Nghiên Cứu Thiết Lập Quy Trình Chế Biến Rượu Từ Củ Năng

Tốc độ sinh trưởng nhanh, kích thước tế bào vi sinh vật rất bé, khối lượng nhỏ nên tỷ lệ enzyme thu hồi nhiều, dễ dàng thực hiện quá trình sản xuất cơng nghiệp enzyme với hiệu suất cao t

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

CHƯƠNG TRANG

Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục bảng viii Danh mục đồ thị - sơ đồ x

1 GIỚI THIỆU 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Yêu cầu 1

1.4 Nội dung thực hiện 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về củ năng 2

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về cây củ năng 2 2.1.2 Thành phần hóa học 3

2.3 Vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men rượu 10

2.3.2 Nấm mốc 12 2.4 Quá trình lên men rượu 13

2.4.1 Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu 13 2.4.2 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu 13 2.4.3 Cơ chế quá trình lên men rượu 14

2.4.4 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 16 2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong quá trình lên men

rượu 16

2.5.1 Giới thiệu 18 2.5.2 Giá trị dược tính của mật ong 19

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 21

3.1.1 Địa điểm 21

3.2 Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.1 Nguyên liệu 21 3.2.2 Môi trường 21 3.2.3 Máy móc thiết bị 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp vi sinh vật 24

3.4.1 Quy trình tiến hành lên men rượu từ củ năng 37

3.5 Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh, hóa sinh 40

3.5.1 Chuẩn bị dung dịch đệm peptone vô trùng SPW 40 3.5.2 Pha loãng mẫu 40 3.5.3 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 40

3.5.4 Định lượng Coliporms, Coliporms chịu nhiệt, Coliporms phân và E.coli 43

3.6 Phương pháp cảm quan đánh giá chất lượng sản phẩm 46

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

4.1 Kết quả xác định thành phần hóa sinh lý của củ năng 52

4.2 Kết quả khảo sát nồng độ và thời gian đường hóa dịch củ năng bằng

ezyme amylase thu từ Aspergillus oryzae 53

4.2.1 Kết quả khảo sát nồng độ enzyme amlylase bổ sung vào

4.2.2 Kết quả khảo sát thời gian quá trình đường hóa 54

4.3 Kết quả khảo sát thời điểm dừng của quá trình nhân giống nấm men

Saccharomyces cerevisiae 56

4.4 Kết quả khảo sát nồng độ giống và thời gian lên men 57

4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của làm lượng đường đến quá trình lên

men 59

4.5.1 Kết quả cảm quan về màu của rượu củ năng theo phương pháp cho điểm thị hiếu ở các hàm lượng đường 63 4.5.2 Kết quả cảm quan về mùi của rượu củ năng theo phương pháp cho điểm thị hiếu ở các hàm lượng đường 65

4.5.3 Kết quả cảm quan về vị của rượu củ năng theo phương pháp cho điểm thị hiếu ở các hàm lượng đường 67 4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mật ong đến chất lượng

4.7 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh, hóa sinh 76

4.7.1 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh 76 4.7.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hóa sinh 76 4.8 Đánh giá cảm quan sản phẩm rượu củ năng 77

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80

5.1 Kết luận 80 5.2 Đề nghị 82

PGA : Potato Glucose Agar

SPW : Saline Peptone Water

PCA : Plate Cout Agar

LSB : Lauryl Sulphate Broth

BGBL : Brilliant Green Bile Lactose Broth

SCA : Simmon Citrate Agar

canh EC : Môi trường lỏng E.coli

MRVP : Methyl Red Voges Proskauer

Hình 2.5 Cơ chế hoạt động tổng quát của enzyme amylase 6

Hình 2.6 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 10

Hình 5.1 Rượu củ năng thành phẩm 80

BẢNG TRANG

Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn của glucose với thuốc thử DNS 29

Bảng 3.2 Thể tích NaOH 0.1N dùng để định lượng nitơ acid amin 34

Bảng 3.3 Xác định hoạt lực enzyme amylase 36

Bảng 3.4 Bảng phân tích phương sai 50

Bảng 4.1 Thành phần hóa học của củ năng 52

Bảng 4.2 Sự biến thiêng hàm lượng đường khử, nồng độ chất khô ở các

đường 64 Bảng 4.9 Kết quả biểu diễn sự khác nhau về màu của các mẫu ở các

Bảng 4.12 Kết quả biểu diễn sự khác nhau về mùi của các mẫu ở các

Bảng 4.22 Kết quả cho điểm thị hiếu về vị của rượu củ năng ở các tỷ lệ

Bảng 4.23 Bảng phân tích phương sai về vị của rượu ở các tỷ lệ mật ong 75

Bảng 4.24 Kết quả biểu diễn sự khác nhau về vị của các mẫu ở các tỷ lệ

Bảng 4.25 Tính toán sơ bộ hiệu quả kinh tế của rượu làm từ củ năng 80

Bảng 4.26 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm rượu củ năng 81

Sơ đồ 3.1 Quy trình tiến hành lên men rượu từ củ năng 37

Sơ đồ 5.1 Quy trình sản xuất rượu củ năng hoàn chỉnh 84

Chương 1 Giới Thiệu

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành cơng nghệ sinh học và kỹ thuật chế biến, cơng nghệ sản xuất rượu cũng tương đối phát triển và đang rất được quan tâm Ở nước ta nhu cầu sử dụng rượu ngày càng nhiều như rượu vang, rượu nếp, rượu gạo…

Để gĩp phần tăng tính đa dạng của các loại rượu trên thị trường chúng tơi tiến hành nguyên cứu chế biến rượu khơng qua chưng cất từ củ năng, vốn là một dạng củ rất phổ biến ở nước ta

Củ năng cĩ tính dược liệu được chúng tơi nguyên cứu sử dụng làm nguyên liệu

chính để lên rượu nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.4 Nội dung thực hiện

• Xác định thành phần hĩa sinh, lý hĩa của dịch củ năng

• Xác định hàm lượng enzyme amylase, thời gian đường hĩa tối ưu dịch củ

• Khảo sát nồng độ nấm men, thời gian lên men thích hợp

• Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh, hĩa sinh cho sản phẩm cuối

• Đánh giá cảm quan, dự tốn giá trị kinh tế

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về củ năng (Chi Cỏ năng) [15, 16, 17]

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về cây củ

Chi Cỏ năng (danh pháp khoa học: Eleocharis) là một chi thực vật, bao gồm

khoảng 200-250 loài trong họ Cói (Cyperaceae) Chúng được gọi chung là cỏ năng hay

củ năng

Một trong những loài được biết đến nhiều nhất là cỏ năng ống (Eleocharis dulcis)

• Cỏ năng ống :Eleocharis dulcis

• Giới (regnum) : Plantae : Angiospermae : Monocots

Chúng có các lá bị suy giảm xung quanh phần gốc của thân, những cái trông giống như lá trên thực tế là thân nhưng chúng thực hiện phần lớn các chức năng quang hợp cho cây

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Một số lồi cĩ thân luơn luơn mọc ngầm dưới nước Các lồi này cĩ xu hướng

sử dụng cơ chế cố định carbon C3

Các hoa mọc thành các bơng con tụ tập dày Phần lớn các lồi mọc lên từ các thân rễ, và vài lồi cĩ thân củ

Phần lớn các lồi trơng khá giống nhau, với một cụm hoa ở trên đầu của phần

thân đơn, Eleocharis được tìm thấy khắp mọi nơi trên thế giới

Bộ phận dùng: Củ - Tuberculum Fleocharidis

Củ năng (chi cỏ năng) và nhiều tên khác: củ mã thầy, mã đề, địa lê, thơng thiện thảo,… được dùng làm thức ăn và thuốc từ lâu đời

Hình 2.2 Củ năng trước và sau khi gọt vỏ

Củ năng so với các loại củ ăn mát như củ ấu, củ đậu thì mã thầy cĩ giá trị sử dụng làm thực phẩm và làm thuốc cao hơn

Mơ tả: Củ to, đen, nạc, trắng giịn, ngọt Thân hình trụ cao 15-60cm hay hơn, đường kính 1,5-3mm hay hơn, bĩng

2.1.3 Nguồn gốc – Phân bố

Nơi sống và thu hái: Loài của Ấn Độ, Trung Quốc,Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, có thể là từ Đông Ấn Độ, được trồng nhiều ở Nam Trung Quốc, Việt Nam và nhiều nước khác

Ở nước ta, cây mọc được ở ruộng muối, đất thấp từ Hà Giang, Cao Bằng tới Lâm Đồng, Kiên Giang Cây phát triển nhanh, trồng khoảng 200 - 240 ngày là có thể thu hoạch, sản lượng 10-15 tấn trên mỗi hecta

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng – dược tính của củ năng

Củ dùng ăn, nấu canh, nấu chè, làm mứt, là loại thức ăn bổ mát Cũng được dùng làm thuốc cầm máu Khi nghiền củ thành một chất dịch như sữa, dịch này có tác

dụng ức chế sự sinh trưởng của Staphylococcus và Bacillus Củ được dùng trị tiêu

khát, bệnh về gan, táo bón, lỵ ra máu, mắt sưng đỏ Liều dùng 10-20g, dạng thuốc sắc

(ThS Hoàng Khánh Toàn, Sức Khỏe & Đời Sống)

Hình 2.3 Chè củ năng nấu trứng

Hình 2.4 Chè củ năng hạt sen

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

2.2 Enzyme Amylase [3]

2.2.1 Khái niệm về enzyme

Enzyme là protein cĩ hoạt tính xúc tác sinh học Người ta khám phá ra rằng các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hĩa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hĩa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng xác định Như vậy, enzyme đã đảm bảo cho

sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và mơi trường bên ngồi, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống

Tế bào vi sinh vật cĩ chứa rất nhiều enzyme Trong quá trình nuơi cấy vi sinh vật sinh ra hai loại enzyme: enzyme nội bào và enzyme ngoại bào Vì thế vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme tương đối lý tưởng, nĩ cĩ nhiều ưu điểm hơn so với nguồn enzyme động vật và thực vật

Tốc độ sinh trưởng nhanh, kích thước tế bào vi sinh vật rất bé, khối lượng nhỏ nên tỷ lệ enzyme thu hồi nhiều, dễ dàng thực hiện quá trình sản xuất cơng nghiệp enzyme với hiệu suất cao trong thời gian ngắn Enzyme vi sinh vật cĩ hoạt tính cao, cao hơn rất nhiều lần so với động vật, thực vật nên nĩ giúp chuyển hĩa một lượng thức

ăn rất lớn (30-40 lần) so với trọng lượng cơ thể của chúng trong 24 giờ

Cĩ thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuơi cấy để thu được hiệu quả cao trong sản xuất

Enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng về chủng loại tùy theo điều kiện của mơi trường và cơ chất khác nhau

Nấm mốc cĩ khả năng tổng hợp một số enzyme như amylase, protease, cellulase, Tùy theo từng chủng nấm mốc mà cĩ khả năng tổng hợp từng loại enzyme khác nhau

Enzyme cĩ thể hồ tan trong nước, trong dung mơi muối lỗng, trong các dung mơi hữu cơ cĩ cực nhưng khơng tan trong các dung mơi khơng phân cực Enzyme cũng cĩ tính lưỡng tính và khơng bền đối với tác dụng của nhiệt

Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đĩ được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase

Amylase là enzyme thủy phân tinh bột, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước Cơ chế hoạt động tổng quát của amylase như sau:

hoạt động tổng quát của enzyme amylase

Amylase chia thành hai nhóm: endoamylase (α-1,4-glucano hydrolase, glucano hydrolase) và exoamylase (β-amylase, amyloglucosidase)

Amylase được ứng dụng trong các ngành công nghiệp rượu, bia, công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hóa, công nghiệp dệt, công nghiệp chế biến rau quả…

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

• Giai đoạn dextrin hĩa: Trong giai đoạn này độ nhớt của tinh bột giảm nhanh

do một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử lượng thấp

• Giai đoạn đường hố: Các dextrin phân tử thấp được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tera-, trimaltose khơng cho màu với iod Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di-, monosacharit

Trong khả năng dextrin hĩa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nĩ Vì vậy người ta thường gọi loại amylose dextrin hĩa hay amylase dịch hĩa

pH thích hợp : 4,8 – 6,9

Tất cả α-amylase bị kiềm hãm bỡi kim loại nặng (Cu2+, Ag+, Hg2+, ) và khơng

bị ảnh hưởng bởi Li+, Na+,… Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường khơng giống nhau

Cĩ thể khai thác α-amylase từ nguồn thực vật (malt) hay vi sinh vật (nấm sợi, vi khuẩn) Tùy thuộc nguồn gốc khai thác mà α-amylase cĩ một tính chất riêng α-amylase thu được từ nấm sợi thì kém bền nhiệt hơn và dễ bị biến tính trước khi tinh bột được gelatin hố

Tính chất của α-amylase: α-amylase là một loại metalloenzyme, chứa từ 1-30 g nguyên tử Ca+/mol Khi tách Ca+ hồn tồn ra khỏi cơ chất thì α-amylase rất dễ mất hoạt tính và tâm hoạt động của α-amylase cĩ chứa các nhĩm –COOH và NH3 vì vậy

mà α-amylase dễ tan trong nước Protein của các α-amylase cĩ tính chất acid yếu và cĩ tính chất của globulin

Việc hồ hĩa tinh bột bằng α-amylase làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ hĩa Mạch amylose sẽ bị thủy phân thành các phân tử nhỏ chủ yếu là maltose và maltotriose cịn amylopectin khi bị thủy phân ngồi hai phân tử trên cịn xuất hiện dextrin và 5-10% glucose

2.2.3.2 β-amylase

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glycogen polysacharit đồng loại Phân cắt tuần tự từng gĩc maltose một từ đầu khơng

khử của mạch Maltose được tạo thành có cấu hình β vì thế amylase được gọi là amylase

β-β-amylase hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột

β-amylase phân cắt 100% amylose thành maltose và phân giải 54 - 58% amylopectin thành maltose

Nếu cho α-amylase và β-amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột được thủy phân tới 95%

β-amylase là một albumin Tâm xúc tác của nó chứa các nhóm –SH, và nhóm –COOH

β-amylase là enzyme ngoại phân, có ái lực với các liên kết α-1,4 glucozit cắt đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4

Khác với α-amylase, β-amylase rất bền khi không có Ca2+ và bị kiềm hãm bởi

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng

pH =3.5 – 5.5 So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn nhưng lại kém bền với tác dụng rượu ethylic, aceton vì khơng được bảo vệ bằng Ca2+

Các chế phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau tuy cĩ những tính chất chung song cũng cĩ khác nhau ở nhiều điểm

Theo (Fukumoto, 1956) đề nghị chia glucoamylase của vi sinh vật thành hai loại theo khả năng thủy phân tinh bột của chúng:

+ Glucoamylase kiểu Rh delemar gồm các glucoamylase thủy phân 100% tinh bột thành glucose, giống như enzyme được tách ra từ Rh delemar

+ Glucoamylase kiểu Asp niger gồm các glucoamylase thủy phân 80% tinh bột thành glucose, giống như enzyme được tách ra từ Asp niger

Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng khơng đồng nhất :

9 Từ Asp niger: pHi =6.5

9 Từ Rh delemar: pHi =7.4

9 Từ Asp awamori: pHi =7.5

pH hoạt động tối ưu của glucoamylase thay đổi theo nhiệt độ và thời gian tác dụng

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của glucoamylase loại bền acid là 50oC Hầu hết glucoamylase mất hoạt tính ở 70oC

2.2.3.4 Isoamylase, pullulanase và amylase tuyến tụy

Isoamylase hay cịn gọi là amylopectin là enzyme thu nhận từ nấm men, nấm sợi Isoamylase xúc tác việc thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin

Pullunase là enzyme thu từ vi khuẩn Acetobacter aerogenes hay Klebsiella

Xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,6 glucoside

Amylase tuyến tụy cĩ nhĩm –SH vì thế rất dễ biến tính bởi ion kim loại nặng Khi cĩ mặt của ion closide hoạt tính mạnh nhất của chúng ở pH = 7

2.3 Vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men rượu

2.3.1 Nấm men [5, 8, 12]

2.3.1.1 Khái quát về nấm men

Nấm men thuộc cơ thể đơn bào, phân bố khắp nơi Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, elip, bầu dục và cả hình dài Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào tuổi nấm men và điều kiện nuôi cấy

Tế bào nấm men thường có kích thước gấp 5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình của nấm men: chiều dài 9-10µm, chiều rộng 2-7 µm

Hình 2.6 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Tế bào nấm men chứa 75% nước, chất khô chủ yếu là protein và hydrat cacbon:

Cấu tạo tế bào nấm men gồm các phần sau: thành tế bào nấm men được cấu tạo

từ các thành phần khác nhau: glucan, manna, protid, lipid, kitin Màng nguyên sinh chất được hình thành từ protein, phospholipids, permease

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Chất nguyên sinh thường cĩ màu xám, chủ yếu được cấu tạo từ nước, protid, glucid, lipid, khi tế bào cịn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn về già Nhân của tế bào nấm men là nhân thực, hình bầu dục hay hình cầu Nhân được bao bọc một

lớp màng bên ngồi, bên trong nữa là dịch nhân, trong cùng là hạch nhân

Nấm men cĩ nhiều hình thức sinh sản: sinh sản bằng cách nẩy chồi hay bằng bào tử

2.3.1.2 Nấm men lên men rượu, cồn

Trong sản xuất rượu, cồn người ta thường dùng Saccharomyces và chia thành

hai nhĩm: lên men nổi và lên men chìm Đa số nấm men bia đều thuộc nấm men chìm, cịn men rượu chủ yếu là men nổi

Nấm men lên men nổi cĩ đặc điểm là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì đến khi quá trình lên men gần kết thúc Sau đĩ nấm men lắng dần nhưng chậm và khơng tạo thành lớp men xít bám vào đáy thùng Theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết thành chuỗi như nấm men chìm

Nấm men chìm là một chủng cĩ enzyme alpha-galatozidaza Nấm men chìm chỉ phát triển trong mơi trường lên men, khơng tạo thành bọt trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp bám sát dưới đáy thùng

Yêu cầu chung của nấm men dùng trong sản xuất cồn là: phải cĩ khả năng lên men mạnh, biến đường thành rượu nhanh và hồn tồn Đồng thời phải ổn định và chịu được những biến đổi của canh trường

™ Một số nấm men dùng trong sản xuất rượu, cồn:

• Saccharomyces vini cịn gọi là Saccharomyces ellipsoideus theo Lodder hay Saccharomyces cerevisiae theo Hansen do phần nhiều là hình cầu hoặc oval,

cĩ khả năng kết lắng nhanh, sinh sản theo cách nảy chồi

• Saccharomyces uvarium được tách ra từ nước nho, và nước quả phúc bồn tử

lên men tự nhiên, khả năng tạo bào tử cao Trong quá trình lên men cĩ khả năng tạo được lượng cồn rất cao

• Saccharomyces oviformis theo Lodder là Sac beuanes saccardo: khả năng

lên men dịch đường để tạo thành lượng cồn rất cao Chúng có khả năng lên men từ nhiều loại đường khác nhau như: glucose, maltose, saccharose và 1/3

rafinose S oviformis không lên men được galactose và men nổi lên bề mặt

dịch lên men tạo thành màng

• Saccharomyces cerevisiae có tế bào hình trứng hay hình bầu dục, có khả

năng lên men glucose, galactose, saccharose, 1/3 rafinose, maltose và các dextrin đơn giản

Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống

đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp.oryzae

thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng

Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

gọi là đính bào tử Đính bào tử của Asp.oryzae cĩ màu vàng lục hay màu vàng hoa

cau…

2.3.2.2 Đặc điểm

Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease,

pectinasa,… ) ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng khơng được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngơ, ở bã sắn… Các bào tử này, dễ bị giĩ cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi

sẽ mọc thành mốc mới

2.4 Quá trình lên men rượu [1,2,7,12,13]

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người

ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên cĩ hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự cĩ mặt của nấm men, chúng

sẽ chuyển hĩa đường lên men thành ethanol và CO2

Mục đích: đây là giai đoạn chuyển đường thành rượu dưới tác dụng của nấm men

2.4.1 Phương trình tĩm tắt quá trình lên men rượu

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 +113,4 Kj Thật ra quá trình lên men rượu rất phức tạp, qua 10 phản ứng khác nhau, với sự tham gia của nhiều thế hệ enzyme xúc tác Kết quả cuối cùng của quá trình lên men rượu cho ta sản phẩm là rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác

2.4.2 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:

• Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự cĩ mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

• Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn cĩ của mình thực

hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

Giai đoạn lên men phụ:

• Mục đích của lên men phụ là làm ổn định chất lượng rượu và làm tăng hương thơm cho rượu Giai đoạn này được tính từ khi lên men chính xong

• Lên men trong giai đoạn này không xảy ra ào ạt do chỉ còn lại một ít men phân hủy những gam đường cuối cùng

• Đồng thời vi khuẩn bắt đầu hoạt động lên men malolactic làm cho rượu bớt chua CO2 còn tiếp tục được giải phóng nhưng ít dần, xác men lắng xuống đáy bình

Trong trường hợp sau khi lên men, lượng cồn tạo thành quá thấp sẽ xảy ra hiện tượng chua rượu do quá trình lên men acetic Do vậy phải tăng thêm lượng cồn cho rượu nhằm đảm bảo chất lượng rượu đồng đều

2.4.3 Cơ chế quá trình lên men rượu

Thực chất, lên men là quá trình oxy hóa – khử sinh học để cung cấp năng lượng cho tế bào vi sinh vật, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ Trong lên men rượu, ethanol và CO2 là sản phẩm tích

tụ chiếm ưu thế, ngoài ra còn rất nhiều các sản phẩm phụ khác như các acid, ester, aldehyde và các rượu cao phân tử

Nấm men là tác nhân của quá trình lên men rượu, với đường là cơ chất chính Quá trình chuyển hóa đường thành rượu, liên quan mật thiết đến quá trình phosphoryl hóa các hợp chất hữu cơ

Đường cùng với chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của tế bào nấm men Sau đó chúng khuếch tán qua màng tế bào (màng bán thấm) và vào bên trong tế bào nấm men Trong khi nước vào và ra khỏi tế bào một cách tự do thì đường và các chất dinh dưỡng khác được giữ lại Tại đây nhờ hoạt động trao đổi chất của tế bào, đường được chuyển theo chu trình đường phân Embden- Megerhof-Parnas (EMP) qua hàng loạt các phản ứng trung gian để tạo thành

acid pyruvic

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Acid pyruvic trong điều kiện yếm khí, dưới tác dụng của enzym pyruvat decacboxylase sẽ bị khử thành acetaldehyde và CO2 Sau đĩ, acetaldehyde bị khử thành rượu etylic dưới tác dụng của enzyme alcoldehydrogenase của nấm men Rượu etylic và CO2 được tạo thành sẽ thốt ra khỏi màng tế bào mà khuếch tán vào mơi trường xung quanh

Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza

2.4.4 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

Trong quá trình lên men, ngoài hai sản phẩm chính là rượu và CO2 còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian khác Acid (acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic, acid succinic), alcol (alcol propylic, izobutylic, izomalic, amylic…)

2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong quá trình lên men rượu

2.4.5.1 Ảnh hưởng của chủng nấm men

Sản phẩm rượu, thực chất là kết quả của quá trình tương tác giữa hai yếu tố nấm men và môi trường lên men Vì thế, việc tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho việc lên men một môi trường đã được xác định là điều quan trọng hàng đầu

Muốn có một chủng nấm men có khả năng lên men tốt, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng nào có khả năng tích tụ enzyme phù hợp, cho chất lượng sản phẩm tốt

2.4.5.2 Ảnh hưởng của điểu kiện nuôi cấy

™ Oxy

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu thuộc giống Saccharomyces

Chúng là nhóm vi sinh vật hô hấp tùy tiện Khi trong điều kiện yếm khí nấm men sẽ lên men đường tạo rượu và CO2

Còn trong điều kiện đầy đủ oxy, nó có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và H2O Đồng thời sinh sản, phát triển mạnh, sự kìm hãm lên men rượu bằng oxy, gọi là

“hiệu ứng Pasteur”

Do vậy trong quá trình sản xuất rượu, giai đoạn đầu cần tạo điều kiện hiếu khí,

để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối đủ lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men rượu Sau đó phải yếm khí tuyệt đối để nấm men chuyển hóa đường thành rượu Tuy vậy khi có đầy đủ oxy cũng có một lượng rượu nhỏ tạo thành

™ Ảnh hưởng của chất khử trùng

Nấm men so với các loài vi sinh vật khác rất bền với SO2 Do đó, người ta thường xông khí SO2 vào thùng lên men để thanh trùng trong sản xuất rượu

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Nếu nồng độ quá cao SO2 cĩ thể ức chế quá trình lên men của nấm men Để tăng khả năng chịu đựng SO2 của nấm men người ta cĩ thể thực hiện bằng cách nuơi nấm men liên tục trong những mơi trường cĩ hàm lượng SO2 tăng dần để tạo sự thích ứng của nấm men

™ Nhiệt độ

Nhiệt độ lên men cĩ ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm Nấm men cĩ thể tồn tại và phát triển ở nhiệt độ từ 4

÷ 450C, nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 28 ÷ 300C

Ở nhiệt độ thấp, nấm men sinh sản chậm, thời gian lên men kéo dài, nhưng hạn chế sự nhiễm khuẩn ngược lại ở nhiệt độ cao (quá 380C) nấm men sinh sản nhanh, thời gian lên men ngắn hơn, khả năng nhiễm khuẩn cao

Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn cĩ thể thấp, đường cịn sĩt nhiều, ester và aldehyde sẽ tạo thành nhiều dẫn đến hương vị sản phẩm

cĩ khi khơng tốt

™ Hàm lượng đường

Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong mơi trường cĩ hàm lượng đường dưới 20% Nồng độ thấp quá, cũng làm giảm năng lực lên men và tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển Cĩ một số chủng hoạt động ở mơi trường cĩ nồng độ đường cao hơn

Nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và năng lực lên men rượu giảm, men bị co nguyên sinh, tăng áp suất thẩm thấu và mất cân bằng trạng thái sinh lý của men Khi nhân giống thường dùng mơi trường cĩ đường thấp dưới 10%

™ Ảnh hưởng của axit hữu cơ

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy: Acid là thành phần quan trọng làm giảm độ

pH, cĩ tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn

Sự ảnh hưởng của acid hữu cơ đối với quá trình lên men khơng phải do hàm lượng tổng số của các acid hữu cơ khơng bay hơi mà do thành phần và hàm lượng một

số loại acid hữu cơ trong dịch lên men: các acid béo, acetic, butyric, propionic ảnh hưởng quyết định đến sự sinh sản và phát triển của nấm men

™ Ảnh hưởng của Nitơ

Nitơ là thành phần quan trọng tham gia vào quá trình hình thành và phát triển của tế bào nói chung Hầu như mọi thành phần tế bào đều chứa Nitơ ở tỉ lệ khác nhau

Thực tế sản xuất, khi nhân giống nấm men người ta bổ sung thêm lizin, arginin hoặc (NH4)2SO4 ở nồng độ 0.6% để tăng cường khả năng sinh sản của nấm men

™ Ảnh hưởng của lượng men giống

Lượng men giống trong dịch lên men thấp thì thời gian lên men sẽ bị kéo dài và

dễ bị nhiễm khuẩn, khi lượng men giống càng cao thì thời gian lên men ngắn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men

Nếu lượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men không có lợi cho quá trình lên men và chất lượng sản phẩm

™ pH của môi trường

Nấm men có thể sinh sản, phát triển trong môi trường có pH từ 2.5 ÷ 7.5 pH phù hợp nhất đối với sự sinh sản và phát triển của nấm men là 4 ÷ 6, nhiều chủng nấm men có thể sinh sản và phát triển tốt ở pH 3 ÷ 3.5 để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với độ pH tự nhiên của nguyên liệu và chất lượng của rượu

Độ pH không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản và phát triển của nấm men mà còn ảnh hưởng đến khả năng hoạt hoá của liên kết các enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình lên men Độ pH quá thấp hoặc quá cao làm thay đổi cấu trúc protein của nhiều loại enzyme, giảm khả năng hoạt hoá của enzym

2.5 Mật ong [16, 17, 18]

2.5.1 Giới thiệu

Mật ong do con ong làm ra từ nhụy hoa Mỗi con ong đều có túi mật để chứa mật hoa Mật hoa trong túi mật được phân hóa thành hai loại đường: fructose và glucose Trong mật hoa còn có rất nhiều nước nhưng lượng nước này sẽ bốc hơi đi làm mật hoa đặc lại thành mật ong

Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu

Các nhà sinh vật học đã thống kê ra rất nhiều loại ong khác nhau Ðặc biệt cĩ một lồi ong sản xuất ra nhiều mật ong mà chúng ta quen gọi là ong mật

Hình 2.9 Ong mật

Ong mật cĩ thể bay xa đến 6 dậm để lấy mật hoa, thơng thường thì ong mật bay tìm hoa từ 1 đến 2 dặm Ong thường lấy phấn hoa và mật hoa vào mùa xuân lúc cây đang nở hoa

2.5.2 Giá trị dược tính của mật ong

Theo Y học cổ truyền, mật ong cĩ tác dụng ích khí, nhuận táo, chữa các chứng bệnh ho, tim, bỏng, đau bụng, khĩ đẻ, lở âm đầu, hĩc xương cá, bí đại tiện, xích bạnh

lị, sản phụ khát nước Khơng nên dùng trong các trường hợp ỉa chảy hoặc đầy bụng

Mật ong vừa cĩ tác dụng thay thế đường, vừa là một vị thuốc quý trong tủ thuốc gia đình Cĩ thể bơi trực tiếp mật ong khơng cần bào chế, trừ khi làm thuốc đặc biệt của Đơng y

Mật ong làm tăng sức dẻo dai của cơ thể và giúp cơ thể nhanh chĩng phục hồi Mật ong cịn cĩ khả năng sát khuẩn, làm liền sẹo nhanh chĩng, cĩ tác dụng hỗ trợ miễn dịch, giúp cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn

Mật ong cũng tác động tốt cho các bệnh về đường tiêu hĩa, đường hơ hấp, ho, viêm thanh quản Mật ong cũng cĩ giá trị cao trong thẩm mỹ, giúp lành sẹo, tốt da, đẹp tĩc

Trong quá trình bào chế mật ong, vận chuyển và bảo quản, rất dễ bị ơ nhiễm

một loại trực khuẩn nguy hiểm Clostridium botulinum

Đối với những trẻ nhỏ dưới 1 tuổi, do hệ thống miễn dịch trong cơ thể vẫn chưa được thành thục, sức đề kháng kém thì nha bào này sẽ lập tức phát triển ở trong

cơ thể trẻ, dẫn tới tình trạng trẻ bị trúng độc

2.5.3 Tính chất

Tính chất của mật ong thay đổi tùy theo từng vùng, từng tỉnh và từng thời kỳ lấy mật Đặc biệt, mật ong có thể có chất độc nếu ong hút mật ở những cây có hoa độc như hoa phụ tử, hoa thuốc lá, hoa cà độc dược

Trong tổ ong có một chất gọi là keo ong Keo ong là một chất nhựa giống sáp

do ong mật hút từ chồi cây hoặc bất kỳ nguồn thực vật nào, và sử dụng như một chất keo để gắn những khoang bị nứt hoặc khoang trống vào tổ

Đây là sản phẩm tốt nhất và công hiệu nhất trong số những sản phẩm của ong Keo ong có khả năng tái tạo và làm lành những tế bào bị tổn thương Nó còn có tác

dụng dưỡng da (DS NGUYỄN BÁ HUY CƯỜNG ĐH Curtin, Úc)

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Thí Nghiệm

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

• Củ năng mua từ chợ Bà Quẹo

• Mật ong từ tiệm thuốc bắc

• Saccharomyces cerevisiae được cung cấp từ phịng thí nghiệm vi sinh

trường đại học Tơn Đức Thắng

• Aspergillus oryzae được cung cấp từ phịng thí nghiệm vi sinh trường đại

học Tơn Đức Thắng

3.2.2 Mơi trường [10]

3.2.2.1 Mơi trường PGA (Potato Glucose Agar): dùng để nuơi và giữ

giống Aspergillus oryzae

• Khoai tây 300g/l

• Agar 20g/l

Lấy khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cân 300g rồi thái nhỏ, thêm 500ml nước cất, đun sôi 30 phút Lọc lấy nước trong, thêm nước đủ 1000ml, cho các thành phần còn lại vào, khuấy đều, đun sôi cho tan đều rồi phân vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng và phần còn lại cho vào erlen để làm thạch đĩa Khử trùng 1atm trong 15 phút

3.2.2.2 Môi trường cám gạo: nuôi nấm mốc Aspergillus oryzae để thu

3.2.2.4 Dung dịch đệm peptone SPW (Saline Peptone Water)

• Peptone 10g/l

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Thí Nghiệm

Dung dịch này được chứa trong các bình chứa 0,5 ÷ 1,0 lít, hấp khử trùng ở

1210C trong 15 phút và được phân phối thành các thể tích chính xác 9 ml vào trong các

ống nghiệm vơ trùng, pH = 7

3.2.3 Máy mĩc thiết bị

Tủ sấy Máy quang phổ Nồi hấp tiệt trùng Bình hút ẩm

Tủ ấm Máy lắc Kính hiển vi quang học

Tủ hút Máy đo pH Máy đo protein

Tủ cấy Máy phân tích độ ẩm Khúc xạ kế điện tử

Tủ lạnh Máy đo quang phổ Máy cơ quay

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp vi sinh vật

3.3.1.1 Phương pháp nuơi cấy nấm men: phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh [10]

™ Nguyên tắc

Dựa vào sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian nhất định của vi sinh vật và

dựa vào tác động của nhiệt độ thấp để làm giảm quá trình trao đổi chất và quá trình hơ

hấp của vi sinh vật

™ Phương pháp thực hiện

Trước khi bảo quản, tiến hành cấy chuyền giống vi sinh vật vào thạch nghiêng

Tiếp theo nuơi chúng trong điều kiện nhiệt độ thích hợp cho đến khi tạo được lượng

sinh khối lớn nhất Sau đĩ bảo quản giống trong nhiệt độ lạnh khoảng 4oC Sau 1 tháng

lập lại qui trình trên một lần

3.3.1.2 Phương pháp nhân giống nấm men [10, 12]

™ Nhân giống cấp 1

Nhân giống ở 10 ml mơi trường Hansen lỏng trong ống nghiệm nhằm hoạt hĩa

giống 24h

Cho 4ml nước muối sinh lý vào ống giống thạch nghiêng, dùng que cấy hòa toàn bộ giống vào nước muối

Hút 1ml sinh khối nấm men vào ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng có nồng độ đường 70Bx đã vô khuẩn ở 1210C trong 15 phút Nuôi trên máy lắc trong 18 -

3.3.1.3 Kiểm tra chất lượng canh trường men giống [10,12]

™ Định lượng nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Nguyên tắc: đếm trực tiếp số tế bào trên buồng đếm hồng cầu

Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu:

• Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày, có đục bốn rãnh chia thành 3 khoang ngang, khoang giữa thấp hơn 2 khoang bên 0,1mm và được chia thành 2 khoang nhỏ nhờ một rãnh dọc

• Trên mỗi khoang nhỏ có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn lại được chia thành 16 ô vuông nhỏ có cạnh dài 1/20 mm diện tích 1/400

mm2 Như vậy thể tích của một ô nhỏ là 1/400 mm3

Phương pháp: thấm nước cất phết nhẹ lên 2 khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính lên, rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính ép chặt vào phiến kính Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho vài giọt vào kẽ hở giữa lưới đếm và lá kính Đặt kính

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Thí Nghiệm

đếm lên khay kính hiển vi, để yên trong 3-5 phút rồi tiến hành đếm số lượng tế bào trong 1 ml canh trường

Quan sát tỷ lệ nảy chồi: Tế bào được xem là đang nảy chồi khi cĩ tế bào con

kích thước bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ Nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ thì tính

là 2 tế bào Đếm số tế bào chung, số tế bào nảy chồi, suy ra tỷ lệ nảy chồi trong canh trường nấm men

Cách tính:

x = (4000ab/c)*1000 x: số lượng tế bào trong 1 ml

a: số tế bào trong 5 ơ lớn

b: tỉ lệ pha lỗng canh trường

c: số ơ nhỏ trong 5 ơ lớn

™ Xác định tỷ lệ sống chết bằng phương pháp nhuộm xanh metylen

Nguyên tắc: tế bào sống khơng cĩ khả năng bắt màu xanh với xanh metylen, tế bào chết thì ngược lại

Phương pháp: nhỏ một giọt canh trường lên phiến kính, và một giọt xanh metylen kế bên Đặt cẩn thận lá kính sạch lên trên phần chất lỏng và quan sát giọt ép dưới kính hiển vi nền sáng với độ phĩng đại x40, đếm số tế bào sống chết và suy ra phần trăm tế bào sống chứa trong mẫu quan sát

™ Kiểm tra giống thuần bằng phương pháp cấy ria

Trên các vạch tạo lại ở về mặt môi trường của các đĩa này, giống vi sinh vật được xem là thuần khiết nếu có một loạt các khuẩn lạc có hình thái giống hệt các khuẩn lạc được phân lập ở đĩa ban đầu trên môi trường dinh dưỡng

3.3.1.4 Nuôi cấy nấm mốc [15]

™ Chuẩn bị

Aspergilus oryzae nuôi trên môi trường thạch nghiêng PGA

Môi trường cám gạo

™ Thực hiện

Cho 10g môi trường cám gạo vào bình tam giác 500ml Hấp khử trùng 1atm trong 30 phút

Chuẩn bị erlen chứa nước cất vô trùng, cho 5ml nước cất vào ống A.oryzae

Dùng que cấy vòng khuấy nhẹ để bào tử nấm mốc hòa điều trong nước Đổ toàn bộ 5ml dịch bào tử vào môi trường cám gạo đã hấp khử trùng, lắc đều

Nuôi ở nhiệt độ phòng trong 30 -36 giờ Đây là giai đoạn nấm bắt đầu tạo bào

tử cũng là thời gian tạo được enzyme nhiều nhất Do đó chúng ta nên thu nhận enzyme thô ở giai đoạn này

Chế phẩm thô sau khi thu nhận được sấy khô ở nhiệt độ dưới 400C có quạt thông gió, sau đó bảo quản và dùng lâu dài

3.3.1.5 Tách chiết enzyme amylase từ nấm mốc [15]

™ Nguyên tắc

Quá trình chiết xuất enzyme phải được thực hiện ở nhiệt độ dưới 40C

Nấm mốc A.oryzae phải được nuôi cấy trước đó 30 – 36 giờ

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Thí Nghiệm

Bấm nút khởi động máy Đặt miếng nhơm vào cân trừ bì

Xay nhuyễn mẫu trải một lớp mỏng đều trên bề mặt miếng nhơm

Đậy nắp máy lại, chờ đến khi giá trị trên máy khơng thay đổi nữa Ghi nhận giá trị m

Nung chén sứ đã rửa sạch ở lị nung 500 - 650 0C đến trọng lượng khơng đổi

Để nguội ở bình hút ẩm, cân phân tích chính xác đến 0.0001g

Cho vào chén sứ khoảng 5g củ năng Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên Sau đĩ cho vào lị nung, nung đến tro trắng cĩ khối lượng khơng đổi

Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác như trên

™ Tính kết quả

Hàm lượng tro tồn phần theo phần trăm (X) tính bằng cơng thức :

X = (G2– G) *100/(G1 – G) Trong đĩ : G : trọng lượng của chén, (g)

G1 : trọng lượng của chén và trọng lượng mẫu thử (g)

G2 : trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung đến khối lượng không đổi (g)

3.3.2.3 Xác định hàm luợng đường khử bằng phương pháp acid 3,5 DiNitroSalisylic (DNS) [13]

™ Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường trong phạm vi nhất định

Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose – fructose – maltose tinh khiết với

thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

™ Hóa chất

+ Dung dịch DNS

Lấy vào becher 60 - 80ml nước cất và 1.6g NaOH khuấy đều trên máy khuấy

từ Khi NaOH tan hết cho tiếp vào bercher 1g DNS, khuấy cho tan hết Sau cùng bổ sung vào dung dịch 30g muối Tatrat Na-K

Cho toàn bộ vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng nước cất Đem dung dịch bảo quản trong chai nâu ở nhiệt độ 6 - 80C (dung dịch dùng trong 15 ngày)

+ Dung dịch chuẩn

Vì các sản phẩm của quá trình thủy phân trong dịch củ chủ yếu là đường maltose, glucose, fructose nên ta sử dụng dung dịch chuẩn là cả 3 loại đường với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc tỷ lệ chúng trong dịch củ Pha dung dịch chuẩn glucose với 4 nồng độ 0.5 – 1 – 1.5 và 2 g/l

™ Tiến hành

Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1: 99

Lấy vào ống nghiệm có nắp 1ml mẫu và 1ml dung dịch DNS, lắc đều dung dịch trong ống và đun cách thủy ở nhiệt độ 1000C trong thời gian 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch về nhiệt độ phòng

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Thí Nghiệm

Cho thêm vào dung dịch 10 ml nước cất và lắc đều đến khi dung dịch khơng cịn phân lớp Đo độ hấp thụ ở bước sĩng λ = 540 nm

Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn của glucose với thuốc thử DNS

Acid ascorbic (Vitamin C) là một hợp chất chưa no cĩ chứa nhĩm enditol

Acid ascorbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hĩa và bền trong

mơi trường acid

Phương pháp dựa trên nguyên tắc acid ascorbic cĩ khả năng oxy hĩa thuận nghịch nhờ trong phân tử của nĩ cĩ nhĩm enditol –C(OH)=(OH)C– Ta xác định acid ascorbic bằng phương pháp chuẩn độ KIO3/KI theo các phản ứng sau:

KIO3 + 5KI + 6 HCl →3 I2 + 6KCl + 3 H2O (1)

Hình 3.1 Phản ứng giữa iod với acid ascorbic thành acid dehydroascorbic

HI O

H

O O

OH CH C C C C C O

HO H

I O

H

OH OH

OH CH C C C C C O

Lượng iod tạo ra ở phương trình (1) sẽ oxy hóa acid ascorbic thành acid dehydroascorbic, phương trình (2) Khi hết acid ascorbic, iod thừa sẽ làm chỉ thị hồ tinh bột hóa xanh

™ Dụng cụ

Cối + chày sứ Bình định mức 50ml 1 buret 25ml 1

Dao + thớt Erlen 100ml 3 cốc 50ml 3

Cân pipet bầu 10ml 1 phểu thủy tinh 1

Giấy lọc bóp cao su + đầu típ 1

Hút 10ml dịch chứa vitamin C từ bình định mức vào erlen 100ml, thêm vài giọt

hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng KIO3/KI 0,01N cho đến khi xuất hiện màu xanh

Định phân 3 lần, kết quả định phân không sai lệch quá 0,003 ml

Tiến hành song song các mẫu kiểm chứng, thay dịch chứa vitamin C bằng dung dịch HCl 1%