao quanh lớp vỏ virut là khoảng 72 bản copy của phức hệ protein gai củaHIV (thường gọi là spickes) Phức hệ này được cấu tạo từ các protein vỏ của virutgọi là protein Env, bao gồm một mũ được tạo thành từ 3 phân tử glycoprotein có độdài 9-10 nm và chiều rộng 14 nm có trọng lượng phân tử là 120 kDa và được gắntrên một gốc gồm 3 phân tử glycoprotein GP41 xuyên màng có trong lượng phân tử

41 kDa neo vào cấu trúc vỏ của virut Rất nhiều nghiên cứu để phát triển vacxinHIV tập trung vào các protein vỏ này [21, 54, 55]

Hình 2: Cấu trúc phân tử của HIV

Protein nền (matrix protein) Ngay sát lớp vỏ có một lớp protein nền được

tạo thành từ các phân tử protein P17 Bên cạnh việc làm ổn định cấu trúc lõi virutbên trong, các nghiên cứu gần đây cho thấy protein này còn có vai trò quan trọngtrong sự tạo thành hạt virut mới [16]

Lõi virut: Bên trong lớp vỏ của HIV trưởng thành có một lõi hình viên đạn

gọi là capsit, được tạo thành bởi 2000 bản copy của protein P24 Lõi capsit baoquanh 2 chuỗi ARN đơn dương có gắn enzym phiêm mã ngược Ngoài ra còn cócác enzym tích hợp integraza, enzym proteaza và một phân tử ARN thông tin

1.1.2.4 Cấu trúc gen của HIV

Hình 3: Sơ đồ cấu trúc gen của HIV

Vật chất di truyền của HIV là sợi ARN đơn dương, mỗi sợi có khoảng 9200cặp bazơ mang 9 bản copy của 9 gen, được chia thành 2 nhóm gen chính: nhóm gencấu trúc và nhóm gen điều hòa sinh trưởng [37, 39, 57]

 Nhóm gen cấu trúc: chứa các thông tin cần thiết để tạo nên protein cấu

trúc cho hạt virut mới

- Gag: là gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu nhóm, gồm các gen P17,

P24, P7 và P6

- Pol: mã hóa cho enzym ADN polymeraza phụ thuộc ARN hay còn gọi là

enzym phiên mã ngược và các enzym khác như integraza và proteaza

- Env: mã hoá cho các protein vỏ là gp120 và gp41.

 Nhóm gen điều hòa: chứa thông tin cần thiết cho các protein điều khiển

sự xâm nhập của HIV vào tế bào vật chủ, tạo ra virut mới và gây bệnh

- Tat (transactivator) là gen khởi động hoạt động của các gen virut khác.

- Rev: (trans-regulator protein) có chức năng điểu hòa, tạo ra một protein

Rev có 2 đầu, một đầu làm nhiệm vụ ức chế (CRS), một đầu làm nhiệm vụ giải ứcchế (CAR)

- Nef: (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm chu trình sống

của virut trong trạng thái tiềm tan

- Vif: (virion infectivity factor) mã hóa cho protein kích thích sự xâm nhập

của virut vào tế bào cảm nhiễm

- Vpu: mã hóa cho protein điều khiển quá trình giải phóng các hạt virut mới

từ tế bào bị nhiễm

- Vpr: cần thiết cho sự nhân lên của virut trong các tế bào không phân chia

như các đại thực bào

Cuối mỗi chuỗi ARN của HIV có một trật tự ARN gọi là đoạn lặp lại dài ởcuối (LTR) Các vùng trong LTR hoạt động như các công tắc để khởi động quátrình tạo thành virut mới và có thể được khởi động nhờ protein của virut và proteincủa vật chủ

1.1.3 Gen p24 và protein P24

1.1.3.1 Gen mã hóa cho protein p24

Gen mã hóa cho protein nucleocapsit có kích thước khoảng 660 bp, nằm ở vị

trí trung tâm trong hệ thống gen cấu trúc gag Nó mã hóa cho một protein có chiều

dài 231 axit amin, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa, do đó được gọi tắt là gen

p24 và protein tạo ra là protein P24 [57]

1.1.3.2 Protein P24 và vai trò của nó trong chu trình sống của HIV

Khi mới được tổng hợp, P24 nằm ở vùng trung tâm của polyprotein Gag haycòn gọi là P55 dài 55 kDa, Trong quá trình trưởng thành của hạt virut mới,polyprotein P55 bị enzym proteaza của virut cắt thành các protein có kích thướckhác nhau là P24, P17, P6 và P7 (Hình 3)

Hình 4 Cấu trúc không gian của phân tử

protein p24 [9] Hình 5: Cấu trúc không gian của đầu C –146-231 của protein p24 [17]Protein p24 có dạng dime và bị photphoryl hóa Trong mỗi đơn phân tử có 7xoắn α, 5 trong số đó được sắp xếp tạo thành cấu trúc dạng ống [9, 29] (hình 4) Xoắn dài nhất trong lõi ống được tách biệt bởi một đoạn peptit dài

và có tính kháng nguyên cao, đó là vị trí liên kết của các phân đoạn của kháng thểvới tinh thể Capsit (CA) Vùng đầu C của protein capsit nằm ở vị trí từ axit aminthứ 146 đến 231 gồm một đoạn chứa 20 axit amin, gọi là vùng tương đồng chính(MHR- major homology region) (Hình 5) Đây là vùng bảo thủ giữa các retrovirutkhác nhau và cần thiết cho sự đóng gói, trưởng thành và sự gây nhiễm của virut[17] Vùng đầu N của p24 có cấu trúc kẹp tóc beta N-terminal beta-hairpin Sự săpxếp của dime CA (146-231) với cấu trúc của vùng đầu N hình thành cấu trúc không

gian của protein capsit và tạo điều kiện liên kết kéo về 2 phía của protein để tạothành một lõi hình viên đạn của HIV-1.

Vai trò của protein P24

HIV muốn nhân lên được trong tế bào chủ phải trải qua các bước khác nhau.Protein nucleocapsit có vai trò quan trọng ở các giai đoạn khác nhau trong chu trìnhsống của virut

Trước tiên, P24 tham gia vào quá trình cởi áo sau khi virut xâm nhập vào tếbào Sau khi HIV xâm nhập vào tế bào chất của tế bào chủ, các protein trong lõicapsit tự động tách nhau ra, làm tan rã cấu trúc của lõi capsit, giải phóng ARNgenom vào trong tế bào chất [13]

Sau đó, P24 cũng tham gia vào quá trình sao chép ngược của virut ở chỗ nó

có ảnh hưởng đến mối liên kết giữa ARN và ADN trong giai đoạn đầu của quá trìnhnhiễm và hoạt động như là cofactor cho enzym phiên mã ngược

Protein P24 còn tham gia vào quá trình đóng gói ARN genom với các thànhphần khác của virut Nó có vai trò đặc biệt trong viêc nhận ra các dấu hiệu đóng góicủa HIV và làm nhiệm vụ trung gian cho sự kết hợp giữa 2 phân tử ARN khác nhau

để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới Dấu hiệu đóng gói bao gồm các cấutrúc gồm 4 phần loop được định vị ở gần đầu 5 của ARN genom của virut NC liên kết với dấu hiệu đóng gói thông qua một liên kết trung gian bởi 2 motif mang

Zn Qua nghiên cứu, người ta thấy chỉ với 2 domain liên kết với Zn thì chưa đủ đểđóng gói ARN của HIV mà nó còn phụ thuộc vào protein nền (matrix) [15]

1.1.4 Chu trình sống của virut HIV

Sự xâm nhập và nhân lên của virut HIV có thể chia lam ba giai đoạn quantrọng: giai đoạn xâm nhiễm và cởi áo, giai đoạn sao chép và dịch mã, giai đoạn lắpráp và tạo thành virut hoàn chỉnh [6, 13,14, 53, 55, 56]

1.1.4.1 Sự xâm nhập và cởi áo của HIV

Quá trình xâm nhiễm được bắt đầu khi một hạt HIV mang 2 bản copy ARNcủa HIV tiếp xúc với tế bào thông qua một phân tử CD4 trên bề mặt tế bào chủ(cluster designation 4) Các tế bào mang phân tử này được gọi là tế bào CD4+(CD4posititve) Một hoặc nhiều phân tử gp120 liên kết lỏng lẻo với phân tử CD4 trên bề

mặt tế bào Sự liên kết giữa CD4 và gp120 làm biến đổi cấu trúc của gp120 chophép nó liên kết với phân tử thứ 2 trên bề mặt tế bào gọi là đồng thụ thể(coreceptor) Gp41 của vỏ tạo điều kiện cho quá trình dung nạp Vỏ của virut vàmàng tế bào sau đó dung nạp với nhau, đẩy virut vào bên trong tế bào Các thuốcđiều trị HIV/AIDS làm cản trở quá trình liên kết và quá trình dung nạp đều đangđược nghiên cứu và kiểm tra để có tác dụng ngay từ giai đoạn lâm sàng.

Hình 6: Chu trình nhân lên của HIVCác nghiên cứu đã xác định được rất nhiều đồng thụ thể khác nhau cho cácchủng HIV khác nhau Ở giai đoạn đầu tiên của quá trình nhiễm, hầu hết HIV đều

sử dụng thụ thể CD4 và đồng thụ thể CCR5 để xâm nhập vào tế bào đích Khi bệnhphát triển, xấp xỉ 50% bệnh nhân mở rộng sự sử dụng đồng thụ thể, đáng kể là thụthể CXCR4 Virut sử dụng đồng thụ thể CCR5 gọi là R5 HIV và virut sử dụng đồngthụ thể CXCR4 gọi là X4 HIV [45]

Mặc dù các tế bào TCD4+ là đích chính của HIV, các tế bào khác trong hệmiễn dịch có hoặc không có CD4 trên bề mặt đều cũng bị nhiễm Trong số này, các

tế bào có đời sống dài như tế bào đơn nhân (monocyte) và đại thực bào(Macrophage) có thể mang một lượng lớn HIV mà không bị tiêu diệt Vì vậy, đâyđược coi là chỗ trú ẩn an toàn của HIV Các tế bào T CD4+ cũng có chức năng chứaHIV, một lượng nhỏ các tế bào này lưu giữ HIV ở dạng tiềm tan, không hoạt dộng

Sự đáp ứng miễn dịch thông thường có thể hoạt hóa các tế bào này, gây ra sự tạo racác hạt virion mới [48].

Sau khi virut HIV được đẩy vào tế bào chất của vật chủ, nó sẽ thực hiện quátrình cởi áo, phá vỡ cấu trúc lõi capsit để đẩy ARN genom của virut vào tế bào chất

1.1.4.2 Sự sao chép và dịch mã

Khi vào trong cơ thể vật chủ, ARN genom sẽ chuyển thành sợi ADN kép nhờenzym phiên mã ngược được mang theo virut trong quá trình xâm nhập vào tế bào.ADN này của virut sẽ được tích hợp vào trong ADN của tế bào bằng enzym tichhợp của virut Lúc này, virut có thể thực hiện 1 trong 2 con đường Con đường thứnhất là virut trở thành trạng thái tiềm tan và tế bào nhiễm tiếp tục hoạt động và thựchiện chức năng của mình Con đường thứ 2 là virut hoạt động, nhân lên, giải phóngmột lượng lớn virut và tiêu diệt tế bào chủ

Con đường tiềm tan: ADN mới được tạo ra của HIV được vận chuyển vào

trong nhân của tế bào chủ Nhờ sự xúc tác của enzym tích hợp intergraza, ADN củavirut gắn với ADN của tế bào chủ và sẽ duy trì ở trạng thái đó cho đến khi có tácnhân kích thích sự hoạt động của nó Trạng thái này gọi là trạng thái tiềm tan vàvirut được gọi là provirus Trạng thái này có thể kéo dài từ 3 đến 12 năm, phụ thuộcvào tình hình sức khỏe của bệnh nhân và các chế độ chăm sóc và điều trị Để tạo ravirut hoạt động, phải có mặt một số các nhân tố dịch mã của tế bào, nhân tố quantrọng nhất là NF-kB ((NF kappa B) - được điều khiển khi các tế bào T được hoạthóa Các phân tử như yếu tố tiêu diệt ung thư (tumor necrosis factor- TNF- anpha vàInterleukin IL 6, được tiết ra với một mức độ cao từ các tế bào bị nhiễm HIV có thểgiúp hoạt hóa provirut [21]

Tạo thành virut mới: Để một provirus tạo ra virut mới, chúng phải sử dụng

bộ máy di truyền của tế bào chủ để thực hiện quá trình phiên mã tạo ARNtt Gen

của virut điều khiển sự sử dụng bộ máy này của vật chủ là gen tat, mã hóa cho

protein kích thích quá trình phiên mã ARN genom cũng được tạo ra bằng quá trìnhphiên mã để tạo thành hạt virion mới sau này

Sau khi ARNtt được tạo ra trong nhân tế bào, nó sẽ được vận chuyển ra tếbào chất Protein của HIV tham gia chủ yếu vào quá trình này Ví dụ, protein Rev

cho phép mARN mang mã của protein cấu trúc được vận chuyển ra ngoài tế bàochất, nếu không có protein Rev, các protein cấu trúc không được tạo ra.

Trong tế bào chất, ARNtt của virut bám vào bộ máy tổng hợp protein nhưribosom của vật chủ để tạo ra môt chuỗi dài polyprotein virut là các protein cấu trúcGag, Env và các enzym cần thiết cho sự hình thành virut mới sau này ARN nàychính là genom của virut

Các gen điều hòa tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng của HIV Nếu tat hoạt động mạnh, nef hoạt động yếu thì virut ở trạng thái provirus và ngược lại, tat hoạt động yếu, nef hoạt động mạnh thì virut sẽ ở trạng thái tiềm ẩn Gen rev điều hòa hoạt động của 2 gen tat và nef

Sự tồn tại ở trạng thái tiền virut còn do tác động đến các nhân tố khác, Ví dụ,các tế bào lympho bị nhiễm HIV sẽ thúc đẩy sự sinh trưởng của HIV bằng các yếu

tố hoại tử khối u (TNF), hoặc do sự nhiễm các tác nhân gây bệnh nhưCytomegalovirus, virut Epstein Barr Các tác nhân này được gọi chung là yếu tốkích hoạt sự sinh trưởng của HIV

1.1.4.3 Lắp ráp và tạo thành virut hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn cuối cùng của chu trình tái tạo virut – tạo thành hạt virutHIV hoàn chỉnh Quá trình này bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ ProteinEnv (gp160) đi qua màng lưới nội chất và được vận chuyển tới phức hệ Golgi, nơi

mà chúng sẽ bị enzym proteaza phân cắt thành 2 phân tử glycoprotein vỏ là gp41 vàgp120 Các protein này được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào vật chủ, tại

đó, gp41 và gp120 gắn lên màng của tế bào xâm nhiễm Các polyprotein Gag 55 vàGag-Pol (gp160) cũng liên kết với bề mặt bên trong của màng sinh chất cùng vớiARN genom của HIV khi hạt virion bắt đầu định hình và nhú ra từ tế bào vật chủ.Lúc này, hạt virion chưa có khả năng gây nhiễm Chỉ khi có sự hoạt động củaproteaza của HIV làm phân cắt các polyprotein thành các enzym và các protein cấutrúc thi hạt virion mới bước sang giai đoạn thành thục Sự thành thục của hạt virutxảy ra từ lúc hạt virion mới bắt đầu nhú ra khỏi màng tế cho đến lúc hạt virut trưởngthành và tách khỏi màng tế bào Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các chất cókhả năng ức chế hoạt động của proteaza, HIV-1 và HIV-2 có cách đóng gói khácnhau HIV- 1 sẽ đóng gói ARN bất kì nào, trong khi đó, HIV-2 chỉ ưu tiên gắn các

ARN mà được sử dụng để tạo ra chính protein Gag của chúng Điều này cho thấyHIV-1 dễ biến đổi hơn do đó, khả năng lây nhiễm cao hơn

1.1 Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải AIDS

1.2.1 Khái niệm về hội chứng AIDS

Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) là hội chứng của các bệnh

nhiễm trùng của người do hệ thống miễn dịch bị phá hủy do nhiễm HIV, và cácvirut tương tự ở các động vật khác như SIV, FIV Trạng thái cuối cùng của quá trìnhmắc bệnh là nhiễm các bệnh cơ hội và ung thư [20, 47, 54]

1.2.2 Nguồn gốc của AIDS

Tháng 6/1981 trung tâm kiểm soát các bệnh truyền nhiễm ở Atlanta (Mỹ) xácđịnh những trường hợp mắc hội chứng suy giảm miễn dịch đầu tiên trên cơ sở pháthiện của bác sĩ Michal Gotlieb về 5 người đồng tính luyến ái nam giới bị nhiễm

trùng Pneumocystis carinii ở Los Angeles (Mỹ) và bác sỹ Friedman Alvin thấy 1

bệnh nhân bị ung thư (sarcoma Kaposi) vốn lành tính mà chết Sau đó nhiều nơicũng lần lượt công bố những ca đầu tiên trên người bệnh ưa chảy máu đã truyềnmáu nhiều lần, chích ma tuý

Hội nghị định danh quốc tế năm 1986 gọi loại virut này là virut gây bệnh suygiảm miễn dịch trên người viết tắt là HIV1

Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được loại virut HIV thứ 2 đặt tên là HIV

- 2 tại Tây Phi Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV2 có thể đã có ở Tây Phi

từ năm 1966 Như vậy có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỉnày hoặc trước đó vài chục năm, nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại dịchAIDS/SIDA

1.1.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam

Theo đánh giá mới đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), HIV/AIDS đượcxếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong (chiếm 7,5%) ở các nước đangphát triển, trong đó có Việt Nam Những năm gần đây các nỗ lực toàn cầu trongviệc ứng phó với đại dịch AIDS đã có nhiều tiến triển khả quan, bao gồm việc giatăng các chương trình dự phòng và tăng số lượng bệnh nhân được tiếp cận với cácphương pháp điều trị có hiệu quả Tuy nhiên cả số người sống với HIV và số người

tử vong do AIDS vẫn đang tiếp tục tăng lên Tổng cộng hiện có 39,5 triệu ngườiđang sống với HIV trong năm 2006, là tăng hơn 2,6 triệu so với năm 2004 Con sốnày bao gồm cả số ước tính 4,3 triệu người lớn và trẻ em mới nhiễm HIV trong năm

2006, so với năm 2004 số này tăng hơn 400.000 người Ở nhiều khu vực trên thếgiới, số mới nhiễm chủ yếu tập trung trong đối tượng thanh niên (15–24 tuổi) [47].Tính riêng trong số những người từ 15 tuổi trở lên, thanh niên chiếm 40% số ngườimới bị nhiễm HIV trong năm 2006 [38]

Bảng 1: Tóm tắt tình hình dịch AIDS toàn cầu (Tháng 12, 2006 )

Số người sống với HIV

năm 2006

Người lớn 37,2 triệu

Trẻ em dưới 15 tuổi 2,3 triệu

Số ca mới nhiễm HIV

trong năm 2006

Người lớn 3,8 triệuTrẻ em dưới 15 tuổi 530.000

Số tử vong do AIDS trong

năm 2006

Người lớn 2,6 triệuTrẻ em dưới 15 tuổi 380.000

HIV xâm nhập vào Việt Nam do người nước ngoài sau đó nhanh chóng lantruyền trong các cộng đồng dân cư của Việt Nam qua các hình thức khác nhau Quađiều tra, Bộ Y tế và Trung tâm dự phòng và Kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ nhận định,khoảng 60% người nhiễm HIV ở Việt Nam là do tiêm chích ma túy, số còn lại làphát sinh từ gái mại dâm và truyền từ mẹ sang con Những năm qua, mặc dù đã cónhiều dự án phòng chống HIV/AIDS được triển khai xuống từng địa phương, nhưngđại dịch vẫn ngày một lan nhanh, hiện đã xuất hiện ở 64 tỉnh thành phố trên cảnước Hiện nay, 100% thành phố, huyện, thị xã trên toàn quốc đã phát hiện có người

có HIV Điều đáng nói là các đối tượng nhiễm HIV còn rất trẻ, tới 90% trong độtuổi 20-30 Đây là lực lượng lao động chính, do vậy ảnh hưởng rất lớn đến sự pháttriển kinh tế đất nước và gây ra nhiều vấn đề phức tạp cho xã hội [2, 4, 5]

Kể từ trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện vào năm 1990 đến thờiđiểm thống kê gần đây nhất của Bộ Y tế tính đến ngày 16/7/2007, cả nước đã pháthiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó 25.470 người chuyển sang AIDS,

14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS Theo các chuyên gia y tế, số người đượcphát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so với thực tế [5]

Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợpnhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp

tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợpnhiễm mới Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ởnước ta, bởi vì sự gia tăng số lượng người nhiễm HIV/AIDS sẽ làm tăng nhu cầu vềđiều trị, chăm sóc và hàng loạt các vấn đề khác về phục vụ người bệnh

1.2.4 Dịch tễ học

1.2.4.1 Con đường lây nhiễm

Có 3 con đường chính của quá trình lây nhiễm là quan hệ tình dục khônglành mạnh, chuyền qua con đường máu và truyền từ mẹ sang con [13, 47, 54, 55]

 Truyền qua đường tình dục Đây là con đường lây truyền chính Nhiễm

HIV qua quan hệ tình dục có thể xảy ra khi người bệnh tiếp xúc với ngườikia thông qua tinh dịch, dịch âm đạo hoặc qua các màng nhày

 Máu và con đường truyền qua máu Con đường truyền bệnh này có thể

tính đến việc nhiễm do dùng chung kim tiêm, những người bị bệnh máu khóđông, truyên máu và các sản phẩm của máu, Những người chăm sóc sứckhỏe như các y tá, người làm việc trong phòng thí nghiệm, bác sĩ cũng có thể

bị nhiễm, mặc dù trường hợp này là rất hiếm

 Truyền từ mẹ sang con Truyền HIV từ mẹ sang con có thể xảy ra trong tử

cung trong những tuần cuối của thời kỳ mang thai, lúc sinh con và cho con

bú Nếu không được xử lý, tỉ lệ lây nhiễm có thể lên đến 25% Tuy nhiên,nếu được sử lý với thuốc và các phương pháp phù hợp, con số này có thểgiảm xuống 1% Sự truyền HIV từ mẹ sang con chủ yếu xảy ra ở HIV- 1,hiếm gặp ở HIV-2

1.2.4.2 Sự hoạt động của HIV trong cơ thể bệnh nhân

Khi vào cơ thể, HIV gây nhiễm trên một lượng lớn các tế bào T CD4+ vànhân lên rất nhanh Trong giai đoạn cấp tính hay giai đoạn đầu của quá trình nhiễm,trong máu bệnh nhân mang rất nhiều các hạt virut và lan truyền rất nhanh trong cơthể, thâm nhập vào các cơ quan, đặc biệt là trong các cơ quan lympho bao gồm cáchạch bạch huyết, lá lách, amidan, vòm họng [6, 13]

Khoảng 2 đến 4 tuần sau khi phơi nhiễm virut, 70% người nhiễm HIV sẽ cócác triệu chứng như cúm liên quan đến quá trình nhiễm cấp tính Hệ thống miễndịch của bệnh nhân chống lại HIV bằng các tế bào Lympho T gây độc (cytotoxic Thoặc T CD8+) và kháng thể của tế bào Lympho B tạo ra Kháng thể đầu tiên doHIV kích thích sinh ra là kháng thể kháng protein p24 Quá trình này làm giảm mộtlượng đáng kể HIV Lượng tế bào T CD4+ có thể được tái tạo lại một lượng nào đóhoặc thậm chí bằng lượng tế bào ban đầu Sau đó, bệnh nhân không thể hiện mộttriệu chứng nào trong vài năm mặc dù HIV vẫn tiếp tục nhân lên trong các cơ quanlympho [6]

Một đặc điểm chỉ thấy ở HIV là mặc dù có đáp ứng miễn dịch rất mạnh của

cơ thể, có thể đủ để tiêu diệt hầu hết sự nhiễm các loại virut khác, một số HIV vẫn

có thể trốn thoát Điều này là do một phần lớn của sự đột biến với tốc độ cao xảy ratrong quá trình sao chép HIV Thậm chí khi virut không tránh được hệ thống miễndịch bằng quá trình đột biến, các thành phần của cơ thể chống lại HIV như cácsubset hoặc các tế bào T gây độc nhận ra HIV có thể bị suy yếu và trở nên mất chứcnăng

Thêm vào đó, trong giai đoạn sớm của quá trình nhiễm bệnh, các bệnh nhân

có thể mất các tế bào đáp ứng đặc hiệu HIV là T CD4+ có vai trò tiết interferon vàcác yếu tố chống virut khác và sự phối hợp của các tế bào T CD8+ Các đáp ứng nàybình thường có tác dụng làm chậm quá trình nhân lên của HIV

Mặt khác, provirut trốn trong các nhiễm sắc thể của tế bào nhiễm và bảo vệkhỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch Các tế bào như vậy là nơi trú ngụ an toàncủa virut HIV[26, 47, 54, 55]

1.2.4.3 Cơ chế phát sinh bệnh

Sự nhiễm HIV dẫn đến việc giảm lượng tế bào T CD4+ thông qua 3 cơ chế:

 Trực tiếp tiêu diệt các tế bào bị nhiễm

 Làm tăng tốc độ chết theo chu trình của các tế bào nhiễm

 Giết các tế bào T CD4+ nhiễm HIV bằng các tế bào gây độc (T CD8+ )Khi lượng tế bào TCD4+ giảm đến một mức dưới mức quy định, các đáp ứngmiễn dịch qua trung gian tế bào sẽ bị mất, do đó dẫn đến suy giảm hệ thống miễndịch, bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch Các rối loạn chính trongđáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân HIV/AIDS gồm:

 Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là TCD4+

 Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất các đáp ứng miễndịch dưới da, khả năng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào, giảmđáp ứng gây độc tế bào do giảm tế bào TCD8+ và tế bào giết tự nhiên NK

 Tăng gamma globulin

 Tăng phức hợp miễn dịch, tăng các tự kháng thể và một số protein chốnglại tế bào trong huyết thanh

 Giảm đáp ứng kháng thể nguyên phát đối với các kháng nguyên mới tiếpxúc lần đầu

 Giảm gamma interferon

Hậu quả của các rối loạn đáp ứng miễn dịch ở bênh nhân nhiễm HIV/AIDS làbệnh nhân dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội (thường do vi khuẩn, virut, nấm,

kí sinh trùng) hoặc sẽ dễ mắc các bệnh ung thư Nếu không được chữa trị, hầu hếtcác bệnh nhân nhiễm HIV cuối cùng đều dẫn đến giai đoạn AIDS và chết Tuynhiên, 1/10 trong số đó vẫn có thể khỏe mạnh trong một thời gian dài mà khôngbiểu hiện triệu chứng nào cụ thể Nếu được chữa trị với các thuốc kháng virut, cóthể kéo dài thời gian sống của người bệnh [25, 51, 52, 53, 56]

1.2 Phương pháp chẩn đoán phát hiện virut HIV và cách phòng bệnh

1.3.1 Chẩn đoán sinh học nhiễm HIV

Sự xác định sớm sự nhiễm HIV là điều rất quan trọng vì ở giai đoạn đầu củapha mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nào cụ thể Các xét nghiệm xác định gầnđây đã được sử dụng có thể phát hiện sự nhiễm HIV trong vòng 2 đến 6 tuần sau khi

nhiễm là khoảng 80% và sau 12 tuần là 100%, chỉ có một số ít các trường hợp chiphát hiện ra sau 3 đến 6 tháng [33].

Phát hiện người nhiễm HIV là một trong những điều kiện cần thiết để có thể

có một phương pháp trị liệu phù hợp nhất, ví dụ bắt đầu dùng HAART đúng lúc cóthể kéo dài thời gian sống và làm cho người bệnh khỏe mạnh hơn Vì thế, nhữngngười có nguy cơ mắc bệnh nên được tư vấn và kiểm tra HIV ngay sau khi phơinhiễm với nguồn bệnh [31] Trong nhiều trường hợp, sự chẩn đoán một bệnh nhân

có HIV thường được diễn ra nhiều lần (thường xuyên qua các năm)

Bên cạnh sự chẩn đoán cho từng cá nhân, xét nghiệm HIV còn được thựchiện với một lượng lớn các mẫu máu và các sản phẩm của máu hoặc các cơ quanghép để đảm bảo an toàn cho người nhận cũng như để làm giảm nguy cơ bùng phátthành dịch (UNAIDS, 1997 và 2001) [33, 34]

Trong tình trạng hiểu biết hiện nay, nhiễm HIV coi như là suốt đời mangHIV Phát hiện HIV dựa trên 3 nguyên tắc [50, 51, 52]

 Nuôi cấy và phân lập virut

 Phát hiện kháng thể kháng HIV

 Phát hiện trực tiếp kháng nguyên, acid nucleic hoặc protein của virut

1.3.1.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy virut HIV

HIV- 1 có thể được cấy từ huyết tương hoặc từ tiểu cầu đơn nhân của bệnhnhân Nếu kết quả cấy là dương tính thì khẳng định ngay là nhiễm HIV Nhượcđiểm của phương pháp này là môi trường nuôi HIV rất phức tạp Do đó, hầu hếtnuôi cấy virut chỉ sử dụng với mục đích nghiên cứu chứ ít được ứng dụng trongchẩn đoán

1.3.1.2 Phương pháp định tính xác định ADN của provirut của HIV-1 bằng kỹ thuật PCR

Mặc dù chỉ có một lượng nhỏ phần của các tế bào tiểu cầu đơn nhân peripheral blood mononuclear cells) của bệnh nhân mang ADN của provirut, nóthường được dùng để xác định virut bằng phản ứng PCR Qua đó, sự chẩn đoánHIV- 1 thông qua việc xác định sự có mặt của ADN của provirut trong PBMC bằng

(PBMC-cách khuếch đại gen gag hoặc gen pol Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR

là 100% Tuy nhiên, trên thực tế, độ nhạy của phương pháp xác định ADN củaHIV-1 trong chẩn đoán chỉ là 96-97% Để tránh kết quả dương tính giả, cần chú ýđến các thành phần và thao tác trong khi làm phản ứng PCR [23]

Ưu điểm của phương pháp này là không cần phòng thí nghiệm có độ an toàncao, và nó nhạy hơn việc xác đinh kháng nguyên với lượng mẫu rất ít Tuy nhiên,

nó chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nhất định, ví dụ như ở giai đoạn đầucủa quá trình nhiễm hoặc trong trường hợp trẻ sơ sinh của người mẹ đã nhiễm HIV

Vì ở những bệnh nhân có nồng độ tế bào CD4 cao dẫn đến việc giảm sự di chuyểncủa các PBMC nhiễm virut trong máu [23,43]

Hiện nay, bằng phương pháp RT - PCR (Reverse Transcriptase PCR) có thểxác định sự có mặt ARN của virut trong huyết thanh bệnh nhân và phương phápReal-time PCR có thể xác định được nồng độ virut trong cơ thể thông qua việc xácđịnh lượng AND trong tế bào [7] Đây là những phương pháp có giá trị lớn trongviệc xác định trạng thái của bệnh nhân và ứng dụng trong việc điều trị bằng cácthuốc kháng virut thích hợp

1.3.1.3 Phương pháp xác định kháng nguyên p24 bằng kỹ thuật ELISA hoặc Western Blot

Một phương pháp cải biến để chẩn đoán HIV-1 là xác định sự có mặt củakháng nguyên virut trong máu bệnh nhân Kháng nguyên tốt nhất được sử dụng chomục đích này là kháng nguyên lõi capsit p24 – một protein cấu trúc là thành phầnchính của hạt virut Kháng nguyên này xuất hiện sau khoảng 2 đến 6 tuần với nồng

độ cao trong máu Do đó, việc kiểm tra kháng nguyên này là phương pháp tối ưutrong việc chuẩn đoán sớm sự nhiễm HIV-1 [7, 16, 50]

Sau giai đoạn này, nồng độ kháng nguyên giảm do liên kết với kháng thể đặchiệu kháng p24 nên không xác định được kháng nguyên trong hầu hết các bệnhnhân Vì lí do này mà phương pháp kiểm tra kháng nguyên p24 là không phù hợp đểchẩn đoán sự nhiễm HIV-1 ở người đang ở trạng thái khỏe mạnh nhưng mang HIV-

1 Trong trường hợp này, người ta phải dùng các biện pháp xét nghiệm khác nhưRT- PCR và bADN [35]

Theo dõi kháng nguyên p24 có thể dự đoán được thời kỳ của bệnh do:

 Kháng nguyên p24 xuất hiện sớm trong giai đoạn sơ nhiễm ở 50-70%bệnh nhân

 Khi đến giai đoạn tiềm tan thì p24 giảm dần theo thời gian

 Khi đến giai đoạn AIDS thì lượng p24 tăng trở lại [52]

Các kháng nguyên của HIV thường được xác định bằng các phương phápnhư phương pháp enzym liên kết miễn dịch (ELISA hoặc EIA) Các phiến plasticđược phủ bằng protein của virut (kháng nguyên) Huyết thanh bệnh nhân được đưavào giếng Nếu trong huyếtt thanhh có kháng thể kháng HIV, các kháng nguyênHIV sẽ liên kết với các kháng thể đặc hiệu trong các phiến Sau khi rửa huyết thanh,các kháng thể gắn kết được xác định bằng kháng thể thứ 2, kháng thể này liên kếtvới một enzym như alkalin phophataza, hoặc peroxidaza Sự liên kết giữa kháng thểthứ 2 với kháng thể kháng HIV có thể xác định được bằng phản ứng của đĩa với cơchất của alkalin phophataza hoặc peroxidaza làm chuyển màu khi được phân cắtbằng enzym [35]

1.3.1.4 Phương pháp xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật ELISA hoặc Western Blot

Các phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng HIV đang sử dụng hiện nay làcực kỳ chính xác đối với việc xác định sự nhiễm cấp tính, về cả độ nhạy (khả năngcủa phương pháp để đưa ra kết quả dương tính khi đối tượng thực sự đã nhiễm HIV)

và độ đặc hiệu (khả năng đưa ra kết quả dương tính khi đối tượng thực sự khôngnhiễm HIV) (theo NIAID và WHO)

Một trong những vấn đề của việc xác định kháng thể kháng HIV là giai đoạncửa sổ Đây là khoảng thời gian từ lúc bắt đầu nhiễm cho đến khi xác định được sự

có mặt của kháng thể Giai đoạn chuyển từ kết quả âm tính kháng thể sang dươngtính được gọi là giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [36, 49]

Ở giai đoạn đầu của sự biến đổi huyết thanh, kháng thể kháng protein p24xuất hiện đầu tiên Sự có mặt của kháng thể kháng p24 đánh dấu sự giảm sự lưuhành kháng nguyên p24 trong cơ thể bệnh nhân Kháng thể kháng p24 vẫn tiếp tụchạn chế lưu hành của p24 cho đến khi kháng thể chống lại glycolprotein vỏ gp41 vàgp120 bắt đầu xuất hiện

Glycoprotein vỏ của HIV-1 và HIV-2 được bảo tồn lớn và là các epitope ưuthế miễn dịch Sự xác định các kháng thể chống lại protein vỏ tạo ra sơ sở cho cáckit chẩn đoán miễn dịch để xác định HIV Tuy nhiên, các loại kit này không thể sửdụng để xác định sớm với mẫu huyết thanh vì tại đó kháng thể chống lại khángnguyên p24 của protein lõi mới là kháng thể xuât hiện đầu tiên Vì vậy, các loại kitnày chỉ được sử dụng ở giai đoạn sau của quá trình nhiễm [22] Do vậy, việc xácđịnh kháng thể kháng p24 trong giai đoạn này là một lựa chọn để xác định sớm sựnhiễm HIV [9, 41].

Chẩn đoán kháng thể kháng HIV nhờ phương pháp ELISA có độ nhạy hơn99%, tuy nhiên cũng có trường hợp dương tính giả Vì thế, tất cả các mẫu dươngtính trong phản ứng ELISA đều được xác định lần thứ 2 nhờ phương pháp Westernblot Mặc dù không nhạy như ELISA, phương pháp Western blot đặc hiệu hơn vàcho phép xác định tại phòng thí nghiệm protein đặc hiệu virut phản ứng với khángthể [17] Chỉ có các xét nghiệm dương tính ở cả 2 phản ứng với ELISA và Westernblot mới được kết luận là nhiễm HIV [41, 52]

1.3.1.5 Chẩn đoán nhanh HIV bằng Rapid HIV Test

Bên cạnh phương pháp chuẩn xác định HIV bằng các phương pháp kiểm tra

đã biết, hiện nay đã có phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định sự nhiễm HIVtrong phòng thí nghiệm đối với phụ nữ mang thai hoặc đối với bệnh nhân bị thương(Abbott Laboratories)

Phương pháp này đã được áp dụng trong chẩn đoán nhanh ở các quốc giaphát triển và nay đã được đưa vào Việt Nam thông qua các hoạt động của các tổchức phòng chống AIDS toàn cầu Chỉ trong 10 phút, sử dụng các hạt latex đượcbọc bởi kháng nguyên HIV-1, sau đó được ủ cùng với huyết thanh của bệnh nhân đểcho ra kết quả Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này là hơn 99% Hiện nay,phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi và liên tục có sự cải tiến để làm giảmthời gian xác định bệnh và làm tăng độ nhạy cũng như độ đặc hiệu [48, 51]

1.3.1.6 Chẩn đoán sinh học có suy giảm và rối loạn miễn dịch

- Dấu hiệu trực tiếp và thường xuyên được sử dụng nhất là sự giảm TCD4+.Bình thường lượng tế bào này trong máu là 450- 1280/ mm3; còn với TCD8+ là 258-800/mm3

Nếu lượng TCD4+ nhỏ hơn 400 tế bào/ ml, chứng tỏ đã suy giảm miễn dịch.Nếu lượng TCD4+ nhỏ hơn 200 tế bào/ml cho thấy có sự suy giảm miễn dịchnghiêm trọng

- Dấu hiệu gián tiếp và cũng thường xuyên được sử dụng là tỷ lệTCD4+/TCD8+ giảm, dạng bình thường, tỉ lệ này là 1,4- 2,2

- Ngoài ra còn căn cứ vào lượng tế bào lympho B, nếu lượng tế bào này nhỏhơn 25- 280/mm3 thì cũng kết luận là có suy giảm miễn dịch

1.3.2 Phương pháp phòng chống và điều trị bệnh

Hiện tại chưa có vacxin để phòng ngừa lây nhiễm HIV, và cũng không cómột liệu pháp nào có thể loại bỏ hoàn toàn virut HIV ra khỏi cơ thể Tuy nhiên,những người sống chung với AIDS hiện nay có thể kéo dài và cải thiện chất lượngcuộc sống bằng liệu pháp điều trị kháng virut Lựa chọn điều trị lý tưởng bao gồmcác điều trị kết hợp (“cocktail”) hai hay nhiều loại thuốc kháng retrovirus nhưHAART Có 2 loại chất ức chế là reverse transcriptase giống nucleoside (nucleosideanalogue reverse transcriptase inhibitor, NRTI) chất ức chế protease hoặc một chấtthuốc ức chế reverse transcriptase non-nucleoside (non-nucleoside reversetranscriptase inhibitor, NNRTI) có thể kéo dài thời gian phát triển bệnh từ giai đoạnHIV sang giai đoạn AIDS, do đó kéo dài thời gian sống của bệnh nhân [41, 42]

Để có được biện pháp điều trị có hiệu quả tốt nhất cho bệnh nhân phụ thuộcrất nhiều vào sự xét nghiệm phát hiện bệnh sớm và theo dõi tiến triển của bệnhthông qua các phương pháp xét nghiệm phù hợp với từng giai đoạn Do đó, việcnghiên cứu và phát triển các loại kit phát hiện nhanh HIV, trong đó việc phát hiệnHIV dựa vào kháng nguyên và kháng thể kháng P24 đang được rất nhiều các nhànghiên cứu và các hãng sản xuất quan tâm

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein P24 tái tổ hợp

Trước vai trò to lớn của việc sử dụng kháng nguyên P24 trong chẩn đoán vàchế tạo vacxin, việc nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp P24 đang thu hút đượcnhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và cũng thu được những thành tựu đáng kể[28, 32, 43, 48] Các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất protein P24 tái tổ hợp đểdùng trong chẩn đoán HIV bằng ELISA hoặc Western blot Rất nhiều loại kit đượclưu hành trên thị trường để kiểm tra sự nhiễm HIV như kit HIV-1 P24 ExtendedRange Kit của hãng Gentaur [44], Bio Rad Thành công từ việc tối ưu hóa sản xuất

protein tải tổ hợp P24 trong Mycobacterium bovis [27] và trong E coli [19] Việc

chuyển gen p24 vào trong cây thuốc là một trong những thành tựu quan trong để

hướng tới việc chế tạo vacxin cho người nhiễm HIV [30] Có nghiên cứu đã tạo

được gen p24 tái tổ hợp từ nấm men và đã gây miễn dịch thành công cho những

người tình nguyện khỏe mạnh [40] Ngoài ra, protein P24 tái tổ hợp còn được ứngdụng trong việc chế tạo kháng thể đơn dòng để dùng trong việc chế tạo các kit chẩnđoán HIV [36]

Trong giới hạn luận văn này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sản xuấtprotein P24 tái tổ hợp dùng trong mục địch phát hiện kháng thể kháng HIV tronghuyết thanh bệnh nhân

1.5 Vectơ

Một vectơ được sử dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau:

 Vectơ phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộcvào sự sao chép hệ gen tế bào chủ

 Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượngADN tối đa Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhậpvào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả

 Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứavectơ, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen chọn lọc Thông thường đó làcác đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trênmôi trường có chất kháng sinh, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme chuyểnhoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch

 Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộnnhất cho tế bào chủ.

 Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đaenzym giới hạn Điều này phát triển khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc Nhờvậy mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chínhgiữa gen và làm bất hoạt gen đấy Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmidkhác nhau ra đời, thế hệ sau là cải tiến của thế hệ trước và ngày càng mangnhiều đặc tính quý báu cho việc tạo dòng

Có nhiều loại vectơ: tách dòng như plasmid, phage, cosmid, YAC Người tachọn sử dụng vectơ dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đíchtạo dòng Về chức năng, người ta chia vectơ thành hai loại lớn là vectơ tạo dòng(cloning vector) và vectơ biểu hiện (expression vector) Để tách dòng và biểu hiệnđoạn gen p24, chúng tôi sử dụng vectơ pCR2.1 để tách dòng và vectơ pVFT2S để

biểu hiện đoạn gen p24 của HIV.

5.1.1 Vectơ pCR 2.1

Để tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá protein P24 của HIV, chúng tôi

sử dụng vectơ pCR2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dòng Đây là một trong cácvectơ đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sảnphẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có mộtbazơ Thimin Vectơ pCR2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết kế có gắn một operonchuyển hoá đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promotơ củaoperon này là gen cấu trúc mã hoá cho - galactosidase có vùng cắt đa vị với 17 vị

trí cắt cho các enzyme giới hạn như EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI, SpeI,

BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeR7I, XhoI, XbaI, ApaI Trong đó EcoRI và BstXI có

hai vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt Với vị trí của vùng cắt gắn đa

vị như vậy, sản phẩm -galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ không được

đính đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn ngoại lai).Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectơ tái

tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra, vectơ pCR2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là

ampicillin, nhờ đó có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứaampicillin với nồng độ ức chế tối thiểu

Hình 7 Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của Vectơ pCR2.1

1.5.2 Vecto biểu hiện pVFT2S

Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải đựơc gắnvào vector biểu hiện Có rất nhiều hệ vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào

biểu hiện khác nhau ở đây, để biểu hiện gen p24 mã hoá một phần kháng nguyên lõi

của HIV, chúng tôi chọn vector pVFT2S làm vector biểu hiện

Vectơ pVFT2S có kích thước khoảng 6041 bp, được thiết kế dựa trên cơ sở củavector pET-28a(+) có vị trí gắn của T7 promoter, vùng Lac Operator là vị trí nhậnbiết và gắn các protein điều hoà giúp cho quá trình điều hoà hoạt động của gen.Vùng cắt gắn đa vị chứa vị trí cắt của các enzym giới hạn Đuôi Histag gồm 6Histidine có vai trò trong việc tinh sạch protein tái tổ hợp, vị trí GST là vị trí nhậnbiết của enzym proteaza, vị trí T7 terminator kết thúc quá trình dịch mã Vùng nhậnbiết gồm gen kháng kháng sinh là kanamycin giúp cho việc chọn lọc chính xác dòngplasmid tái tổ hợp

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là mẫu máu của bệnh nhân nhiễm HIV đã được bất hoạt do Bệnh viện Phụ sản Hà Nội cung cấp.

2.2 Vật liệu và hóa chất

2.2.1 Sinh phẩm

Trong quá trình tách dòng và thiết kế vector biểu hiện, và biểu hiện chúng tôi

đã sử dụng một số sinh phẩm của các hãng nổi tiếng trên thế giới như: Kit tách dòng

- TA cloning của hãng Invitrogen, Kit xác định trình tự - BigDye Terminator v3.1của hãng Applied Biosystem, Vector biểu hiện pVFT2S và chủng giống BL21-DE3Star do hãng Novagen cung cấp, Kit tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM của hãngInvitrogen, Kit thôi gen - S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen…

2.2.2 Hóa chất

Các hóa chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử củahãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad… bao gồm IPTG, Ethanol, Acetat natri,Cao nấm men, Trypton, Chloroform, EDTA, Agarose, Natriclorua, Agar-bacter,Tris-HCL, SDS, MgCl2, Acrylamide, bis-Acrylamide

2.2.3 Trang thiết bị

Trong quá trình thực hiện đề tài này chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị,máy móc của Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ Gen thuộc ViệnCông nghệ Sinh học:

Máy lắc ổn nhiệt 37oC

Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

Máy ly tâm (Sorvall)

Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)

Máy hút chân không - Speed VAC Se

110A-Savant)

Máy quang phổ (Hewlett Packard, Mỹ)

Máy soi chụp ảnh gel (Pharmacia)

Cân phân tích 10-4g (Mettler Toledo).Cân điện 10-1g (Ohaus)

Nồi khử trùng (Nhật Bản)

Tủ lạnh sâu –20oC, và -80oC -Sanyo, Nhật

Tủ cấy vô trùng (Sanyo)

Pipetteman các loại (Gilson)

Bộ điện di (Bio-Rad)

Bộ điện di ADN - Advance Tech, Nhật

Máy ly tâm lạnh (Sorvall)

Máy khuếch đại gen 9700-Applied

Biosystem

Và một số thết bị máy móc khác

Bể ổn nhiệt 37oC, 42oC, 50oCMáy phá màng tế bào bằng siêu âmMáy xác định trình tự ADN tự động(Genetic Analyze Avant 3100)

2.2.4 Môi trường và dung dịch

Dung dịch dùng cho điện di ADN

- Dung dịch đệm điện di TAE 1X: Lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thànhphần như sau:

Axit acetic glacial 28,6 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 50 mlNước khử ion vừa đủ 500 ml

- Đệm tra mẫu ADN ( Loading buffer) 5X :

Tris-HCl 1 M pH 8,0 1 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 0,2 ml

Bromphenol Blue 1% 2 ml

Dung dịch dùng trong tách chiết ADN plasmit từ vi khuẩn

- Dung dịch Sol I: Tris-HCl pH8 50mM, EDTA pH8 10mM

- Dung dịch Sol II: NaOH 200mM, SDS 1%

- Dung dịch Sol III: CH3COOK 3M, pH 5,5

- Dung dịch chloroform: isomylalcohol (24:1)

- Dung dịch CHCOONa (Natri acetat) 3M, pH 5,2

- Dung dịch TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0)

- Dung dịch TE-RNase: 100l RNase 10mg/ml trong 10ml dung dịch TE

Dung dịch dùng cho điện di protein

- Dung dịch đệm SDS-PAGE10X: Tris base15,14 g; Glycine 72,1 g

Khuấy tan rồi bổ sung 25 ml SDS 20% Sau đó rồi bổ sung nước khử ion vừa

- Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue (CBB) 0,25% : Cân 0,25 g CBB(Merck) hoà tan trong 100 ml dung dịch tẩy màu

Dung dịch dùng cho Western blot

- Đệm chuyển protein sang màng bloting buffer 10X :

100 ml đệm chuyển bloting buffer 10X

200 ml metanol

700 ml H2O khử ion

- Dung dịch đệm TBS 1X

25 mM Tris-HCl, pH 7,50,5 M NaCl

- Dung dịch đệm TTBS 1X

H2O khử ion: 250 mlTween 20: 250 l

- Dung dịch Ponceau : 50 mg Ponceau (Merck) hoà trong 50 ml dung dịch axít axêtic 2%

- Dung dịch che chắn bản (Skim milk 5%):

Dung dịch TBS 100ml

- Dung dịch hiện màu

5 ml metanol để trên đá + 15 mg chất hiện màu (4-chloronaphtol)

25 ml TBS 1X + 15 l H2O2 30%

Trộn 2 thành phần vào với nhau trước khi hiện màu

Dung dịch màu dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết ADN tổng số từ máu

Nguyên tắc: ADN là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cầntránh mọi tác nhân cơ học hay hoá học mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này

 Cho 1ml máu vào Ependorf 1,5+0,8 ml SSC Ly tâm 12000v/1phút

 Hút bỏ 1 ml dung dịch ly tâm (lớp trên)

 Bổ sung 1 ml SSC 1X -> Ly tâm 12000 v/1phút

 Loại bỏ hoàn toàn dung dịch ly tâm

 Bổ sung 375 l NaOAc 0,2 M  Vortex

 Bổ sung 25 l SDS 10% và 5 l proteaza  ủ 550C trong 1h

 Bổ sung 120l phenol_chlochoroform_isoamyl, lắc mạnh

 Ly tâm 12000 v/2phút

 Hút lớp trên sang ống mới

 Bổ sung 1 ml cồn 100% Trộn đều, ủ ở 200C trong 15- 30 phút

 Ly tâm 12000 v/5 phút, bỏ dịch

 Làm khô, bổ sung 180 l TE  Vortex, ủ ở 550C trong 10 phút

 Thêm 20 l NaOAc 2M trộn đều

 Bổ sung 500 l cồn 1000  Ly tâm 12000 v p trong 3 phút

 Rửa 1 ml cồn 700  Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ dịch

 Làm khô, hoà lại trong 200 l TE  ủ 550C qua đêm

 Thỉnh thoảng lắc mạnh

 Bảo quản - 250C

2.3.2 Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế

Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độADN có trong mẫu, đồng thời kiểm tra được độ sạch của mẫu mà ta tách chiết.Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ởbước sóng 260 nm của các bazơ purin và primidin Từ giá trị mật độ quang học (OD

- Optical Density) ở bước sóng 260 nm của mẫu đo cho phép xác định nồng độ axitnucleic trong mẫu

Cách tiến hành: