Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Và Nước Dừa Đến Quá Trình Nhân Giống In Vitro Cây Lan Nhất Điểm Hồng

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG

IN VITRO CÂY LAN NHẤT ĐIỂM HỒNG

(Dendrobium draconis)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

TÓM TẮT

Đề Tài : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng

Giáo viên hướng dẫn : TS.Trần Thị Dung

Đề tài được tiến hành tại Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện : tháng 9/09 đến tháng 12/09

Nội dung đề tài thực hiện gồm 4 thí nghiệm:

 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa

đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro Thí nghiệm

được tiến hành nhằm xác định nồng độ nước dừa thích hợp cho quá trình nhân chồi cây lan Nhất Điểm Hồng

Kết quả thu được: Nồng độ nước dừa = 200 ml/l bổ sung vào môi trường

MS cho kết quả hình thành chồi nhiều nhất (2,65 chồi) và thời gian nảy chồi nhanh nhất (14,78 NSC)

 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng hình thành chồi

từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định nồng độ BA tốt nhất cho quá trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng

Kết quả thu được: Nồng độ BA = 1,5 mg/l được bổ sung vào môi trường

MS thích hợp nhất cho sự hình thành chồi với số chồi hình thành cao ( 3,17 chồi), thời gian hình thành ngắn (15,89 NSC)

 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng hình

thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định nồng độ BA kết hợp NAA tốt nhất cho quá trình nhân giống in vitro cây

lan Nhất Điểm Hồng

Kết quả thu được: Sự kết hợp giữa nồng độ BA = 1 mg/l và NAA = 0,5 mg/l

trong môi trường cho kết quả về sự hình thành chồi tối ưu nhất, với thời gian hình thành chồi ngắn nhất ( 13,22 NSC), số chồi đạt cao nhất ( 3,28 chồi)

 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ từ

cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định nồng

độ NAA tốt nhất cho quá trình hình thành rễ in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng

Kết quả thu được: Nồng độ NAA = 1 mg/l bổ sung vào môi trường MS

thích hợp nhất cho sự hình thành rễ của cây lan Nhất Điểm Hồng với số rễ nhiều nhất (3 rễ), thời gian ra rễ nhanh (17,22 NSC)

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các hình vii

Danh sách các bảng viii

1 MỞ ĐẦU 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Điều kiện sinh thái 5

2.1.3 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và trong nước 7

2.1.4 Đặc điểm của cây lan Nhất Điểm Hồng 10

2.2 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro 12

2.3.1 Nhân giống bằng chồi nách 12

2.3.2 Nhân giống bằng chồi đỉnh 12

2.3.3 Nhân giống bằng chồi bất định 13

2.3.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus 13

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro 14

2.4.1 Mẫu nuôi cấy 14

2.4.2 Môi trường nuôi cấy 15

2.4.2.1 Các nguyên tố đa lượng 17

2.4.2.2 Các nguyên tố vi lượng 19

2.4.2.3 Vitamin 19

2.4.2.6 Agar 20

2.4.2.7 Các chất điều hoà sinh trưởng 21

2.5 Các công trình nghiên cứu về Dendrobium 22

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

3.2 Đối tượng nghiên cứu 24

3.3 Vật liệu nghiên cứu 24

3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ trong phòng nghiên cứu 24

3.3.2 Điều kiện nuôi cấy 24

3.3.3 Môi trường nuôi cấy 25

3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 27

3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng 28

3.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng 29

3.4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ từ cây lan Nhất Điểm Hồng 30

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của Dendrobium 7

Hình 2.2 Hoa lan Nhất Điểm Hồng (Dendrobium draconis) 8

Hình 3.1 Cách bố trí cây trong chai nước biển 26

Hình 4.1 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa

đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 33

Hình 4.2 : Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng

hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 36

Hình 4.3a : Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng

hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 39

Hình 4.3b : Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng

hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 40

Hình 4.4 : Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

hình thành rễ từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 43

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các nồng độ nước dừa được sử dụng trong thí nghiệm 27

Bảng 3.2: Các nồng độ BA được sử dụng trong thí nghiệm 28

Bảng 3.3: Các nồng độ BA và NAA được sử dụng trong thí nghiệm 29

Bảng 3.4: Các nồng độ NAA được sử dụng trong thí nghiệm 30

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 31

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 34

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 37

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro 41

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hoa lan được người tiêu dùng ưa chuộng vì vẻ đẹp đặc sắc và các hình thức

đa dạng của chúng Hoa lan là một món quà của tạo hóa Đây không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa

muôn màu, muôn vẽ của các loài hoa như: Cattleya, Phalaenopsis, Dendrobium,

Vanda, Cymbidium

Thành phố Hồ Chí Minh nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng, phù hợp với một số loài lan, tuy nhiên việc sản xuất hoa lan còn ở quy mô nhỏ và chủ yếu

sản xuất các giống ngoại nhập như lan Mokara, Phalaenopsis, Dendrobium

Với mức sống ngày càng cao của con người, bên cạnh việc thỏa mãn nhu cầu

về ăn, mặc thì việc thõa mãn nhu cầu về tinh thần là không thể thiếu Trong nông nghiệp, nếu các loài cây có giá trị kinh tế như: cây lương thực, cây công nghiệp, cây

ăn quả có vai trò nuôi sống con người thì cây hoa kiểng đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần con người Nó biểu tượng cho vẻ đẹp, cho hạnh phúc và sức sống của con người Hiện nay hoa được sử dụng rộng rãi khắp nơi vào nhiều dịp như: lễ, tết, hội họp, … Do vậy, việc phát triển cây hoa và xây dựng hoàn thiện quy trình nhân nhanh các giống cây hoa là một việc làm cần thiết

Được sự cho phép của Khoa Khoa Hoc Ứng Dụng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Tôn Đức Thắng Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

“Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa đến quá

trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng ”

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium

Dendrobium là loài lan sống trên các cành cây nhưng không cộng sinh, phân

bố nhiều ở Âu Châu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Úc Châu,

Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya Dendrobium được trồng phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành Hiện nay thị trường Dendrobium ngày càng

đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau Dendrobium là loại hoa cắt cành phổ biến ở Thái lan như: Dendrobium Anna, Blue, Bangkok Land,

Big White, Candy, Candy Kiss, Casablanca, Caesar, Channel, Chidchom, Intuwong, Juliana, Madame Pompadour, Marco Polo Madame Pompadour, Mary Mak, Missteen, Nina, Royal Pink, Sabin, Sakura, Siam Ruby, Sonia, Walter Oumae, Yoko, Waipahu

Dendrobium là loài đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang

một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ Hoa có thể mọc từ

thân thành từng chùm hay từng hoa Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường lá đài sau nằm một mình, 2 lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm Môi gắn vào cằm, đôi khi kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Môi nguyên hay có thùy, gai, sọc có lông hay không 2 cánh hoa bên giống như 2 lá đài Trụ thấp Phần đực của đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ 1 chỉ ngắn về phái sau, 4 khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp

2.1.1 Đặc điểm hình thái

 Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô

xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt

trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi

mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp

 Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình

múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống

 Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoan và các gân

lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng

 Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những

chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ hoa) Cột nhị, nhụy ngắn

Hình dạng của Dendrobium cũng rất biến thiên:

- Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy,

thường rụng hết lá khi ra hoa như Long tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo (Dendrobium gratio sissimum)

- Nhóm giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như: Thủy tiên

trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum), Vảy cá (Dendrobium lindleyi)

- Nhóm cá giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài của chúng, dai bền không rụng Hoa thường cô độc ở nách như Hương duyên

(Dendrobium revolutum)

Việt Nam có hàng trăm loài phong lan, trong đó có Dendrobium là giống

sinh trưởng, phát triển tốt, cho hoa đẹp, có thể sử dụng làm nguồn gen quý cho công

tác lai tạo giống hoa lan mới của nước ta trong thời gian tới Giống lan Dendrobium

được chia thành nhiều nhóm tùy theo hình dạng và trục phát hoa, nhưng nhìn chung Dendrobium thuộc dạng đa thân, có nhiều đốt, sống phụ (chỉ bám vào cây làm giá thể, không ký sinh), và ra hoa từ các đốt trên thân; trong đó có hai nhóm chính: nhóm Callista và nhóm Dendrobium Nhóm Callista với chùm hoa rũ xuống

(pendulous) như Den chrysotoxum, Den farmeri, Den thyrsiflorum v.v

2.1.2 Điều kiện sinh thái

 Nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu

Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6 0C trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt Ở 18,50C Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng

mà không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 130C hay thấp hơn

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm

chính:

 Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng

là 150C, gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25 C, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa

 Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này

là 250C, gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống

Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam

 Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể

sống ở cả vùng lạnh và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa

nhiều hơn như Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của

các loài này là 20oC

 Độ ẩm và chế độ tưới nước

Các cây lan, sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện của các loài phong lan

Trong thời kỳ sinh trưởng cần tưới đủ, nhất là vào mùa nóng Giữa các lần tưới cần xem xét các giá thể trồng có bị đọng nước không Khô hoặc gần khô là tốt nhất Phải đảm bảo cho giá thể trồng được thông thoáng làm cho rễ lan có lúc khô,

và được khô từng lúc là điều rất quan trọng Chế độ thở của lan có một phần nhờ

vào rễ Trong mùa nóng, tưới hai đến ba lần một ngày là vừa phải, mùa thu và mùa đông hai lần

Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm cần từ 60 đến 70% Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng

 Ánh sáng

Dendrobium là loài lan ưa sáng (60 - 70%), rất thích hợp với ánh sáng mạnh,

có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90% Nhờ đó mà chúng phát triển được các giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy

lá Do đặc tính này nên việc nuôi trồng trong nhà hoặc dùng ánh sáng nhân tạo thực

tế không thuận tiện, dễ dàng

 Nhu cầu phân bón

Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều

phân bón và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại

Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu

bò khô có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10-20- 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 bằng phân 10-20- 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn

Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng

năm của nó Thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng

2.1.3 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và trong nước

 Trên thế giới

Hà Lan là quốc gia duy nhất ở châu Âu có công nghiệp trong lan xuất khẩu

Do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là

Cybidium

Italia là quốc gia nhập khẩu lan lớn nhất châu Âu

Đối với các nước châu Âu và châu Mỹ cũng như hầu hết các nước trên thế giới, hoa lan là một đặc phẩm cao quý Đặc biệt, đến mùa giáng sinh hoa lan đã được xuất nhập một cách ồ ạt từ các nước châu Á như: Thái Lan, Singapore…sang các nước với giá rất cao

Có thể nói Thái Lan là một nước điển hình trong ngành nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan ở các nước châu Á Hiện nay Thái Lan đang đứng đầu về xuất khẩu

hoa lan, hàng năm đã sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%,

Mokara chiếm 10% và Oncidium chiếm 5%, bán và thu được 60-70 triệu USD

Hiện nay, tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới phát triển ngày càng mạnh

mẽ, nó đã trở thành một ngành thương mại có giá trị kinh tế cao mang lại nhiều lợi nhuận cho người nuôi trồng và kinh doanh hoa

Hiện nay, mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50-60 ha trên một doanh nghiệp Một vài địa phương khác phong lan chỉ mới trồng

ở quy mô hộ gia đình trên diện tích từ vài m2 đến vài nghìn m2, cá biệt mới có vài

hộ trồng từ 1- 2 ha Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan Một số địa phương khác như Sapa, Phú Yên đã bước đầu khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân giống hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan

Nhìn chung tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh

mẽ

ở các tỉnh phía nam, đăc biệt là ở Đà Lạt và TP Hồ Chí Minh Và một thực tế còn tồn tại hiện nay là mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan

từ các nước láng giềng để đáp ứng nhu cầu nội địa Trong những tháng đầu năm

2007, mặc dù kim ngạch nhập khẩu hoa lan cắt cành đã giảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khá cao Theo số liệu thống kê của tổng cục hải quan, kim ngạch nhập khẩu phong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong tháng 2/2007 là 26,515 nghìn USD, giảm 20,17 % so với tháng 1/2007 nhưng vẫn tăng 51,76% so với tháng 12/2006 Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của Việt Nam trong thời gian qua là ở Thái Lan với gần 100% lượng lan cắt cành

D sulawesii D spectabile D uniforum

D densiflorum D victoriae-reginae D sulcatum

D sanderae var major D purpureum D senile

D nemorale D peguanum D primulinum

Hình 2.1 Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của Dendrobium

2.1.4 Đặc điểm của cây lan Nhất Điểm Hồng

Lan Nhất Điểm Hồng thuộc:

Tên khoa học : Dendrobium draconis

D draconis (Nhất Điểm Hồng) là một giống phong lan cao chừng 40 cm có

7-9 đốt với vỏ bọc đầy lông đen Hoa nở vào mùa xuân, màu trắng trong họng có màu đỏ hay đỏ cam, ngang to 6-7 phân, thơm như mùi cam, quýt, lâu tàn mọc từ các đốt gần ngọn của thân cây mọc từ năm trước Mọc thành bụi đứng; thân hình đùi, có rãnh; lá có phiến tròn, dài, thon, dài 10cm - 13cm, đầu tà, có 2 thùy Cây mọc ở Đà Lạt (Lâm Đồng), Nha Trang, Đà Nẵng và phân bố ở Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia

Hình 2.2 Hoa lan Nhất Điểm Hồng ( Dendrobium draconis)

2.2 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh học Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các

tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong

tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết củaSchleiden và Schwann vào thực nghiệm Tuy nhiên ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào

đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm như Erythronium, Ornithogalum,

Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông lại

dùng các tế bào đã mất khả năng tái sinh)

Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins (người Mỹ) đã thành công trong việc lập lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu

rễ một cây hòa thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose Tuy nhiên, sự sinh trưởng mạnh chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian dài

đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối

khoáng, glucose, và nước chiết nấm men Sau đó, cũng chính White chứng minh là

có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1),

Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid Đồng thời cũng trong thời gian này, R.J Gautheret đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên này không vượt quá 8 tháng Năm 1939, Gautheret thông báo các kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy vô hạn các mô của

cà rốt (Daucus carote L.) Sau thế chiến thứ II, lĩnh vực này phát triển đặc biệt

nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông lâm nghiệp được công

bố

2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro

2.3.1 Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách nhô lên từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Tùy theo các loại cây riêng biệt chỉ có một số giới hạn đỉnh sinh trưởng nách lá phát triển, phần lớn bị ức chế bởi ưu thế ngọn Khi các mẫu cấy là chồi được cảm ứng giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay cả ở nách lá bắc Như thế sẽ dẫn tới một số lượng lớn chồi con có thể tách ra và cấy chuyền hoặc tăng sinh chồi mẹ hơn nữa hoặc tạo rễ và sớm hình thành cây con Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm, kết quả của sự phân nhánh sớm này dẫn tới sự phát triển chồi bậc hai, bậc ba…trong sự tăng sinh cụm chồi Khi các cụm chồi như vậy phát triển chúng có thể được phân chia thành những cụm chồi nhỏ hơn hay các chồi được tách ra để hình thành cụm chồi giống như vậy khi cấy chuyền trong môi trường mới

Tiến trình phân chia có thể tiếp tục không hạn định Ví dụ: Các chồi tăng sinh của vài loại cây đã duy trì tới 10 - 15 năm mà không có biểu hiện bị hủy hoại (Hussey, 1983) Nếu sử dụng cytokinin ở nồng độ tối ưu (tổng quát trong khoảng từ 0.5 - 10 mg/l) và nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, tốc độ nhân giống có thể đạt được gấp 5 - 10 lần trong chu kỳ đều đặn 4 - 8 tuần Điều này có thể dẫn đến mức độ nhân giống cực nhanh trong khoảng 0.1 - 30 x 10 6 trong một năm Vì tất cả các thao tác nuôi cấy thực hiện trong điều kiện môi trường nhân tạo, mức độ nhân giống này có thể duy trì suốt năm do đó độc lập hơn đối với ảnh hưởng của thời vụ so với nhân giống cổ điển

2.3.2 Nhân giống bằng chồi đỉnh

Sự thành công trong việc nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt Ball (1946) nhận thấy rằng sự phát khởi rễ và hình thành cây con xảy ra nếu đỉnh nuôi cấy gồm ba lá nguyên thủy và

đỉnh sinh trưởng với một vài lá nguyên thủy kề cận Như vậy, kích thước nhỏ nhất (0,1 – 0,5 mm) mô tả cho sự nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường không sử dụng trong nhân giống vì khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp nhưng lại quan trọng trong việc phát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh Kích thước từ 0.5 - 2 mm thông dụng hơn và thích hợp cho việc nhân giống (Hartmann và Kester,1983) Một cách tổng quát, nồng độ cytokinin tăng lên trong những lần cấy chuyền tiếp sau để đạt một tốc độ tăng sinh chấp nhận được mà không làm chồi bị vàng hoặc hủy hoại chồi Nồng độ cytokinin trong môi trường ức chế sự phát triển rễ Nguyên liệu nuôi cấy thường chuyển sang môi trường ra rễ mà nồng độ cytokinin giảm khi chuẩn bị cấy trồng

2.3.3 Nhân chồi bằng chồi bất định

Chồi bất định là cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường Một số các loại nguyên liệu nuôi cấy bao gồm lá, vẩy, cuống lá( cây tái sinh từ những dãy biểu bì hoặc những lớp tế bào bên trong) ở Begonia (thu hải đường) và một số cây cảnh khác - tử diệp, trục hạ

diệp ở Conifers (thông tùng) - căn hành ở Gladiolus - các phần của hoa ở Lilium (Lily), Narcissus (thủy tiên), Chrysanthemum (cúc), các chồi mới có thể phát triển

trực tiếp trên mẫu cấy, bắt đầu từ tế bào nhu mô ở vị trí bên trong biểu bì hay ngay dưới bề mặt của thân, một số những tế bào này trở thành nhu mô phân sinh và phát triển thành những tế bào nhỏ, dày đặc theo dạng mô phân sinh, chúng biểu hiện nguồn gốc từ một tế bào duy nhất Mặt khác, các chồi mới cũng có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy Sự hình thành chồi bất định có thể cho kết quả cao về tốc độ nhân giống nói chung cao hơn tốc độ nhân giống từ chồi nách Tuy nhiên, chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây biến dạng Khi

sử dụng phương pháp này, cây trồng sản xuất phải được đánh giá cẩn thận về tính biến dị (Harmann và Kester,1983)

2.3.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus

Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan

hay phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp

Điều này do ảnh hưởng của thể bội không hoàn chỉnh và thể đa bội đôi khi đã tập hợp chung với mô hoặc cây tái sinh được từ đỉnh hay các dạng mô phân sinh Nuôi cấy callus và tế bào đơn có tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh Điều

này không có nghĩa là nhân giống in vitro qua trung gian callus không có khả năng

tạo dòng tái sinh đồng nhất Trong những trường hợp nào đó, có thể phân biệt những dòng tái sinh biến dạng ở bước đầu tiến trình nhân giống khi phân tách chồi lấy từ mô sẹo Đôi khi chồi biến dạng có thể phân biệt bởi biểu hiện hóa thủy tinh hay trong suốt của chúng mà điều này có thể giảm được ở những bước nhân giống

kế tiếp Callus đạt được có thể tái sinh cây trồng có kiểu gen đồng nhất cho tới 10 -

14 năm

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống invitro

2.4.1 Mẫu nuôi cấy

- Loại cây: cây 2 lá mầm thường tái sinh tốt hơn cây 1 lá mầm và thực vật hạt trần có khả năng tái sinh rất hạn chế (ngoại trừ cây non)

- Tuổi cây: Khi cây già, khả năng tái sinh thường giảm, sử dụng phần non của cây sẽ thích hợp hơn đặc biệt đối với cây thân gỗ và cây bụi Đôi khi sự cấy chuyền nhiều lần làm chồi đỉnh hay đặc biệt hơn là đỉnh sinh trưởng dần dần sẽ có được tính chất non trẻ Sự trẻ hoá này là kết quả của quá trình gia tăng phân chia tế bào và tái sinh cây

- Tuổi của mô và cơ quan: mô non, mềm dễ nuôi cấy hơn là mô già, hóa gỗ Mẫu cấy lấy từ cơ quan già, sự phân chia tế bào và tái sinh cây sẽ giảm

- Tình trạng sinh lý: Bộ phận cây non tái sinh mạnh hơn bộ phận cây già

Chồi lấy từ cây thân gỗ hay cây bụi ở tình trạng ngủ nghỉ thường nuôi cấy in vitro

khó hơn chồi đã qua giai đoạn hưu miên

- Tình trạng sức khỏe: nếu cây trồng khỏe mạnh ở giai đoạn lấy mẫu cấy thì

nuôi cấy in vitro sẽ thành công hơn nhiều

- Điều kiện tăng trưởng: mẫu cấy lấy từ cây trồng trong nhà kính tái sinh dễ dàng hơn từ cây trồng ngoài đồng ruộng

- Ảnh hưởng theo từng năm: mẫu cấy lấy từ cây trồng ngoài đồng ruộng tạo

sự nuôi cấy khác biệt tuỳ theo từng năm vì điều kiện khí hậu thời tiết thay đổi mỗi năm

- Vị trí lấy mẫu cấy trên cây: chồi trên cao tạo rễ bất định thấp hơn chồi dưới thấp, chồi đỉnh sinh trưởng nhanh hơn chồi nách

- Kích thước mẫu cấy: các cấu trúc rất nhỏ như tế bào, cụm tế bào và đỉnh sinh trưởng sẽ tái sinh và tăng trưởng khó hơn cấu trúc lớn hơn như lá, thân hay củ

- Vết thương: mẫu cấy có nhiều vết thương sẽ hấp thụ nhiều chất dinh dưỡng

và kích thích sinh trưởng, đồng thời cũng sản xuất nhiều ethylene

 Khử trùng mẫu cấy:

Trên nguyên tắc, có 4 nguồn gây nhiễm: cây trồng (bên trong và bên ngoài), môi trường dinh dưỡng (không tiệt trùng hoàn toàn), không khí và người cấy (thao tác không chính xác) Quan trọng nhất là cây trồng, mẫu cấy phải được khử trùng tốt trước khi cấy Trước khi khử trùng, loại bỏ đất và các thành phần chết trên cây, nên rửa nước đối với các loại rễ củ nằm trong đất, khử trùng bằng cách: Nhúng mẫu vào cồn 70% trong vài giây, rồi khử trùng bằng NaOCl 1% trong 10-30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước khử trùng (thường là 3 lần) Bắt đầu cắt mẫu cấy trong tủ cấy laminar với dụng cụ khử trùng Nếu mẫu cấy vẫn bị nhiễm sau khi khử trùng, nguyên nhân là do:

- Nguồn nhiễm bên trong

- Thao tác không đúng (không rửa tay, không lau sạch bàn với cồn 96%, không khử trùng dao kéo, dĩa petri, giấy và môi trường dinh dưỡng không được tiệt trùng hoàn toàn, áo blouse dơ…) Sử dụng mặt nạ, bao tóc, găng tay sẽ ít bị nhiễm hơn

- Tủ cấy laminar không hoạt động tốt Cần được kiểm tra hàng năm Phin lọc của tủ cấy phải được thay mới định kỳ

- Cồn ngâm dụng cụ cấy bị nhiễm, cần được thay mới thường xuyên

- Ống nghiệm, bình đựng môi trường dinh dưỡng không được lau sạch bên ngoài Sau khi khử trùng môi trường dinh dưỡng phải bảo quản trong điều kiện sạch

- Sàn nhà không được khử trùng Phải xử lý đèn UV vào ban đêm hoặc thổi không khí sạch vào phòng

- Quá nhiều khách đến phòng nuôi cấy làm nhiễm sàn nhà và không khí

- Phòng tăng trưởng không giữ sạch (sàn nhà không lau và khử trùng thường xuyên), thường gây nhiễm

 Hiện tượng hóa nâu mẫu cấy

Nhiều mẫu cấy thải ra hợp chất tannin hay polyphenol làm ngăn cản sự sinh trưởng và phát triển

-Sử dụng hóa chất hấp thu phenol hoặc chất khử để ngăn chận sự oxy hóa phenol

-Giảm nồng độ muối khoáng và chất điều hòa sinh trưởng

-Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non và gây ít vết thương trên mẫu cấy

-Ngâm mẫu trong dung dịch pH thấp để ngăn chận hoạt động của enzyme phenolase

 Hiện tượng thủy tinh thể

Quá trình nuôi cấy có thể gây ra hiện tượng sinh lý là thủy tinh thể: cây in

nồng độ agar thấp Cytokinin cao, nhiệt độ cao, bức xạ ánh sáng yếu, khử trùng mạnh làm tăng thủy tinh thể.

2.4.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn carbon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô

- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự

sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo

mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…)

2.4.2.1 Các nguyên tố đa lượng

mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật

 Nitơ (N)

Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium (NH4+) Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3 Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng

 Phospho (P)

Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng

 Lưu huỳnh (S)

Lưu huỳnh như SO42- được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm Giống như nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino acid, protein và enzyme Lưu huỳnh ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid

 Kali (K)

K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ

và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều

trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3 , KCl 6H2O, KH2PO4

 Canxi (Ca)

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng cách thức không giống như K+ và Mg+ vì Ca2+ không phải là ion linh động Canxi có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của tế bào và rễ

 Magiê (Mg)

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển photphat

2.4.2.2 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo)

Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu cầu của thực vật đối với các chất này Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ < 0.5 mM Nhu cầu của cây đối với nguyên tố vi lượng

là rất thấp Do vậy những nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng

độ tương ứng Hầu hết các nguyên tố vi lượng sử dụng ở lượng nmol Một số nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như agar, các chất bổ sung như nước dừa, dịch chiết nấm men (yeast extract), các muối và nước Tầm quan trọng của một số nguyên tố vi lượng trong thành phần môi trường còn chưa được hiểu một cách rõ ràng