Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Nấm Và Tạo Chế Phẩm Sinh Học Từ TRICHODERMA

3.2 Khảo sát hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma đối với các chủng nấm bệnh trên môi trường PGA .... DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : số bào tử bình quân trong một ô lớn ALG : tốc

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM VÀ

TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ TRICHODERMA

Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG MỞ ĐẦU 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 Sơ lược Trichoderma 14

1.1.1 Hệ gen của Trichoderma 14

1.1.2 Môi trường sống 15

1.1.3 Đặc điểm hình thái 16

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16

1.1.5 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma 17

1.1.6 Một số sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma 18

1.1.7 Một số ứng dụng của nấm Trichoderma 19

1.1.7.1 Bảo vệ thực vật[4] 19

1.1.7.2 Cải thiện năng suất cây trồng 21

1.1.7.3 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 22

1.1.7.4 Trong lĩnh vực khác 23

1.2 Sơ lược về một số nấm gây bệnh thực vật 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu 28

2.1.1 Chủng giống nghiên cứu 28

2.1.2 Vật liệu sử dụng 28

2.2 Dụng cụ, thiết bị 28

2.3 Các môi trường nuôi cấy 29

2.3.1 Môi trường PGA 29

2.3.2 Môi trường tăng sinh nấm mốc 29

2.4 Phương pháp 29

2.4.1 Phương pháp bảo quản giống trên thạch nghiêng 29

2.4.2 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng sợi nấm 29

2.4.3 Phương pháp khảo sát tính đối kháng của Trichoderma đối với nấm bệnh trên môi trường PGA 30

2.4.3.1 Nguyên tắc 30

2.4.3.2 Cách tiến hành 30

2.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi 30

2.4.3.4 Cách xác định hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma đối với nấm bệnh 30

2.4.4 Phương pháp xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng phương pháp đo OD660 nm và đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu 31

2.4.4.1 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu 31

2.4.4.2 Phương pháp đo OD660 n 32

2.4.5 Phương pháp nuôi cấy bán rắn để thu nhận bào tử 32

2.5 Các phương pháp nghiên cứu 33

2.5.1 Phương pháp chọn chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các nấm bệnh 33

2.5.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên quá trình tăng sinh cấp một nấm Trichoderma trên môi trường bán rắn 33

2.5.2.1 Ảnh hưởng của từng loại cơ chất riêng lẻ 33

2.5.2.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp các loại cơ chất 33

2.5.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm 33

2.5.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ các thành phần cơ chất trong môi trường nuôi cấy 33

2.5.2.5 Ảnh hưởng của sự bổ sung các dung dịch khoáng vi lượng 34

2.5.3 Phương pháp tăng sinh thu bào tử cấp hai nấm Trichoderma trên môi trường bán rắn 34

2.5.4 Phương pháp xác định tỷ lệ sử dụng của chế phẩm bào tử cấp hai trong phòng thí nghiệm 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 36

3.1 Tốc độ tăng trưởng trên môi trường PGA của các chủng Trichoderma và các chủng nấm bệnh 36

3.1.1 Tốc độ tăng trưởng trên môi trường PGA của các chủng Trichoderma 36

3.1.2 Tốc độ tăng trưởng trên môi trường PGA của các chủng nấm bệnh 37

3.2 Khảo sát hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma đối với các chủng nấm

bệnh trên môi trường PGA 37

3.2.1 Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với chủng NB01 38

3.2.2 Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với NB02 40

3.2.3 Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với NB03 42

3.3 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường và chọn lọc các điều kiện thích hợp cho sự sản xuất bào tử cấp một của nấm Trichoderma 44

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo bào tử cấp một của Trichoderma 44

3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của từng loại cơ chất riêng lẻ lên sự sản xuất của nấm Trichoderma 44

3.3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của sự kết hợp các loại cơ chất 45

3.3.2 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào môi trường nuôi cấy 48

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ các thành phần cơ chất trong môi trường nuôi cấy 49

3.3.4 Ảnh hưởng của khoáng vi lượng 51

3.4 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm canh trường bào tử cấp hai của các chủng Trichoderma chọn lọc 53

3.4.1 Xác định lượng bào tử có trong chế phẩm canh trường bào tử cấp hai các chủng Trichoderma 53

3.5 Khảo sát liều dùng ở mức độ phòng thí nghiệm của các chế phẩm 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.1.1 Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma đối với các chủng nấm bệnh 59

4.1.2 Thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận bào tử các chủng Trichoderma chọn lọc 59

4.1.3 Thu nhận chế phẩm bào tử cấp hai các chủng Trichoderma và đánh giá hiệu quả của chế phẩm 60

4.2 Đề nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 27

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Sclerotium solfsii[12] 24

Bảng 1.2: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Rhizoctonia[12] 24

Bảng 1.3: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Phytophthora[12] 25

Bảng 1.4: Một số bệnh trên Hồ tiêu ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30] 26

Tên bệnh 26

Triệu chứng 26

Tác nhân 26

Bảng 1.5: Một số bệnh trên lúa ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30] 26

Bảng 1.6: Một số bệnh trên ngô ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30] 27

Bảng 2.1: Các giống Trichoderma và giống nấm bệnh dùng trong nghiên cứu 28

Bảng 3.1: Tốc độ tăng trưởng của các chủng Trichoderma trên môi trường PGA 36

Bảng 3.2: Tốc độ tăng trưởng của các chủng nấm bệnh trên môi trường PGA 37

Bảng 3.3: Kết quả đối kháng với NB01 Sclerotium rolfsii 38

Bảng 3.4: Kết quả đối kháng với NB02 Rhizoctonia solani 40

Bảng 3.5: Kết quả đối kháng với NB03 Phytophthora capsici 42

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của từng loại cơ chất riêng lẻ lên sự tạo thành bào tử của các chủng Trichoderma chọn lọc 44

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của sự kết hợp các loại cơ chất lên sự tạo thành bào tử của chủng T12 47

Bảng 3.9: Sự tạo thành bào tử của các chủng Trichoderma trên môi trường có lượng nước bổ sung 48

Bảng 3.10: Lượng bào tử Trichoderma thu được sau khi nuôi cấy trên môi trường có tỷ lệ các nguồn cơ chất khác nhau 50

Bảng 3.11: Lượng bào tử thu được khi nuôi cấy các chủng Trichoderma trên môi trường có bổ sung các dung dịch khoáng khác nhau 52

Bảng 3.12: Lượng bào tử cấp 2 của các chủng Trichoderma thu được trong chế phẩm canh trường 53

Bảng 3.14: Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chế phẩm canh trường bào tử cấp

hai Trichoderma đối với các nấm bệnh chọn lọc tương ứng (thời gian xác định: 4

ngày) 57

Bảng 4.1: Thành phần môi trường thích hợp để nuôi cấy nuôi cấy chủng Trichoderma

59

Biểu đồ 3.7: Sự tạo thành bào tử của các chủng Trichoderma trên môi trường có lượng

nước bổ sung khác nhau 49

Biểu đồ 3.8: Lượng bào tử Trichoderma thu được sau khi nuôi cấy trên môi trường có

tỷ lệ các nguồn cơ chất khác nhau 50

Biểu đồ 3.9: Lượng bào tử Trichoderma thu được khi nuôi cấy trên môi trường có

những thành phần khoáng khác nhau 52 Biểu đồ 3.11: Hiệu quả đối kháng của chủng T27 đối với 3 chủng nấm bệnh 55 Biểu đồ 3.12: Hiệu quả đối kháng tương ứng với liều lượng sử dụng của các chủng T02, T12 và T21 đối kháng với nấm bệnh tương ứng 57

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1: Cấu trúc cơ quan sinh bào tử (A) và sợi tơ (B) của Trichoderma[27], [31]

Error! Bookmark not defined

Hình 1.2: Khuẩn lạc của một số chủng Trichoderma trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA) A: T parceromosum; B: T viride; C: T hamatum và D: T resei sau 4

ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined

Hình 1.3: Chu trình sống của Trichoderma[32] Error! Bookmark not defined

Hình 1.4: Khuẩn lạc của một số chủng Trichoderma trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA) A: T longibrachiatum; B: T harzianum; C: T aureoviride sau 3 ngày nuôi cấy và D: T longibrachiatum sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (Nguyễn

Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined

Hình 1.5: Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma[28] 17

Hình 1.6: Các hoạt động điều hòa tăng trưởng thực vật của Trichoderma:[17] Error! Bookmark not defined

Hình 1.9: Tỷ phần các loài Trichoderma có khả năng kiểm soát sinh học [22] 19

Hình 1.11: Thử nghiệm ứng dụng Trichoderma để phòng trị bệnh do nấm R solani

trong quy trình trồng rau Diếp sạch[24] Error! Bookmark not defined

Hình 1.12: Mầm lúa được và không được xử lý với Trichoderma T-22[14] Error! Bookmark not defined

Hình 1.13: Chu trình sống của Sclerotium Error! Bookmark not defined Hình 1.14: Chu trình sống và gây bệnh của Rhizoctonia Error! Bookmark not

defined

Hình 1.15: Chu trình gây bệnh thối rễ và chồi do Phytophthora sp Error! Bookmark

not defined

Hình 1.16: Khuẩn lạc Sclerotium rolfsii và hạch nấm trên môi trường PGA sau 9 ngày

nuôi cấy (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined

Hình 1.17: Khuẩn lạc Rhizoctonia solani và hạch nấm trên môi trường PGA sau 9

ngày nuôi cấy (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined

Hình 1.18: Khuẩn lạc Phytophthora capsici trên môi trường PGA sau 7 ngày nuôi cấy

(Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009) Error! Bookmark not defined

Hình 2.1: Hình minh họa vị trí cấy Trichoderma và nấm bệnh 30

Hình 2.2: Hình minh họa cho quy ước hiệu quả đối kháng 31

Hình 2.3: Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu 35

Hình 3.1: Môi trường BKM-R trước và sau khi nuôi cấy chủng T12 46

Hình 3.2: Khả năng kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh NB03 của chế phẩm canh trường bào tử cấp hai của chủng T21 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A : số bào tử bình quân trong một ô lớn

ALG : tốc độ tăng trưởng đường kính trung bình

AOX : các hợp chất halogen thấm nước

BCA : nhân tố kiểm soát sinh học

D : đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối kháng

Ddc : đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối chứng ĐVT : đơn vị tính

F1 : đường kính khuẩn lạc trung bình sau 1 ngày nuôi cấy

F3 : đường kính khuẩn lạc trung bình sau 3 ngày nuôi cấy

H : hiệu quả đối kháng

L : số lần pha loãng dịch huyền phù bào tử

CHƯƠNG MỞ ĐẦU

Bệnh hại cây trồng đã và đang tiếp tục gây thiệt hại nghiêm trọng đến mùa màng ở Việt Nam và các nước trong khu vực Đông Nam Á Bệnh dịch vàng lùn và lùn xoắn lá trên lúa ở Việt Nam gần đây cho thấy những tác động đáng kể của bệnh cây đối với kinh tế - xã hội cấp quốc gia Sự bùng phát dịch bệnh trên các cây trồng có giá trị kinh tế có thể tác động lớn đến từng hộ nông dân tại những địa phương có ít cây trồng thay thế phù hợp

Nhiều bệnh do nấm trong đất gây ra sẽ gây ảnh hưởng trực tiếp đến cây trồng, làm giảm năng suất và chất lượng nông sản dẫn đến thu nhập của người nông dân bị giảm sút đáng kể.[11] Hơn thế nửa, chi phí cho các biện pháp phòng trừ nấm sẽ càng làm giảm hơn nữa thu nhập của họ Trong năm 2006, dịch vàng lùn và lùn xoắn lá do nấm bệnh gây ra đã gây thiệt hại lớn trên lúa ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, ảnh hưởng đến một triệu hecta lúa thuộc 22 tỉnh thành Đây là một ví dụ điển hình và cần được phòng tránh triệt để

Ở nước ta, công tác phòng trừ bệnh hại cây trồng hiện nay áp dụng bằng nhiều biện pháp, trong đó, biện pháp hóa học vẫn được xem là hữu hiệu nhất Nhưng các loại thuốc hóa học thường có tác dụng không giới hạn lên các sinh vật không phải mục tiêu (sinh vật có ích) Bên cạnh đó, việc lạm dụng các loại thuốc diệt nấm hóa học đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người dân, làm cho mầm bệnh trở nên kháng thuốc và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nguồn nước và đất đai.[18], [19], [26]

Chính vì thế, xu hướng hiện nay là sử dụng các tác nhân sinh học như các vi sinh vật, côn trùng có ích hoặc các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên để kiểm soát dịch bệnh trên cây trồng Ưu thế của việc sử dụng các sản phẩm sinh học là tránh được việc gây ô nhiễm môi trường như các loại thuốc hóa học đã gây

ra, không ảnh hưởng xấu đến năng xuất cây trồng cũng như sức khỏe của người sử dụng, bên cạnh đó, việc tận dụng các phế phụ liệu công nông nghiệp để sản xuất các chế phẩm sản phẩm này là điều đang được các nhà nghiên cứu quan tâm sâu sắc.[19]

Ứng dụng của chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma hiện nay vào nông

nghiệp có thể nói bước đầu đã đáp ứng được căn bản các yêu cầu trên Số liệu thống

kê cho thấy trong số các chế phẩm sinh học đang lưu hành trên thế giới hiện nay có

đến 60% được sản xuất từ các loài nấm Trichoderma.[17] Hiện có nhiều quốc gia ứng

dụng Trichoderma phổ biến trong nông nghiệp như Mỹ, Bỉ, Thụy Điển, Ấn Độ, Israel,

Tây Ban Nha, New Zealand, Đan Mạch…[13] Các sản phẩm này có khả năng kháng nấm bệnh gây hại cây trồng rất tốt bằng những cơ chế như: tiết ra chất kháng sinh và các enzyme phân hủy vách sợi nấm bệnh, ký sinh trên nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, không gian với chúng Tuy nhiên, việc ứng dụng các sản phẩm vào nông nghiệp vẫn còn hạn chế do nhiều nguyên nhân như thiếu nguồn cung cấp chế phẩm, chế phẩm không đa dạng, chi phí đầu tư ban đầu cao cũng như thói quen sử dụng các sản phẩm hóa học của người nông dân

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng nấm và tạo chế phẩm sinh học từ Trichoderma” với mục tiêu sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh thực vật và gồm các

nội dung nghiên cứu sau:

 Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng Trichoderma đối với một vài

nấm bệnh tiêu biểu

 Chọn lọc và nghiên cứu điều kiện thích hợp để sản xuất chế phẩm bào tử

Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm bệnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược Trichoderma

1.1.1 Hệ gen của Trichoderma[12]

Trichoderma là nhóm những loài nấm sợi tăng trưởng nhanh (Samuels, 1996)

và phân bố rộng khắp trên thế giới (Domsch và cộng sự, 1980; Gams và Bissett, 1998; Klein và Eveleigh, 1998) Chúng có mặt trong hầu hết các loại đất và thường chiếm ưu thế trong quần thể vi sinh vật đất (Killham, 1994) Trong những loài vi nấm sợi,

Trichoderma được phân vào có nhóm bào tử trần (Domsch và Gams, 1972)

Persoon là người đầu tiên đã giới thiệu về hệ gen của Trichoderma vào năm

1794 (Rifai, 1969) Tuy nhiên, sự phân loại các loài Trichoderma vẫn còn mù mịt và

gây nhiều tranh cãi mãi cho đến năm 1969 khi mà Rifai đã nổ lực để tìm ra một hệ

thống phân loại khả thi cho hệ gen Trichoderma Hệ thống phân loại này dựa trên hình

thái của các loài và dựa trên khái niệm “tập hợp loài” (Rifai, 1969) Đến năm 1991,

Bissett đã đề xuất một hệ thống phân loại Trichoderma có chỉnh sửa dựa trên các đặc tính về hình thái và bốn phân chi (Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum và Hypocreanum) (Bissett, 1991) Mặc dù vậy hệ thống phân loại của Bissett vẫn chỉ là

xác định các đặc điểm một cách đơn giản

Trong những năm gần đây, các phương pháp phân tử đã giúp cho chúng ta cải

thiện đáng kể những hiểu biết về hệ gen Trichoderma đến cấp độ loài Hiện nay, đã có khoảng 75 loài Trichoderma đã được xác định Trong số đó, có nhiều loài là những nhân tố kiểm soát sinh học (BCA) như T hamatum, T harzianum, T koningii Oud., T polysporum (Link ex Pers.) Rifai, T virens (Harman và cộng sự, 2004; Metcalf, 2004

và Samuels, 1996)

Hệ gen Trichoderma có các đặc tính hình thái đặc trưng được dùng để phân biệt

và phân loại chúng Trichoderma là nhóm nấm có vách ngăn Chúng hình thành nên

rất nhiều nhánh mang những cuống bào tử đính tạo thành dạng có hình chóp hoặc hình nón (Rifai, 1969) Trên đỉnh của cuống bào tử đính có mang những cấu trúc dạng cổ chai Các bào tử dạng chuỗi, còn được gọi là bào tử đính, được hình thành ở đầu mút của cấu trúc cổ chai và chúng tạo thành chóp bào tử đính (Gams và Bissett, 1998)

Như những loài khác trong nhóm nấm sợi, các loài Trichoderma chỉ có thể sinh

sản vô tính thông qua quá trình sinh bào tử mạnh mẽ hoặc chúng có thể tăng trưởng vô

tính từ những đoạn sợi (Gams và Bissett, 1998) Tuy nhiên, các loài Trichoderma cũng

có một giai đoạn hữu tính như Hypocrea (Samuels, 1996) Theo đó, giai đoạn sinh sản hữu tính của Trichoderma cũng có các đặc tính quan trọng của giai đoạn sinh sản vô

tính Trong giai đoạn này, chúng tạo thành các nang bào tử

Trichoderma là loài có đặc tính khuẩn lạc mọc thành dạng khóm (búi) với nhiều

màu sắc khác nhau như trắng, vàng, xanh… Trước đây, những đặc điểm này của

Trichoderma được sử dụng để phân loại chúng (Rifai, 1969) Ngày nay, việc sử dụng các đặc điểm hình thái để phân loại các loài Trichoderma đang dần được thay thế bằng

các phương pháp sinh học phân tử có tính chính xác, đáng tin cậy và thiết thực hơn (Lieckfeldt và cộng sự, 1998)

1.1.2 Môi trường sống

Trichoderma là những loài nấm phổ biến trong đất (Waksman, 1952) Chúng

hiện diện trong một dãy rộng các loại cấu trúc đất khác nhau từ vùng có nhiệt độ mát lạnh đến nơi có khí hậu nhiệt đới bao gồm các vùng đất nông nghiệp, đất rừng, đất cây

ăn quả, bãi cỏ hay sa mạc (Domsch và cộng sự, 1980; Hagn và cộng sự, 2003 và Roiger và cộng sự, 1991)

Nhóm nấm này gồm những nấm hoại sinh nên chúng thường phân bố trên tầng đất mặt Tại đây, hiện diện sợi nấm với số lượng lớn Tầng đất này có chứa nhiều lá rụng, rơm… và ẩm ướt nên chúng có thể sinh sản (Danielson và Davey, 1973 và Widden và Abitbol, 1980)

Một số loài nấm Trichoderma có tính năng động cao thông qua việc chúng có

thể phát triển trên các vùng sinh thái khắc nghiệt như đầm lầy muối, rừng Đước hay bùn cửa sông (Borut và Johnson, 1962; Domsch và cộng sự, 1980 và Lee và Baker, 1972) Ở những vùng sinh thái này, thông thường các loài vi nấm khó có thể tồn tại do các điều kiện áp suất thẩm thấu cao bất lợi cho sự phát triển của chúng Ở những nơi

có điều kiện như vậy, người ta thường tìm thấy loại T viride Pers.Ex Gray, đây là một loài phân bố rộng rãi nhất trong số các loài Trichoderma (Domsch và cộng sự, 1980)

Một số loài Trichoderma khác như T harzianum được tìm thấy nhiều ở bầu rễ

các cây như lúa mì, khoai tây và thuốc lá (Pakinson va cộng sự, 1963) Chúng có thể được phân lập từ rễ của những cây lâu năm như cây liễu (Gochenaur và Backus,

1967) Qua đó cho thấy hệ gen của Trichoderma ít bị giới hạn bởi các điều kiện môi

trường sống Nhiều môi trường gần như chỉ hiện diện hệ gen này Sự giới hạn về môi trường sống chỉ có thể xảy ra trong quá trình phát tán hoặc tăng sinh của chúng.[12]

1.1.3 Đặc điểm hình thái[2]

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn

ty (Bertrand và cộng sự, 1998) Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào

tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn Khuẩn lạc nấm có màu lục trắng hoặc từ lục

trắng đến lục, vàng xanh màu lục xỉn đến lục đậm Các chủng của Trichoderma có tốc

độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20oC

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa[6]

Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Trichoderma là từ

30 – 35ºC Chúng là loài nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Hầu hết chúng là những sinh vật hoại sinh, chúng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác

Trichoderma phát triển tốt ở pH nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất kiềm

nếu như ở đó có sự tập trung một lượng CO2 và bicarbonate (Papavizas, 1985) Chúng

có thể phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau như sáp, gỗ, thép không gỉ…

Trichoderma thuộc loại nấm có khả năng đối kháng, nhóm nấm này thuộc hệ vi

sinh vật đất (Pomsch và cộng sự 1920), chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc nấm mà chúng kháng, cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh Sự phân bố của các loài nấm đối kháng này phụ thuộc vào vùng địa lý, loại đất, điều kiện khí hậu và thảm thực vật ở từng khu vực

Trichoderma là vi nấm ưa ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt, những khu rừng khác nhau Trichoderma hamatum và Trichoderma

pseudokoningii có thể chịu điều kiện có độ ẩm cao hơn so với những loài khác Tuy nhiên, Trichoderma spp thường không chịu được độ ẩm thấp và điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ

ẩm thấp, song các loài Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm

cũng khác nhau (I Grondona và cộng sự, 1997)

1.1.5 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma[15], [16], [27]

Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh,

giúp cây hồi phục, sinh trưởng và phát triển Nấm Trichoderma có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh khác như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia Những loài này gây bệnh trên nhiều loài cây trồng: cây họ đậu, cây ăn

trái, hòa thảo, cây công nghiệp và cây hoa kiểng…

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Trong đó chủ yếu

là cơ chế phòng trừ nấm bệnh của nấm đối kháng Trichoderma là tại những điểm tiếp xúc trực tiếp của Trichoderma với nấm bệnh sẽ làm cho nấm bệnh teo đi và chết, đây

là hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma Ngoài ra, nấm Trichoderma còn có khả

năng sinh các chất kháng sinh nên dù không tiếp xúc trực tiếp nấm bệnh vẫn chết

Hình 1.5: Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma[28]

Vào năm 1932, Weindling đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm

gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm” (Cnyder, 1976) Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như sau:

(1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh

Sự ký sinh trên nấm bệnh

Sự cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí nhiễm

Sự cản trở các yếu tố gây bệnh

Sự cảm ứng

hệ thống phòng thủ

Sự ức chế nấm bệnh tăng trưởng, sự tiêu diệt sợi và bào tử và làm giảm sự phát triển của bệnh

(2) Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh

cây

(3) Cuối cùng, sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào của nấm gây

bệnh, dẫn đến sự gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết

Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã

làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết (Dubey, 1995; Rousscu và cộng sự, 1996) Tuy

nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma, nấm gây bệnh vẫn

chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh tiết ra từ nấm

Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh (Agrowcal và cộng sự, 1979;

Michrina và cộng sự 1996)

Theo L.L Burpee (1990), khả năng đối kháng của Trichoderma trong môi

trường đất chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố vô sinh như pH, nhiệt độ, độ ẩm, loại đất, thành phần của không khí trong đất, các thành phần vô cơ và hữu cơ trong đất cũng như hàm lượng thuốc diệt nấm hiện diện trong đó.[16] Điều này chứng tỏ rằng các yếu

tố trong môi trường này cũng ảnh hưởng lên sự phát triển của Trichoderma Sự phụ

thuộc của sự phát triển cũng như hiệu quả đối kháng này vào môi trường là một trong

những khó khăn để đưa vào ứng dụng các chế phẩm Trichoderma

1.1.6 Một số sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma[4]

Trichoderma là một trong số những nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp

nhiều loại kháng sinh khác nhau Weindling là tác giả đầu tiên công bố được sản phẩm

trao đổi của Trichoderma Weindling và Emerson đã và kết tinh được chất trao đổi hữu

cơ rất độc với liều lượng nhỏ Chất này có tên thông thường là Gliotoxin Chất độc thứ

2 do Brian và Mc Growan công bố là Viridian được sản xuất từ Trichoderma viride

Trước đó Webster và Lomas ghi nhận là hai chất kháng sinh này đều hiện diện trên

dịch lọc từ canh trường nuôi cấy của Trichoderma viride sau đó Weindling cô lập ra

sản phẩm Gliotoxin, Brian và Mc Growan cô lập Viridian Dennis và Webster ghi

nhận Trichoderma spp có sản phẩm kháng khác với Gliotoxin và Viridian, sản phẩm

đó là chất kháng sinh

Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết ra

nhiều enzyme khác như exo và endoglucanase, cellulase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Trong quá trình ký sinh trên nấm bệnh,

Trichoderma có thể tiết ra các loại enzyme để phân hủy thành tế bào của nấm gây

bệnh…

Nấm Trichoderma giống như một số nấm mốc khác như Gliocladium, Calvatia

cho lượng enzyme chitinase cao Chitinase có nhiều chức năng, một trong những chức năng chính là khả năng phân hủy chitin, là thành phần chính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố rất quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật

1.1.7 Một số ứng dụng của nấm Trichoderma

1.1.7.1 Bảo vệ thực vật[4]

Một trong những nghiên cứu về ứng dụng của Trichoderma spp được quan tâm

nhiều nhất đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số

nấm bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loài Trichoderma spp

khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm bệnh khác nhau

Hình 1.9: Tỷ phần các loài Trichoderma có khả năng kiểm soát sinh học [22]

Hiện nay các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại như: chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma) của

Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi – ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam… đang được nông dân TP Hồ Chí Minh, khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ sử dụng trong việc ủ phân chuồng để bón cho

cây trồng Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 –

3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng mà người nông dân còn tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng

của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong phân Chế phẩm Trichodex với Trichoderma harzianum là thành phần chính được sử dụng để chống lại sự thối rữa của

táo sau thu hoạch Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống

để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt

Ứng dụng chế phẩm sinh học vào sản xuất nông nghiệp là xu hướng đang phát

triển mạnh hiện nay Trong đó, chế phẩm nuôi cấy nấm Trichoderma là một trong các

ứng dụng được xem là phổ biến vì giá thành thấp, cách sử dụng đơn giản và nhất là hiệu quả đem lại rất thuyết phục

Hình 1.10: Số liệu thống kê về thị trường các sản phẩm BCA Các BCA khác gồm vi

khuẩn, virus và giun tròn.[17]

Những người nông dân đã sử dụng nấm Trichoderma trong quy trình trồng dưa

hấu ở Tân Trụ đều có chung nhận định là các ruộng dưa giảm đáng kể tỷ lệ dưa gặp các bệnh chết cây con, chạy dây và cháy lá so với trước đó Một số khảo sát thực địa

đã cho thấy rằng: việc sử dụng nấm Trichoderma trên cây dưa hấu có thể giúp giảm 60-90% tình trạng dưa chết cây con, giảm 15-30% bệnh chạy dây do Fusarium và 10- 15% bệnh cháy lá do Phytophthora Với các vườn chanh ở Bến Lức thì ghi nhận việc

sử dụng Trichoderma có thể giúp giảm đến 80% chanh bị thối rễ, chết cành

Tuy nhiên, để có thể phát huy tác dụng của nấm Trichoderma một cách tốt nhất

thì yêu cầu người nông dân cần thực hiện đúng và đầy đủ các hướng dẫn sử dụng;

trong đó, do Trichoderma là vi sinh vật sống nên phải có thời gian cách ly với vôi và

các loại thuốc bảo vệ thực vật trừ nấm từ 7-10 ngày; đồng thời, nấm cần có nguồn phân hữu cơ như nguồn dinh dưỡng để các bào tử nấm phát triển mạnh Cụ thể như khi trồng dưa hấu, sau khi làm đất và xử lý vôi thì tốt nhất là 10 ngày sau mới đưa nấm

Trichoderma đã được ủ với phân hữu cơ rãi đều trên các luống trồng, rồi sau đó cho

tưới, đặt màng phủ nông nghiệp và gieo hạt giống trực tiếp hoặc đặt cây con đã bầu

sẳn Tương tự, với cây chanh, Trichoderma được đưa vào đất khi lên mô và bổ sung

vào các lần bón phân thúc

Thông qua tác dụng phòng ngừa một số bệnh hại nên nấm Trichoderma giúp

giảm một phần thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), giảm ô nhiễm môi trường, giúp cây trồng sinh trưởng khỏe, giúp đất tơi xốp, giữ độ phì đất lâu dài và cho sản phẩm sạch,

an toàn Vì thế có thể khẳng định chế phẩm Trichoderma sẽ được ứng dụng rất rộng

rãi trên nhiều loại cây trồng trong thời gian tới

1.1.7.2 Cải thiện năng suất cây trồng[2], [4], [6]

Cũng như thuốc trừ sâu, việc sử dụng phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn, các loại giun đất không phát triển được làm hạn chế độ xốp, đồng thời độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt Vì vậy, xu hướng hiện nay trên thế giới là sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới – thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng:

1) Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh nấm sương mai

và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân

2) Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích

sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải các chất xơ, chitin, ligin, pectin… trong các phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng

3) Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả

năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán Một khả năng có lẽ

đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T-22 ở

rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

4) Sử dụng chế phẩm kết hợp với phân hữu cơ có tác dụng cải tạo làm cho đất tơi xốp hơn, tăng hàm lượng chất mùn và mật độ côn trùng có ích, giữ được độ phì của đất

Ngoài những chế phẩm đã kể trên, ở nước ta, các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP Hồ Chí Minh); phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai)… đã được nông dân các vùng trồng rau, cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả

1.1.7.3 Trong lĩnh vực xử lý môi trường[4]

Trichoderma harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất

rừng Sự tồn tại của các hợp chất chloroguaiacols và các hợp chất AOX (các hợp chất halogen thấm nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney,

Đông Nam nước Úc và các sản phẩm phân giải của Trichoderma harzianum đã được

nhà khoa học Van Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu Chất tẩy trắng chlor của các nhà máy sử dụng sulfite hóa bột giấy được tháo ra hồ một cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước và cặn bẩn Hợp chất chlorophenol này rất

độc Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất

tự do 2,4,6–trichlorophenol; 4,5–dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối khoáng Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiaacol tự do trong môi trường khoáng mặn

Trichoderma harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng

trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphonic acid (3–methoxyphenyl)

Một công trình nghiên cứu khác sử dụng chủng nấm mốc Trichoderma reesei

RUT – 30 để xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn một nguồn sản xuất enzyme được đánh giá là tốt hơn và kinh tế hơn so với enzyme cellulase được lấy từ các nguồn

cơ chất cellulose tinh chế

1.1.7.4 Trong lĩnh vực khác[29]

 Lương thực và ngành dệt

Trichoderma spp là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào rất có

hiệu quả Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương ứng

 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hóa các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều gen có

nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong

chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh

L.Grange và cộng sự đã nghiên cứu biểu hiện gen  – xylanase (XYN2) của

Trichoderma reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm,

tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác 1.2 Sơ lược về một số nấm gây bệnh thực vật

Bệnh hại cây trồng gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho thu nhập của nhiều nông dân Việt Nam qua việc làm giảm năng suất và chất lượng nông sản Chi phí cho các biện pháp phòng trừ như thuốc trừ nấm càng làm giảm hơn nữa thu nhập của người dân

Đôi khi bệnh bùng phát thành dịch tàn phá các cây trồng chính Những dịch bệnh như vậy có thể tác động nghiêm trọng đến kinh tế và xã hội của toàn thể một vùng hoặc quốc gia Chẳng hạn như trong năm 2006, dịch vàng lùn và lùn xoắn lá đã gây thiệt hại lớn trên lúa ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, ảnh hưởng đến một triệu hecta lúa thuộc 22 tỉnh thành Bệnh dịch này trực tiếp ảnh hưởng đến hàng triệu gia đình nông dân

Một trong những tác nhân chính gây ra các bệnh cây trồng là nấm, điển hình là

các loài: Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Sclerotium… Chúng gây ra

một số bệnh như: gỉ sắt, thối rễ, thối thân, héo rũ…

Tính chất trồng trọt quanh năm tại các vùng châu thổ Việt Nam, sự lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới, thoát nước kém, cây giống không sạch

bệnh và khí hậu nhiệt đới là những yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các bệnh này

Bảng 1.1: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Sclerotium solfsii[12]

Triệu chứng Gây thối ở gốc thân, cây bệnh héo và chết

Các dấu hiệu

chuẩn đoán

Các sợi nấm màu trắng và các hạch nấm nhỏ màu nâu, tròn, dạng hạt cải, được hình thành trên bề mặt gốc thân bị bệnh Các sợi nấm trắng, phát triển mạnh khi bệnh lan từ cây bệnh sang cây khỏe

Phổ ký chủ Bao gồm cà chua, ớt, bầu bí, đậu cô ve, cà rốt và hành… Nấm bệnh

thường xâm nhiễm vào các cây trồng đã bị ảnh hưởng bởi các tác nhân gây bệnh khác (bệnh cơ hội)

Thời tiết Bệnh trầm trọng nhất trong điều kiện thời tiết ấm trở nên nóng, mưa

hoặc môi trường ẩm ướt

Bảo tồn Tồn tại dưới dạng hạch nấm trong đất qua thời gian dài

Xâm nhiễm Sợi nấm phát triển từ hạch nấm xâm nhiễm vào cây qua gốc, thân

Sự xâm nhiễm sẽ nhanh và mạnh hơn ở những nơi có tàn dư cây bệnh sót lại trên bề mặt đất Các sợi nấm có thể mọc lan đến vài cm trên mặt đất từ cây hoặc mô bệnh để xâm nhiễm những cây gần đó

Bảng 1.2: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Rhizoctonia[12]

Các triệu

chứng chính

Phụ thuộc vào loài, chủng nấm và cây ký chủ, bao gồm lở cổ rễ cây

con, héo, chết cây con Rhizoctonia gây ra những vết thối đen trên

lá ở bắp cải Bệnh khô vằn lúa và khô vằn ngô sẽ thấy xuất hiện các vết bệnh màu vàng và các vết mất màu bất thường xen kẽ

Các dấu hiệu

chuẩn đoán

Việc chuẩn đoán thường phụ thuộc vào quá trình phân lập và giám định nấm thuần trên môi trường nhân tạo Các hạch nấm điển hình màu nâu, hình dạng bất định được hình thành ở một số loài trên các

mô ký chủ bệnh

Phổ ký chủ Đa dạng, tùy thuộc vào chủng nấm

Thời tiết Điều kiện thời tiết mưa ướt, ấm tới nóng tạo điều kiện thuận lợi cho

sự phát triển của các bệnh ở lá và thân cây Các bệnh ở cây con và thối rễ lại gây hại nặng hơn trên cây trồng ảnh hưởng bởi những điều kiện thời tiết không thuận lợi Ví dụ, cây con đậu cô ve dễ mẫn cảm với bệnh lở cổ rễ khi trời lạnh vì nhiệt độ thấp làm chậm việc nảy mầm và nhú chồi

Bảo tồn Tồn tại trong đất dưới dạng hạch nấm hoặc sợi nấm trong tàn dư

cây ký chủ

Xâm nhiễm Các sợi nấm Rhizoctonia trong tàn dư cây bệnh xâm nhiễm trực

tiếp vào mô cây và một số tạo các cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt Hạch nấm nảy mầm tạo ra sợi nấm xâm nhiễm vào cây

Bảng 1.3: Một số đặc điểm về nguồn nấm bệnh và bệnh do Phytophthora[12]

Các triệu

chứng chính

Cây bị bệnh chết dần từ ngọn cây và có thể có triệu chứng thối rễ

và nứt ở phần thân gần mặt đất Các cây rau bị thối rễ như ớt trở nên còi cọc và héo Cây thường chết nhanh sau khi các triệu chứng héo trầm trọng xảy ra

Các dấu hiệu

chuẩn đoán

Việc chuẩn đoán đòi hỏi quá trình phân lập và giám định tác nhân gây bệnh Triệu chứng héo cũng có thể do các tác nhân khác làm thối rễ và thân

Phổ ký chủ Phổ ký chủ của Phytophthora tùy thuộc vào từng loài cụ thể Một

số loài như Phythophora palmivora có phổ ký chủ rộng, trong khi các loài khác như Phythophora infestans có phổ ký chủ hẹp

Thời tiết Các bệnh do Phytophthora thích hợp với điều kiện ẩm ướt Lượng

mưa cao tại các vùng nhiệt đới thúc đẩy quá trình lan truyền của du động bào tử và các mầm bệnh khác theo nước mưa tạt Du động bào tử cũng di chuyển theo nước trong các lạch và kênh tưới tiêu

Nhiều loài Phytophthora ưa điều kiện nóng ẩm trong khi đó một số loài như Phythophora infestans gây bệnh mốc sương, lại ưa điều

kiện ẩm ướt và mát

Bảo tồn Các tác nhân gây bệnh bảo tồn dưới dạng bào tử trứng và/hoặc bào

tử hậu trong đất, có thể được phát tán theo vật liệu nhân giống, đất hoặc nông cụ có chứa nấm bệnh

Xâm nhiễm Cách thức xâm nhiễm tùy từng loài và ký chủ Tuy nhiên, quá trình

xâm nhiễm vào các bộ phận khác nhau của cây sẽ được thực hiện bởi bào tử trứng, bọc bào tử động và du động bào tử Mưa tạt hoặc côn trùng làm phân tán bào tử lên bộ lá của cây Vì vậy, quá trình xâm nhiễm có thể bắt đầu từ thân, lá và quả

Hiện nay, bệnh hại cây trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long rất phong phú Có gần 30 dạng bệnh hại cây trồng do nấm ở vùng này

Bảng 1.4: Một số bệnh trên Hồ tiêu ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30]

Bệnh rụng lóng

(tiêu cùi)

Các lóng rụng dần từ đọt xuống hoặc rụng đồng loạt nhiều long

Rhizoctonia solani, Phitophthora sp

Bệnh thối cổ rễ Dây tiêu có màu vàng và héo từ đọt xuống

Cổ rễ có vết bệnh ẩm ướt, thối, làm vỏ cổ

rễ bong ra Dưới vết bệnh mọc ra chồi mới

Phytophthora parasitica var

piperina

Bệnh héo rũ Các lá dưới bị vàng héo dần lên các lá trên

Dây héo đột ngột, trong dây tiêu có màu đen, rễ cũng có màu đen

Fusarium sp

Bệnh héo dây Dây héo dần dần, lá vàng, vết bệnh màu

nâu xuất hiện ở phần thân cách mặt đất khoảng 1-2 dm Bệnh nặng, nhu mô nơi vết bệnh bong ra

Sclerotium sp

Bảng 1.5: Một số bệnh trên lúa ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30]

Bệnh đốm vằn Xuất hiện ở bẹ lá các đốm có hình bầu dục

dài 1-3 cm Nhóm đốm liên kết làm cho vùng bệnh có dạng vằn Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh

Rhizoctonia solani

Bệnh đốm vòng Trên vỏ hạt nhiễm có đốm nâu nhạt hay

trắng bạc, bìa vết có màu nâu đậm, tâm vết

có đốm đen nhỏ Nấm có thể xâm nhập vào hạt gạo bên trong làm biến màu hạt gây giòn và dễ vỡ

Alternaria padwickii

Bệnh than lá Trên cả 2 mặt lá có các đốm nhỏ như sọc

ngắn, hình chữ nhật hay elip có góc cạnh 0.5-1.5 mm x 0.5-5 mm, màu đen chì

Entiloma oryzae

Bệnh gạch nâu Trên lá xuất hiện những vết gạch màu nâu,

ngang 1mm, dài 2-10mm

Cercospora oryzae

Bệnh lúa von Bệnh có thể thấy trong nương mạ hay trong

ruộng cấy, cây con bị nhiễm bệnh sẽ cao hơn, ốm yếu và hơi vàng Sau 1 thời gian cây sẽ chết

Fusarium moniliforme

Bảng 1.6: Một số bệnh trên ngô ở Việt Nam do nấm có trong đất gây ra[30]

Bệnh đốm vằn Xuất hiện ở bẹ lá các đốm hình bầu dục dài

1-3 cm Nhóm đốm liên kết làm cho vùng bệnh có dạng vằn Lây lan rất nhanh

Rhizoctonia solani

Bệnh đốm vòng Trên vỏ hạt nhiễm có đốm nâu nhạt hay

trắng bạc, bìa vết có màu nâu đậm, tâm vết

có đốm đen nhỏ Nấm có thể xâm nhập vào hạt gạo bên trong làm biến màu hạt gây giòn và dễ vỡ

Alternaria padwickii

Bệnh than lá Trên cả 2 mặt lá có các đốm nhỏ như sọc

ngắn, hình chữ nhật hay elip có góc cạnh 0,5-1,5 mm x 0,5-5 mm, màu đen chì

Entiloma oryzae

Bệnh gạch nâu Trên lá xuất hiện những vết gạch màu nâu,

ngang 1mm, dài 2-10 mm

Cercospora oryzae

Bệnh lúa von Bệnh có thể thấy trong nương mạ hay trong

ruộng cấy, cây con bị nhiễm bệnh sẽ cao hơn, ốm yếu và hơi vàng Sau 1 thời gian cây sẽ chết

Fusarium moniliforme

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng giống nghiên cứu

Giống Trichoderma và nấm bệnh do phòng thí nghiệm Chi nhánh công ty

TNHH Gia Tường cung cấp

Bảng 2.1: Các giống Trichoderma và giống nấm bệnh dùng trong nghiên cứu

TM1 Trichoderma hamatum NB01 Sclerotium rolfsii

T02 Trichoderma hamatum NB02 Rhizoctonia solani

T11 Trichoderma harzianum NB03 Phytophthora capsici

2.3 Các môi trường nuôi cấy

2.3.1 Môi trường PGA[6]

Khoai tây 200g

Glucose 20g

Agar 24g

H2O 1000ml

2.3.2 Môi trường tăng sinh nấm mốc[21]

Các loại môi trường bán rắn là sự kết hợp của các thành phần lấy từ 2 nhóm (xem mục 2.1.2) theo các tỷ lệ khác nhau với độ ẩm (lượng nước bổ sung) chiếm khoảng 55% tổng khối lượng môi trường (phụ lục 1) Sau khi trộn đều các thành phần với nhau, môi trường được hấp khử trùng ở 1atm trong 40 phút

2.4 Phương pháp

2.4.1 Phương pháp bảo quản giống trên thạch nghiêng[5]

Giống vi sinh vật được bảo quản trên thạch nghiêng ở nhiệt độ lạnh Trong điều kiện lạnh, hệ enzyme bị ức chế, quá trình trao đổi chất giảm, nhờ đó duy trì sự ổn định mật độ bào tử của vi sinh vật trong thời gian dài Phương pháp này đơn giản, áp dụng cho nhiều loài vi sinh vật

Các chủng giống nghiên cứu được cấy chuyền trên các ống thạch nghiêng chứa

môi trường PGA và ủ 5 ngày (đối với các chủng Trichoderma) và 10 ngày (đối với các

chủng nấm bệnh) Sau đó giống được giữ trong điều kiện lạnh

2.4.2 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng sợi nấm[28]

Nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường PGA

Xác định tốc độ tăng trưởng đường kính trung bình (ALG, average linear growth) theo công thức:

ALG = (F3_ F1)/T (mm/ngày)

Trong đó:

F1: Đường kính khuẩn lạc trung bình sau 1 ngày nuôi cấy (mm)

F3: Đường kính khuẩn lạc trung bình sau 3 ngày nuôi cấy (mm)

T: Khoảng thời gian khác nhau giữa hai lần xác định đường kính (ngày), = 2 ngày

2.4.3 Phương pháp khảo sát tính đối kháng của Trichoderma đối với nấm bệnh trên môi trường PGA[7], [26]

2.4.3.1 Nguyên tắc

Chủng Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm bệnh khi chúng có thể ức

chế sự phát triển của khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa petri có chứa môi trường PGA Khuẩn lạc nấm bệnh thí nghiệm bị ức chế sẽ có đường kính nhỏ hơn đường kính

khuẩn lạc trên đĩa đối chứng (không có sự hiện diện của Trichoderma)

2.4.3.2 Cách tiến hành

Môi trường PGA được hấp khử trùng và rót vào các đĩa Petri đã vô trùng, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường

Cấy Trichoderma và nấm bệnh trên 2 điểm đối xứng nhau qua tâm đĩa petri;

Các điểm cấy cách mép đĩa 1,5cm.[13]

Hình 2.1: Hình minh họa vị trí cấy Trichoderma và nấm bệnh

Đĩa đối chứng là đĩa chỉ được cấy riêng nấm bệnh mà thôi

Ủ trong tối ở nhiệt độ phòng

2.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu xác định: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh tại thời gian thời gian khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng phát triển đến mép đối diện của đĩa

2.4.3.4 Cách xác định hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma đối với nấm

Sau khi tiến hành thử đối kháng, theo dõi các đĩa đã cấy cho đến khi hai vòng

tròn đối kháng của Trichoderma và nấm bệnh tiếp xúc nhau

Công thức tính hiệu quả ức chế theo Soytong (1988):

H = (Ddc – D)/Ddc*100 (%)

Trong đó:

H : Hiệu quả ức chế (%) D: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối kháng (cm)

Ddc: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình trên đĩa đối chứng (cm) Quy ước hiệu quả đối kháng như sau:

[_]: Không đối kháng [+]: Đối kháng kém (H < 50%) [++]: Đối kháng trung bình (H = 51-60%) [+++]: Đối kháng tốt (H = 61-75%)

[++++]: Đối kháng cực tốt (H > 75%)

Hình 2.2: Hình minh họa cho quy ước hiệu quả đối kháng 2.4.4 Phương pháp xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng phương pháp đo

2.4.4.1 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu[5]

Bào tử nấm mốc có kính thước tương đối lớn nên có thể quan sát trực tiếp dưới

kính hiển vi quang học (vật kính 10) Buồng đếm hồng cầu (gọi là buồng đếm

Neubauer) có 25 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ Thể tích mỗi ô nhỏ là 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3 Dịch bào tử được pha loãng trong nước muối sinh lý (0,85%), vortex đều rồi cho vào mao dẫn vào buồng đếm, quan sát dưới kính hiển vi ta có được

lượng bào tử trong từng ô lớn Ta chỉ đếm 5 ô lớn (4 ô ở góc và 1 ô ở giữa)

Cách tính mật độ bào tử: mỗi ô nhỏ có thể tích là 1/4000 mm3 và 1 ô lớn có thể tích là 1/25 mm3 hay 1/25 x 10-3 cm3 = 4 x 10-6 ml Từ đó ta suy ra công thức tính mật

độ bào tử:

S = 0,25*a*L*106 (bào tử/ml) Trong đó:

a: số bào tử bình quân trong 1 ô lớn S: lượng bào tử trong dịch huyền phù bào tử

L: số lần pha loãng dịch huyền phù bào tử 2.4.4.2 Phương pháp đo OD 660 nm[5]

Thực hiện pha loãng huyền phù bào tử nấm mốc bằng dung dịch NaCl 0,85% sao cho thu được các huyền phù có OD660 nm là: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 Dùng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ bào tử tương ứng với các huyền phù khác nhau (bào tử/ml) Vẽ đường cong tuyến tính giữa OD660 nm và lg của mật độ bào tử

Xác định mật độ bào tử có trong huyền phù (huyền phù X) Nếu trị số OD660nm nhận được nằm ngoài vùng tuyến tính giữa mật độ bào tử (bào tử/ml) và OD660nm , tiến hành pha loãng huyền phù này để có giá trị OD660nm nằm trong vùng tuyến tính Từ đó, suy ra được mật độ bào tử cần tìm Trong trường hợp có pha loãng thì mật độ bào tử cần tìm là mật độ bào tử suy ra từ đồ thị nhân với số lần pha loãng

2.4.5 Phương pháp nuôi cấy bán rắn để thu nhận bào tử[9]

Lấy 10ml dung dịch nước muối sinh lý 0,85% vô trùng để huyền phù bào tử trong ống giống được giữ trên môi trường thạch nghiêng Pha loãng huyền phù bào tử sao cho đạt được 105 bào tử/ml

Cấy 2ml huyền phù bào tử trên vào các erlen chứa 20g môi trường bán rắn (đã được hấp khử trùng) rồi đảo đều

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày Sau khi ủ, dùng NaCl 0,85% để chiết lấy bào

tử khỏi canh trường Lọc và pha loãng dịch bào tử cho phù hợp để đo OD đo được ở bước sóng 660nm nằm trong vùng từ 0,1  0,5 Dựa vào đường chuẩn ở mục 2.4.4 ta xác định được lượng bào tử có trong mỗi erlen (N)

2.5 Các phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp chọn chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các

nấm bệnh

Tiến hành xác định hiệu quả đối kháng của 8 chủng Trichoderma với 3 loài

nấm bệnh theo mục 2.4.4 Dựa vào hiệu quả đối kháng, chọn được các chủng

Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các nấm bệnh

2.5.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên quá trình tăng

sinh cấp một nấm Trichoderma trên môi trường bán rắn

2.5.2.1 Ảnh hưởng của từng loại cơ chất riêng lẻ

Nuôi cấy bán rắn riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc trên nhiều môi

trường chứa các loại cơ chất khác nhau ở mục 2.3.2 và phụ lục 1 Sau khi nuôi cấy 5 ngày và xác định được số lượng bào tử trong mỗi erlen, từ đó chọn được loại cơ chất

tốt nhất cho sự tăng sinh của nấm Trichoderma chọn lọc

2.5.2.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp các loại cơ chất[9]

Tiến hành nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc trong môi trường

có loại cơ chất thích hợp đã chọn ở mục 2.5.2.1 có bổ sung thêm các cơ chất khác nhóm (mục 2.1.2) Xác định lượng bào tử trong mỗi erlen sau khi nuôi cấy 5 ngày để chọn môi trường có chứa các thành phần kết hợp thích hợp

2.5.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm[9], [20]

Nuôi cấy riêng lẻ các chủng Trichoderma trên môi trường có các nguồn cơ chất

phối hợp thích hợp (mục 2.5.2.2) với độ ẩm môi trường thay đổi từ 45% đến 65% Độ

ẩm thích hợp được xác định là hàm lượng nước bổ sung (%) cho vào erlen mà ở đó lượng bào tử tạo thành nhiều nhất

2.5.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ các thành phần cơ chất trong môi trường nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc trên môi trường

có các thành phần thích hợp đã chọn được ở (mục 2.5.2.3) với tỷ lệ các thành phần khác nhau Dựa vào lượng bào tử đã được xác định trong mỗi erlen sau khi nuôi cấy 5 ngày, xác định tỷ lệ các thành phần cơ chất trong môi trường nuôi cấy thích hợp để tiếp tục nghiên cứu

2.5.2.5 Ảnh hưởng của sự bổ sung các dung dịch khoáng vi lượng[10], [18], [26]

Sau khi đã chọn lọc được môi trường thích hợp ở mục 2.5.2.4, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các dung dịch khoáng vi lượng bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Có 4 loại dung dịch khoáng: MS1, MS2, MS3 và MS4 (xem phụ lục 2) Loại dung dịch khoáng nào cho kết quả thu được lượng bào tử cao nhất sẽ được chọn để tiếp tục nghiên cứu

2.5.3 Phương pháp tăng sinh thu bào tử cấp hai nấm Trichoderma trên môi trường bán rắn[9]

Nuôi cấy tăng sinh cấp hai riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc ở các

điều kiện đã được xác định (mục 2.5.2) Canh trường sau khi ủ được đem đi xác định

số lượng bào tử và so sánh hiệu quả đối kháng của bào tử trong chế phẩm với bào tử

Trichoderma từ thạch nghiêng và bào tử cấp 1 Trichoderma

2.5.4 Phương pháp xác định tỷ lệ sử dụng của chế phẩm bào tử cấp hai trong phòng thí nghiệm[8], [20]

Xác định tỷ lệ sử dụng của các chế phẩm canh trường bào tử cấp hai của các

chủng Trichodema bằng cách cấy vào đĩa Petri chứa môi trường PGA sao cho mật độ bào tử Trichoderma đạt 1, 10, 102, 103, 104, 105, 106 và 107 bào tử/ml môi trường Sau

đó cấy chủng nấm bệnh đã xác định tương ứng (mục 2.5.1) vào giữ đĩa Petri Ủ các đĩa

ở nhiệt độ phòng cho đến khi khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng (đĩa không có

hiện diện của bào tử Trichoderma) phủ đầy khắp đĩa Petri Xác định đường kính khuẩn

lạc của nấm bệnh sau khi ủ và tính hiệu quả đối kháng của các chế phẩm ở những tỷ lệ

sử dụng trên theo mục 2.4.3