Nghiên Cứu Biến Đổi Sinh Học Đậu Hũ Bằng Bacillus Subtilis Dùng Trong Chế Biến Thực Phẩm

Phương pháp xác định thời gian tạo sinh khối tối đa trong môi trường sữa đậu nành .... Kết quả độ ẩm của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân .... Kết quả đạm tổng số của nguyên liệu v

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tp Hồ Chí Minh – 2009

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SINH HỌC ĐẬU HŨ BẰNG Bacillus

subtilis DÙNG TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS LÊ CHIẾN PHƯƠNG

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Mục lục iii

Danh sách các hình iv

Danh sách các bảng v

Danh sách đồ thị vi

Danh sách chữ viết tắt vii

Chương 1 Mở đầu 1

Chương 2 Tổng quan tài liệu 2

2 1 Giới thiệu về đậu tương 2

2 1 1 Phân loại đậu tương 2

2 1 2 Đặc điểm thực vật 2

2 1 3 Giá trị dinh dưỡng 2

2 1 4 Công dụng y học của đậu nành 5

2 1 5 Các sản phẩm về đậu nành 6

2 1 5 1 Đậu phụ 6

2 1 5 2 Chao 7

2 1 5 3 Tương 8

2 1 5 4 Miso 9

2 1 5 5 Natto 9

2 1 5 6 Tempeh 10

2 2 Giới thiệu về Bacillus subtilis 11

2 2 1 Đặc điểm của Bacillus subtilis 11

2 2 2 Phân bố trong tự nhiên 12

2 2 3 Tác hại 12

2 2 4 Lợi ích 13

2 2 4 1 Tạo kháng sinh 13

Chương 3 Vật liệu và phương pháp 15

3 1 Thời gian và địa điểm 15

3 2 Vật liệu 15

3 2 1 Nguyên liệu 15

3 2 2 Chủng vi sinh vật 16

3 2 3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 16

3 2 4 Môi trường dùng trong thực nghiệm 16

3 3 Phương pháp 17

3 3 1 Phương pháp nhuộm Gram 17

3 3 2 Phương pháp nhuộm bào tử 17

3 3 3 Phương pháp nhuộm tiêm mao 19

3 3 4 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng 19

3 3 5 Phương pháp xác định thời gian thế hệ 21

3 3 6 Phương pháp xác định thời gian sinh khối max trong môi trường CP lỏng 21

3 3 7 Phương pháp xác định thời gian tạo sinh khối tối đa trong môi trường sữa đậu nành 21

3 3 8 Phương pháp định tính enzyme 22

3 3 9 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase 22

3 3 10 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme protease 23

3 3 11 Phương pháp xác định độ ẩm 24

3 3 12 Phương pháp xác định hàm lượng đạm tổng số 25

3 3 13 Phương pháp định lượng đạm formol 27

3 3 14 Phương pháp định lượng đạm amoniac 28

3 3 15 Phương pháp định lượng đường tổng 29

3 3 16 Phương pháp định lượng đường khử 30

3 3 17 Phương pháp định lượng lipid thô 31

3 3 18 Phương pháp xác định chỉ số peroxyde 32

3 3 19 Phương pháp xây dựng quy trình chế biến thực phẩm từ đậu hũ thuỷ phân 33

Chương 4 Kết quả và thảo luận 34

4 1 Kết quả khảo sát nguồn giống 34

4 1 1 Hình thái đại thể và vi thể của Bacillus subtilis 34

4 1 3 Kết quả nhuộm bào tử 35

4 1 4 Kết quả nhuộm Gram 35

4 1 5 Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường CP lỏng 36

4 1 6 Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường sữa đậu nành 38

4 1 7 Kết quả xác định thời gian thế hệ 38

4 1 8 Kết quả định tính enzyme 39

4 1 9 Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase của Bacillus subtilis 40

4 1 10 Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease của Bacillus subtilis 41

4 2 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu của đậu hũ thuỷ phân 42

4 2 1 Độ ẩm 42

4 2 1 Đạm tổng số 43

4 2 2 Đạm formol 44

4 2 3 Đạm amoniac 45

4 2 4 Đường tổng 46

4 2 5 Đường khử 47

4 2 6 Lipid thô 48

4 2 7 Peroxyde 49

Chương 5 Kết luận và đề nghị 51

Phụ lục 52

Tài liệu tham khảo 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2 1 Cây đậu nành 2

Hình 2 2 Hình sản phẩm đậu hủ 7

Hình 2 3 Hình sản phẩm chao 8

Hình 2 4 Hình sản phẩm nước tương 8

Hình 2 5 Hình các loại Miso 9

Hình 2 6 Hình sản phẩm Natto 10

Hình 2 7 Hình sản phẩm tempeh 11

Hình 2 8 Hình ảnh của Bacillus subtilis 12

Hình 3 1 Hình đậu hũ Vina Tofu 15

Hình 3 2 Hình chai nước mắm Hưng Thịnh 15

Hình 3 3 Hình sữa đậu nành không đường 16

Hình 4 1 Hình thái đại thể và vi thể của Baccillus subtilis 34

Hình 4 2 Hình thái khuẩn lạc trong ống nghiệm giữ giống 34

Hình 4 3 Hình kết quả nhuộm bào tử 35

Hình 4 4 Hình kết quả nhuộm gram 35

Hình 4 5 Hình kết quả vòng phân giải tinh bột của Bacillus subtilis sau 3 ngày cấy39 Hình 4 6 Hình kết quả vòng phân giải casein của Bacillus subtilis sau 3 ngày cấy 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Thành phần acid amin trong protein đậu nành 4

Bảng 2 2 Thành phần khoáng trong đậu nành 4

Bảng 2 3 Thành phần vitamin của đậu nành 5

Bảng 4 1 Kết quả mật độ tế bào theo thời gian 36

Bảng 4 2 Kết quả OD610nm theo thời gian 37

Bảng 4 3 Kết quả mật độ tế bào theo thời gian trên môi trường sữa đậu nành 38

Bảng 4 4 Kết quả hoạt tính enzyme amylase của Bacillus subtilis theo thời gian 40

Bảng 4 5 Kết quả hoạt tính enzyme protease của Bacillus subtilis theo thời gian 41

Bảng 4 6 Kết quả độ ẩm của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 42

Bảng 4 7 Kết quả đạm tổng số của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 43

Bảng 4 8 Kết quả đạm formol của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 44

Bảng 4 9 Kết quả đạm amoniac của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 45

Bảng 4 10 Kết quả đường tổng của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 46

Bảng 4 11 Kết quả đường khử của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 47

Bảng 4 12 Kết quả lipid thô của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 48

Bảng 4 13 Kết quả peroxyde của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 49

Bảng 4 14 Bảng tổng kết kết quả các chỉ tiêu của đậu hũ thủy phân theo thời gian 50

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4 1 Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo CFU 36

Đồ thị 4 2 Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo OD610nm 37

Đồ thị 4 3 Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo CFU 38

Đồ thị 4 4 Đồ thị biễu diễn hoạt tính amylase của Bacillus subtilis theo thời gian 40

Đồ thị 4 5 Đồ thị biễu diễn hoạt tính protease của Bacillus subtilis theo thời gian 41

Đồ thị 4 6 Đồ thị biễu diễn độ ẩm của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 42

Đồ thị 4 7 Đồ thị biễu diễn % đạm tổng số của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 43

Đồ thị 4 8 Đồ thị biễu diễn đạm formol của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân44

Đồ thị 4 9 Đồ thị biễu diễn đạm amoniac của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 45

Đồ thị 4 10 Đồ thị biễu diễn đường tổng của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 46

Đồ thị 4 11 Đồ thị biễu diễn đường khử của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân47

Đồ thị 4 12 Đồ thị biễu diễn lipid thô của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 48

Đồ thị 4 13 Đồ thị biễu diễn peroxyde của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

LDL: Low-density lipoprotein

HDL: High-density lipoprotein

FDA: Food and Drug Administration

AOAC: Association of Analytical Communities

FAO: Food and Agriculture Organization

OD: Optical Density

Chương 1 MỞ ĐẦU

Từ rất xa xưa có thể từ hơn hai nghìn năm trước, đậu nành đã được sử dụng

dùng làm thực phẩm cho con người Theo thời gian các kỹ thuật chế biến đậu nành đã

trở nên tinh vi và phức tạp hơn, đã thực hành rộng rãi ở phương Đông và khu vực

Đông Nam Á hàng trăm năm nay Sản phẩm phổ biến nhất là đậu phụ (đậu hũ) Các

sản phẩm lên men từ đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao như nước chấm lên men,

tương, chao (Việt Nam), đậu phụ, sáng sáu, xì dầu (Trung Quốc), Natto, Miso, xoin

(Nhật), sữa đậu nành…Tuy nhiên ở nước ta đậu tương lại nằm trong nhóm sản phẩm

và dịch vụ có sức cạnh tranh thấp trong nền kinh tế quốc dân do các nguyên nhân:

 Ít có sản phẩm từ đậu nành có giá trị công nghiệp

 Các phụ phế phẩm ít được tận dụng

 Các sản phẩm được sản xuất với quy mô công nghiệp của đậu nành chỉ được dùng

với một lượng nhỏ trong khẩu phần ăn hàng ngày

Hầu hết các sản phẩm lên men từ đậu tương chủ yếu sử dụng nấm mốc, bên cạnh

đó có một vài sản phẩm từ vi khuẩn và việc sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis đã trở

thành những món ăn truyền thống của nhiều nước Châu Á như Natto của Nhật, thua

nao của Thái Lan… Tuy nhiên cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa phổ biến Vì các lý

do trên và vì tính độc đáo của Bacillus subtilis: hệ enzyme nhiều, phát triển mạnh trên

môi trường sữa đậu nành cho nên chúng tôi đã tuyển chọn chủng Bacillus subtilis và

nghiên cứu chế biến thực phẩm từ đậu hũ đã thủy phân bởi Bacillus subtilis nhằm tạo

ra một loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao đồng thời hỗ trợ tiêu hóa cho người sử

dụng

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2 1 Giới thiệu về đậu tương

2 1 1 Phân loại đậu tương

 Đậu nành có tên khoa học là Glycine max merrill, có đặc điểm phân loại khoa học như sau:

Giới: plantae Bộ: fabales Họ: fabaceae Phân họ: faboideae Chi: glycine Loài: G.max

2 1 2 Đặc điểm thực vật

 Đậu nành là cây thường niên, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim, phiến lá có hình oval Chùm hoa có cuốn ngắn, hoa màu tím hoặc màu trắng, quả thường cong và có lông Mỗi quả có ba hạt hình cầu hay hình tròn Vỏ hạt có màu từ vàng sáng cho đến nâu, đen, xanh Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau nhưng loại có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều nhất (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 2 1 Cây đậu nành

2 1 3 Giá trị dinh dưỡng

 Kể từ đầu thế kỷ 20, Hoa Kỳ đã tổ hợp các thực phẩm theo các thành phần dinh dưỡng và khuyến cáo người dân dựa theo đó mà thiết lập chương trình ăn uống cho có đầy đủ sức khỏe Khuyến cáo đầu tiên được ban hành vào năm 1916, chỉ dẫn lượng và

loại thực phẩm cần thiết đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho protein, chất béo, cacbohydrate, sinh tố và chất khoáng

 Thực phẩm thế kỷ 21 là thực phẩm có chứa các chất phytochemicals Trước khi trình bày về phytochemicals có trong đậu nành, ta nói sơ bộ về thành phần dinh dưỡng chính của đậu nành (Nguồn Dương Thanh Liêm, 2008)

 Protein

 Giá trị của protein trong bất kỳ thực phẩm nào cũng tùy thuộc vào hai yếu tố: lượng và phẩm Lượng protein được diễn tả bằng bách phân của trọng lượng thực phẩm, còn phẩm chất được xác định bởi hai yếu tố: khả năng tiêu hóa và đầy đủ thành phần acid amin thiết yếu Nếu thực phẩm nào hội đủ hai yếu tố này thì được đánh giá cao về phẩm

 Phần lớn thực phẩm của đậu nành đều thuộc loại dễ dàng tiêu hóa Đậu nành là loại đậu duy nhất hội tụ đủ 2 yếu tố này, có nghĩa là nó chứa đựng tất cả các loại thiết yếu cùng với hàm lượng cần thiết tương đương với protein động vật và được tiêu hóa dễ dàng

 Protein là những chuỗi phân tử dài được tạo thành bởi những phân tử nhỏ hơn gọi

là acid amin Những acid amin này là những khối kiến trúc của những bộ phận sống cần thiết để bão dưỡng các mô tế bào, xương cốt, răng, tóc, chiến đấu chống lại sự nhiễm trùng và đảm nhiệm vai trò quan trọng trong tiến trình chuyển hóa năng lượng Mặc dù có khoảng 20 loại acid amin nhưng trong số đó chỉ có khoảng 8 acid amin là không thể tự tạo từ cơ thể con người mà cần phải hấp thụ từ nguồn thực phẩm bên ngoài, 8 acid amin này là: trytophan, threonine, isoleucine, valine, lysine, methyonine, phenylalanine và leucine

 Cơ thể chúng ta cần tất cả 8 loại acid amin này để cho đồng bộ và điều chỉnh tỷ lệ phù hợp với nhau Nếu một trong 8 acid amin này thiếu, những thứ khác không thể tác hợp và vận hành được, có nghĩa là tất cả 8 loại acid amin phải được hấp thu vào trong

cơ thể cùng lúc để có thể làm việc điều hòa

 Đậu nành là nguồn giàu protein, cung cấp từ 35 – 38 % calo so với các loại rau, đậu khác

Bảng 2 1 Thành phần acid amin trong protein đậu nành

 Sinh tố và chất khoáng

 Đậu nành nhiều protein hơn bất cứ loại thực phẩm nào kể cả thịt động vật Ngoài

ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và sinh tố như vitamin B1, B2, B3, B6, niacine, canxi, sắt, kẽm…Đậu nành cũng chứa nhiều chất xơ

Bảng 2 2 Thành phần khoáng trong đậu nành

Bảng 2 3 Thành phần vitamin của đậu nành

Pantothenic acid 13 – 21.5 mg/g Vitamin B2 0.29 mg%

Folic acid 1.9 mg/g Vitamin PP 2.3 mg% (Nguồn: Dương Thanh Liêm, 2008)

2 1 4 Công dụng y học của đậu nành

 Như chúng ta đã biết đậu nành chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và

là nguồn cung cấp canxi, sắt, vitamin, chất xơ Các hợp chất isoflavon và các chất thảo

mộc khác trong đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau

tim, ung thư vú, tai biến mạch máu não, ung thư kết tràng (Theo Viện ung thư Quốc

Gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama Minesota Iowa và

Hensinki, Phần Lan) Những chất có trong đậu nành có tinh thảo dược gồm có:

protease inhibitor, sphytases, phytosterols, saponins, phenolic acid, lecithin, ω3 va

isoflavones (phytoestrogens)

 Protease inhibitors: vốn là chất kháng dinh dưỡng, có khả năng ngăn ngừa sự phát

triển của bệnh ung thư nhờ protease inhibitors có khả năng ngăn ngừa sự tác động của

một số gen di truyền gây nên chứng ung thư Bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi

trường xung quanh như tia nắng mặt trời và các chất ô nhiễm trong không khí Tuy

nhiên protease inhibitors bị giảm sau khi đậu nành được chế biến qua phương pháp

làm nóng

 Phytates: là hợp chất ngăn cản sự hấp thu canxi và sắt trong ruột Thông thường thì

những thực phẩm giàu phytates cũng thường có nhiều chất xơ và những thực phẩm

này bảo vệ chúng ta khỏi bị bệnh ung thư kết tràng

 Phenolic acid: là một antioxidant và phòng ngừa các nhiễm sắc thể DNA khỏi bị

tấn công bởi các tế bào ung thư

 Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa để bảo vệ cơ thể khỏi các tác hại của các gốc tự do Nó cũng có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng

và làm giảm lượng cholesterol trong máu

 Lecithin: là một hóa chất thực vật quan trọng, đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự biến dưỡng ở khắp các tế bào cơ thể, có khả năng cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương, và tăng cường sức đề kháng

 Phytosterol: phytosterol ngăn cản sự hấp thu cholesterol trong thức ăn vào máu và ngăn cản sự tái hấp thu cholesterol từ acid mật vào ống tiêu hóa, do đó làm giảm lượng cholesterol vào máu nên giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch

 Trong đậu nành có chứa chất insoflavones tương tự kích thích tố nữ estrogen Vì thế nó được mệnh danh là “estrogen thảo mộc” Nhiều nghiên cứu cho thấy, insoflavones của cây đậu nành có tác dụng ngăn ngừa các bệnh tim mạch

 Theo Lames W Anderson, một chuyên gia về bệnh nội tiết và dinh dưỡng, cho rằng chỉ cần trong chế độ ăn mỗi ngày 30g đậu nành là có thể làm cholesterol giảm 12%, LDL giảm 13%, HDL không thay đổi mấy Đó là do các amino acid có trong đậu nành đặc biệt là glycine và arginine Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn chứng minh rằng insoflavones đậu nành còn có tác dụng trong việc giảm bệnh ung thư và bệnh thận

 Do có nhiều hữu ích nên các chuyên gia dinh dưỡng khuyến cáo nên tiêu thụ nhiều các sản phẩm từ đậu nành trong khẩu phần ăn hàng ngày

(Nguồn: insoflavones-dau-nanh-htm)

2 1 5 Các sản phẩm từ đậu nành

2 1 5 1 Đậu phụ

 Đậu phụ là một sản phẩm được làm từ sữa đậu nành, được cho thêm tác nhân làm đông và ép thành miếng Là sản phẩm rất phổ biến ở các nước Châu Á đặc biệt là Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Đại Hàn…

 Tên chung: Soybean curd

 Tên Việt Nam: Đậu Phụ (đậu hủ)

 Đậu phụ là sản phẩm dễ tiêu hóa hơn đậu nành, được mệnh danh là thịt không xương ở Trung Quốc Có nhiều dạng đậu phụ khác nhau nhưng cơ bản được chia làm

 Loại cứng: là loại đậu phụ được ép hết nước trong quá trình chế biến

 Loại mềm: không ép nước hoặc ép nước rất nhẹ

 Loại đậu phụ lụa: mềm hơn loại đậu phụ mềm, được làm theo phương pháp khác hai loại kia (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 2 2 Hình sản phẩm đậu hủ

2 1 5 2 Chao

 Là sản phẩm được lên men từ đậu phụ và có hệ số tiêu hóa cao hơn đậu phụ Đó là

do quá trình lên men sinh ra nhiều amin, acid béo…dễ hấp thu

 Tên chung: Soya cheese

 Tên Việt Nam: Chao

 Các vi sinh vật trong chao là các loài nấm mốc: Actinormucor elegans,

M.Hiemalis, M.sivticus, M.Subtilis Các loài này có enzyme protease, lipase,

amylase….thủy phân cơ chất đậu hũ thành các chất dinh dưỡng có cấu tạo đơn giản,

dễ hấp thu vào cơ thể (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006)

 Các vi sinh vật dùng trong sản xuất tương thường thấy là các loại nấm mốc như:

Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillium motatum, các tài liệu nghiên cứu về

tương cho thấy rằng nấm mốc có ý nghĩa lớn nhất trong sản xuất tương là loại nấm

mốc A.oryzae (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 2 4 Hình sản phẩm nước tương

2 1 5 4 Miso

 Miso là sản phẩm lên men truyền thống từ Nhật Bản Hiện nay Nhật là nước sản xuất và tiêu thụ Miso nhiều nhất

 Có rất nhiều Miso khác nhau nhưng có 3 loại chủ yếu là Miso gạo, Miso đại mạch

và Miso đậu nành Tùy mỗi loại, tùy theo hương vị và màu sắc mà người ta lại chia thành nhiều loại khác nhau như Miso ngọt, Miso mặn, Miso trắng, Miso đỏ, Miso dinh dưỡng

 Tùy theo nguyên liệu sử dụng mà giá trị dinh dưỡng của mỗi loại khác nhau Miso đậu nành có hàm lượng protein và lipid cao hơn Miso gạo và Miso đại mạch Nhưng lượng đường khử lại thấp hơn Tất cả các loại Miso đều có chứa nhiều vitamin (B1, B2, niacin), và khoáng chất (Ca, P, Fe, Na, K)

 Các vi sinh vật dùng trong sản xuất Miso hầu hết thuộc các giống Aspergillus Loại nấm mốc khác đôi khi cũng được dùng như: Rhizopus (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng,

2006)

Hình 2 5 Hình các loại Miso

2 1 5 5 Natto

 Natto trong tiếng Nhật có nghĩa là đậu lên men Giống như Miso, Natto cũng là một loại thực phẩm lên men truyền thống của người Nhật Bản đã được lưu truyền từ rất nhiều đời

 Natto chia thành hai loại: Natto sợi và Natto muối Điểm khác biệt giữa hai loại này là Natto sợi sử dụng vi khuẩn để lên men, còn Natto muối sử dụng nấm mốc để lên men

 Natto là những hạt đậu nành đã luộc chín được ủ với enzyme (Bacillus Natto) ở

môi trường 40oC trong vòng 14 – 18 giờ để ủ men thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao và bền (chứa nhiều acid glutamic), có mùi nồng rất khó chịu với người không quen Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ nhớt càng cao thì chất lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 2 7 Hình sản phẩm tempeh

2 2 Giới thiệu về Bacillus subtilis

2 2 1 Đặc điểm của Bacillus subtilis

 Theo phân loại của Bergey Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae Fisher 1895, 139,

giống Bacillus, chủng Bacillus subtilis họ Bacillaceae có những đặc điểm sau:

 Trực khuẩn (tế bào hình que), không tạo chuỗi, có nội bào tử (nha bào) khác và tế bào dinh dưỡng bị sự khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu hơn, bền hơn đối với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác Bào tử có chứa acid dipicolinic (5 – 10% so với chất khô), được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài

 Phần lớn Gram (+), chuyển động nhờ tiêm mao vị trí bên cạnh hay xung quanh hoặc bất động Hiếu khí hay yếm khí tùy ý Thường tạo các trực khuẩn thẳng hoặc hầu như thẳng, 0.3 – 2.2 x 1.2 x 7.0 micro, phần lớn di động Tạo một bào tử bền nhiệt trong mỗi tế bào Dị dưỡng cần cacbon hữu cơ, trao đổi chất thuộc loại hô hấp tuyệt đối, lên men tuyệt đối hoặc vừa hô hấp lên men, sử dụng các cơ chất lên men khác nhau Nhân tố cuối cùng tách điện tử trao đổi chất hô hấp là oxy phân tử ở một số chủng được thay bằng nitrat Hiếu khí bắt buộc hoặc hiếu khí tùy ý Lượng G + X trong AND của các dòng được nghiên cứu từ 32 – 62 mol%

 Chủng đại diện là B subtilis (Ihrenberg) có một số đặc điểm sau:

 Là trực khuẩn Gram (+), hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính lại với nhau tạo thành chuỗi ngắn

 Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, về sau tiêm mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường

 Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ thành bào tử Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào nên vi khuẩn giữ nguyên hình dạng khi hình thành bào tử

Hình 2 8 Hình ảnh của Bacillus subtilis

2 2 2 Phân bố trong tự nhiên

 B subtilis có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ (cho

gia súc ăn) nên có tên gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”, chúng còn phân bố rộng rãi trên bề

mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó Trong bột mì B

subtilis chiếm khoảng 75 – 95% vi khuẩn tạo bào tử

 Người ta nhận thấy rằng vi khuẩn B subtilis có mặt khắp nơi và dường như có vai

trò đáng kể (mặt lợi cũng như mặt hại) trong quá trình biến đổi sinh học Các nguyên vật liệu dùng để sản xuất như bột mì, bột gạo, muối bột… tới các sản phẩm thực phẩm truyền thống như các loại nấm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao…

2 2 3 Tác hại

 Do có bào tử chịu nhiệt cao nên B subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm

hộp Đồ hộp lúc đó có mùi thối chua rất khó chịu không tạo hoặc gas trong môi trường

2 2 4 Lợi ích

2 2 4 1 Tạo kháng sinh

 Từ B subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh có ích đối với nhiều loại vi trùng

gây bệnh như: Subtilin (Humfeld và Feustel, 1943), Eumycin (Johnson và Burdon, 1946), Bacillin (Foster và Woodruff, 1946), Bacillomin (Shtikell và Poplavskii, 1955)

 Ngoài Subtilin, từ dịch nuôi cấy B subtilis còn có thể thu được nhiều kháng sinh

 Amylase B subtilis không có liên kết sulfihidrilvà có khả năng phân giải tinh bột

2 – 2.5 lần nhanh hơn so với α – amylase nấm mốc

 α – amylase của vi khuẩn B subtilis có tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có

mạch dài khoảng 6 – 8 glucose (G6, G7, G8) Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ sau:

 Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α – amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α –

amylase của Asp.Oryzae tới 25% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân

(Dell weg, Jonh, 1972)

 pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của α – amylase B subtilis là

từ 5.6 – 6.2

 Độ bền đối với tác dụng của acid kém hơn α – amylase của nấm mốc

 Trong dung dịch hồ tinh bột, α – amylase vi khuẩn chỉ bắt đầu bị vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 770C Ở 700C α – amylase của nấm mốc đã bị mất đi 50% hoạt lực

 α – amylase B subtilis có pH tối thích là 6.0, bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 4.0 và bị

vô hoạt một nửa ở pH = 8.0

 Sinh tổng hợp α – amylase ở B subtilis không có chất cảm ứng đặc hiệu

 Protease

 Các enzyme protease (peptid – hydrolase) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid trong các peptid hoặc protein

 B subtilis có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm (subtilzin)

 Protease do B subtilis tổng hợp ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao

phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh

vật có thể dễ dàng hấp thụ Đây là chức năng rõ ràng nhất của các protease ngoại bào

 Theo Otrosko và tập thể (1977) thì glucose, sacarose, mantose, fructose, socbit là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình tổng hợp protease ở B.Natto

var.amylolyquefaciens 795

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3 1 Thời gian và địa điểm

 Nguồn nguyên liệu dùng làm cơ chất thử nghiệm là đậu hũ Vina Tofu

Hình 3 1 Hình đậu hũ Vina Tofu

 Nước mắm Hưng Thịnh

Hình 3 2 Hình chai nước mắm Hưng Thịnh

 Sữa đậu nành không đường

Hình 3 3 Hình sữa đậu nành không đường

 Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân phân tích, …

3 2 4 Môi trường dùng trong thực nghiệm

 Môi trường giữ giống Bacillus subtilis.

 Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone)

 Môi trường nhân giống Bacillus subtilis

 Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone)

 Môi trường sữa đậu nành

 Môi trường định tính enzyme

 Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột để định tính enzyme amylase

 Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease

 Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram

 Nhỏ dung dịch Lugol, để 1 phút, thấm khô

 Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây (vi khuẩn từ canh lỏng tẩy 15 giây, vi khuẩn từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây) Rửa nước, thấm khô

 Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuchin kiềm loãng (hoặc Safranin O), để 1 phút, rửa nước thấm khô

 Quan sát bằng vật kính dầu độ phóng đại 100 lần

 Kết quả nếu là vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn Gram

âm bắt màu hồng Fuchin (Safranin O)

3 3 2 Phương pháp nhuộm bào tử [6]

 Nguyên tắc

 Khác với bào tử nấm sợi hay nấm mốc, bào tử vi khuẩn (nha bào) không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục Khi tế bào vi khuẩn

sống trong môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển do thiếu chất dinh dưỡng hay độ ẩm thấp thì bào tử được hình thành Nhưng khi môi trường trở nên thích hợp thì bào tử lại hồi sinh trở lại và tế bào lại có thể phân chia

 Bào tử rất khó nhuộm bởi đa số các thuốc nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu và chứa nhiều lipid Vì thế cần phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối với bào tử Tuy nhiên, đối với bất kì phương pháp nào thì tế bào được trước hết xử

lý bằng nhiệt hay acid để bào tử dễ bắt màu Sau đó nhuộm cả tế bào chất của cả vi khuẩn và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi rồi nhuộm nó với thuốc nhuộm phân biệt khác Đôi khi bào tử được nhìn thấy bên trong tế bào Hình thái của bào tử còn giúp nhận diện vi khuẩn Hình dáng và kích thước bào tử phụ thuộc vào vị trí của nó trong tế bào và kích thước bề ngang của tế bào mang nó Ở một số loài vi khuẩn, bào tử có thể tồn tại tự do vì các tế bào xung

quanh nó đã tan rã

 Thuốc nhuộm

Lục malachite và safranin

 Tiến hành

 Lấy một vòng vi khuẩn phết lên phiến kính, cố định trên ngọn lửa đèn cồn

 Thêm một ít nước vào cốc bese và đun sôi

 Đặt giá nhuộm lên cốc bese và đặt phiến kính lên nó

 Đặt nhẹ mẫu giấy thấm lên phiến kính nơi có vi khuẩn đã được cố định Nhỏ thuốc nhuộm lục Malachite lên miếng giấy lọc và hơ hơi nước trong vòng 5 phút Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khô

 Khử màu với nước trong 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính Các tế bào sinh dưỡng sẽ mất màu còn bào tử sẽ giữ lại màu

 Nhuộm lại với Safranin trong 30 giây rồi rửa nước trong 30 giây nữa, thấm khô

 Quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu vật kính 100 Bào tử có màu xanh còn tế bào sinh dưỡng có màu hồng

3 3 3 Phương pháp nhuộm tiêm mao [6]

 Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn rồi mới sử dụng

 Tiến hành

 Hoạt hoá vi khuẩn 2 – 3 lần trước khi tiến hành nhuộm

 Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18 – 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không khí

 Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần

 Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất

 Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước Nhuộm bằng dịch B trong 30 – 60 giây Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất

Cách thực hiện

 Thực hiện bằng kĩ thuật đỗ đĩa ở các nút thời gian 0h, 4h, 8h, …., 32h, 36h, 40h

 Pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán

 Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 30 – 300 khuẩn lạc trên đĩa

Tính kết quả

 Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di

được tính theo công thức là:

3 3 5 Phương pháp xác định thời gian thế hệ

n: số lần phân chia tế bào

B0: số lượng tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy

B1: số lượng tế bào sau thời gian nuôi cấy T1

Khoảng thời gian từ lúc bắt đầu phân chia T – T0

 Tiến hành

 Tiến hành đo OD ở bước sóng 610nm ở các nút thời gian 0h, 4h, 8h, …, 36h, 40h

 Dựa vào kết quả đo OD610nm ta xác định được thời gian tạo sinh khối max

3 3 7 Phương pháp xác định thời gian tạo sinh khối tối đa trong môi trường sữa đậu nành

 Vì trong môi trường sữa đậu nành không thể tiến hành đo OD được nên ta xác định thời gian tạo sinh khối tối đa bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

 Dựa vào kết quả mật độ tế bào theo thời gian ta xác định được sinh khối max

3 3 8 Phương pháp định tính enzyme [6]

 Nguyên tắc

 Khi cho các enzyme tác dụng với các hợp chất biopolymer trong môi trường thạch, các hợp chất này bị phân giải cho ra các hợp chất đơn giản hơn Có thể định tính hệ enzyme dựa trên vòng phân giải do các hợp chất đơn giản không có phản ứng màu với thuốc thử tạo ra

 Tiến hành

 Chuẩn bị các môi trường cảm ứng của các hệ enzyme cần định tính trong đĩa petri

 Dùng một vật có hình tròn, biết trước đường kính vòng tròn, đã được vô trùng, đục một vòng thạch trên đĩa petri, dùng pipet lấy một ít dịch vi khuẩn nhỏ lên vòng tròn 1 – 2 giọt dịch Gói đĩa lại, ủ ở nhiệt độ phòng trong ba ngày

3 3 9 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase [1]

 Nguyên tắc

 Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966) Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme có trong một gam mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy

sẽ phản ứng với iod và được đo màu bằng máy so màu quang học

1ml dung dịch đệm phosphat pH 6.2 1ml dung dịch đệm phosphat pH 6.2 1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch tinh bột 1%

0.5ml dung dịch NaCl 3% 0.5ml dung dịch NaCl 3%

1ml HCl 1N