Kiểm Tra Khả Năng Sinh Tổng Hợp Phytase Tái Tổ Hợp Của Nấm Men Pichia Pastoris GS115-Phyai

Để tạo ra một lượng lớn phytase có hoạt tính cao, ổn định, không gây độc tố, có khả năng áp dụng trong sản xuất công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phyta

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Phospho là nguyên tố thiết yếu cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của động vật Tuy nhiên, có khoảng 60-75% phospho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức

ăn của động vật tìm thấy ở dạng phytate (inositol hexaphosphat) hoặc acid phytic

(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphoric acid) Động vật dạ dày một ngăn như gia

cầm, lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong phytate vì chúng không có enzyme phytase trong đường ruột Do đó, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn để đáp ứng yêu cầu Ngoài ra, phospho ở dạng phytate trong thức ăn không được động vật hấp thu

sẽ bị đào thải trong phân và phospho dư thừa trong phân bị rửa trôi theo luồng nước thải gây ra sự phát triển nhanh chóng của tảo và có thể ảnh hưởng đến lượng oxy trong nước, làm cho cá chết

Phytase là một enzyme acid phosphohydrolase, xúc tác thủy phân acid phytic thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo-inositol phosphate Hoạt tính phytase trong vi sinh vật thường được tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc

Phytase được quan tâm cho những ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt giảm phytate trong thức ăn và nguyên liệu Bổ sung phytase vào nguyên liệu thức ăn chăn nuôi sẽ làm tăng giá trị sinh học của phosphate, giảm ô nhiễm phospho trong những vùng chăn nuôi tập trung Sự thủy phân acid phytic bằng enzyme sẽ không sinh ra những sản phẩm có độc tố Như vậy, khai thác enzyme trong công nghiệp sẽ thân thiện với môi trường và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển của những công nghệ mới

Tuy nhiên, khả năng ứng dụng enzyme này để thương mại hóa không được khả thi trong nhiều năm, do hoạt tính thấp và giá thành cao khi sản xuất phytase theo phương pháp lên men truyền thống Để tạo ra một lượng lớn phytase có hoạt tính cao,

ổn định, không gây độc tố, có khả năng áp dụng trong sản xuất công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phytase từ vi sinh vật vào vector biểu hiện và biến nạp vào hệ thống biểu hiện chủ

Trong những hệ thống biểu hiện thì Pichia pastoris được xem là có nhiều ưu thế

trong việc biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp với năng suất cao và có khả năng chịu nhiệt tốt Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục đích tối ưu hóa các điều kiện sinh

tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI

mã hóa cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

 Tối ưu hóa các điều kiện lên men cho quá trình sản xuất phytase tái tổ hợp:

 Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris

 Khảo sát nguồn cacbon và nồng độ glucose thích hợp

 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp

 So sánh khả năng lên men sản xuất phytase của nấm men Pichia pastoris

GS115 theo phương pháp nuôi cấy trên máy lắc và trong bình lên men có cánh khuấy

 Định lượng protein theo phương pháp Bradford

 Điện di SDS-PAGE của sản phẩm enzyme thu nhận

 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp của nấm men Pichia

pastoris GS115-phyAI

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ACID PHYTIC

2.1.1 Giới thiệu

Acid phytic là một acid hữu cơ có danh pháp quốc tế là myo-inositol

(1,2,3,4,5,6) hexakisphosphoric acid Muối của acid phytic đuợc gọi là phytate và được tìm thấy trong thực vật, động vật và đất Phytate thường tìm thấy trong các loại hạt, ngũ cốc và đậu chiếm khoảng 0,5-5% khối lượng hạt Nó thường được tìm thấy trong hạt dưới dạng muối Ca và Mg không tan (được gọi là phytin) Ở ngũ cốc và hạt

có dầu, phytate là dạng dự trữ phospho và inositol, nó chiếm 80% tổng lượng các hợp chất có chứa phospho trong hạt

Với cấu trúc ổn định, ở điều kiện thường acid phytic dễ dàng liên kết với Ca2+,

Mg2+, Fe2+ và Zn2+ Ngoài ra, acid phytic cũng có khả năng liên kết và hình thành các phức chất với các acid amin và protein, điều này gây cản trở và làm giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của người và động vật 1, 4

Hình 2.1 Acid phytic phức hợp tồn tại trong thực vật (Thompson, 1986 và

Kies, 1998) 2.1.2 Nguồn gốc trong tự nhiên

Phytic acid có thể được tìm thấy trong hầu hết các loại hạt, ngũ cốc và đậu Những nguồn giàu acid phytic nhất là cám lúa mì và hạt lanh (3%)

Phân bố của phytate trong hạt thay đổi tuỳ loài Khoảng 90% phytate trong hạt bắp nằm trong phần nhân của hạt Trong khi đó, ở lúa gạo và lúa mì, hầu hết phytate

ở lớp vỏ cám bên ngoài Trong hạt cây lấy dầu và hạt cây họ đậu, phytate thường ở

dạng kết hợp với các protein và được chứa trong các túi nhỏ nằm rải rác trong nhân hạt Ngược lại thì ở đậu nành, phytate không tập trung phân bố ở một vị trí nhất định Bên cạnh đó, hàm lượng phospho có trong đất cũng ảnh hưởng đến hàm lượng phytate có trong hạt Đất càng giàu phospho thì hàm lượng phytate trong hạt càng cao

Bảng 2.1 Hàm lượng phospho và phytate trong một số cây trồng 17

Nguồn

Hàm lượng phospho tổng

số (%)

Hàm lượng phospho trong phytate (%)

Tỷ lệ % phospho trong phytate so với hàm lượng phospho tổng

 Dạng cấu trúc tripyrophosphate bất đối xứng

 Dạng cấu trúc hexa-orthophosphate đối xứng 1

Hình 2.2 Acid phytic 21

2.1.3.2 Tính chất hoá học

Acid phytic có cấu trúc hoá học khá ổn định Do mang nhiều nhóm acid phosphoric nên nó tích điện âm cao và tồn tại trong phổ pH rộng

Vì tích điện âm nên acid phytic có thể gắn chặt với các cation kim loại như:

Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, K+, tạo thành các muối không tan Một cation kim loại có thể gắn với một hoặc nhiều nhóm phosphate có trong một phân tử phytate hoặc gắn với nhóm phosphate thuộc nhiều phân tử khác nhau

Muối phytate có thể tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo phức hợp với kim loại tùy thuộc vào pH và nồng độ ion của dung dịch Ở pH thấp, phytate có khả năng hòa tan tốt hơn khi ở pH cao Lý do là vì ở pH acid, phytate ở dạng không liên kết với ion kim loại do sự proton hoá của các nhóm acid phosphoric trong phân tử phytate Ngược lại ở pH trung tính, các nhóm phosphate của phytate bị khử proton nên tăng ái lực với các cation kim loại hoá trị hai Do đó, phytate hình thành phức hợp với các cation kim loại hoá trị hai, chủ yếu là Mg2+ và Ca2+

Các nhóm acid phosphoric của phytate còn có khả năng kết hợp với các nhóm mang điện tích dương của protein, amino acid, tinh bột, lipid

Tương tác của phytate với các protein phụ thuộc vào pH Ở giá trị pH dưới điểm đẳng điện của protein, các nhóm phosphate tích điện âm của phytate sẽ gắn chặt với các nhóm tích điện dương trên protein tạo phức hợp không tan Những phức hợp phytate-protein có thể bị phá vỡ do tác động cạnh tranh của các cation kim loại hoá trị 2 và 3

Ở giá trị pH nằm trên điểm đẳng điện của phytate và protein, cả protein và phytate đều tích điện âm Nhưng khi có sự hiện diện của các cation kim loại đa hoá trị, những phức hợp tan protein-cation kim loại-phytate có thể được tạo thành Những phức hợp này có thể bị phá vỡ bởi lực ion mạnh, pH cao (>10) 1, 18

 Chất khởi động quá trình nảy mầm của hạt

Trong cơ thể người và động vật, acid phytic giúp tăng cường quá trình điều hoà trao đổi chất, kích thích tạo máu, tăng vận chuyển hemoglobin oxygen và hỗ trợ quá trình hình thành mô xương 1

2.1.4.2 Tác động kháng dưỡng

Nhiều nghiên cứu cho thấy phytic acid trong thức ăn gia súc có ảnh hưởng kháng dưỡng mạnh vì một số lý do sau:

 Động vật dạ dày một ngăn thiếu enzyme phân giải phytate vì thế không thể

sử dụng phospho có trong phytate

 Vì nhóm acid phosphoric mang điện tích âm nên có thể gắn chặt với các cation như: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, K+, tạo thành các muối không tan làm ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ và tiêu hóa các chất khoáng này của động vật và làm giảm đi nguồn cung cấp sinh học các khoáng này

 Nhóm acid phosphoric của phytate cũng có thể gắn kết với các nhóm protein, amino acid, tinh bột và lipid có trong thức ăn làm giảm khả năng hoà tan của các chất này và ảnh hưởng lên khả năng tiêu hoá các chất này

 Các nhóm acid phosphoric cũng có thể gắn với các protein trong cơ thể như: amylase, pepsin, trypsin và acid phosphorylase để làm giảm hoạt tính của các enzyme này ảnh hưởng lên khả năng sử dụng chất dinh dưỡng 1, 4, 18

2.1.5 Các biện pháp giảm thiểu những tác động bất lợi của phytic acid

Để giải quyết những bất lợi gây ra bởi phytate trong chăn nuôi, nhiều phương pháp đã đề nghị:

 Ngâm hạt ngũ cốc trong nước trước khi cho ăn Đây là một biện pháp đơn

phytate, giải phóng phospho vô cơ Phương pháp này tương tự với phương pháp ngâm hạt giống để kích thích việc nảy mầm của hạt dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên phương pháp này tỏ ra không đáng tin cậy và không khả thi khi thực hiện trong qui mô chăn nuôi lớn

 Tạo dòng các loại ngũ cốc có hàm lượng enzyme phytase cao Phương pháp này được xem là có nhiều hứa hẹn Tuy nhiên còn đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu thêm

 Tạo dòng các loại ngũ cốc có hàm lượng acid phytic thấp nhờ đó giảm thiểu các tác động lên môi trường Tuy nhiên lại cần phải bổ sung thêm phospho vào trong thức ăn của vật nuôi Bên cạnh đó, hạt giống cần có acid phytic để nảy mầm và phát triển khỏe mạnh Nghiên cứu ở bắp cho thấy những hạt có hàm lượng acid phytic bằng 75% trung bình sẽ phát triển kém và cho năng suất chỉ bằng từ 5-15% sản lượng trung bình

 Tạo dòng các gia súc, gia cầm có khả năng tự tổng hợp phytase Một số nhà nghiên cứu ở Canada đã tạo giống lợn biến đổi gen Enviro có khả năng tự tổng hợp enzyme phytase ở tuyến nuớc bọt Giống lợn Enviro này có mang gen mã hoá cho

phytase được tạo dòng từ chủng E.coli không gây bệnh Thí nghiệm cho thấy lượng

phytate trong chất thải của lợn giảm đi 75% so với lợn bình thường Tuy nhiên việc đưa giống lợn này ra ứng dụng trong sản xuất vẫn còn nhiều khó khăn

 Một phương pháp khác là thêm enzyme phytase tái tổ hợp vào thức ăn Đây được xem là phương pháp phổ biến nhất hiện nay Việc bổ sung phytase vào thức ăn

sẽ giúp giải phóng phospho khỏi phytic acid, loại bỏ những ảnh hưởng kháng dưỡng của acid phytic, nhờ đó kích thích sự tăng trưởng của vật nuôi và không cần bổ sung thêm phospho vào thức ăn Giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất và giải quyết những tác động có hại lên môi trường Phytase thương mại thường được sản xuất nhờ lên

men các chủng Aspergillus niger, A.ficuum và A.oryzae Hiện nay nhiều nghiên cứu đang tập trung vào việc biểu hiện phytase bởi hệ thống biểu hiện Pichia pastoris và

đã thu được những thành công đáng kể 1, 15

2.2 ENZYME PHYTASE

2.2.1 Khái quát

Phytase (myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate phosphohydrolase) là một

enzyme phosphatase đặc hiệu cho phytate, xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối phytate, giải phóng acid phosphoric,

myo-inositol và các dẫn xuất của nó

Hiện nay, các nghiên cứu tập trung vào việc tạo dòng, sản xuất enzyme này ở mức độ thương mại, đặc biệt là các phytase có nguồn gốc vi sinh vật thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp 1

2.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase

1903 – Posternak: mô tả về acid phytic

1907 – Suzuki và cộng sự: mô tả và tách chiết phytase từ cám gạo

1911 – Dox và Golden: tìm được phytase trong Aspergilli

1913 – Plimmer và Anderson: xác định được các phức hợp phospho hữu cơ trong nguyên liệu thực vật

1914 – Anderson: xác định được cấu trúc của acid phytic

1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính phytase 1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử nghiệm thương mại hóa phytase

1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic

1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính phytase

Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A.ficuum và đã thu nhận gen phyA và

phyB có hiệu suất cao nhất so với các báo cáo trước đó, trong chủng có biến đổi

không phải do di truyền

1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A.niger NRRL

3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm lượng nhất định

1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía nam,

bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về phytase

1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino acid của

gen phyA thu nhận từ A niger NRRL 3135

1993 – Ehrlich và cộng sự: tạo dòng gen phyB, mã hóa cho enzyme acid phosphatase pH 6,0, từ A.niger NRRL 3135

1993 – Pen và cộng sự: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào trong tobacco

1994 – Ullah và cộng sự: tạo dòng gen, từ A.niger NRRL 3135, mã hóa cho

enzyme acid phosphatase pH 6,0

1993 – Beudeker và Pen: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào trong Canoda (Brassica napus) 1

2.2.3 Phân loại

2.2.3.1 Dựa trên vị trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động

Theo tổ chức Sinh hóa và Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB), tổ chức định danh sinh hóa (JCBN), enzyme phytase được phân thành hai nhóm chính dựa vào vị trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động:

 EC 3.1.3.8

Tên thường gọi: 3-phytase

Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 3-phosphohydrolase

Các tên khác: Phytase, phytate 3-phosphatase

Enzyme này phân giải nhóm phosphate của myo-inositol-hexakisphosphate ở vị trí D-3 trước tiên tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và

phosphate tự do

Phytase có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn thường thuộc nhóm này

 EC 3.1.3.26

Tên thường gọi: 6-phytase

Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 6-phosphohydrolase

Các tên khác: Phytase, phytate 6-phosphatase, 4-phytase

Enzyme này phân giải nhóm phosphate ở vị trí L-6 trước tiên tạo sản phẩm

1L-myo-inositol 1,2,3,4,5-pentakisphosphate và phosphate tự do, hoặc cũng có thể tác

động vào nối monophosphoester ở vị trí D-4 tạo sản phẩm 1D-myo-inositol

1,2,3,5,6-pentakisphosphate Do vậy enzyme này còn có tên gọi khác là 4-phytase

6-phytase có nguồn gốc từ thực vật 1, 5, 17

2.2.3.2 Dựa trên pH tối ưu

Phytase được chia làm 2 loại:

 Acid phytase: chủ yếu là các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật với pH tối ưu trong khoảng 4,5-6,0

 Alkaline phytase: chủ yếu là các enzyme có nguồn gốc thực vật như ở hạt, phấn hoa, và enzyme ruột chuột với khoảng pH tối ưu trên 6,5 5,16

2.2.4 Đặc điểm sinh lý và sinh hoá của enzyme phytase

2.2.4.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử

Hầu hết phytase được xác định là các enzyme đơn phân tử, như phytase từ vi

nấm, E.coli, Bacillus subtilis Tuy nhiên, phytase của một số động vật và thực vật

gồm nhiều tiểu đơn vị Như phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xem là một enzyme gồm hai tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa, phytase được tinh sạch từ ruột chuột có hai loại phytase kích thuớc 70 và 90 kDa Hầu hết phytase của vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm Theo kết quả nghiên cứu thực nghiệm, phytase của nấm có trọng lượng phân tử

khoảng 62-128 kDa Ở Aspergillus ficuum, phyA và phyAI có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 85-100 kDa và phyB có trọng lượng phân tử khoảng 62-68 kDa

mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu

Trong chế biến thức ăn gia súc, phytase cần phải có nhiệt độ tối ưu cao vì quá trình kết vón thực phẩm được thực hiện ở 80-100oC trong một vài giây

Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để làm tăng tính ổn nhiệt của phytase như thay thế proline và tạo cầu disulfite hoặc có thể dùng kỹ thuật sinh học phân tử để tạo dòng các phytase chịu nhiệt từ các nấm chịu nhiệt như

M.thermophila và T.thermophilus 1, 5, 6

2.2.4.3 pH

pH tối ưu của các loại phytase dao động từ 2,2-8

Hầu hết các phytase vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối

với phytase từ nấm mốc Tuy nhiên phytase từ nấm mốc A.fumigatus có phổ pH khá

rộng, từ 4,0-7,3

Phytase vi khuẩn có pH tối ưu tại 6,5-7,5, đặc biệt đối với giống Bacillus

Hầu hết các phytase từ nấm men có pH tối ưu trong khoảng 4-5 Tuy nhiên, giá trị pH tối ưu của các phytase nấm men còn tùy thuộc vào nhiệt độ

Các phytase nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0-7,5, đa số trong khoảng 4,0-5,6

Để ứng dụng được trong công nghiệp thức ăn gia súc, phytase phải có hoạt tính cao ở pH trong hệ thống tiêu hoá Các nhà khoa học đã tạo được đột biến điểm định hướng bằng cách thay thế Gly-277 và Tyr-282 của phytase chủng hoang dại

A.fumigatus bằng các gốc tương đương của phytase A.niger (Lys và His) tạo được

một phytase có sức chịu pH tốt hơn, tối ưu tại 2,8-3,4 1, 5, 6

2.2.4.4 Cơ chất

Phytase có cơ chất đặc trưng rộng: acid phytic, phytate và các chất có cấu trúc tương tự như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenylphosphate, fructose-1,6-bisphosphate, glucose-6-phosphate, α và β-glycerolphosphate, 3-phosphoglycerate

Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối với acid phytic như phytase Bacillus

(Powar và Jagannathan, 1982, Shimizu, 1992) và alkaline phytase từ phấn hoa lily (Barrientos và cộng sự, 1994) 1

Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase phân thành hai lớp, phytase với dãy cơ chất

đặc trưng rộng (ví dụ như A.fumigatus, M.thermophila, E.nidulans) và phytase chỉ đặc hiệu với acid phytic (như A.niger, A.terrus, E.coli)

Phytase có cơ chất rộng có hoạt độ đối với acid phytic thấp (23 tới 43 U/mg) Ngược lại, phytase có cơ chất đặc hiệu là acid phytic có hoạt độ cao hơn, 103-811 U/mg

Phytase có cơ chất rộng phân giải acid phytic thành myo-inositol monophosphat

và myo-inositol Trái lại, phytase có cơ chất hẹp đặc hiệu với myo-inositol phosphate, có hoạt tính thấp đối với myo-inositol-1-monophosphate, do vậy nó chỉ tạo thành sản phẩm myo-inositol tri hay bisphosphate 1, 5, 6

2.2.4.5 Đặc điểm xúc tác của enzyme phytase

Trung tâm hoạt động

Các enzyme nói chung khi xúc tác phản ứng, không phải toàn bộ enzyme tham gia mà chỉ có một bộ phận nhỏ của enzyme chịu trách nhiệm tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận này là nơi tập trung của một số nhóm chức được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Hoạt tính của phytase cũng do trung tâm hoạt động của nó quyết định

Trung tâm hoạt động của phytase (histidin acid phosphatase) là một đoạn trình

tự acid amin được ký hiệu là: RHGXRXP ( gần đầu N-terminus), trong đó:[24]

R: Arginine H: Histidin G: Glycin P: Prolin X: acid amin bất kỳ

Trình tự này được bảo tồn trong phytase của nấm mốc và vi khuẩn E.coli Phân

tử của phytase nấm mốc và E.coli còn có một vùng bảo tồn gần đầu C, motif HD (H:

histidin, D: acid aspartic) Phytase có cả hai vùng này thường có khối lượng phân tử lớn

Phytase tấn công vào nhóm phosphate đầu tiên và phân giải liên kết

monophosphoester, giải phóng phospho vô cơ và myo-inositol-pentakisphosphate

Sau đó, năm nhóm phosphate còn lại tiếp tục được giải phóng khỏi phytate nhờ phytase hoặc những enzyme phosphatase không đặc hiệu khác vốn hiện diện với số lượng lớn trong đường tiêu hóa 1,5

+ H 2 O

+

2.2.4.6 Khả năng chịu nhiệt

Enzyme thường được dùng như nguồn bổ sung vào thức ăn gia súc nên thường phải chịu được nhiệt độ từ 80-100oC, đây là nhiệt độ có thể đạt tới trong suốt quá trình kết vón thực phẩm

Phytase là một enzyme ổn nhiệt và có thể hoạt động trên nhiều cơ chất khác

nhau Phytase từ A.fumigatus có khả năng ổn nhiệt rất cao, có thể chịu được nhiệt độ

lên đến 100oC trong 20 phút mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu

Khả năng hồi tính sau khi bị biến tính bởi nhiệt của các loại phytase cũng khác nhau Sau khi bị biến tính ở 90oC, phytase từ A.fumigatus phục hồi lại nguyên vẹn cấu trúc ban đầu và phục hồi hoàn toàn hoạt tính Trong khi đó, phytase từ A.niger bị

biến đổi cấu trúc một cách không thuận nghịch, khi ủ ở 55-90oC thì mất 70-80% hoạt

tính 1, 5, 6

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase

2.2.5.1 Ion kim loại

Các kim loại được xem là các tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ phytase Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ của enzyme phải xem xét trên từng đối tượng cụ thể Một ion kim loại có thể là các tác nhân làm giảm hoạt độ đối với enzyme phytase này nhưng có thể là yếu tố tăng hoạt độ đối với enzyme phytase khác Các ion kim loại Zn2+, Cu2+ và Al3+ được chứng minh là có khả năng ức chế

hoạt động phytase của Enterobacter sp Trong khi đó Zn2+ và Fe2+ được xem là có

tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme phytase ở chuột 1, 5

2.2.5.2 Nồng độ cơ chất

Nồng độ cơ chất cao, sự tích tụ nhóm phosphate có thể ảnh hưởng vào trung tâm xúc tác của enzyme Điều này làm ức chế sự chuyển đổi phức hợp enzyme-cơ chất thành enzyme và sản phẩm

Nồng độ cơ chất khoảng 300 mol ức chế các enzyme của Paramecium Phytase của Rhizopus cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chất cao Phytase nấm mốc bị

ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1 mM 1, 6

2.2.5.3 Cạnh tranh bởi các chất có cấu tạo tương tự cơ chất

Một số chất có cấu tạo tương tự cơ chất có thể trở thành tác nhân ức chế Ví dụ

myo-inositol hexasulfate có khả năng ức chế enzyme phytase của Aspergillus ficuum

do có cấu trúc tương tự phytate 1, 5

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase

2.2.6.1 Các yếu tố vật lý

Các tham số vật lý có ảnh hưởng mạnh nhất đến sự tăng trưởng và sự tổng hợp các sản phẩm biến dưỡng của các vi sinh vật là pH, nhiệt độ, sự khuấy trộn, lượng oxy hoà tan và áp suất

Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp phytase đối với hầu hết các vi sinh vật nằm trong khoảng từ 25-37oC

Giá trị pH có ý nghĩa lớn đối với quá trình sản xuất phytase Giá trị pH tối ưu cho hầu hết các vi khuẩn và nấm mốc nằm trong khoảng giữa 5,0 đến 7,0

Trong lên men chìm, sự khuấy trộn và thông khí rất quan trọng để giữ các thành phần môi trường, tế bào vi sinh vật và hàm lượng oxy phân bố đồng đều

2.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng

Sodium phytate cũng có thể được dùng như nguồn cacbon duy nhất cho sản

xuất phytase, ví dụ chủng Klebsiella aerogenes, Arxula adeninivorans 2

Các chủng vi sinh vật đều có nguốn nitơ ưa thích khác nhau Chủng Aerobacter

aerogenes dùng pepton (1%), chủng K.oxytoca dùng dịch chiết nấm men (1%) 2

c) Các nguyên tố vi lượng và vitamin

Bên cạnh các nguồn C và N, một vài vi sinh vật cần các nguyên tố vi lượng và các vitamin để tăng trưởng và sản xuất enzyme Đối với sản xuất phytase bởi nấm men, môi trường nuôi cấy cần các vitamin và nguyên tố vi lượng Tuy nhiên một số

nấm như A.niger, A.ficuum không cần nguyên tố vi lượng trong lên men sản xuất

bò Tuy nhiên, phytase trong hệ ruột động vật không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hoá phytate

Phytase từ ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase từ ruột chuột

và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hoá phytate Phytate được tiêu hoá trong hệ ruột của người nhờ lượng phytase có trong thực phẩm

Động vật nhai lại tiêu hoá được phytate nhờ hoạt động của phytase được sản xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ Lượng photphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt

động của phytase lên phytate được cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng

5, 15

2.2.7.3 Phytase từ vi sinh vật

Đối với vi khuẩn, phytase được tổng hợp cả ở vi khuẩn gram dương và gram

âm Phytase từ các vi khuẩn gram âm là các protein nội bào, trong khi phytase từ các

vi khuẩn gram dương là các protein ngoại bào

Đối với nấm mốc, hầu hết các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergillus,

Penicillium, Rhizopus đều sản xuất phytase ngoại bào có hoạt tính.Trong đó Aspergillus ficuum được xem là một trong những chủng có khả năng sản xuất

phytase có hoạt tính cao

Đối với nấm men, phytase ngoại bào được tìm thấy trong Schwanniomyces

castellii, Arxula adeniivorans, Saccharomyces cerevisae, Candida tropicalis,

Kluyveromyces fragilis

Chủng nấm men Arxula adeniivorans được xem là một trong những chủng nấm

men hiếm có vì khả năng đồng hoá phytate như là nguồn cacbon và photphate duy nhất Phytase từ nấm men có sự đặc hiệu cơ chất rộng, ổn nhiệt và bền trong acid

So với phytase thực vật, phytase vi sinh vật có hoạt tính cao hơn Hoạt tính phytase thực vật giảm đáng kể ở pH vượt khỏi khoảng từ 4,0-7,5, trong khi phần lớn các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật chịu được ở pH trên 8,0 và dưới 3,0 5, 15

2.2.8 Tổng quan về chuyển gen mã hóa phytase

Mặc dù tác dụng phân giải phytate của phytase đã được phát hiện cách đây khoảng 30 năm (Nelson và cs., 1971), nhưng khả năng ứng dụng thương mại hóa phytase không được khả thi trong nhiều năm, do hiệu quả hoạt tính thấp và giá thành cao khi áp dụng sản xuất phytase theo phương pháp lên men cổ truyền Với sự phát triển của kĩ thuật DNA tái tổ hợp, thông qua hệ thống biểu hiện protein ngoại lai của các chủng vi sinh vật khác nhau đã tạo ra một lượng lớn enzyme phytase có hoạt tính cao, do đó giảm giá thành sản xuất, mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội

so với việc thu nhận từ các nguồn vi sinh vật ban đầu Đồng thời, việc áp dụng công nghệ mới này có thể dễ dàng kiểm soát mức độ sinh enzyme phytase, không sinh độc

tố tạo thực phẩm an toàn cho động vật Nhiều vi sinh vật khác nhau được nghiên cứu

sử dụng làm chủng chủ biểu hiện gen phytase bao gồm cả vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, tế bào động vật 2

2.2.8.1 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong vi khuẩn

Gen mã hóa phytase được biểu hiện trong nhiều chủng vi khuẩn như: Bacillus

subtilis, B.alkalophilus, B.amyloliquefaciens, B.coagulans, B.circulans, B.Lautus, B.Thuringiensis, E.coli, Lactobacillus plantarum,

a) Trong vi khuẩn E coli

Gen phyC biểu hiện trong chủng E.coli XL-Blue MRS (vector biểu hiện pBsm)

sinh phytase nội bào do hình thành thể bao ngoài Đồng thời trình tự peptid tín hiệu

phyC tự nhiên không có chức năng tiết phytase trực tiếp vào môi trường nuôi E.coli

XL-Blue MRS Để giải quyết vấn đề này, một chiến lược được tạo dòng khác đã được lựa chọn Một đoạn gen mã hóa phytase không có trình tự tiết tự nhiên được

tạo dòng sau trình tự tín hiệu phân giải pectate từ Erwinia carotoyora dưới sự điều khiển của promoter tac Cấu trúc này có khả năng biểu hiện phytase có hoạt tính trong môi trường nuôi E coli RV308 ở nồng độ khoảng 80 mg/l Tuy nhiên, E.coli là

một prokaryote và thiếu các bào quan nội bào hiện diện trong tế bào eukaryote như:

ti thể, bộ máy golgi, lưới nội chất, , những bào quan này giữ chức năng biến đổi

protein thành sản phẩm có chức năng Đồng thời vì E.coli có khả năng sản xuất

nhiều enzyme khác nhau nên khó thu hồi và tinh sạch enzyme phyatse 2

b) Trong Lactobacillus plantarum

Gen mã hóa phytase được biểu hiện trong chủng Lactobacillus plantarum 755 Gen phyC không chứa trình tự tín hiệu của nó được tạo dòng trong plasmid pLPM11

để thu được vector biểu hiện phytase pLPM/phyC Tuy nhiên, một số thí nghiệm đã

chỉ ra rằng phytase tái tổ hợp được tiết ở mức độ thấp so với protein tiết tự nhiên ở

Lactobacillus plantarum 755 (2 mg/l) Hơn nữa, sự acid hóa của môi trường do kết

quả của sự lên men acid lactic sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme phytase 2

2.2.8.2 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm mốc

Gen phyA mã hóa phytase ngoại bào từ nấm mốc chịu nhiệt Thermomyces

lanuginosus được gắn chèn và biểu hiện trong vector dưới sự điều khiển phiên mã

của promoter gen mã hóa trypsin của Fusarium oxysporum và sử dụng để biến nạp

hoạt tính chịu nhiệt ở 75oC và hiệu quả phân giải cao hơn phyatse của nấm mốc ở

65oC (Berka và cs., 1998) Gen phyA mã hóa cho phytase chịu nhiệt từ A.fumigatus được tạo dòng và biểu hiện vượt mức trong nấm mốc A.niger (Pasamontes và cs.,

1997)

Tuy nhiên, do nấm mốc có nhiều nguy cơ sinh độc tố mycotocin như: aflatoxin, trichothecenes, deoxynivalenol, vomitoxin, ochratoxin, Các loại độc tố này có thể gây ngộ độc do tác động đến hệ thần kinh, hệ tiêu hóa làm rối loạn chức năng, đặc biệt gây ung thư gan, nguy hiểm cho vật nuôi và con người, nên nhiều nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện gen mã hóa phytase trên các chủng vi sinh vật an toàn cho thực phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc 2

2.2.8.3 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm men

Gen mã hóa enzyme phytase của A.fumigatus được biểu hiện hiệu quả trong

Pichia pastoris Đoạn DNA 1,4 kb có chứa vùng gen mã hóa gen phytase được gắn

chèn vào vector biểu hiện pPICZαA và biểu hiện trong Pichia pastoris như một

phytase ngoại bào hoạt động Enzyme này có nhiệt độ, pH tối ưu, trọng lượng phân

tử và khả năng gắn nhóm đường tương tự như phytase từ chủng A.fumigatus Điều

đó kết luận rằng Pichia pastoris là một chủng chủ có tiềm năng biểu hiện phytase

A.fumigatus ở mức độ cao (Rodrigues và cs., 2000) Chủng tái tổ hợp Hansenula polymorpha sinh phytase hiệu quả vì so với quá trình sử dụng glycerol, sử dụng

glucose sẽ dẫn đến giảm 80% giá thành Thêm vào đó, nồng độ đặc biệt cao của enzyme có hoạt tính (> 13,5 g/l) thu được từ môi trường, với lượng enzyme phytase thu nhận trên 97% so với lượng tổng protein thu nhận (Mayer và cs., 1999) 2

2.2.8.4 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong thực vật

Phytase cũng được phát triển sản xuất trong công nghệ sinh học thực vật, sử dụng kĩ thuật chuyển gen ở thực vật để ứng dụng trong lĩnh vực y dược và sản xuất enzyme trong công nghiệp Tạo thực vật chuyển gen với việc tăng cường mức độ biểu hiện của 3-phytase bằng cách sử dụng vector biểu hiện chứa gen mã hóa phytase từ nấm được biến nạp vào thực vật chủ Tốt nhất là thu nhận gen mã hóa

phytase từ A.niger, A.awamorii, và A.nidulans, A.ficuum (Brocades, 1991) Gen

phyA từ A.ficuum mã hóa phytase có chiều dài 441 amino acid được biểu hiện trong

lá của cây thuốc lá Nicotiana tabacum (Ullah và cs., 1999)

Các ứng dụng khác của công nghệ sinh học trong thực vật để giảm sự cần thiết của phytase bởi lượng phytate thấp có trong cây ngũ cốc hay thức ăn Giống bắp với hàm lượng thấp acid phytic cũng đã được sản xuất Đậu nành chuyển gen mã hóa phytase từ nấm mốc và do đó sẽ loại bỏ hay giảm sự cần thiết bổ sung thức ăn với phytase Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu thành công biểu hiện gen mã hóa phytase

từ A.niger NRRL 3135 trong đậu nành Phytase tái tổ hợp có trọng lượng phân tử

thấp hơn phytase của nấm, nhưng khả năng chịu nhiệt và pH tối ưu hầu như không thay đổi 2

2.2.8.5 Biểu hiện gen mã hóa phytase trong động vật

Trong tương lai, gia cầm và lợn chuyển gen có thể sản xuất phytase trong đường tiêu hóa của chúng Một vài nghiên cứu đã tiến hành biến nạp và biểu hiện gen mã hóa phytase từ nấm mốc trong động vật (Mullaney và cs., 2000) Hiện nay

chuột chuyển gen cũng đã được phát triển biểu hiện gen phytase appA từ E.coli điều

hòa biểu hiện trong tuyến nước bọt Sự biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt của động vật làm giảm 11% lượng photpho trong phân (Golovan và cs., 2001) 2

2.2.9 Một số ứng dụng của enzyme phytase

2.2.9.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Thức ăn gia súc thường có nguồn gốc thực vật Khoảng 2/3 hàm lượng photpho trong thức ăn gia súc có nguồn gốc thực vật là acid phytic hiện diện dưới dạng phytate Phytate liên kết với các ion có giá trị dinh dưỡng cao, vì thế hạn chế giá trị dinh dưỡng của các ion này

Động vật nhai lại tiêu hoá phytate thông qua hoạt động của enzyme phytase tiết

ra từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ Phosphate vô cơ được giải phóng từ phytate bởi phytase được cả hệ vi sinh vật dạ cỏ và động vật chủ sử dụng Tuy nhiên, các động vật có dạ dày một ngăn như lợn, gia cầm và cá lại không thể biến dưỡng acid phytic

vì chúng thiếu phytase ở hệ ruột và dạ dày Do đó, người ta thêm phosphate vô cơ, bột đậu nành và các loại bột có hàm lượng phospho tổng cao vào thức ăn gia súc để đáp ứng nhu cầu phosphate của cơ thể động vật Việc này làm tăng chi phí cho các nhà chăn nuôi gia súc và tăng ô nhiễm phospho cho môi trường Các vấn đề này có thể giải quyết bằng cách bổ sung phytase vi sinh vật vào thức ăn gia súc hoặc dùng

Wodzinski và Ullah (1996) đã đưa ra con số thống kê rằng nếu dùng phytase để

bổ sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ thì lượng phospho được giải phóng ra sẽ tương ứng với 168 triệu USD và sẽ giảm được 8,23x104 tấn phospho thải

ra môi trường mỗi năm Cục Quản Lý Thuốc và Thực Phẩm (FDA-The Food and Drug Administration) đã công nhận chế phẩm phytase đạt tiêu chuẩn GRAS (Generally Regarded As Safe) 1, 7, 9, 15

2.2.9.2 Trong công nghiệp thực phẩm

Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến thực phẩm Điều này dẫn đến một lượng lớn phytate được tiêu thụ vào trong cơ thể con người Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp thụ kẽm, canxi, magiê và sắt Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hoá Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có một ý nghĩa lớn

Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến bột mì để làm giảm lượng acid phytic trong các loại bánh dùng bột mì Phytase thích hợp cho quá trình này cần có

pH tối ưu ở 4,5-5, nhiệt độ tối ưu 30oC 1, 7, 9, 15

2.2.9.3 Trong tổng hợp myo-inositol phosphate

Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay Trong nghiên cứu, Svàberg (1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5)

cótác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt Thêm 10 mg phospho như IP5 làm giảm sự hấp thu sắt đến 39% IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được cho cùng với IP5 và IP6 Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu, nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3

Mặt khác, các ester myo- inositol có ít phospho (mono, bis, tris, và

tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật (Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996, Krystofova, 1994) 1

Các phosphate inositol có thể tổng hợp hóa học hoặc tổng hợp bằng enzyme Tuy nhiên, cơ chế tổng hợp hóa học của inositol phosphate (Billington, 1993) phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao Trái lại, tổng hợp bằng enzyme phytase thực hiện trong điều kiện ôn hòa, có hiệu quả lớn trong việc sản xuất Siren (1986) sản

xuất thành công D-myo-inositol 1,2,6 trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5 trisphosphate, L-myo-1,3,4 trisphosphate, và myo-inositol-1,2,3 trisphosphate với sự trợ giúp của phytase có nguồn gốc từ S.cerevisiae Tương tự, phytase phân lập từ A

thuộc vào lượng enzyme (Dvorakova, 2000) 7, 9, 15

2.2.9.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong chế biến giấy và bột giấy, các nguyên liệu được dùng có nguồn gốc từ thực vật có hàm lượng acid phytic khá cao, do đó góp phần làm tăng ô nhiễm phospho cho môi trường Các phytase chịu nhiệt được dùng để phân hủy acid phytic trong nguyên liệu giúp tránh được việc tạo các sản phẩm phụ độc hại, có khả năng gây ung thư và là một biện pháp “thân thiện môi trường”  9, 15

2.3 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS

2.3.1 Giới thiệu chung về nấm men Pichia pastoris

Được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1970, ban đầu những nghiên cứu về

Pichia pastoris cũng như một số chủng nấm men sử dụng methanol khác chủ yếu tập

trung vào lĩnh vực sản xuất protein đơn bào từ các chủng nấm men sử dụng methanol này đã không được đưa vào thực tiễn

Cho đến đầu những năm 1980, Pichia pastoris được phát triển thành một hệ

thống nhằm biểu hiện protein tái tổ hợp Từ đó, những nghiên cứu về việc biểu hiện

các protein tái tổ hợp sử dụng hệ thống Pichia pastoris gia tăng nhanh chóng

Về mặt phân loại học, Pichia pastoris có hệ thống phân loại như sau:

Loài : Pichia pastoris

Hình 2.5 Tế bào nấm men Pichia

pastoris 21

Hệ thống Pichia pastoris đã được biến đổi thông qua kĩ thuật di truyền, nó đã

trở thành hệ thống biểu hiện chủ thành công cho việc sản xuất đa dạng các protein tái

tổ hợp trong tự nhiên 11, 14

2.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris

Những yếu tố góp phần giúp cho hệ thống biểu hiên bằng Pichia pastoris ngày

càng được ứng dụng rộng rãi gồm có:

 Các thao tác kĩ thuật sinh học phân tử đơn giản, tương tự như các bước tiến

hành đối với S.cerevisiae Thêm vào đó, phân loại di truyền sử dụng cho

Saccharomyces cũng được áp dụng cho Pichia pastoris Hơn nữa, nếu như tế bào S.cerevisiae ở dạng đơn bội không ổn định, nhanh chóng giao phối để trở thành dạng

lưỡng bội, thì tế bào Pichia pastoris hầu hết ổn định ở trạng thái đơn bội, đó là một

thuận lợi lớn trong việc phân lập kiểu hình đột biến

 Mật độ sinh khối tế bào Pichia pastoris cao, có thể cao gấp 10 lần so với

S.cerevisiae, môi trường nuôi không đòi hỏi bổ sung nhân tố tăng trưởng gây tốn

kém và khó tinh sạch protein, mức độ biểu hiện tăng gấp 10-100 lần so với

S.cerevisiae

Hình 2.6 So sánh khả năng tạo sinh khối giữa Pichia pastoris và

Saccharomyces cerevisiae 14

 Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực

hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú

 Pichia pastoris bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó Do đó, nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ dàng tinh sạch Pichia pastoris

đã được chứng minh là sinh vật an toàn, hầu như không tạo ra độc tố

 Ngoài ra hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris còn có promoter mạnh như

là AOX1 Gen được điều khiển bởi các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen của Pichia pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao với hàm lượng lên đến vài g/l Trong đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì

khả năng cảm ứng bằng methanol

khác như khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như: xử lý phân cắt protein, gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide và gắn gốc đường để tạo protein hoạt động Đây là một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện bằng prokaryote không có được Hiện nay đã có hơn 300 protein từ rất nhiều nguồn khác nhau được biểu hiện

thành công ở Pichia pastoris Bên cạnh đó, các nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ hợp khác bằng hệ thống Pichia pastoris cũng tăng lên từng ngày 1, 14

Saccharomyces cerevisiae

Pichia pastoris

Bảng 2.2 Một số protein đã biểu hiện thành công ở Pichia pastoris 11

Protein Mức độ biểu

hiện (g/l)

Kiểu hình chủng biểu hiện Dạng biểu hiện Kháng nguyên bề mặt

s

Nội bào

Albumin của người 4,0 Mut+, Muts Tiết ra môi trường

Carboxypeptidase B 0,8 Mut+, Muts Tiết ra môi trường

2.3.3 Cơ chế cảm ứng bằng methanol

Pichia pastoris là một trong khoảng 12 loài nấm men thuộc 4 giống có khả

năng chuyển hoá methanol Các giống khác là Candida, Hansenula, Torulopsis

Pichia pastoris có khả năng sử dụng methanol như một nguồn cacbon và năng

lượng duy nhất Những nghiên cứu sinh hóa cho thấy việc sử dụng methanol cần một con đường chuyển hóa liên quan đến một vài enzyme Alcohol oxidase (AOX) là enzyme đầu tiên và là enzyme chính trong con đường biến dưỡng methanol, có vai trò xúc tác sự oxy hóa methanol tạo formaldehyde và hydrogen peroxide (H2O2) Catalase hiện diện trong peroxisome cùng với AOX sẽ chuyển hóa hydrogen peroxide thành O2 và H2O Một phần formaldehyde sinh ra bởi AOX rời peroxisome vào tế bào chất và bị oxy hóa thành acid formic và CO2 nhờ formaldehyde dehydrogenase và formate hydrogenase Những phản ứng này là cơ sở sinh hóa biến dưỡng methanol tạo năng lượng cho tế bào phát triển

Theo con đường đồng hóa, formaldehyde còn lại trong peroxisome sẽ phản ứng với xylulose-5-phosphate, được xúc tác bởi dihydroxyacetone synthase (DAS), tạo ra hai phân tử là dihydroxyacetone và glyceraldehyde-3-phosphat Những hợp chất này sau đó được chuyển hóa trong tế bào chất, tái tạo xylulose-5-phosphate Trong số này, 1/3 số phân tử glyceraldehyde-3-phosphate sinh ra được chuyển hóa và tạo sinh khối tế bào

Pichia pastoris có 2 gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, trong

đó gen AOX1 chịu trách nhiệm cho phần lớn hoạt tính alcohol oxidase trong tế bào

Việc biểu hiện gen AOX1 được điều hòa chặt chẽ và cảm ứng bởi methanol Trong nuôi cấy lắc có cảm ứng methanol gen AOX1 được biểu hiện chiếm 5% và có thể lên

hơn 30% tổng số protein được tế bào sản xuất, trong giai đoạn này tế bào tăng trưởng với tốc độ giới hạn

Sự kiểm soát gen AOX1 được điều khiển bằng 2 cơ chế: “cơ chế ức chế - giải

ức chế ” và “cơ chế cảm ứng” Việc giải ức chế (khi không có nguồn cacbon gây ức

chế trong môi trường) không đưa đến sự phiên mã đủ mức của gen AOX1 Sự hiện

diện của methanol là một nhân tố cần thiết cho việc cảm ứng cho sự phiên mã với mức độ cao 11, 12, 14

Hinh 2.7 Cơ chế cảm ứng bằng methanol trong nấm men Pichia

pastoris.11

2.3.4 Sự tiết các protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp được sản xuất bởi Pichia pastoris có thể tồn tại nội bào hoặc tiết ra ngoài môi trường Pichia pastoris chỉ tiết một lượng ít protein nội sinh của

chính nó, môi trường nuôi cấy không chứa thêm protein nào khác Đây là một thuận lợi cho việc tinh sạch protein sau này vì phần lớn protein được tiết ra môi trường là protein tái tổ hợp Việc tiết yêu cầu sự hiện diện một trình tự tín hiệu trên protein tái

tổ hợp nhằm hướng protein đi vào con đường tiết 11, 12, 14

2.3.5 Các chủng biểu hiện phổ biến

Hầu hết các chủng biểu hiện đều có mang đột biến Các chủng này mang kiểu

gen HIS4 và không có khả năng tự tổng hợp histidin do đó không mọc được trên môi

bộ gen chủng chủ, tạo thành chủng tái tổ hợp có mang gen HIS4 Những tế bào

Pichia pastoris có sự gắn chèn thành công vector tạo dòng vào trong bộ gen sẽ có

khả năng phát triển trên môi trường tối thiểu không có histidin Nhờ đó ta có thể dễ dàng sàng lọc được những tế bào nấm men đã biến nạp thành công

Các chủng chủ được chia thành 3 nhóm chính dựa trên khả năng sử dụng methanol gồm có:

 Mut+ : có khả năng sử dụng methanol tốt

 MutS: có khả năng sử dụng methanol với tốc độ chậm

 Mut-: không có khả năng sử dụng methanol

Khả năng sử dụng methanol của từng chủng thay đổi tuỳ thuộc vào việc thay

thế 1 hay cả 2 gen AOX mã hoá cho alcohol oxidase Càc chủng có gen AOX bị thay

thế cần ít methanol cho việc cảm ứng thể hiện, một đặc điểm có ích trong nuôi cấy cho nồi lên men lớn vì dùng nhiều methanol dẫn đến nguy cơ bốc cháy cao Một số

chủng Pichia pastoris thường được sử dụng:

 GS115: có 2 gen AOX1 và AOX2 nên có thể sử dụng methanol như chủng

hoang dại (Mut+)

 KM71: có kiểu gen his4 arg4 aox1 ∆....ARG4 Gen AOX1 đã bị thay bằng gen ARG4 của S.cerevisiae,do chỉ có mỗi gen AOX2 nên hoạt tính alcohol oxidase yếu

hơn Vì thế chủng này tăng trưởng với tốc độ chậm hơn (MutS)

 MC100-3: có kiểu gen his4 arg4 aox1 ∆....SARG4 aox2 ∆ ...Phis4 Gen AOX1

và AOX2 bị thay thế hoàn toàn Vì thế chủng này không có khả năng sử dụng

methanol (Mut-)

Ở đề tài này, chúng ta sẽ sinh tổng hợp phytase từ nấm men Pichia pastoris

GS115 tái tổ hợp Đây là chủng đã được tạo dòng và biểu hiện thành công mang gen

phAI mã hoá cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum 11, 14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Phòng Vi sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới

3.1.2 Thời gian thực hiện

 Máy điều nhiệt khô

3.2.2 Hóa chất và môi trường

3.2.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong luận văn này được cung cấp bởi Himedia, Merck, Biorad

a) Hóa chất xác định nồng độ protein

b) Hóa chất xác định hoạt tính enzyme phytase

 Đệm acetate pH 5,6

Thêm nước đến 500 ml Bảo quản đệm trong chai thủy tinh, giữ lạnh

 Dung dịch natri phytate 1 mM : Cân 85,8 mg natri phytate hòa tan vào đệm acetate pH 5,6, khuấy cho tan Định mức lên 100 ml bằng đệm acetate

 Dung dịch phosphate stock 1000 ppm P = 1000 mg P/l: Cân 3,065 g

Na3PO4.12H2O và hòa tan trong nước, thêm nước thành 250 ml

 Dung dịch phosphate stock 100 ppm P = 100 mg P/l: Hút 10 ml dung dịch phosphate stock 1000 ppm P và thêm nước 90 ml

Pha dãy dung dịch phosphate chuẩn có nồng độ theo Bảng 3.1