Mối liên quan của đa hình đơn nucleotide APOE rs429358 và rs7412 tới rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội

2. Tổng quan tài liệu 2.1. Tổng quan về lipid và rối loạn chuyển hóa lipid2.1.1. Lipid và chuyển hóa lipid trong cơ thể 2.1.1.1. Vai trò của lipidLipid là nguồn năng lượng trực tiếp cho cơ thể, 1g lipid khi bị đốt cháy trong cơ thể sẽ cung cấp 9,3kcal. Với khẩu phần ăn hợp lý, lipid tham gia cung cấp 2530% năng lượng cơ thể. Lipid được oxy hóa để tạo năng lượng tại các tế bào cơ thể dưới dạng acetyl coenzym A. Riêng tại gan, một lượng nhỏ acetyl coenzym A được chuyển thành các thể ketone (acetoacetate, βhydroxybutyrate và acetone). Lipid là nguồn năng lượng dự trữ lớn nhất trong cơ thể dưới dạng TG tại mô mỡ. Mô mỡ chiếm khoảng 1520% khối lượng cơ thể ở người trưởng thành. Ở trạng thái bình thường, khối lượng mỡ thay đổi theo tuổi, giới và chủng tộc. Lipid tham gia cấu trúc cơ thể và một số hoạt chất sinh học quan trọng như: phospholipid tham gia cấu trúc màng tế bào và là tiền chất của prostaglandin và leucotrien; cholesterol cần cho sự tổng hợp acid mật, các hormon steroid thượng thận và sinh dục; mô mỡ đệm dưới da và bọc quanh các phủ tạng.2.1.1.2. Đặc tính của lipidVề tính chất lý học: các lipid đều có tỷ trọng nhẹ hơn nước, không tan trong nước, có khả năng liên kết với protein huyết tương để thành lipoprotein có tỉ trọng khác nhau (từ 0,9 đến 1,2).

MỤC LỤC

Trang

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan về lipid và rối loạn chuyển hóa lipid 3

2.1.1 Lipid và chuyển hóa lipid trong cơ thể 3

2.1.1.1 Vai trò của lipid 3

2.1.1.2 Đặc tính của lipid 3

2.1.1.3 Dạng tồn tại của lipid trong cơ thể 4

2.1.1.4 Lipoprotein 5

2.1.1.5 Chuyển hóa lipid trong cơ thể 7

2.1.2 Đại cương rối loạn chuyển hóa lipid máu 9

2.1.2.1 Định nghĩa 9

2.1.2.2 Phân loại 9

2.1.2.3 Nguyên nhân 10

2.1.2.4 Điều trị 12

2.2 Đại cương về gen đa hình Apolipoprotein E 13

2.2.1 Vị trí 13

2.2.3 Cấu trúc chung 14

2.2.4 Gen APOE là một gen đa hình đơn nucleotide 14

2.2.5 SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE 15

2.2.6 Vai trò của APOE trong chuyển hóa lipid 15

2.3 Các nghiên cứu mối liên quan của gen APOE SNP rs429358 và rs7412 tới rối loạn chuyển hóa lipid 17

2.3.1 Một số nghiên cứu trên đối tượng người trưởng thành 18

2.3.2 Một số nghiên cứu trên đối tượng trẻ em 18

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

1 Đối tượng nghiên cứu 20

2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.1 Thời gian nghiên cứu 20

2.2 Địa điểm nghiên cứu 20

3 Vật liệu nghiên cứu 20

3.1 Trang thiết bị 21

3.2 Hóa chất 21

4 Phương pháp nghiên cứu 22

4.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn chuyển hóa lipid máu 22

4.2 Thiết kế nghiên cứu 22

4.3 Cỡ mẫu và quy trình chọn mẫu 22

4.3.1 Cỡ mẫu cho nghiên cứu bệnh chứng 22

4.3.2 Quy trình chọn mẫu 23

4.4 Các phương pháp thu thập thông tin 23

4.4.1 Phương pháp tính tuổi 23

4.4.2 Phương pháp đo chiều cao đứng 24

4.4.3 Phương pháp xác định cân nặng 24

4.4.4 Phương pháp tính chỉ số khối cơ thể 25

4.4.5 Phương pháp đo vòng eo, vòng mông 25

4.4.6 Phương pháp phỏng vấn thu thập thông tin 25

4.5 Xét nghiệm sinh hóa máu 25

4.6 Sai số và khống chế sai số 26

4.7 Các phương pháp sinh học phân tử 27

4.7.2 Phương pháp xác định kiểu gen 27

4.8 Phương pháp điện di 29

4.8.1 Phương pháp điện di trên gel agarose 29

4.8.1 Phương pháp điện di trên gel polyacryamide 30

4.9 Phương pháp xử lý số liệu 32

5 Đạo đức trong nghiên cứu 33

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

1 Kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP – PCR 34

2 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 35

3 Tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình APOE rs 429358 và rs7412 ở học sinh nam tại một số trường tiểu học Hà Nội 37

4 Phân tích các biến liên quan đến rối loạn chuyển hóa lipid máu theo kiểu gen của đa hình APOE 41

4.1 Phân tích các biến liên quan đến rối loạn chuyển hóa lipid máu theo kiểu

gen của đa hình APOE trên từng SNP 41

4.2 Phân tích các biến liên quan đến rối loạn chuyển hóa lipid máu theo kiểu gen của đa hình APOE trên cả 2 SNP rs429358 và rs7412 42

5 Phân tích ảnh hưởng của đa hình APOE đối với nguy cơ mắc rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội 43

5.1 Phân tích ảnh hưởng của đa hình APOE rs 429358 đối với nguy cơ mắc rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội 43

5.1.1 Phân tích đơn biến ảnh hưởng của đa hình APOE rs429358 đối với nguy cơ mắc rối loạn chuyển hóa lipid máu ở đối tượng nghiên cứu 43

5.1.2 Phân tích đa biến ảnh hưởng của đa hình APOE rs 429358 đối với nguy cơ mắc rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em nam tại các trường tiểu học Hà Nội 45

5.2 Phân tích ảnh hưởng của đa hình APOE rs 7412 đối với nguy cơ mắc rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội 46

5.2.1 Phân tích đơn biến ảnh hưởng của đa hình APOE rs 7412 đối với nguy cơ mắc bệnh rối loạn chuyển hóa lipid máu trên đối tượng nghiên cứu 46

5.3 Phân tích đơn biến ảnh hưởng của đa hình APOE đối với nguy cơ mắc bệnh rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội 48

5.3.1 Phân tích đơn biến ảnh hưởng của đa hình APOE đối với nguy cơ mắc bệnh rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ em tiểu học Hà Nội 48

5.3.2 Phân tích đa biến ảnh hưởng của đa hình APOE rs429358 và rs7412 đối với nguy cơ mắc bệnh rối loạn chuyển hóa lipid máu ở học sinh tiểu học Hà Nội 50

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Điều đáng lo ngại là tỷ lệ mắc RLCHLM ở trẻ em đang ngày một gia tăng,

tỉ lệ thuận với tỉ lệ trẻ thừa cân, béo phì đặc biệt là ở các thành phố lớn Mộtnghiên cứu ở trẻ em 4 - 9 tuổi tại một số trường quận Hoàn Kiếm, Hà Nội chothấy tỷ lệ trẻ thừa cân béo phì có tăng triglyceride (TG) máu là 30,7%; tăngcholesterol tổng số (Cholesterol Total, CT) là 15,3%; tăng lipoprotein tỉ trọngthấp - cholesterol (Low Density Lipoprotein - Cholesterol, LDL-C) là 12,6%

và giảm lipoprotein tỉ trọng cao cholesterol (High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C) là 5,3% [12] Nghiên cứu của Yoshinaga và cs (2005) ởNhật Bản cho thấy tỷ lệ trẻ thừa cân - béo phì có tăng TG máu là 31% [51] Nguyên nhân gây RLCHLM có thể là nguyên phát (do gen di truyền) hoặcthứ phát (do thói quen ăn uống, sinh hoạt và hoạt động thể lực) Nguyên nhânnguyên phát gây ra do một hoặc nhiều gen đột biến làm tổng hợp quá mứchoặc đào thải ít TG hay cholesterol hoặc tổng hợp không đủ hay đào thải quámức HDL Những rối loạn tiên phát là nguyên nhân hàng đầu gây rối loạn lipidmáu ở trẻ em, do đó nếu được phát hiện và can thiệp sớm có thể ngăn ngừađược nguy cơ mắc bệnh tim mạch khi trưởng thành [3]

-Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy có tới 95 locus gen độc lập có liênquan đến các chỉ số lipid máu ở người trưởng thành [25] Tuy nhiên, đã có nhiềunghiên cứu chỉ ra rằng sự ảnh hưởng gen đến RLCHLM không đồng nhất giữacác dân tộc khác nhau, ở độ tuổi và giới tính khác nhau… Một trong những gen

ApolipoproteinE (APOE) Theo Emmi Tikkanen và cộng sự, sự có mặt của alen E4 có khả năng làm tăng mức LDL-C, TC và TG huyết tương (P < 0,001), đồng

thời làm giảm lượng HDL-C ở trẻ từ 3 đến 6 tuổi [25] Khi nghiên cứu ở trẻ embéo phì Bồ Đào Nha (2009), Henrique Nascimento và cộng sự cũng chỉ ra rằngnhững trẻ mang alen E4 có giá trị TC, LDL-C, apo B cao hơn đáng kể, đồng thời

có mức TG cao nhất và giá trị HDL-C, apo AI thấp nhất [36] Bên cạnh đó,nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bé trai thường có xu hướng mắc RLCHLMcao hơn so với các bé gái trong độ tuổi từ 6- 11 tuổi [30],[36] cho thấy ngoàiyếu tố di truyền, RLCHLM còn chịu ảnh hưởng của một số yếu tố khác trong đó

có giới tính

Mặt khác, RLCHLM ở trẻ em nếu không được phát hiện, ngăn chặn vàchữa trị sớm có thể dẫn đến mắc các bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa(HCCH) ở giai đoạn trưởng thành Do đó, việc phát hiện các gen có liên quantới nguy cơ mắc RLCHLM ở trẻ em có thể giúp cảnh báo, đề phòng mắc bệnh,can thiệp kịp thời, ngăn ngừa sự xuất hiện các biến chứng và cải thiện nguy cơtim mạch trong tương lai

Tại Việt Nam, hiện nay đã có một số nghiên cứu về gen APOE nhưng chủ

yếu là trên bệnh Alzheimer ở người trưởng thành [7], [13] nhưng các nghiên cứu

về ảnh hưởng của gen APOE đến RLCHLM trên đối tượng trẻ em vẫn còn hạn

chế Do vậy, để có thêm những dữ liệu về gen liên quan đến RLCHLM ở trẻ em

Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: “Mối liên quan của đa hình đơn nucleotide APOE rs429358 và rs7412 tới rối loạn chuyển hóa lipid máu ở trẻ

em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định tần số alen, sự phân bố kiểu gen của đa hình đơn nucleotide

(Single nucleotde polymorphism, SNP) rs429358 và rs7412 nằm trên gen APOE

ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội

- Phân tích mối liên quan của từng SNP rs429358 và rs7412 trên gen

APOE với RLCHLM ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội.

- Phân tích ảnh hưởng kết hợp của 2 SNP rs429358 và rs7412 trên gen

APOE với RLCHLM ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp đa hình chiều dài cắt giới hạn đoạn gen khuếchđại (Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase ChainReaction, RFLP - PCR) để xác định kiểu gen của các đối tượng nghiên cứu,

từ đó xác định sự phân bố alen và kiểu gen của SNP rs429358 và rs7412 trên

gen APOE ở nhóm trẻ mắc RLCHLM (nhóm bệnh) và nhóm trẻ có các chỉ số

lipid máu ở mức bình thường (nhóm chứng) theo tiêu chuẩn chẩn đoán củachương trình giáo dục quốc gia về cholesterol (National CholesteronEducation Program, NCEP) [4]

- Nghiên cứu bệnh chứng xác định mối liên quan của SNP rs429358 và

rs7412 trên gen APOE ở các mô hình di truyền khác nhau với RLCHLM ở trẻ.

- Phân tích tương tác của 2 SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE với

RLCHLM ở trẻ em nam tại một số trường tiểu học Hà Nội

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Tổng quan về lipid và rối loạn chuyển hóa lipid

2.1.1 Lipid và chuyển hóa lipid trong cơ thể

2.1.1.1 Vai trò của lipid

Lipid là nguồn năng lượng trực tiếp cho cơ thể, 1g lipid khi bị đốt cháytrong cơ thể sẽ cung cấp 9,3kcal Với khẩu phần ăn hợp lý, lipid tham gia cungcấp 25-30% năng lượng cơ thể Lipid được oxy hóa để tạo năng lượng tại các tếbào cơ thể dưới dạng acetyl coenzym A Riêng tại gan, một lượng nhỏ acetylcoenzym A được chuyển thành các thể ketone (acetoacetate, β-hydroxybutyrate

và acetone)

Lipid là nguồn năng lượng dự trữ lớn nhất trong cơ thể dưới dạng TG tại

mô mỡ Mô mỡ chiếm khoảng 15-20% khối lượng cơ thể ở người trưởng thành

Ở trạng thái bình thường, khối lượng mỡ thay đổi theo tuổi, giới và chủng tộc Lipid tham gia cấu trúc cơ thể và một số hoạt chất sinh học quan trọng như:phospholipid tham gia cấu trúc màng tế bào và là tiền chất của prostaglandin vàleucotrien; cholesterol cần cho sự tổng hợp acid mật, các hormon steroid thượng

đó, lipd được chia làm 2 loại là acid béo no (không chứa liên kết kép trong chuỗihydrocarbon) và acid béo không no (chứa liên kết kép trong chuỗi hydrocarbon).2.1.1.3 Dạng tồn tại của lipid trong cơ thể

Dựa vào cấu tạo hóa học, lipid trong cơ thể gồm 3 nhóm chính, bao gồm:

- Triglyceride: là các este không tích điện của glycerol, có công thức cấutạo chung như hình 1.1 R1, R2, R3 là mạch cacbon của các acid béo tươngứng (Hình 1.1) Các acid béo này có thể giống hoặc khác nhau Trong tựnhiên thường gặp các loại TG hỗn hợp (có chứa 3 loại acid béo khác nhautrong phân tử) [4]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử triglyceride [3][7]

- Phospholipid: là các este của rượu đa chức với các axit béo và có gốc axitphosphoric cùng với những base N đóng vai trò là những nhóm phụ bổ sung.Trong thành phần của phospholipid thường có một gốc axit phosphoric, tuynhiên ở một vài loại inozitphospholipid lại có 2 gốc axit phosphoric Các base Ncủa phospholipid cũng rất khác nhau, thường gặp nhất là dẫn xuất của

etanolamin (colin và serin) Dựa vào nhóm rượu đa chức người ta chiaphospholipid làm 3 loại glycerophospholipid, inozitphospholipid, vàsphingolipid (Hình 1.2).

Hình 1.2 Cấu trúc các dạng của phospholipid (A): Cấu trúc của

glycerophospholipid; (B): Cấu trúc của inozitphospholipid; (C): Cấu trúc của

sphingolipid [3] [7]

- Cholesterol: là các sterol, có bản chất là dẫn xuất củacyclopentanoperhydrophenantren gồm 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh, nhómphân cực (-OH) ở C3, phần không phân cực là bộ khung hydrocarbon các vòng

và chuỗi hydrocarbon ở C17 (Hình 1.3) Cholesterol được tổng hợp chủ yếu tronggan nhưng cũng có nhiều trong mô thần kinh, máu, tinh trùng, lớp mỡ dưới da…

2.1.1.4 Lipoprotein

* Cấu trúc: Lipoprotein là sự kết hợp của lipid và protein Trong đó,

protein đặc hiệu trong thành phần của lipoprotein được gọi là apolipoprotein hayapoprotein (apo)

Phần lõi của lipoprotein là TG cùng với cholesterol este hóa không phâncực, xung quanh được bao bọc bởi phần vỏ phân cực, ưa nước bao gồmphospholipid, cholesterol tự do và các loại apo nhất định (hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc của lipoprotein [64][67]

Hầu hết lipoprotein được tạo thành ở gan, vì hầu như toàn bộ mỡ trong máu

do gan sản xuất, trừ TG của chylomicron là do hấp thu từ ruột Gan cũng chính

là nơi sản xuất protein chuyển chở lipid, gọi là apo-protein

* Phân loại: Dựa vào nồng độ TG trong máu, lipoprotein được chia làm

các loại khác nhau do lipoprotein chứa nhiều TG có tỷ trọng thấp, lipoproteinchứa ít TG sẽ có tỉ trọng cao [10], cụ thể là:

- Chylomicron (CM): trong thành phần chứa khoảng 84 - 87% là TG, làloại lipoprotein có kích thước lớn nhất (từ 0,01 đến 0,1 mm), được tổng hợp ởruột non, chủ yếu vận chuyển mỡ từ niêm mạc ruột đến gan [11]

- Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (Very low density lipoprotein, VLDL):chứa 50 - 60% là TG [11] Được tổng hợp trong gan, có vai trò vận chuyển TG

và cholesterol đến mô xung quanh

- Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein, LDL): chuyênchở phần lớn lượng cholesterol có trong máu, cung cấp cholesterol cho các

tế bào ngoại biên Sự liên kết giữa LDL và các thụ thể bề mặt của các tế bào

có ảnh hưởng đến việc kiểm soát và điều chỉnh nồng độ cholesterol máu.Cholesterol kết hợp với LDL được ký hiệu là LDL-C là dạng cholesterol gâyhại cho cơ thể, chúng vận chuyển cholesterol thấm vào thành mạch máu.Nồng độ LDL-C cao liên hệ với tăng nguy cơ bệnh tim mạch Vì vậy, LDL-Cđược coi là cholesterol xấu

- Lipoprotein tỷ trọng trung gian (Intermediate Density Lipoprotein, IDL):

có tỷ trọng trung gian giữa VLDL và LDL IDL được tạo thành từ VLDL, sau

đó một số được giữ lại ở gan, số còn lại ở hệ tuần hoàn và chịu sự phân hủy tiếptục của các TG để chuyển thành LDL

- Lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein, HDL): Nồng độHDL tỷ lệ nghịch với nồng độ TG, với khối lượng cơ thể; HDL tăng ở ngườihoạt động thể thao, năng vận động và giảm ở những người bị đái tháo đường,suy thận [6] Là lipoprotein phóng thích cholesterol, được tổng hợp cả ở tế bàoruột và gan, một phần được hình thành do chuyển hóa của VLDL trong máungoại vi Có khoảng 1/3 đến 1/4 cholesterol máu được vận chuyển bởi HDL.Cholesterol kết hợp với HDL được ký hiệu là HDL - C là một dạng cholesterol

có lợi cho cơ thể, chúng chống lại quá trình xơ mỡ động mạch bằng cách mangcholesterol dư thừa ứ đọng từ trong thành mạch máu trở về gan

2.1.1.5 Chuyển hóa lipid trong cơ thể

Quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể được chia thành hai con đường,ngoại sinh và nội sinh, phụ thuộc phần lớn vào nguồn gốc của lipid trong cơ thể

Hình 1.5 Sự chuyển hóa lipid trong cơ thể [21]

* Con đường ngoại sinh

Gọi là ngoại sinh vì các lipid, bao gồm triglyceride, phospholipid vàcholesterol được đưa từ bên ngoài (thức ăn, thức uống) để vào cơ thể Sau khichúng ta ăn chất béo (mỡ), TG và cholesterol được hấp thu vào tế bào niêmmạc ruột non dưới dạng acid béo và cholesterol tự do Những chất béo này liênkết với apoB-48 trong CM Những CM mới ra đời được tiết ra từ các tế bàobiểu mô ruột vào mạch bạch huyết tới gan vào máu và cuối cùng là các môtrong cơ thể, trong đó mô mỡ là nơi tiếp nhận chính Tại mô, CM được thủyphân thành các acid béo tự do và glycerol nhờ enzyme lipoprotein lipase (LPL)trên bề mặt tế bào nội mạc mao mạch 70 - 80 % TG trong CM được thủyphân, phóng thích ra acid béo tự do và glycerol đi vào tế bào cơ và tham giavào quá trình sinh năng lượng, một phần đi vào các tế bào mỡ và tái tạo lipid

dự trữ CM mất dần TG và mất apoC trả về cho HDL rồi trở thành CM dư cóthành phần cholesterol este cao hơn TG được vận chuyển về tế bào gan Tế bàogan hấp thụ các CM dư nhờ các receptor đặc hiệu Thời gian tồn tại của CM rấtngắn chỉ vài phút trong huyết tương (gây màu trắng sữa) Tại gan, cholesterolđược chuyển thành acid mật, muối mật và đào thải theo đường mật xuống ruộtnon, một phần CT và TG tham gia tạo VLDL VLDL rời gan vào hệ tuần hoàn

để bắt đầu con đường vận chuyển hay chuyển hoá lipid nội sinh [14] [28]

* Con đường nội sinh

Phần lớn cholesterol và một số TG có nguồn gốc tại gan do đó chúng sẽđược chuyển hóa theo con đường nội sinh dưới dạng VLDL Các lipoprotein sẽvận chuyển lipid theo những con đường khác nhau, cụ thể là VLDL, IDL, LDLvận chuyển cholesterol từ gan tới các tế bào ngoại biên; còn HDL thì ngược lại,chúng sẽ vận chuyển cholesterol từ tế bào ngoại biên về gan để oxi hóa và đàothải ra ngoài theo đường mật

TG đóng vai trò quan trọng trong vận chuyển năng lượng từ thức ăn vàotrong tế bào và được vận chuyển chủ yếu trong các tiểu thể CM và VLDL CMđược cấu tạo ở ruột từ acid béo trong thức ăn được hấp thụ qua tĩnh mạch cửavào gan và qua ống bạch mạch ngực vào đại tuần hoàn để chuyển năng lượng từthức ăn và mô mỡ VLDL được tổng hợp ở gan, từ kho dự trữ mỡ vàcarbohydrat của gan VLDL cũng làm nhiệm vụ chuyển năng lượng vào tế bào.Phần còn lại chuyển hóa thành LDL cung cấp cholesterol cho nhu cầu tế bào.Phần LDL thừa sẽ được tập trung về gan và lượng cholesterol trong LDL này sẽđược giải phóng đào thải qua mật HDL cũng được tổng hợp ở gan và ruột non,làm nhiệm vụ vận chuyển ngược cholesterol từ các mô về gan

2.1.2 Đại cương rối loạn chuyển hóa lipid máu

2.1.2.1 Định nghĩa

RLCHLM là tình trạng tăng cholesterol và triglyceride một cách bấtthường, hoặc giảm nồng độ HDL-C, giảm nồng độ LDL-C làm tăng nguy cơmắc các bệnh tim mạch

Hiện nay có 2 định nghĩa về RLCHLM được công nhận rộng rãi là địnhnghĩa của WHO và của chương trình giáo dục quốc gia về cholesterol (NationalCholesteron Education Program, NCEP) [4],[16],[27]

2.1.2.2 Phân loại

Bảng 1.1 Phân loại rối loạn lipid máu theo NCEP [27]

Hiện nay, cách phân loại mới nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là theoNCEP [27] Cách phân loại này cho biết sự thay đổi các thành phần lipid máugây xơ vữa động mạch và các thành phần lipid máu làm giảm xơ vữa độngmạch, đồng thời cũng cho biết mức độ rối loạn của các thành phần trên thôngqua việc xác định đầy đủ các thông số sau khi ăn từ 9-12 giờ (Bảng 1.1).

2.1.2.3 Nguyên nhân

Nguyên nhân gây RLCHLM có thể do yếu tố di truyền (nguyên nhânnguyên phát) hoặc do các yếu tố bên ngoài như lối sống, chế độ ăn uống, chế độ

làm việc (nguyên nhân thứ phát).

* Nguyên nhân nguyên phát: RLCHLM là một dạng bệnh di truyền

hiếm gặp do sự ảnh hưởng của các gen như APOA5, APOB, APOE Một hoặc

nhiều gen bị đột biến sẽ gây ra sự tăng quá mức hoặc giảm đào thải TG,

LDL-C Một số trường hợp phát hiện có rối loạn di truyền gây giảm các yếu tố tham

gia chuyển hóa lipoprotein máu như: Giảm lipoprotein lipase (LPL) gây giảm

thủy phân TG, hoặc giảm Apo-CII (đồng yếu tố của LPL) dẫn đến giảm hoạttính của LPL Hoặc giảm enzyme hepatic triglyceride lipase dẫn đến giảm thủyphân TG trong IDL, gây tăng IDL Các rối loạn nguyên phát là nguyên nhânchủ yếu gây ra RLCHLM máu ở trẻ em Tuy nhiên, theo nghiên cứu liên tục

của Emi và cộng sự trong 42 năm (3 - 45 tuổi) trên 2443 đối tượng cho thấyhầu hết các gen có liên quan đến RLCHLM đều có ảnh hưởng khác nhau ở các

độ tuổi khác nhau (Hình 1.6) [25]

Hình 1.6 Ảnh hưởng khác nhau của các gen tới chỉ số HDL-C (trái) và LDL-C

(phải) trong các độ tuổi khác nhau Màu sắc và kí hiệu * khác nhau biểu thị giá

trị P khác nhau (*: P < 0,05; **: P < 0,01; ***: P < 0,001) [25]

Xét gen HNF41 tại SNP rs1800961 cho thấy người có kiểu gen mang alen

T có nồng độ HDL-C thấp hơn và LDL-C cao hơn so với người không mangalen T nhưng alen này ít hoặc không ảnh hưởng tới trẻ từ 3-6 và 6-9 tuổi Mặt

khác, đa hình SNP rs629301 trên gen SORT1 gây ảnh hưởng lớn tới chỉ số

LDL-C và TLDL-C ở độ tuổi từ 9 – 45 tuổi mà không hề có ảnh hưởng tới trẻ từ 3-6 tuổi

Ngược lại, đa hình ABCA1 rs1883025 gây tăng TC và giảm HDL-C rõ rệt ở trẻ

từ 3-6 và từ 6-9 tuổi nhưng không ảnh hưởng tới 2 chỉ số này ở người trưởngthành Như vậy, để có thể đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố di truyền tớiRLCHLM, cần phải nghiên cứu ở các độ tuổi khác nhau hoặc thời gian nghiêncứu thích hợp để có kết luận chính xác nhất

* Nguyên nhân thứ phát: Có nhiều yếu tố gây nên RLCHLM thứ phát, như:

- Một số bệnh rối loạn điều hòa nội tiết liên quan đến chuyển hóa lipid nhưđái tháo đường, bệnh thận gây rối loạn các hormon, cụ thể như: hormon làmtăng thoái hóa lipid, hormon kích thích tổng hợp triglyceride [1]

- Việc sử dụng thuốc điều trị các bệnh khác: Nhiều loại thuốc làm tăng

mạch như thuốc ức chế bêta giao cảm, sulfonamides, ACE-I, NSAIDS,azathioprine, retinoids.

- Chế độ dinh dưỡng cũng góp phần không nhỏ trong việc làm tăng khảnăng mắc RLCHLM Một nghiên cứu trên 1062 trẻ bảy tháng tuổi trong suốt 4năm của Leena Rask-Nissilä và cộng sự cho thấy những trẻ được can thiệp chế

độ ăn uống với chất béo chiếm từ 30% đến 35%, năng lượng hàng ngày, tỉ lệacid béo bão hòa/ không bão hòa đơn/ không bão hòa đa là 1:1:1, lượngcholesterol < 200mg/ngày có hàm lượng cholesterol huyết thanh thấp hơn so vớinhóm trẻ không có sự can thiệp [17]

- Hoạt động thể lực cũng là một trong những nguyên nhân gây RLCHLM

Ở những người lao động chân tay hoặc thường xuyên rèn luyện thể lực, cơ tim

có khả năng thích ứng tốt hơn khi gắng sức, làm giảm thiểu lượng LDL-C, đồngthời tăng HDL-C, làm tiểu cầu ít bị kết dính nên ít có khả năng đông vón máu

- Ngoài ra còn một số nguyên nhân khác như uống rượu nhiều kích thíchgan tổng hợp thêm acid béo và giảm quá trình oxy hóa acid béo làm cho gantăng sản xuất VLDL giàu TG hay hút thuốc lá cũng làm tăng nguy cơ lên gấpnhiều lần Theo ước tính của Law M thì cứ 1% nồng độ lipid máu tăng sẽ đicùng với tăng 2,7% nguy cơ bệnh tim mạch [40]

Tuy nhiên RLCHLM cũng có thể do nguyên nhân ngẫu nhiên như mangthai Trong thời gian này, hàm lượng hormone estrogen cao, kích thích gan tăngsản xuất lipoprotein giàu TG làm cho nồng độ TG tăng dần, với nồng độ TGmáu tăng lên nhiều gấp ba lần trong ba tháng cuối của thai kỳ so với trước khimang thai [20]

2.1.2.4 Điều trị

Theo Viện tim mạchViệt Nam, quá trình điều trịRLCHLM cần tuân thủnguyên tắc chung theo sơ đồsau:

Thông thường có 2 nhóm thuốc phổ biến nhất được áp dụng vào điều trị.Nhóm thứ nhất là các thuốc nhóm fibrat làm giảm dòng acid béo về gan, làmgiảm tổng hợp VLDL, làm tăng độ thủy phân VLDL, giảm hình thành LDL nhỏ

và đặc dễ gây xơ vữa động mạch, giảm oxy hoá LDL: kết quả là giảm TG máu,giảm VLDL và LDL, tăng HDL Nhóm thứ hai là nhóm các thuốc statin có tácdụng ức chế men HMG CoA reductase làm cản trở quá trình nội sinh CT trong

tế bào, làm tăng tổng hợp các thụ thể cho LDL để tăng thoái hóa LDL theo conđường các thụ thể Qua đó, các statin làm giảm TG máu, tăng nhẹ HDL và giảm

CT Khi dùng thuốc giảm TG máu phải được sự chỉ định và theo dõi của bác sĩ

vì thuốc ngoài tác dụng hạ TG máu còn gây tác dụng phụ

Tuy nhiên việc điều trị RLCHLM ở trẻ em còn nhiều tranh luận do chế độ

ăn khó áp dụng, tính an toàn và hiệu quả của việc dùng thuốc hạ lipid máu lâudài vẫn còn hạn chế Theo Viện Hàn lâm Nhi khoa của Hoa Kỳ (AAP) khuyếncáo điều trị bằng chế độ ăn cho trẻ có LDL-C > 100mg/dL

Thuốc hạ lipid máu được chỉ định cho trẻ trên 8 tuổi và mắc một trong cáctình trạng sau:

+ Đáp ứng kém với phương pháp điều chỉnh qua chế độ ăn, LDL-C > 190mg/dL, gia đình không có người sớm mắc các bệnh tim mạch

+ Nếu LDL-C > 160 mg/dL, tiểu sử gia đình có người mắc bệnh tim mạchsớm, hoặc có nhiều hơn 2 yếu tố nguy cơ mắc bệnh tim mạch

+ Ngoài các yếu tố trên còn có một số các yếu tố bổ sung như hút thuốc lá,huyết áp thấp, HDL-C thấp (< 35mg/dL), béo phì và ít hoạt động thể lực

2.2 Đại cương về gen đa hình Apolipoprotein E

Gen đa hình Apolipoprotein E (APOE) là gen cấu trúc, tổng hợp nên

protein kí hiệu là apoE, kết hợp với chất béo, trở thành một lipoprotein ApoE có

trong lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL), chịu trách nhiệm một phần để loại bỏcholesterol trong máu qua đó ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa cholesterol,liên quan trực tiếp đến các bệnh tim mạch Các dạng của apoE cũng liên quan

Hình 1.8 Cấu trúc protein được tổng hợp từ đồng dạng APOE2, E3, E4 [67]

APOE là gen đa hình đơn nucleotide, trong đó hai đa hình đơn nucleotide

(SNP) rs429358 và rs7412 tại exon 4 làm phát sinh ba biến thể, được biết đến làE2, E3, và E4 lần lượt mã hóa ba đồng dạng protein apoE2, apoE3, và apoE4;trong đó E3 là dạng tự nhiên với tần số cao nhất trong quần thể người

Trình tự nucleotide hoàn thiện của gen APOE bao gồm cả 856 nucleotide

gần đầu 5’ và 629 nucleotide gần đầu 3’, đồng thời xác định được tiền mRNA

được mã hóa từ gen APOE gồm 4 exon được ngăn cách bởi 3 intron Tất cả các

intron bắt đầu bằng các nucleotide G - T và kết thúc bằng nucleotide A - G - phùhợp với trình tự nối exon - intron ở sinh vật có nhân điển hình Chiều dài của cácexon lần lượt là 44, 66, 193 và 860 nucleotide; độ dài các intron lần lượt là 760,

1092, và 582 nucleotide tính từ đầu 5’ đến 3’

So sánh với trình tự trên mRNA tương ứng, các intron đầu tiên ở vùngkhông mã hóa 5’ tương ứng với guanine ở vị trí -78 trên mRNA Intron thứ 2 là

codon mã hóa cho glycine ở vị trí -4 của vùng peptide tín hiệu, tương ứng vớiguanine ở vị trí -12 trên mRNA; và intron thứ 3 xảy ra ở codon mã hóa arginine

ở vị trí -61 trong protein huyết tương trưởng thành tương ứng với guanine ở vịtrí -182 ở mARN [61]

Tổng chiều dài của gen APOE và mRNA tương ứng của nó là 3597 và

1163 nucleotide, tương ứng với sản phẩm là 1 protein huyết tương [61] Ngoài

ra có 4 chuỗi họ Alu liên kết với gen APOE: một chuỗi Alu ở cuối gen và 2

chuỗi Alu ở intron thứ 2 Kiến thức về cấu trúc của gen sẽ cho phép tiếp cận các

đặc trưng phân tử của gen APOE.

2.2.4 Gen APOE là một gen đa hình đơn nucleotide

NST số 19 có tổng chiều dài 56 044 000 bp, trong đó chứa 25 676 SNP

[61] Phân tích các locus của gen APOE đã cho thấy mức độ đa dạng di truyển của APOE một cách toàn diện Bốn vùng đối mã khác nhau gồm 2 SNP phổ biến nhất (tại các điểm 3937 và 4075) là vùng xác định các đồng dạng của APOE và

các biến thể khác tại vị trí 4036 (Arg 142 Cys) có liên quan đến tăng lipid loạiIII [31] Các biến thể khác tại vị trí 3106 (Leu 28 Pro) không liên quan tới bất kìquá trình rối loạn lipid nào [23]

Các SNP ở khu vực lân cận đầu 5’có thế làm thay đổi biểu hiện gen và liênquan đến bệnh Alzheimer và bệnh tim mạch [44][45][50] Một trong số các SNPđược biết đến là -419A/T, -424C/T Chúng có liên quan tới việc tăng nguy cơ mắcbệnh Alzheimer nhưng lại độc lập với trạng thái của alen E4 [19], [37] Một vùngkhác quy định các biến thể, kí hiệu là Th1/E47c hoặc -219 G/ T cũng có liên quantới nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và bệnh tim mạch [45] Điều thú vị là các SNPtại -471A/T và -427 C/T có liên quan đến một chuỗi Alu Tuy nhiên, các SNP nàycũng được liên kết với 1 trình tự Alu xác định nhưng sự thay thế trong trình tựAlu thường không liên quan đến chức năng và quy định của gen

2.2.5 SNP rs429358 và rs7412 trên gen APOE

Hình 1.10 Sự khác nhau về trình tự amino acid trong phân tử protein ở các

đồng dạng của Apolipoprotein E [64]

Gen APOE gồm 195 SNP [70], trong đó hai SNP tại exon 4 (rs429358 và rs7412) làm phát sinh ba biến thể của APOE, được biết đến là E2, E3, và alen E4,

mà lần lượt mã hóa ba đồng dạng protein (ApoE2, ApoE3, và ApoE4) khác nhau

ở trình tự amino acid ở vị trí 112 và 158 tức là cysteine- cysteine ở APOE2, cysteine- arginine ở APOE3 và arginine- arginine ở APOE4 (Hình 1.9) [42].

2.2.6 Vai trò của APOE trong chuyển hóa lipid

ApoE được tổng hợp bởi

một số mô bao gồm gan, não,

mô cơ và động mạch Phần

lớn các apoE được tìm thấy

trong huyết tương liên kết với

lớp lipoprotein đặc trưng và

có nguồn gốc chủ yếu từ gan

ApoE được tham gia nhiều

bước trong quá trình cân bằng

lipid và lipoprotein nội mô với

lipoprotein giàu TG và HDL

ApoE cũng đóng vai trò quan trọng trong nội cân bằng chất béo trong não, độngmạch và mô mỡ thông qua quá trình tổng hợp các tế bào thần kinh đệm, các tếbào mỡ, các đại thực bào Ngoài ra apoE còn ảnh hưởng tới phản ứng miễn dịch

và kháng viêm, quá trình oxy hóa, sự phát triển và di cư của cơ trơn Vì vậy,protein đa chức năng này được cho là có ảnh hưởng tới trạng thái bình thường

và sinh lý bệnh ở nhiều mức khác nhau, được xem là chất vận chuyển lipid,protein tín hiệu trong máu, gan và động mạch (Hình 1.10) [21]

* ApoE tham gia quá trình sản xuất lipoprotein giàu TG

ApoE cũng liên quan đến quá trình đồng hóa trong việc cân bằng VLDLnội mô Nồng độ apoE cao trong gan dẫn đến kết quả là sự tăng sản xuấtVLDL, TG Khi nồng độ apoE tăng cao sẽ hoạt hóa thụ thể, giải phóng hoàntoàn lipoprotein Ngược lại, khi nồng độ apoE giảm sẽ kích thích tăng TG máu(Hình 1.11)

Hình 1.11 Vai trò của ApoE với cơ thể người [69]

Mặc dù tế bào gan và các tế bào Kupfer sản xuất ra apoE nhưng vai trò của

tế bào Kupffer ít được chú ý trong quá trình cân bằng VLDL nội mô [21]

Hình 1.11 Sơ đồ quá trình sản xuất lipoprotein giàu triglyceride [64]

* ApoE và cân bằng HDL nội mô

ApoE giống như Apo A-I, tương tác với ABCA1 để tạo ra các hạt HDLmới Các phân tử HDL cũng có thể phát sinh do sự sản sinh VLDL của tế bàogan Khi đó các apoE và apoC sẽ liên kết trên bề mặt của các phức hợp VLDL-apoB1 để chuyển đổi thành HDL từ các phân tử giàu TG Do đó, apoE trên HDLgiảm khi sự hấp thụ chất béo trong cơ thể tăng cao Trên phân tử HDL chứaapoE và apo A-I nhưng tỉ lệ apoE sẽ cao hơn apoA-I nên apoE có khả năng điềuhòa lõi trung gian mở rộng của HDL tốt hơn Mặt khác, việc tích lũy hoặc cácbiến đổi trong hoạt động của HDL dưới sự kiểm soát của protein vận chuyểnlipid huyết tương thường được tăng lên khi có apoE [21]

* Apo E trong não

Apo E đóng 1 vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh Nó được sảnxuất trong các tế bào thần kinh đệm, và đóng vai trò như một protein vận chuyểncholesterol giữa tế bào hình sao và các noron trong suốt quá trình sinh trưởng vàphát triển Trong hệ thần kinh trung ương, ApoE được sản xuất bởi các tế bàohình sao, có nhiệm vụ vận chuyển cholesterol tới các tế bào thần kinh thông quacác thụ thể của apoE- một trong các thụ thể của lipoprotein mật độ thấp (LDL)[4][5] Điều đó cho thấy apoE có thể ảnh hưởng tới hoạt động của các tế bào

thần kinh, gây nên nguy cơ suy giảm nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer và cácbệnh thần kinh trung ương khác.

* Apo E ảnh hưởng đến nội cân bằng trong mô mỡ

Apo E có mặt chủ yếu trong các tế bào mô mỡ và 1 phần trong các đạithực bào Vì khối lượng mô mỡ lớn nên hàm lượng apoE trong cơ thể tương đốicao Xét lượng apoE ở 2 con chuột, con chuột béo phì di truyền do thiếu apoE

có lượng mỡ cơ thể tích lũy thấp hơn và tế bào mỡ nhỏ hơn so với chuột kiểmchứng nhưng biểu hiện dung nạp glucose cao hơn, độ nhạy cảm của insulin cũngcao hơn VLDL cung cấp acid béo tới các mô mỡ khác bằng cách phân giải lipid

ở lipoprotein hoặc nhập bào Do đó, nồng độ apoE ở mô mỡ sẽ suy giảm khimắc bệnh béo phì và tăng ở những người ăn chay Ảnh hưởng của apoE ở mô

mỡ tới cân bằng nội năng lượng trong cơ thể và bệnh xơ vữa động mạch đangđược tích cực nghiên cứu

2.3 Các nghiên cứu mối liên quan của gen APOE SNP rs429358 và rs7412 tới rối loạn chuyển hóa lipid

Gen APOE được nghiên cứu khá nhiều vì nó đóng vai trò quan trọng trong

vận chuyển lipid, trao đổi chất, cũng như tham gia điều hòa miễn dịch, liên quantrực tiếp đến hàng loạt bệnh ở người [55], [38] Tính đến tháng 1/2015, trên cơ

sở dữ liệu HuGE (Human Genome Epidemiology) đã có 3617 bài báo công bố

các nghiên cứu về gen APOE, trong đó có 119 bài liên quan đến các bệnh động

mạch vành, 57 bài chỉ ra mối liên quan đến tăng lipid máu, 43 bài liên quan đếntăng cholesterol, 33 bài liên quan đến tăng TG, và 29 bài liên quan đếnRLCHLM [71] Tuy nhiên tổng hợp các nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của gen

APOE không đồng nhất giữa các độ tuổi, quần thể người và giới tính khác nhau 2.3.1 Một số nghiên cứu trên đối tượng người trưởng thành

(1) Năm 1994, Schachter và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu bệnh

chứng 338 người cao tuổi Nghiên cứu đã chỉ ra alen E4 của APOE thúc đẩy xơ vữa động mạch sớm, so với nhóm kiểm soát (P < 0,001), trong khi tần số của alen E2 lại liên quan với tăng lipid máu loại III và IV (P < 0,01) [54]

(2) Nghiên cứu của Martin và cộng sự kéo dài từ năm 1999 đến năm

2000 trên 1708 đối tượng từ 35 đến 74 tuổi gồm 2 nhóm nam và nữ đã chỉ ra

ảnh hưởng của các biến thể APOE tới các chỉ số lipid Trong đó, ở cả 2 giới,

alen E4 có xu hướng làm giảm HDL-C và tăng LDL-C so với người khôngmang alen E4 [44]

(3) Năm 2004, Roberto và cộng sự tiến hành nghiên cứu mối liên quan của

đa hình APOE ở người trưởng thành giữa 2 giới nam và nữ Nghiên cứ này được

thực hiện 2723 người trong độ tuổi từ 30 đến 62 tuổi, bao gồm: 1315 nam và

1408 nữ Kết quả về ảnh hưởng của kiểu gen được phân tích trên cả 2 giới [57].Trong đó:

+ Ở nam giới: người mang alen E4 có nồng độ TC cao nhất và HDL-C thấpnhất so với người mang không mang alen E4

+ Ở nữ giới: người mang alen E4 có nồng độ TC, LDL-C cao nhất vàHDL-C thấp nhất so với người mang không mang alen E4

(4) Năm 2011, Richard và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 166 ngườitrưởng thành gồm 82 nam và 84 nữ Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt

về chỉ số lipid giữa 2 giới và giữa các kiểu gen [56] Trong đó:

+ Nam giới có chỉ số HDL-C thấp hơn và LDL-C cao hơn so với nữ giới + Người mang alen E4 có nguy cơ mắc RLCHLM cao hơn so với ngườikhông mang alen E4 trong kiểu gen

2.3.2 Một số nghiên cứu trên đối tượng trẻ em

(1) Năm 1997, nghiên cứu của Palier và cộng sự trên 137 trẻ từ 6- 11 tuổi với

2 nhóm béo phì và nhóm chứng, đã chỉ ra rằng những trẻ mang alen E2 trong kiểugen có nguy cơ mắc RLCHLM cao hơn những trẻ không mang alen E2

(2) Năm 2004, Nghiêm Nguyệt Thu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ở

348 bé gái từ 7- 9 tuổi với 2 nhóm thành thị và nông thôn Kết quả cho thấynhững trẻ mang alen E4 có nồng độ LDL-C cao hơn những trẻ không mangalen E4 trong kiểu gen, trong khi nồng độ HDL-C ở những trẻ mang alen E4lại thấp hơn [50]

(3) Năm 2009, Henrique Nascimento và cộng sự đã tiến hành nghiên cứubệnh chứng trên trẻ em béo phì ở Bồ Đào Nha, cho thấy những trẻ mang alen E4

có giá trị TC, LDL-C, apo B cao hơn đáng kể, đồng thời có mức TG cao nhất vàgiá trị HDL -C và apo AI thấp nhất [33]

(4) Năm 2000, nghiên cứu của Myoung Hee Han và cộng sự trên 119 trẻgồm 2 nhóm: 89 trẻ béo phì và 30 trẻ bình thường cũng đã chỉ ra mối liên quan

của gen APOE tới RLCHLM Kết quả nghiên cứu cho thấy trẻ mang alen E2 có

nồng độ TC, LDL-C thấp hơn so với tổng mẫu Tuy nhiên với nhóm béo phì,nồng độ LDL-C ở những trẻ mang alen E4 có xu hướng tăng cao trong khiHDL-C có xu hướng giảm so với những trẻ không mang alen E4 [48]

(5) Nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng sơ sinh trên yếu tố quyết định ditruyền apoE của lipid máu, Garces & cộng sự (2002) đã đánh giá kiểu gen

APOE và lipid huyết tương, nồng độ apolipoprotein trong 933 trẻ em (491 nam

và 442 nữ), tuổi từ 6 đến 8 năm (trung bình 6,7 năm), với trọng lượng khi sinh

đã biết Nghiên cứu đã chỉ ra ảnh hưởng lớn của đa hình APOE tới cholesterol

tổng số (TC), LDL cholesterol (LDL -C), và mức độ apoB của cả hai giới Sựgiảm TC, LDL-C và apoB kết hợp với alen E2 càng rõ hơn khi trọng lượng sơsinh thấp và có thể được giải thích bởi sự tương tác tích cực giữa cân nặng khisinh và alen E2 thể hiện bằng cách phân tích hồi quy tuyến tính [21]

Như vậy, các nghiên cứu đều đã chỉ ra được mối liên quan giữa đa hình

SNP rs429358 và rs7412 với RLCHLM trên các quần thể người, nhóm tuổi và

giới tính khác nhau

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu được chọn ra dựa vào kết quả điều tra sàng lọc trên7.500 trẻ em 6 - 11 tuổi tại 31 trường tiểu học của Hà Nội trong đề tài cấp sở

khoa học công nghệ, Hà Nội: “Nghiên cứu mối liên quan của gen và lối sống đối với nguy cơ mắc bệnh béo phì ở trẻ em tiểu học Hà Nội” 397 trẻ em nam

tiểu học từ 6 - 11 tuổi tại 30 trường tiểu học nội & ngoại thành ở Hà Nội đãđược chọn ra để tiến hành nghiên cứu

- Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu: đối tượng thu thập đủ số liệu và

thông tin cần thiết

- Tiêu chuẩn loại trừ trẻ khỏi nghiên cứu: đối tượng bị mắc bệnh tâm

thần; mắc các bệnh cấp tính hoặc các bệnh mãn tính như lao, nhiễm HIV/AIDS,đang điều trị rối loạn lipid máu (hay dùng thuốc chống rối loạn lipid), hay thuốcgiảm cân

2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng 4/2015.

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu này được tiến hành tại các địa điểm sau :

- Phòng y tế của 29 trường tiểu học tại 8 quận (huyện) Hà Nội : H ĐôngAnh, Q Thanh Xuân, H Từ Liêm, H Thanh Trì, Q Hoàng Mai, Q Hai BàTrưng, Q Hoàn Kiếm, Q Đống Đa

- Bộ môn sinh lý người và động vật, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm

3.1 Trang thiết bị

Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Một số vật liệu và trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Gía, phiến để ống eppendoft 1,5ml; găng tay ít

bột, áo choàng, khẩu trang, giấy thấm, bút dạ,

đồng hồ bấm dây

Việt Nam

3.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Một số hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

1 Bộ kit tách chiết ADN: Winzard ® Genomic

DNA Purification Kit

Promega Corporation, USA

2 Dream Taq Green PCR Master Mix (2X) Thermo – Fermentas

3 ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) MarkerX174 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker Thermo

4 10X TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) Thermo

7 RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution Intron

8 FastDigest® HhaI NEB

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn chuyển hóa lipid máu

Tiêu chuẩn xác định trẻ RLCHLM theo NCEP cụ thể trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Đánh giá các mức độ rối loạn lipid máu ở trẻ em theo NCEP [51]

Xét nghiệm

lipoprotein lúc đói

Bình thường (mg/dL)

Vùng trung gian (mg/dL)

Rối loạn chuyển hóa lipid máu (mg/dL)

Cholesterol toàn phần < 170 170-199,9  200 (5,2 mmol/L)LDL-cholesterol < 110 110-129,9  130 (3,4 mmol/L)

TG 0 – 9 tuổi < 75 75-99,9  100 (1,13 mmol/L)

10 – 19 tuổi < 90 90-129,9  130 (1,46 mmol/L)HDL–cholesterol > 45 45-35,1  35 (0,9 mmol/L)

4.2 Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng nghiên cứu bệnh chứng (case - control study) để tìm hiểu mối liên

hệ giữa gen đa hình APOE rs429358 và rs7412 với RLCHLM.

+ Nhóm chứng: trẻ từ 6-11 tuổi, có các chỉ số lipid bình thường theo bảng1.3

+ Nhóm bệnh: trẻ từ 6-11 tuổi, rối loạn ít nhất 1 trong 4 chỉ số lipid lipidmáu theo bảng 1.3

4.3 Cỡ mẫu và quy trình chọn mẫu

4.3.1 Cỡ mẫu cho nghiên cứu bệnh chứng

Công thức tính cỡ mẫu [15] là:

Trong đó:

- OR: Tỷ suất chênh mong muốn phát hiện, lấy bằng 1,9

- p: Tỷ lệ yếu tố nguy cơ trong quần thể nghiên cứu, ước tính là 0,5

- Các sai số thống kê với =0,05 và =0,2; tương ứng với hằng số C là 7,85

- r: là tỷ số cỡ mẫu giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, lấy r = 3 tức là 1 bệnh

3 chứng

- Thay vào công thức trên ta được n = 406

Như vậy cần điều tra ít nhất 406 đối tượng (304 đối tượng có chỉ só lipidmáy bình thường và 102 đối tượng RLCHLM)

4.3.2 Quy trình chọn mẫu

Đề tài được thực hiện theo nội dung được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

4.4 Các phương pháp thu thập thông tin

4.4.1 Phương pháp tính tuổi

Sử dụng cách tính tuổi theo quy ước của Tổ chức Y tế Thế giới 1983 hiệnđang được sử dụng rộng rãi trong tài liệu ở Việt Nam nói riêng và các nước trênthế giới nói chung Đó là cách tính tuổi quy về tháng và năm gần nhất [8]

Tính tuổi theo năm, dựa vào ngày tháng năm sinh của trẻ theo giấy khaisinh hoặc giấy chứng nhận của nơi sinh hay sổ hộ tịch của địa phương: Quy ướcnhư sau:

- Từ sơ sinh đến trước ngày đầy năm (tức là năm thứ nhất) gọi là 0 tuổi haydưới 1 tuổi

- Từ ngày tròn 1 năm đến 1 năm 11 tháng 29 ngày gọi là một tuổi.Tóm lại

kể từ ngày sinh nhật thứ bao nhiêu thì trẻ được bấy nhiêu tuổi (tính theo năm).Theo cách tính này thì trẻ được tính là 09 tuổi khi trẻ tròn 09 năm đến 09năm 11 tháng 29 ngày kể cả 2 ngày trên Dựa vào cách tính trên để thu thập sốliệu, dự kiến trong nghiên cứu sẽ gồm có các tuổi: 06, 07, 08, 09, 10, 11

Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các số đo nhân trắc: cân nặng, chiềucao, vòng bụng, vòng mông

4.4.2 Phương pháp đo chiều cao đứng

Chiều cao đo bằng thước đo chiều cao đứng bằng thước gỗ (hình 2.1 A)(độ chính xác 0,1cm), kết quả tính bằng cm và ghi tới 1 số lẻ Thước được đặttrên nền đất phẳng, theo chiều thẳng đứng, vuông góc với mặt đất nằm ngang.Người được đo bỏ guốc dép, đi chân không, không buộc tóc cao, không đeobờm tóc, đứng quay lưng vào thước đo, mắt nhìn thẳng ra phía trước, hai taybuông thõng sao cho có 4 điểm theo một đường thẳng áp sát vào thước đo: gótchân, mông, vai, chẩm

Người đo dùng thước vuông hoặc mảnh gỗ áp sát đỉnh đầu thẳng góc vớithước đo Tiến hành đo 2 lần, lấy kết quả trung bình Nếu trong 2 lần đo có sai

số lớn hơn 0,2 cm thì tiến hành đo lại

4.4.3 Phương pháp xác định cân nặng

Cân nặng được đo bằng cân điện tử TANITA (hình 2.2 B) với độ chínhxác 100g, kết quả tính bằng kg và lấy 1 chữ số thập phân Cân đặt ở vị trí ổnđịnh và bằng phẳng, chỉnh thăng bằng về số 0 trước khi cân, hàng ngày phảikiểm tra với một vật chuẩn để kiểm soát độ chính xác và độ nhạy của cân.Đặt cân trên nền nhà phẳng, trẻ bỏ giày, dép, mặc quần áo gọn nhất,đứng giữa bàn cân, không cử động, mắt nhìn thẳng, khối lượng phân bố đềutrên 2 bàn chân (Hình 2.2 A)

A B

Hình 2.2 Dụng cụ đo chiều cao đứng (A) và cân cân nặng (B) [66]

4.4.4 Phương pháp tính chỉ số khối cơ thể

Để xác định mức độ thừa cân béo phì, WHO thường sử dụng chỉ số khối cơ

thể (BMI) Công thức tính BMI như sau:

4.4.5 Phương pháp đo vòng eo, vòng mông

Sử dụng thước dây không co dãn, chia chính xác đến 1 mm Kết quả đochiều cao được tính bằng đơn vị cm, lấy 1 chữ số thập phân Vòng eo được tính

là vòng tròn đi qua vị trí nằm giữa bờ trên của xương mào chậu và bờ dưới củaxương sườn cụt dưới cùng ở 2 bên cơ thể Vòng mông được tính là vòng trònlớn nhất đi qua mông Khi đo, vòng tròn thước đo phải vuông góc với cơ thểđối tượng

Tính chỉ số vòng eo/vòng mông (WHR): Đây là chỉ số đánh giá mức phân

bố tổ chức mỡ dưới da và mỡ trong ổ bụng Tỷ số vòng eo/vòng mông cao khi >0,9 ở nam và > 0,8 ở nữ [60]

4.4.6 Phương pháp phỏng vấn thu thập thông tin

Để xác định các yếu tố liên quan đến tăng TG máu, chúng tôi nghiên cứuthông qua sử dụng phương pháp phỏng vấn cha (mẹ) hoặc người giám hộ trẻ bởimột bảng câu hỏi thiết kế sẵn

- Các thói quen ăn uống của trẻ

- Tình trạng tham gia các họat động thể lực

- Đặc điểm bản thân, gia đình như tình trạng thừa cân, béo phì của bố mẹ,cân nặng lúc sinh của trẻ, tình trạng dinh dưỡng của trẻ

4.5 Xét nghiệm sinh hóa máu

Xét nghiệm TG, CT, LDL-C, HDL-C do Bệnh viện Medlatec thực hiện Đốitượng nghiên cứu được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào buổi sáng sau khi nhịn đói ítnhất 08 giờ Máu được đựng trong ống chống đông bằng heparin Các mẫu máuđược ly tâm trong vòng 10 phút ở 40C để tách lấy huyết thanh và huyết tương

Máu đem đi định lượng các chỉ số lipid máu TG, TC, HDL-C, LDL-C vàđược thực hiện bởi công ty Medlatec bằng các phản ứng enzyme và các phầnmềm tự động, theo nguyên tắc:

- TG: thử nghiệm TG bằng glycerol phosphate oxydase (GPO) dựa trên sựxác định bằng enzyme của glycerol với GPO sau khi thủy phân bằng lipoproteinlipase phát hiện được TG toàn phần bao gồm mono và diglyceride và các thànhphần glycerol tự do

- TC: sử dụng phương pháp thử nghiệm cholesterol bằng kỹ thuật enzyme,

sử dụng cholesterol esterase và cholesterol oxidase và đo mật độ ở bước sóngkhả biến

- HDL-C: định lượng bằng phương pháp siêu li tâm và định lượng bằng kỹthuật đo cholesterol sau khi tách LDL-C và VLDL-C Các phương pháp khácnhau sử dụng các hóa chất gây kết tủa khác nhau LDL được gây kết tủa bằngpolyethylene glycol (PEG) và dextransulfate

- LDL-C: xét nghiệm CT, TG và HDL-C từ đó tính ra LDL-C theo côngthức của Friedwald:

[LDL-C] = [CT] – [HDL-C] – [TG]/2,2 (mmol/L)

Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu được so sánh với các giới hạn bìnhthường ở trẻ 6 - 11 tuổi.

4.6 Sai số và khống chế sai số

- Sai số do không (thiếu) hợp tác: hạn chế bằng cách tăng cỡ mẫu, đồng

thời gửi thư ngỏ nêu mục đích, ý nghĩa, các yêu cầu để thăm dò sự tham gia củaphụ huynh học sinh trước khi tiến hành điều tra và loại trừ những trường hợpkhông đủ dữ liệu sau khi điều tra

- Sai số do thu thập số liệu từ phía người thu thập và dụng cụ thu thập:

được hạn chế bằng cách tổ chức tập huấn kỹ lưỡng, thống nhất cách ghi nhận sốliệu cho toàn bộ điều tra viên trước khi tiến hành điều tra và rút kinh nghiệm saumỗi ngày điều tra, sử dụng các dụng cụ thiết bị có mức sai số thấp (Ví dụ: cânđiện tử TANITA sai số 100g, thước đo chiều cao đứng sai số 1mm, thước dâykhông co dãn…), đã được kiểm tra và chuẩn hóa đồng bộ trước khi tiến hànhđiều tra và hiệu chỉnh ngay khi có dấu hiệu sai lệch Thay pin các dụng cụ điện

tử thường xuyên

- Sai số do hồi tưởng, nhớ lại: được giới hạn bằng cách hỏi trong khoảng

thời gian không quá xa để hạn chế sai số, hỏi theo trình tự thời gian với nhữngmốc nhất định để đối tượng dễ nhớ lại

- Xét nghiệm sinh hóa: mẫu máu được thu thập vào buổi sáng khi các em

nhịn ăn ít nhất 8 giờ và chưa ăn sáng do các kỹ thuật viên của Trung tâm xétnghiệm Y khoa MEDLATEC thực hiện

4.7 Các phương pháp sinh học phân tử

4.7.2 Phương pháp xác định kiểu gen

Tất cả các mẫu nghiên cứu được xác định kiểu gen bằng phương phápRFLP –PCR (Fragment Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp RFLP - PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài

của các phân đoạn ADN dựa trên điểm cắt của các enzyme giới hạn (RestrictionEnzyme, RE) Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzymecắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen Khi ủ vớienzyme giới hạn ở dung dịch đệm, pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp, đoạn

ADN sẽ bị enzyme giới hạn cắt ở vị trí đặc hiệu để tạo ra những phân đoạnADN với kích thước khác nhau Dựa vào kích thước các đoạn sau khi cắt để xácđịnh alen và kiểu gen

Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế phương pháp RFLP - PCR gồm 3bước sau:

Bước 1 Dùng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) để khuếch đại đoạn gen chứa SNP

- Cặp mồi được sử dụng: Phản ứng PCR dùng để khuếch đại đoạn gen chứa

cả 2 SNP sử dụng đoạn mồi oligonucleotide xuôi và mồi ngược được thiết kếbởi Emi và cộng sự [45] lần lượt là:

5'ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'

và 5'TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'

- Mỗi phản ứng gồm 4µl nước tinh sạch; 7µl Dream Taq Green (thànhphần: 0,4mM Dream Taq DNA polymerase; 0,4mM 2X Dream Taq Greenbuffer; 0,4mM Datp; 0,4mM dCTP; 0,4mM dGTP; 0,4mM dTTP và 4mMMgCl2); 10pmol mỗi loại mồi; 2µl DNA; tổng thể tích cuối cùng là 15µl

- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

- Điện di 5 µl sản phẩm PCR trên thạch agarose 3 %, đệm TBE 0,5X trong

50 phút ở 100v, nhuộm RedSafe và chụp hình để kiểm tra kết quả

Bước 2 Ủ sản phẩm PCR với enzyme đặc hiệu

- Enzyme cắt giới hạn: FastDigest HhaI (Thermo Corporation, USA)

- Enzyme Fastdigest HhaI nhận biết và cắt tại vị trí sau:

3' C↑G C G 5'

- Những mẫu có băng 244 bp rõ nét được ủ enzyme giới hạn FastDigest

HhaI trong 15 phút ở 37oC với các thành phần gồm: 4,4µl nước tinh sạch;

0,4µl10X Buffer; 0,2µl HhaI hoặc (hoặc 3,5µl nước tinh sạch; 1µl 10X Buffer; 0,5µlHhAI) và 5,0µl sản phẩm PCR tạo thành tổng thể tích cuối cùng là 8µl Sau

đó, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra trên polyacrylamide gel 12% ở 150V,20mA, 10W trong 90 phút, dùng đệm TBE 1X, nhuộm lắc với RedSafe trong 30phút, marker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) MarkerX174 HAE III, 2x DYE, chụp hình kiểm tra sản phẩm và tiếnhành nhận định kiểu gen

Bước 3 Nhận định kiểu gen từ sản phẩm

Sản phẩm PCR 244bp của hai SNP rs429358 và rs7412 sau khi ủ vớienzyme giới hạn ở dung dịch đệm, pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp sẽ bịphân cắt thành các phân đoạn ADN với kích thước khác nhau Dựa vào kíchthước các đoạn sau khi cắt để xác định alen và kiểu gen của đa hình.Mỗi kiểu

gen là sự kết hợp của các phân đoạn ADN sau khi ủ với enzyme HhaI Kiểu gen E2/E2 chứa đoạnADN có kích thước 91bp và 83bp (enzyme HhaI không

cắt ở cả hai vị trí); kiểu gen E3/E3 cũng chứa đoạn ADN có kích thước 91bp(cắt tại codon 112)và 48bp, 35bp từ sự phân cắt tại vị trí codon 158, kiểu gen

E4/E4 chứa các đoạn 48bp, 35bp và đoạn 72bp (enzyme HhaI cắt ở cả hai vị trí

codon 112 và 158) (đoạn 19bp quá nhỏ nên chạy ra khỏi bản thạch trong quátrình điện di) Các kiểu gen dị hợp là sự kết hợp của các đoạn ADN từ mỗi alen(Hình 2.3) [48]

Hình 2.3 Vị trí cắt của enzyme HhaI [21]

4.8 Phương pháp điện di

4.8.1 Phương pháp điện di trên gel agarose

Tất cả các mẫu sản phẩm PCR đều được điện di trên gel agarose 2,5%,nhuộm với RedSafe, sử dụng ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) MarkerX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE0,5X trong thời gian thích hợp ở 100V

- Nguyên tắc: Các phân tử acid nucleic có khối lượng và điện tích khácnhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hê ̣điện di trongđiện trường

- Các bước tiến hành điện di được thể hiện trong hình 2.5

+ Chuẩn bị gel agarose 2,5%: Cho 5g bột agarose vào 200ml đệm TBE0,5X, đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Để nguội bớt,thêm redsafe (1µ redsafe cho vào 5ml thạch), lắc để redsafe hòa đều vào gel.Sau

đó, đổ gel vào khuôn điện di có cài sẵn lược.Chiều dày gel từ 5 - 7mm là thíchhợp.Sau 30 - 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra

+ Tra mẫu ADN vào giếng: Dùng micropipet hút sản phẩm PCR (5 10µl) vào giếng, chú ý tra cẩn thận, tránh làm thủng giếng Đổ đệm TBE 0,5Xvào buồng điện di, sau đó đặt bản gel đã tra mẫu vào buồng điện di đã có dungdịch đệm sao cho dung dịch đệm ngập bản gel (chú ý đặt đúng chiều để ADNchạy từ cực âm sang cực dương) Sau khi hoàn tất, chạy máy điện di

-Hình 2.4 Một số bước trong quá trình điện di trên gel agarose

+ Sau khi hết thời gian chạy điện di, lấy bản gel và đưa vào máy chuyêndụng để quan sát các băng sản phẩm dưới ánh sáng tử ngoại.Chụp ảnh để lưu lạikết quả

4.8.1 Phương pháp điện di trên gel polyacryamide

Các mẫu sản phẩm PCR đều được điện di trên gel plyacryamide 12,5%,nhuộm với RedSafe, sử dụng ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) MarkerX174DNA/HaeIII Markers, dung dịch đệm TBE1X trong thời gian thích hợp ở 100V

- Nguyên tắc: Các phân tử acid nucleic có khối lượng và điện tích khácnhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hê ̣điện di trongđiện trường

- Các bước tiến hành điện di được thể hiện trong hình 2.5, gồm 16 bước:

Hình 2.5 Một số bước trong quá trình điện di trên gel polyacryamide

 Nhỏ 500£l Ethanol 100% lên bề mặt 2 tấm kính, một mặt gồ một mặt phẳng

 Lau sạch hai mặt kính bằng giấy mềm

 Đặt gioăng cao su, ghép hai tấm kính với nhau, kẹp chặt bằng 2 chiếc kẹp

 Pha dung dịch tạo Gel

Chú ý: lắc trộn PAS và APS trước khi lấy và sau khi cho vào dung dịch tạo gel , lắc đều dung dịch

tạo gel trước khi cho TEMED vào (TEMED cho cuối cùng), lắc nhanh hỗn hợp.

 Dùng Pasteur pipette, nhỏ dung dịch vừa pha vào giữa hai tấm kính cho đầy

 Lắp lược tạo giếng vào phía trên, chú ý không để không khí còn sót lại tronglược Dùng bút đánh dấu các giếng trên tấm kính Đợi ít nhất 30 phút

 Rót dung dịch 1XTBE vào hộp Electrophoresis aquarium (khoảng 1/3 hộp)

 Nhấc tấm lược ra, chú ý không để đứt các giếng

 Nhúng khung vào hộp điện di, chú ý không để bọt khí ở phía dưới

 Rót dung dịch 1X TBE vào ngăn phía trên, sao cho ngập hết các giếng

⑪ Dùng xilanh hút dung dịch 1XTBE bơm vào các giếng để rửa

Chế độ 1 20 mA 10 W 150V 20 min

⑬ Chạy điện di 20 phút để chuẩn bị môi trường

⑭ Dùng pipetman, hút các dung dịch, nhỏ vào các giếng theo thứ tự:

+ Dung dịch Dye: 2 giếng ở 2 đầu

+ φX174 HaeⅢ digest (DNA marker) vào giếng giữa: 3μll

+ Sản phẩm DNA PCR vừa ủ enzyme: 8.0 μll

+ Sản phầm DNA PCR không ủ enzyme: 3.0 μll

⑮ Kiểm tra lại chế độ chạy, chạy điện di trong 90 phút

⑱ Nhuộm bằng Redsafe: Chuẩn bị một hộp nhựa, cho vào hộp 60 ml 1XTBE, 3

μll Redsafe Dùng miếng nhựa chuyên dụng tách 2 phiến kính, lấy sản phẩm cho

vào hộp nhựa (Chú ý vị trí có mẫu φX174 HaeⅢ digest) Đặt lên máy lắc, lắc 65lần/phút trong 30 phút Lấy sản phẩm, đem đi chụp Electrophoresis

4.9 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Epidata 3.1 để nhập và quản lý thông tin điều tra.Kết quả được phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 với các test thống kê dùngtrong y sinh học Số liệu phân tích được trình bày theo bảng tần số, tỷ lệ,trung bình Các biến định lượng được trình bày dưới dạng số trung bình ± độlệch chuẩn ( )

Mối quan hệ giữa các yếu tố nguy cơ về điều kiện sống và hoạt động thểlực với tăng TG máu được đánh giá bằng cách sử dụng:

- Kiểm định T - test: sử dụng đối với các dữ liệu liên tục để xem xét sựkhác biệt giá trị trung bình của nhóm bệnh và nhóm chứng có ý nghĩa thống kêhay không

- Kiểm định Chi - square: sử dụng đối với các dữ liệu rời rạc để xem xét sựkhác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm chứng có ý nghĩa thống kê hay không

- Phân tích hồi quy logistic với OR và 95% CI: dùng cho biến độc lập đểxác định mối liên quan giữa yếu tố nguy cơ và đối tượng phân tích

Các giá trị có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 Giá trị p được hiệu chỉnh bằngphần mềm SPSS 16.0