Đánh giá đa dạng di truyền và độ độc tính của các chủng vi khuẩn ralstonia solanacearum smith được thu thập tại các tỉnh phía nam việt nam

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Đề tài nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền và độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh HXVK.. - Đánh giá

Lời Cảm Ơn

Được sự phđn công của khoa Nông học, trường Đại học Nông Lđm Huế

vă được sự đồng ý của cô giâo hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thu Thủy, tôi đê thực hiện đề tăi luận văn “Đânh giâ đa dạng di truyền vă độ độc tính của câc chủng

vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith được thu thập tại câc tỉnh phía Nam Việt Nam”.

Để có thể hoăn thănh luận văn năy, tôi tỏ lòng kính trọng vă biết ơn sđu sắc đến cô giâo TS Nguyễn Thị Thu Thủy vă cô giâo TS Trương Thị Hồng Hải lă 2 người đê trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quâ trình thực hiện vă viết

đề tăi Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quâ trình học không chỉ lă nền tảng cho quâ trình nghiín cứu đề tăi mă còn lă hănh trang quý bâu giúp tôi trưởng thănh hơn trong cuộc sống.

Xin chđn thănh cảm ơn câc thầy cô giâo đê trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kiến thức khoa học chuyín ngănh trong thời gian tôi học tập tại trường.

Xin ghi nhận những đóng góp nhiệt tình của câc anh chị học viín cao học trong vă ngoăi lớp K19, K20, nhóm câc em sinh viín K45, K46, K47, câc bạn ở trường THPT Lí Hồng Phong đê giúp đỡ tôi trong quâ trình thực hiện đề tăi Có thể khẳng định sự thănh công của luận văn năy, trước hết thuộc về công lao của tập thể Đặc biệt lă sự quan tđm, động viín khuyến khích từ phía gia đình vă người bạn tốt đồng hănh Trần Thị Bảo Ngă Nhđn đđy, tôi xin được băy tỏ lòng biết ơn sđu đậm đến tất cả mọi người.

Mặc dù đê cố gắng rất nhiều song do buổi đầu mới lăm quen với công tâc nghiín cứu khoa học trong phòng thí nghiệm cũng như hạn chế về kỹ năng thao tâc nín không thể trânh khỏi được những thiếu sót nhất định Tôi rất mong nhận được sự đóng góp của quý thầy cô vă câc bạn đồng nghiệp để luận văn được hoăn chỉnh hơn.

Tôi xin chđn thănh cảm ơn!

Huế, ngăy 20 thâng 7 năm 2015

Học viín

Phạm Thanh Bình LỜI CAM ĐOAN

Để hoàn thiện công trình nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành các công việcliên quan từ xử lý mẫu, phân lập mẫu, chạy PCR đánh giá đa dạng di truyền tại phòngCông nghệ Sinh học, phòng thí nghiệm Bệnh cây và thực hiện thí nghiệm lây nhiễmtại nhà lưới của Bộ môn Bảo vệ thực vật, trường Đại học Nông lâm Huế Đây là thànhquả tập thể nhóm nghiên cứu của chúng tôi.

Tất cả số liệu, thông tin trong luận văn này được chúng tôi ghi nhận từ thực tếnghiên cứu Vì vậy tôi cam đoan tất cả số liệu ở trong luận văn này là chính xác vàkhách quan, có tính khoa học cao và chưa từng được công bố ở trên một luận văn caohọc nào khác

Huế, ngày 20 tháng 7 năm 2015

Học viên

Phạm Thanh Bình

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 2

4 NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI 2

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 CÂY CÀ CHUA 3

1.1.1 Giá trị dinh dưỡng 3

1.1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 4

1.1.3 Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam 4

1.1.4 Các bệnh thường gặp trên cây cà chua 5

1.1.5 Thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra trên cà chua 6

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM 7

1.2.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 8

1.2.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên thế giới 11

1.2.3 Nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở trong nước 12

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN 13

1.3.1 Triệu chứng bệnh 13

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát sinh bệnh 13

1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh héo xanh vi khuẩn 14

1.3.4 Biện pháp phòng trừ 14

1.3.5 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới 18

1.3.6 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở trong nước 19

1.3.7 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà chua ở Việt Nam 20

1.4 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 21

1.4.1 Tổng quan đa dạng sinh học - đa dạng di truyền 21

1.4.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 22

1.4.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 22

1.4.4 Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 28

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 30

2.1.1 Mục tiêu chung 30

2.1.2 Mục tiêu cụ thể 30

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30

2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum được thu thập tại các tỉnh phía Nam 30

2.2.2 Đánh giá độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum được thu thập tại các tỉnh phía Nam 30

2.3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 31

2.3.1 Nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum 31

2.3.2 Giống cà chua 35

2.3.3 Môi trường nhân tạo 35

2.3.4 Vật liệu nghiên cứu 36

2.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 38

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.5.1 Phương pháp thu mẫu bệnh 38

2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum 38

2.5.3 Phương pháp tách chiết DNA 39

2.5.4 Phương pháp xác định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum.39 2.5.5 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum 40 2.5.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 41

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM 44

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VI KHUẨN RALSTONIA

SOLANACEARUM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 47

3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA 49

3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHYLOTYPE CỦA 19 CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM 50

3.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH BẰNG KỸ THUẬT RAPD 50

3.6 ĐÁNH GIÁ KIỂU GEN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT RAPD 52

3.7 ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA 19 CHỦNG VI KHUẨN 54

3.8 ĐÁNH GIÁ DIỄN BIẾN BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN SAU KHI LÂY NHIỄM 58

3.9 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VỚI CÁC GIỐNG CÀ CHUA 66

3.9.1 Tính kháng của các giống cà chua 66

3.9.2 Độc tính của các chủng vi khuẩn 67

3.9.3 Tương tác giữa tính kháng của các giống cà chua với độc tính của các chủng vi khuẩn 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 80

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

AVRDC : The World Vegetable Center (Trung tâm rau thế giới)

DNA : Deoxy ribonucleic axit

dNTP :Deoxy nucleotide triphosphates

H7996 : Haiwaii 7996

HXVK : Héo xanh vi khuẩn

PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Phân tích DNA đa

hình được nhân bản ngẫu nhiên)

RE : Restriction enzyme

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA : Ribonucleic acid

SSR : Simple Sequence Repeats

TBE : Tris-Boric acid-EDTA

W700 : West Virginia 700

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích 5 loại rau được trồng phổ biến trên thế giới (năm 2013) 4

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu vi khuẩn được thu thập ở các tỉnh phía Nam 31

Bảng 2.2 Các giống cà chua chuẩn bị cho thí nghiệm lây nhiễm 35

Bảng 2.3 Một số môi trường nhân tạo chuẩn bị cho phân lập vi khuẩn 35

Bảng 2.4 Bộ mồi RAPD biểu hiện đa hình 36

Bảng 2.5 Bộ mồi xác định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 39

Bảng 3.1 Danh sách các chủng vi khuẩn được phân lập 44

Bảng 3.2 Tổng số băng DNA khuếch đại của 19 chủng vi khuẩn khi phân tích với 24 mồi RAPD 53

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng giữa 19 chủng vi khuẩn 56

Bảng 3.4 Diễn biến bệnh HXVK sau khi lây nhiễm các chủng vi khuẩn 59

Bảng 3.5 Tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các giống cà chua 66

Bảng 3.6 Độc tính của các chủng vi khuẩn héo xanh 67

Bảng 3.7 Sự tương tác giữa tính kháng của 3 mẫu giống cà chua với độc tính của các chủng vi khuẩn 68

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm cho một giống cà chua 41

Hình 2.1 Thang điểm đánh giá diễn biến bệnh HXVK 42

Hình 3.1 Dịch nhầy trắng sữa của vi khuẩn 46

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc đặc trưng 47

Hình 3.3 Một số hình thái khuẩn lạc đại diện khác 47

Hình 3.4 Kết quả điện di sử dụng cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 48

Hình 3.5 Kết quả tách chiết DNA lần đầu của 19 chủng vi khuẩn 49

Hình 3.6 Kết quả tách chiết DNA hoàn chỉnh của 19 chủng vi khuẩn 49

Hình 3.7 Kết quả điện di phylotype của 19 chủng vi khuẩn 50

Hình 3.8 Kết quả điện di cuả một số mồi RAPD biểu hiện đa hình được khảo sát từ 3 chủng vi khuẩn Rs11, Rs66, Rs86 51

Hình 3.9 Kết quả điện di mồi UBC#353 của 7 chủng vi khuẩn 52

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 19 chủng vi khuẩn với các mồi UBC#333 và UBC#388 54

Hình 3.11 Biểu đồ về quan hệ di truyền giữa 19 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum 57

Đồ thị 3.1 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs24 sau khi lây nhiễm 60

Đồ thị 3.2 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs38 sau khi lây nhiễm 61

Đồ thị 3.3 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs51 sau khi lây nhiễm 62

Đồ thị 3.4 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs57 sau khi lây nhiễm 63

Đồ thị 3.5 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs66 sau khi lây nhiễm 64

Đồ thị 3.6 Diễn biến bệnh HXVK của chủng vi khuẩn Rs86 sau khi lây nhiễm 65

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ bệnh của các giống khi lây nhiễm các chủng vi khuẩn khác nhau 69

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một trong những

bệnh hại rất phổ biến và nghiêm trọng trên các đồng ruộng, có khu phân bố rộng ở cácvùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nhiều khu vực ôn đới trên thế giới [39] Đây là loại vikhuẩn được tìm thấy trên cả 6 lục địa, có nhiều chủng sinh lý và nòi sinh học khácnhau, có phổ ký chủ rất rộng, có khả năng gây hại trên 200 loại cây, đặc biệt gây hạinặng trên cây họ cà như cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ nhưđậu phụng, gừng, chuối [64] Bệnh rất khó phòng trừ do vi khuẩn có khả năng tồn tạilâu dài trong đất, trong cơ thể ký chủ thực vật như thân, hạt giống, củ giống, tàn dưthực vật,

Tác hại của bệnh héo xanh là rất nghiêm trọng, bệnh héo gây hại nặng có thể làmcây chết trên diện tích lớn, gây khuyết mật độ Bệnh gây hại làm ảnh hưởng đến năngsuất, có thể giảm từ 15-95%, thậm chí có khi lên tới 100% ảnh hưởng đến phẩm chấtrau quả khi thu hoạch [38] Chẳng hạn, đầu những năm 2000, bệnh héo xanh vi khuẩn(HXVK) đã làm giảm năng suất từ 30-80% trên các ruộng khoai lang ở Đài Loan [99].Theo dự báo của các nhà khoa học, cùng với sự thay đổi khí hậu toàn cầu, bệnhHXVK sẽ ngày càng gây hại nghiêm trọng hơn trong sản xuất

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới nóng ẩm càng thuận lợi cho bệnhphát triển Bệnh HXVK thường phát sinh và gây hại nặng ở các vùng chuyên canh raumàu truyền thống, bệnh gây hại hầu như trên cả nước, tuy nhiên mức độ nhiễm phụthuộc vào nhiều yếu tố như: chế độ luân canh cây trồng, kỹ thuật canh tác, Biệnpháp dùng hóa chất phòng chống bệnh HXVK được cho là ít có hiệu quả do vi khuẩn

có nguồn gốc từ đất xâm nhập và sinh sản trong hệ thống bó mạch của cây Hiện nayphương pháp ghép ngọn cà chua năng suất cao lên gốc cà tím EG203 có khả năngkháng bệnh HXVK đang được áp dụng rộng rãi và được xem là biện pháp hiệu quảnhất để phòng trị bệnh HXVK Tuy nhiên, hiện nay nhiều ruộng trồng cà chua ghépvẫn xuất hiện tỷ lệ cây bị bệnh cao, đặc biệt trong thời tiết nóng ẩm Điều này cho thấy

sự không bền vững của tính kháng Ralstonia solanacearum ở các giống Nguyên nhân

là do sự đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh và các yếu tố môi trường [96]

Chọn tạo giống mang gen kháng bệnh được xem là biện pháp ưu việt và hiệu quảnhất Nhưng tính kháng của giống phụ thuộc rất nhiều vào độ độc tính của các chủng

vi khuẩn Chính vì vậy để tạo ra được giống kháng bền vững phải hiểu được đặc điểm

di truyền cũng như độ độc tính của các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khác nhau

Để chọn tạo giống kháng bệnh cần định dạng được các chủng vi khuẩn gây bệnh và độđộc tính của từng chủng đến đối tượng gây bệnh Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một

tài liệu cụ thể nào nghiên cứu về phân loại và đánh giá độ độc tính của các chủng vi

khuẩn Ralstonia solanacearum tại Việt Nam.

Từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di

truyền và độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith được

thu thập tại các tỉnh phía Nam Việt Nam”.

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền và độc tính của các chủng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh HXVK.

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Ý nghĩa khoa học

Kết quả đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp đánh giá

đa dạng di truyền, phân loại và đánh giá độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum.

Ý nghĩa thực tiễn

- Phân loại được các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập tại phía

Nam Việt Nam để hỗ trợ trong việc thiết lập các chương trình kiểm soát bệnh HXVKtại Việt Nam

- Đánh giá được độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum góp

phần làm cơ sở cho việc chọn giống có tính kháng cao để bố trí trồng ở những vùngthích hợp với mục đích hạn chế bệnh cao nhất có thể

4 NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Cung cấp cho các nhà sinh học, nhà lai tạo giống, nghiên cứu bệnh học thông

tin về các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum tại các tỉnh ở phía Nam Việt Nam.

- Xác định được độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum tại

các tỉnh ở phía Nam Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 CÂY CÀ CHUA

Cây cà chua (Lyeopersicum esculentum Mill) thuộc họ Cà (Solanaceae) là một

trong những cây rau chính, chiếm vị trí thứ hai sau khoai tây, được trồng hầu hết ở cácnước trên thế giới Cà chua được sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau như ăn tươi,làm salat, nước uống hoặc chế biến làm dạng dự trữ, sản phẩm chế biến cũng có nhiềudạng như đống hộp dạng quả bốc vỏ, dạng cô đặc, nước sốt cà chua, mứt cà chua,

1.1.1 Giá trị dinh dưỡng

Theo bảng phân tích thành phần hoá học của Viện dinh dưỡng (Bộ Y tế), trong100g cà chua có 94g nước; 0,6g protit; 4,2g gluxit; 0,8g xenlulô; 12mg canxi; 26mgphotpho; 1,4mg sắt; các loại vitamin caroten cung cấp được 20kcalo [4]

Quả cà chua chín có màu đỏ tươi tạo màu đẹp và sự ngon miệng cho các món ăn.Màu đỏ này còn cho thấy hàm lượng vitamin A thiên nhiên trong cà chua cao, trung bìnhchỉ cần 100g cà chua chín còn tươi sẽ đáp ứng được 13% nhu cầu hằng ngày về vitamin

A, cũng như các vitamin B6, vitamin C Ngoài ra còn có các vitamin B1, B2, PP…[16].Các chất khoáng vi lượng có trong cà chua như canxi, sắt, kali, photpho, lưuhuỳnh, nickel, cobalt, iôt, các axit hữu cơ dưới dạng muối citrat và tuỳ theo môi trườngtrồng, trong cà chua có thể có cả đồng, molibden Chính nhờ các yếu tố này, cà chuađược coi là một thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, tăng cường sức đề khángcủa cơ thể

Khi so sánh thành phần dinh dưỡng của cà chua với một số rau quả khác như táo,chanh, anh đào, dâu tây thì Beeker-Billing thấy rằng: nhóm vitamin trong quả cà chuachiếm tỷ lệ cao hơn (vitamin A, C, B1, B2) đặc biệt là vitamin A và C gấp 10 lần dâutây, gấp 2 lần so với anh đào [21]

Ngoài ra, cà chua còn có tác dụng về mặt y học Theo Võ Văn Chí (1997) [6], càchua có vị ngọt tinh mát, giải nhiệt, kháng khuẩn, lọc máu, nhuận tràng, giúp hoạt hóatốt tinh bột Nước ép cà chua kích thích gan, tốt cho dạ dày Sắc tố lycopen trong càchua hiện đang được đánh giá cùng với bêta-caroten là những chất chống oxy hoámạnh, vừa ngăn chặn tế bào ung thư, vừa chống sự hình thành các cục máu đông trongthành mạch Cà chua cung cấp năng lượng, chất khoáng, làm tăng sức sống, làm cânbằng tế bào, khai vị, giải nhiệt, hoạt huyết, chống nhiễm khuẩn, chống nhiễm độc, làmkiềm hóa các quá trình axit, lợi tiểu, thải ure, giúp tiêu hóa dễ dàng tinh bột Cà chuađược chỉ định dùng ăn hay lấy dịch quả để uống trị suy nhược, ăn không ngon miệng,nhiễm độc mãn tính, thừa máu…

1.1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

Cà chua là loại cây trồng có lịch sử phát triển tương đối muộn nhưng lại là loạithực phẩm được ưa chuộng hàng đầu do có khả năng thích ứng rộng, hiệu quả kinh tế

và giá trị sử dụng cao Trên thế giới đã có nhiều giống mới được ra đời nhằm đáp ứngđược nhu cầu ngày càng cao của con người cả về số lượng và chất lượng

Theo FAO (2013), hiện nay có tới 158 nước trồng cà chua Diện tích, năng suất

và sản lượng cà chua trên thế giới cho đến năm 2013 như sau: 4725 nghìn ha, 34,69tấn/ha, 163,963 triệu tấn

Trong số 5 loại rau được trồng và sử dụng phổ biến nhất thế giới thì cà chua đứngthứ 2 chỉ sau khoai tây Diện tích lớn hơn nhiều lần so với các loại rau khác, cho thấyđược tầm quan trọng của cây cà chua trong vấn đề tiêu thụ và sử dụng của thế giới

Bảng 1.1 Diện tích 5 loại rau được trồng phổ biến trên thế giới (năm 2013)

Loại rau Diện tích (triệu ha)

1.1.3 Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam

Cà chua là cây mới du nhập vào Việt Nam được hơn 100 năm trở lại đây nhưng

đã trở thành một loại rau phổ biến và được sử dụng ngày càng rộng rãi Cà chua ởnước ta được trồng chủ yếu ở vụ Đông với diện tích khoảng 6.800-7.300 ha và thườngtập trung ở các tỉnh thuộc đồng bằng và trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hải Dương, VĩnhPhúc….), còn ở miền Nam tập trung ở các tỉnh An Giang, Tiền Giang, Lâm Đồng [1].Hiện nay có một số giống chịu nhiệt mới lai tạo chọn lọc có thể được trồng tại miềnTrung, Tây Nguyên và Nam bộ nên diện tích ngày càng được mở rộng Nhiều giống càchua lai ghép có chất lượng tốt được phát triển mạnh ở Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng Một sốgiống cà chua chất lượng đã được xuất khẩu ra thị trường thế giới

Ở nước ta, các giống cà chua được trồng chủ yếu thuộc 3 nhóm sau đây:

+ Cà chua múi: quả to, nhiều ngăn tạo thành múi Quả có vị chua nhiều hạt, ănkhông ngon nhưng cây con mọc khỏe, sai quả, chống chịu sâu bệnh khá Giống điểnhình là cà chua múi Hải Phòng

+ Cà chua hồng: quả hình quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ Thịtquả nhiều bột, ăn ngon Cây chống chịu sâu bệnh kém hơn cà chua múi, các giốngchính là: Đại Hồng, Yên Mỹ, Hp 5

+ Cà chua bi: cây sai quả, quả ăn chua Cây chống chịu sâu bệnh khá Nhóm càchua này dễ trồng nhưng giá trị kinh tế thấp, thường nông dân trồng trong vườn để tựtúc trong vụ hè

Sản xuất cà chua ở nước ta chủ yếu phục vụ nhu cầu tiêu dùng nội địa, việc sảnxuất tiêu thụ cà chua không cân đối, sản phẩm lúa thừa, lúc thiếu, giá cả không ổnđịnh Theo Trần Khắc Thi (2003) [30], tồn tại cơ bản trong sản xuất cà chua ở nước ta

là chưa có bộ giống tốt cho từng vụ trồng, sản phẩm tập trung chủ yếu trong vụ ĐôngXuân (70%), nửa thời gian trong năm (tháng 5-10) thiếu cà chua, đầu tư cho cà chuacòn thấp, chưa đồng đều ở các vùng, chưa có quy trình canh tác thích hợp cho mỗivùng, mỗi vụ trồng và các giống khác nhau Năng suất chưa cao trong khi đó cà chualại dễ bị nhiều nguồn sâu, bệnh hại tấn công, điển hình có bệnh HXVK làm giảm năngsuất từ 25-45% [28] Bên cạnh đó sản xuất manh mún, chưa có sản phẩm hàng hóa lớncho chế biến công nghiệp, quá trình canh tác, thu hái hoàn toàn thủ công Tuy nhiênsản xuất cà chua ở nước ta có nhiều lợi thế về đất đai, thời tiết, kinh nghiệm trồng trọt

và nguồn lao động Vì thế việc lựa chọn bộ giống cà chua có năng suất cao, có chấtlượng tốt và khả năng kháng bệnh HXVK cao đáp ứng các yêu cầu chế biến là một yêucầu bức thiết hiện nay ở nước ta

1.1.4 Các bệnh thường gặp trên cây cà chua

Việc trồng cà chua trong điều kiện nóng ẩm như ở nước ta, cây cà chua dễ mắcnhiều bệnh, đáng kể là các bệnh do vi khuẩn, virut, nấm gây ra

* Bệnh héo xanh vi khuẩn: Bệnh do vi khuẩn Ralstonia Solanacearum Smith gây

ra, cây héo đột ngột, lá vẫn còn xanh, có thể héo từng cành, bó mạch hóa nâu chứadịch nhờn màu trắng đục

* Bệnh héo vàng: Bệnh do nấm Rhizoctonia Solani làm mốc trắng gốc, cây héo,

lá gốc héo vàng, bó mạch thâm đen sau vài ngày cây bị bệnh và chết

* Bệnh mốc sương: Bệnh do nấm Phytophthora thuộc bộ sương mai, lớp nấm tảo

khuẩn gây ra Bệnh phá hoại tất cả các bộ phận trên và dưới mặt đất (lá, thân, cành, củ)

và kể cả lúc đang tồn trữ Bệnh gây hại nặng từ cuối tháng 12 đến hết tháng 2

* Bệnh xoăn lá: Bệnh do vi-rút gây ra Biểu hiện bệnh là ngọn xoăn vàng, nhăn

nheo, màu vàng xanh xen kẽ, lá nhỏ dị hình Nếu bị bệnh ở giai đoạn đầu, cây còi cọc,

đối với cây cà chua thì không ra, đối với khoai tây thì ra củ nhỏ Bệnh lan truyền bằngdịch cây, củ giống, hạt giống, qua tàn dư cây bệnh vụ trước, do bọ phấn chích húttruyền bệnh.

* Bệnh thán thư: bệnh do nấm Colletotrichum phomoides gây ra Bệnh thường

gây hại trên quả đang và đã chín, đôi khi ở trên quả già khi có mưa nhiều và độ ẩmkhông khí cao Đốm bệnh lúc đầu hình tròn, úng nước hơi lõm xuống Sau đó đốmbệnh lan dần ra, có đường kính 0,5-0,2 cm, tâm vết bệnh có màu nâu đen, viền màunâu xám Bên trong vết bệnh có nhiều vòng đồng tâm với những chấm nhỏ li ti màuđen nhô lên

Trong các bệnh kể trên thì bệnh HXVK là một trong những bệnh gây thiệt hạinặng nhất cho cây cà chua Bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Italy vào năm 1882,nghiên cứu chuyên khảo được Smith thực hiện vào năm 1986 tại Mỹ Cho đến naybệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các nước châu Á, Phi, Mỹ, Úc, bệnh gây hại nghiêmtrọng chủ yếu ở các nước vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm Bệnh cókhả năng lây lan nhanh gây chết hàng loạt, bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn, giảm năngsuất từ 5-100% tùy theo loại cây, giống cây, vùng địa lý và nhiều yếu tố khác

1.1.5 Thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra trên cà chua

Bệnh HXVK phân bố rộng rãi, phổ biến và gây tác hại nghiêm trọng ở vùng nhiệtđới, á nhiệt đới và những vùng có khí hậu ấm và ẩm trên thế giới [53]

Ở nhiều nước, bệnh HXVK đã là một yếu tố cản trở lớn đối với việc sản xuất rau

như Mỹ, Pháp, Úc, Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh HXVK là loài ký

sinh đa thực, với nhiều chủng, nòi khác nhau, thể hiện tính độc, khả năng gây bệnh,phân bố ở các vùng địa lý khác nhau

Trên cây cà chua mức độ thiệt hại có thể lên đến 81,5% trên giống mẫn cảmMarglobe và 47% đối với giống Talatuoya [37]

Nhiều vùng sản xuất cà chua trên thế giới, bệnh HXVK đã gây thiệt hại lớn đếnnăng suất, có khi lên tới 95%

Ở Brazil, tỷ lệ bệnh HXVK trung bình trên cà chua của 30 vùng điều tra là 13,1%trong đó có 7 vùng tỷ lệ bệnh từ 20,1-50% và một vùng tỷ lệ bệnh lớn hơn 90% [86]

Ở Việt Nam, vi khuẩn này đã được xác định có chủng (race) 1 gồm nòi sinh học(biovar) 3 và 4, đây là chủng có phạm vi ký chủ rộng, tồn tại lâu trong đất Vì thếngoài phá hoại trên cà chua, loài vi khuẩn này còn xâm nhiễm gây hại trên nhiều đốitượng cây trồng khác [13]

Đối với cà chua, hầu như các giống trồng trong sản xuất của nước ta đều nhiễm bệnh.

Sự phát sinh phát triển của bệnh HXVK trên cà chua có liên quan chặt chẽ với điều kiệnngoại cảnh như: nhiệt độ và độ ẩm đất, lượng mưa, gió, kết cấu và pH đất, v.v

Ở miền Bắc nước ta, bệnh HXVK hại cà chua đã và đang là một yếu tố hạn chếlớn nhất đối với các vùng chuyên canh rau màu hiện nay như Hà Nội, Bắc Ninh, HưngYên Ở miền Nam, bệnh xuất hiện cũng tương tự ở các vùng chuyên canh cà chua lớn

ở Đà Lạt, Lâm Đồng, Kiên Giang [13]

Tạ Thị Thu Cúc và cs (1983) [8] cho biết: trong các loại bệnh chủ yếu hại cây cà

chua như mốc sương, virus, bệnh HXVK thì bệnh HXVK do loài Ralstonia solanacearum gây hại nghiêm trọng nhất.

Trong thực tế sản xuất bệnh HXVK đã phát sinh gây hại ở hầu hết các vùng trồng

cà chua ở miền Bắc, đặc biệt là những địa phương có truyền thống trồng rau màu nhưkhu vực ngoại thành Hà Nội, Hải Phòng, Hưng Yên Theo Đỗ Tấn Dũng (1995a) [14]thiệt hại do vi khuẩn gây chết héo cây cà chua lên tới 70-80%, thậm chí có thể lên tới100%, nhất là cà chua vụ sớm và vụ muộn Chính vì thế bệnh HXVK đã và đang làvấn đề nan giải và nghiêm trọng đối với các vùng trồng rau trên cả nước

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM

Các bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất, trong đó vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith là nguyên nhân gây bệnh héo xanh phổ biến và nguy hiểm đã gây

tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp, nhất là các cây trồng có ý nghĩakinh tế như lạc, khoai tây, cà chua làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng củanông sản phẩm

Do các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trong đất nên việc chẩn đoán và công tácphòng trừ bệnh gặp rất nhiều khó khăn Các bệnh này rất khó phòng trừ bằng thuốchóa học nên càng bị lạm dụng, gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người, đất,nước, môi trường sinh thái

Mặt khác, hiện nay ở nước ta những nghiên cứu về chế phẩm sinh học để phòngtrừ các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trong đất hại cây trồng chưa được ứng dụngnhiều trong sản xuất

Vì vậy, những nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền và độc tính của vi khuẩn

Ralstonia solanacearum sẽ góp phần tích cực trong việc tạo ra các giống kháng bệnh,

hay các chế phẩm sinh học,… để nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên một

số cây trồng cạn là điều cấp thiết hiện nay

1.2.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Tế bào loài Ralstonia solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu,

thường ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi Tuy có sự dao độngđáng kể nhưng kích thước của chúng khoảng 0,5-0,7 µm x 1,0-2,0 µm (Stevention, W

R và cs, 2001) (dẫn theo Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2014) [32] Hầu như chúng luônchuyển động, có một đến vài tiên mao ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thườngnhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng hoặctrắng Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [74]

1.2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Ralstonia solanacearum là loại vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử, có

thể sinh trưởng trên nhiều loại môi trường khác nhau Nó có thể tổng hợp sắc tốkhuếch tán nitrat thành nitrit và tạo ra khí nhưng không thể thủy phân tinh bột, hóa

lỏng yếu hoặc không hóa lỏng getatin Ralstonia solanacearum có khả năng tạo ra

H2S, khử nitrat, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidasa và catalasa, ure,pectin, oxi hóa axetat, malonat và gluconat [13]

1.2.1.2 Các hình thức xâm nhập của Ralstonia solanacearum vào cây chủ

Ralstonia solanacearum xâm nhiễm vào rễ, gốc thân, thân và cuống lá qua vết

thương xây xát do nhổ cây con giống, do kỹ thuật chăm sóc hoặc thông qua côn trùng

như: ong, kiến hoặc các loại sâu gây hại khác v v có mang Ralstonia solanacearum,

chúng chích vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào cây chủ, hình thức này cóthể là rất phổ biến và lan truyền nhanh

Vi khuẩn sau khi xâm nhiễm vào rễ, thân cuống lá qua các vết thương cơ giới donhổ cây giống đem về trồng, do côn trùng hoặc tuyến trùng tạo ra, do chăm sóc vuntrồng…Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào qua các lỗ hở tự nhiên, qua bì khổng trên

củ (khoai tây) Sau khi đã xâm nhập vào rễ lan tới các bó mạch dẫn xylem, sinh sảnphát triển ở trong đó Sản sinh ra các men pectinaza và cellulaza để phân huỷ mô, sinh

ra các độc tố ở dạng exopolysaccarit (EPS) và lipopolysacrit (LPS) vít tắc mạch dẫncản trở sự vận chuyển nước và nhựa trong cây, dẫn tới cây héo nhanh chóng

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Bệnh héo xanh thường xuất hiện ở những vùng có khí hậu nóng ẩm

Nhiệt độ không khí: nhiệt độ thích hợp cho Ralstonia solanacearum phát triển là

25-35oC, nhiệt độ tối thiểu 10oC tối đa là 41oC, pH thích hợp 6,8-7,2 [55] Tốc độ pháttriển của bệnh tăng sau khi lây nhiễm nếu nhiệt độ tăng trong phạm vi 26,7-37,8oC.Nhiệt độ cao làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong cây chủ, dẫn

đến cây bị héo nhanh hơn, số lượng vi khuẩn xâm nhiễm vào đất nhiều hơn, dẫn đến

sự xâm nhiễm vào cây bên cạnh cũng tăng lên

Nhiệt độ đất: Nhiệt độ trên 25oC và ở độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm của đất cao làđiều kiện thuận lợi cho bệnh héo xanh phát triển [62]

Ngoài nhiệt độ không khí, nhiệt độ của đất cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến

sinh trưởng và phát triển của Ralstonia solanacearum

Cường độ chiếu sáng: đã có một số nghiên cứu, khảo sát ảnh hưởng phối hợp củacường độ chiếu sáng và chu kỳ quang lên sức đề kháng của cây chủ đối với vi khuẩngây bệnh héo xanh Cường độ chiếu sáng giảm, không làm giảm sức đề kháng của càchua 1169 đối với chủng vi khuẩn LB-6 ở nhiệt độ 26,6oC, trong khi đó làm giảm rấtđáng kể sức đề kháng của cà chua ở 29oC [50]

Độ ẩm của đất: độ ẩm cao của đất thường thấy ở những nơi đất phẳng, đất ruộng,vùng bình nguyên hoặc những vùng có mưa lớn, nói chung rất thuận lợi cho vi khuẩnphát triển Sức đề kháng của vi khuẩn gây bệnh là rất lớn ở những nơi đất ẩm, nhưngchúng sẽ bị tổn thương nặng khi đất gặp hạn và ngập nước, nhưng không tăng sinh ở

đất khô Mức độ giảm quần thể Ralstonia solanacearum trong đất bị sấy khô xảy ra

chậm hơn so với đất bị xử lý ướt (ngập nước) [10]

Năm 1992, Chae Gun Phea [43] phát hiện ra rằng, sự xâm nhiễm không xảy ra ởtrên cát, nhưng nó lại là cao nhất ở đất thịt nặng, một mẫu đất sẽ không cản trở vikhuẩn gây bệnh phát triển nhưng lại không cho phép bệnh phát triển, điều này dễ nhậnthấy bởi tỷ lệ cây chủ bị chết giảm, có thể nhờ sự tồn tại một thành phần nào đó ởtrong đất (như canxi chẳng hạn), trong trường hợp cụ thể này, nó ức chế vi khuẩn gâybệnh phát triển đồng thời làm giảm mức độ gây hại của chúng

1.2.1.4 Các chủng nòi (race, biovar) của vi khuẩn

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài kí sinh đa thực, chúng gây bệnh trên các

loài ký chủ với các chủng sinh lý khác nhau ở mỗi loài, mỗi giống cây trồng, mỗi vùngmiền khác nhau có thể chỉ nhiễm một hay một số chủng của chúng và ở những mức độnặng nhẹ khác nhau

Loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum, không phải là một đơn vi khuẩn đồng

dạng về sinh học hay phạm vi ký chủ, mà là một nhóm các dòng vi khuẩn biến thểphức tạp, vi khuẩn rất dễ biến dị, phân hóa thành nhiều chủng, thể hiện qua các race,biovar, phylotye, khác nhau về phạm vi ký chủ, sự phân bố địa lý và khả năng tồn tạidưới những môi trường khác nhau

Dựa vào khả năng sử dụng, oxy hóa 3 loại rượu mạch vòng (hexose alcohol) làmanitol, sorbitol, dulcitol và 3 loại đường lactoza, maltoza, cellobioza Hua et al (1984)[57] đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn đến biovar (thứ sinh học) Theo Buddenhagen

(1962) [41], Hayward (1964) [52] đã xác định loài Ralstonia solanacearum có 5 biovar

gây bệnh HXVK, đó là:

Biovar 1: không có phản ứng oxy hóa cả hai nhóm đường và nhóm rượu

Biovar 2: chỉ oxy hóa nhóm đường và không oxy hóa nhóm rượu

Biovar 3: có phản ứng oxy hóa của nhóm đường và nhóm rượu

Biovar4: chỉ có phản ứng oxy hóa nhóm rượu

Biovar 5: chỉ oxy hóa lactoza, maltazo, cellobioza và manitol mà không oxy hóasorbitol vàddulcitol

Cho đến nay, đã có nhiều tác giả công bố kết quả nghiên cứu về race của loài

Ralstonia solanacearum Người ta đã phát hiện công bố 5 race khác nhau trên cơ bản

phân biệt về phạm vi ký chủ, phân bố địa lý và khả năng tồn tại ở những môi trườngkhác nhau

Race 1 bao gồm biovar 1, 3, 4 có phổ ký chủ rộng, phân bố ở khắp các vùng đấtthấp nhiệt đới, cận nhiệt đới, gây bệnh chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà như càchua, khoai tây, thuốc lá, ớt, một số cây cỏ dại và các cây thuộc họ cà khác

Race 2 gồm biovar 1 gây héo chuối có phân bố hẹp ở một số nước, chủ yếu ởvùng Trung và Nam Mỹ, nhưng hiện nay đã phát hiện thấy chủng này ở một số nướcthuộc châu Á

Race 3 bao gồm biovar 2 gây hại chủ yếu trên khoai tây, cà chua và một số cây

ký chủ là cỏ dại Nhóm này có độc tính cao đối với các cây thuộc họ cà

Race 4 gồm biovar 4 gây héo cây gừng ở Trung Quốc, Philippin và một sốnước khác

Race 5, biovar 5 chỉ gây hại ở cây dâu tằm

Theo Buddenhagen (1986) [40], các đặc điểm sinh học của race 4 và 5, chưađược xác định rõ ràng

Gần đây, một cách phân loại khác dựa trên các trình tự gen hrpB, egl và mutS, vi

khuẩn này chia ra 4 phylotype [46] : Phylotype I: 144bp; phylotype II: 371bp;phylotype III: 91bp; phylotype IV: 213 bp

1.2.1.5 Tính độc của vi khuẩn

Tính độc của vi khuẩn có mối quan hệ với hình thái khuẩn lạc và các race tổng

hợp polysachrit ngoại bào [54] Các biovar đột biến của Ralstonia solanacearum có

thể được phát hiện dễ dàng khi chúng được cấy vạch trên môi trường thạch Kelman có2,3,5-triphenyl tetrazolium clorit (TTC) sau 36-48 giờ [54] Môi trường TTC là môitrường chỉ thị của vi khuẩn gây bệnh héo xanh và được sử dụng để phát hiện các dòng

vi khuẩn còn độc tính Những đột biến có tính độc thường hình thành các khuẩn lạcmàu trắng, thể nhầy lỏng, khoanh tròn mực với màu phớt hồng ở tâm Những khuẩnlạc của vi khuẩn bị mất độc tính thường nhỏ, màu kem hay đỏ sẫm Khả năng tổng hợp

chất nhầy polysacharit là một thuộc tính chung của tất cả các chủng phân lập Ralstonia solanacearum có tính độc Tuy nhiên sự tương quan giữa khả năng tổng hợp chất nhầy

và tính độc của vi khuẩn rất phức tạp

Về mặt sinh hóa của tính độc, khi nghiên cứu so sánh sự tổng hợp IAA (axit indol

3-axetic) ở Ralstonia solanacearum dạng chảy không cố định có độc tính và dạng chảy

không độc, Sequeira and Williams (1963) [85] đã phát hiện ra rằng cả hai dạng đềutổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi tryptophan không có mặt trong môi trường nuôi

cấy Khi cấy trên môi trường TTC, tế bào vi khuẩn Ralstonia solanacearum tạo thành

các khuẩn lạc có bề mặt nhẵn, hơi chảy, màu trắng đục ở rìa và phớt hồng ở tâm

1.2.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên thế giới

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài ký sinh đa thực Nó có thể tồn tại lâu

dài trong đất, trong tàn dư cây bệnh và trên cỏ dại Nhiều công trình của các tác giả

trước đây đã công bố cho thấy sự tồn tại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum ảnh

hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường như: nhiệt độ và độ ẩm đất

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh cho hơn 200 loài cây trong hơn 50 họ bao gồm cây trồng, cây cảnh và cỏ dại Ralstonia solanacearum phân bố rộng

trên toàn thế giới từ vùng nhiệt đới đến vùng ôn đới (Châu Á, Bắc Á) Đây là vi khuẩngây bệnh và lây lan trong đất và nước Vi khuẩn có thể tồn tại nhiều năm ở một số loại

đất Tuy nhiên sự tồn tại đó phụ thuộc vào race của loài Ralstonia solanacearum có

mặt trong đất và thường race 1 tồn tại nhiều năm hơn so với race 3 do khả năng sống

sót của race 3 bị giảm sút nhanh [73] Ở lớp đất có độ sâu 55-65cm vi khuẩn Ralstonia solanacearum race 3, biovar 2 có thể tồn tại được 82 ngày, còn ở lớp đất bề mặt (10-

15cm) thì race 3 chỉ tồn tại được 10 ngày Ở Nhật Bản, Okabe (1975) [77] đã phát hiện

thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở độ sâu 80-100cm trên cánh đồng trồng thuốc

lá bị nhiễm bệnh tự nhiên sau thu hoạch 4 tháng

Ralstonia solanacearum là một trong những loại vi khuẩn phá hoại cây nghiêm

trọng nhất trên toàn thế giới và hàng năm gây thiệt hại cho ngành nông nghiệp hàng tỉ

đô la Mỹ Vi khuẩn Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 (R3bv2) không xuất hiện

ở Mỹ nhưng khả năng lây nhiễm vào nước này rất cao thông qua con đường nhậpkhẩu cành giâm cây hoa phong lữ được sản xuất tại nước ngoài Nếu vi khuẩn R3bv2này lây nhiễm vào Mỹ sẽ dẫn tới hậu quả nghiêm trọng cho ngành sản xuất khoai tây

Vi khuẩn này đã được liệt vào danh sách các tác nhân gây bệnh trên cây và có điềuluật kiểm tra an toàn sinh học chặt chẽ tại Mỹ [56]

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là tác nhân gây bệnh trong đất và trong nước,

vi khuẩn này có thể tồn tại và phân tán trong một thời gian dài trong đất hoặc nước bịnhiễm khuẩn Vi khuẩn thường lây nhiễm thông qua rễ cây khoai tây (thông qua cácvết thương hoặc tại các điểm xuất hiện của rễ bên) Các sinh vật trong đất như giuntròn có thể gây ra tổn thương cho rễ cây và tạo điều kiện cho sự xâm nhập của vikhuẩn vào cây Trong một số trường hợp, vi khuẩn từ cây bị nhiễm bệnh có thể lây lanqua các cây chưa bị nhiễm bệnh qua nước tưới Từ những nguồn bệnh đó, vi khuẩn cóthể lây lan từ những ruộng bị nhiễm bệnh đến các ruộng chưa bị nhiễm bệnh qua đấtdính trên nông cụ, nước tưới hay do mưa

Trong điều kiện nhiệt độ thấp (<4oC) mật độ vi khuẩn giảm nhanh chóng nhưng

vi khuẩn vẫn có thể tồn tại và thường ở trạng thái tiềm ẩn Trong môi trường tự nhiên,

vi khuẩn Ralstonia solanacerum biovar 3 race 2 có thể sống sót qua mùa đông trong cỏ

dại bán thủy sinh, trong các phần sót lại của cây trên ruộng hoặc trong vùng đất quanh

rễ của các cây ký chủ [79]

1.2.3 Nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở trong nước

Theo Tạ Thị Thu Cúc và cs (1983) [8], vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài

gây hại nghiêm trọng trên cà chua Đặc biệt ở các vùng trồng cà chua đất trũng, khôngthoát nước, đất thịt năng hoặc chân đất bón nhiều đạm, không cân đối với lân và kali.Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) [20] khi nghiên cứu nguyên nhân gây

bệnh HXVK hại lạc đã thấy rằng loài Ralstonia solanacearum được phân lập từ các

mẫu bệnh thu thập từ các vùng khác nhau có tính độc khác nhau Điều đó có nghĩa làcần thiết phải chọn lọc ra các giống kháng thích hợp với các vùng sinh thái

Nghiên cứu về phạm vi ký chủ của loài Ralstonia solanacearum Smith, Đoàn Thị Thanh và cs (1995) [29] cho rằng vi khuẩn Ralstonia solanancearum không những gây

hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà.Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ

yếu trên các cây thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminasae).

Theo tác giả Lê Lương Tề (1997a) [25] cho biết vi khuẩn xâm nhập qua vếtthương xây xát và di chuyển trong bó mạch ở thân, lá, sản sinh độc tố có tác động gâyhéo Các yếu tố thời tiết như nhiệt độ, ẩm độ cao sẽ làm bệnh hại năng hơn

Nguyễn Thi Yến và cs (2002) [36] trong khi nghiên cứu thành phần nòi biovar vikhuẩn trên cây trồng cạn đã thu được kết quả: các isolate vi khuẩn héo xanh thu thậpđược từ các vùng trồng cà chua, khoai tây ở miền Bắc Việt Nam chủ yếu thuộc biovar

3 Các isolate thu thập trên lạc chủ yếu thuộc biovar 3 và 4, các biovar 3 và 4 đều gâybệnh trên cà chua, khoai tây, thuốc lá và cà

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN

1.3.1 Triệu chứng bệnh

Bệnh xuất hiện gây hại từ khi cây con đến khi thu hoạch nhưng gây hại chủ yếu

từ ra hoa đến thu quả đợt đầu Đặc điểm của bệnh là cây héo đột ngột, chết nhanh mà

lá không kịp chuyển màu vàng Cây mới bị bệnh thường héo vào ban ngày, lúc nắng to

và tươi lại vào sáng sớm và chiều mát, sau một vài ngày thì cây héo rũ rồi chết hẳn.Lõi cây và rễ bị úng nước và sau đó chuyển màu nâu Đôi khi lõi cây trở nên rỗng Rễ

có thể mọc ra từ thân cây sau đó chuyển vàng và thối rễ, số lá khô và héo tăng cho đếnkhi cây chết Quá trình này có thể diễn ra rất nhanh Khi cây mới bị bệnh nếu cắtngang đoạn thân gần rễ dài 3-5cm nhúng trong cốc nước sạch sau vài phút có dòngdịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra ở đầu lát cắt Đó là triệu chứng bệnh HXVK Chấtdịch này được gọi là ooze và chứa nhiều vi khuẩn Các mô thân gỗ chuyển sang màunâu và có thể bắt đầu mọc ra từ thân cây Vi khuẩn gây thối nhũn có thể xâm nhiễmvào các bộ phận của cây Cây cà chua nhiễm bệnh vào mọi giai đoạn sinh trưởngnhưng mạnh nhất vào thời kỳ cây ra hoa, kết quả, quả lớn

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát sinh bệnh

Do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra Vi khuẩn phát triển thích hợp ở pH

6,8-7,2 Nhiệt độ thích hợp 25-35oC Nhiệt độ gây chết 52oC

Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác trên đồng ruộng nhờ nước tưới, nướcmưa, gió bụi, đất bám dính ở các dụng cụ dùng để vun sới, chăm sóc cây Vai trò của

tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita và các loài tuyến trùng khác hoạt động ở

trong đất, tạo vết thương cho vi khuẩn lan truyền, lây bệnh hỗn hợp rất đáng chú ý đểngăn ngừa

Nguồn bệnh của bệnh HXVK hại cà chua có thể tồn tại ở nhiều dạng khác nhau:

vi khuẩn có thể sống lâu trong đất, trong tàn dư cây bệnh, trong vật liệu giống nhiễmbệnh, trong các cây kí chủ phụ thuộc họ cà và cỏ dại là ký chủ của bệnh

Bệnh xuất hiện gây hại ở cả giai đoạn vườn ươm cây con và ở ruộng trồng ngoàisản xuất, gây hại nặng khi cây cà chua đã lớn, nhất là giai đoạn ra nụ - hoa đến hìnhthành quả non - quả già thu hoạch Ở giai đoạn cây con nhiễm bệnh thường làm toàn

bộ lá héo rũ nhanh chóng, lá héo xanh gục xuống, cây chết xanh

Bệnh phát triển mạnh và nhanh trong điều kiện nhiệt độ cao, mưa gió, nhất là ởtrên đất cát pha, thịt nhẹ hoặc đất đã nhiễm vi khuẩn, trồng các giống mẫn cảm từtrước Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phát sinh phát triển của bệnh.Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển trong khoảng từ 25-35 nhiệt độ tối thiểu

là 10 và tối đa là 52 ; pH thích hợp 6,8-7,2 [66] Độ ẩm đất và các vi sinh vật đối

kháng cũng là những yếu tố hạn chế quan trọng khống chế hay thúc đẩy phát triển của

bệnh Lượng mưa cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum Ở những vùng có mưa nhiều, nhiệt độ đất và không khí trong khoảng

25-35 bệnh thường gây thiệt hại nặng nề về kinh tế Sau những trận mưa, thời tiếtnóng hoặc xen kẽ giữa ngày mưa và nắng ấm sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh pháttriển nhanh và hậu quả là bệnh sẽ xảy ra nghiêm trọng [89] Đất khô ải hoặc ngâmnước dài ngày (luân canh lúa nước), bón phân đạm hữu cơ, phân hoai mục với lượngcao (thâm canh) đều có khả năng làm giảm bệnh

Nguồn bệnh vi khuẩn đầu tiên lưu truyền qua vụ khác là đất, tàn dư cây bệnh vàgiống (khoai tây) Ở trong đất vi khuẩn có thể bảo tồn sức sống lâu dài tới 5-6 nămhoặc 6-7 tháng tuỳ thuộc vào ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, loại đất, các yếu tố sinhvật và các yếu tố khác Đối với cà chua, hầu như các giống trồng trong sản xuất củanước ta đều nhiễm Sự phát sinh phát triển của bệnh HXVK trên cà chua có liên quanchặt chẽ với điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ và độ ẩm đất, lượng mưa, gió, kết cấu

và pH đất, v.v

1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh héo xanh vi khuẩn

Một phương pháp phát hiện, chẩn đoán bệnh HXVK nhanh ngoài đồng ruộngthông thường được áp dụng là dựa vào triệu chứng bệnh điển hình trên cây như héo,

bó mạch màu nâu, thâm đen Để xác định thêm độ chính xác khi cây mới bị bệnh, nếu cắtngang đoạn thân gần rễ dài 3-5cm nhúng trong cốc nước sạch sau vài phút thấy có dòngdịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra ở đầu lát cắt Đó là triệu chứng bệnh HXVK [65]

Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy trên thuốc lá: tiêm dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum nồng độ 108-109 tế bào/1ml vào mô lá thuốc lá Sau 24-48 giờ quan sát

thấy đốm hoại tử có màu sáng chuyển dần sang màu sẫm, còn nếu là vi khuẩn hoạisinh hoặc mất khả năng gây bệnh thì không có hiện tượng mô bị chết [67]

Phương pháp phân ly, nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc nhân tạo: trên

môi trường TTC thì khuẩn lạc của loài Ralstonia solanacearum có rìa không đều,

nhầy, rìa trắng sữa, ở giữa có phớt hồng nhạt [63]

Phương pháp PCR chẩn đoán và giám định loài Ralstonia solanacearum bằng việc sử dụng cặp mồi AU.P759/760 [78] đặc hiệu cho loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum Trong thực tế thì phương pháp PCR tỏ ra rất nhanh, nhạy, đặc hiệu và

hiệu quả cao hơn

1.3.4 Biện pháp phòng trừ

Bệnh HXVK do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra có nguồn gốc từ đất, có

khả năng tồn tại lâu dài trong đất, trong cơ thể ký chủ thực vật như thân, hạt giống, củgiống, tàn dư thực vật, phân bố rộng khắp ở các vùng trên thế giới nên là loại bệnh rất

khó phòng trừ, con người rất khó kiểm soát bởi nhiều yếu tố như cây trồng, điều kiệnkinh tế xã hội, điều kiện tự nhiên hơn thế vi khuẩn lại có sự phân hóa thành nhiềurace, biovar có tính chuyên hóa khác nhau và có khả năng biến thể tùy theo điều kiện

tự nhiên Vì vậy, việc áp dụng biện pháp phòng chống bệnh HXVK riêng rẽ sẽ khôngđem lại hiệu quả như mong muốn

Để phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả, theo Hayward (1994) [51] thì phải ápdụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp, kết hợp hài hòa các biện pháp như dùng giốngkháng bệnh, sử dụng các biện pháp sinh học, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học,cần có hiểu biết trạng thái của cây, các race và biovar của vi khuẩn gây bệnh vàphương thức lan truyền

1.3.4.1 Biện pháp sử dụng giống kháng

Đây là một trong các biện pháp quan trọng và mang lại hiệu quả kinh tế nhấttrong phòng chống bệnh HXVK Nhiều giống kháng trên khoai tây, cà chua, thuốc lá,lạc cũng như các cây trồng khác đã đem lại hiệu quả trong việc phòng chống bệnhHXVK

Nguyễn Thị Vân và cs, 2014 [34] đã nghiên cứu chọn tạo giống vừng chống chịubệnh HXVK trên một số vùng trồng chính ở Nghệ An Kết quả cũng đã chọn lọc được

12 dòng giống vừng mang nhiều đặc tính nông học tốt và kháng bệnh HXVK Trong

đó có các dòng vừng số 10 có tiềm năng đưa vào sản xuất, đạt năng suất 9,1 tạ/ha,thích ứng cao với cơ cấu cây trồng cây giống trong vụ Hè Thu tại Nghệ An

Đỗ Văn Tuân và cs, 2014 [33] thực hiện các nghiên cứu phân lập và khảo sát khả

năng kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum của vi tảo Scenedesmus quadricauda Dịch chiết tảo Scenedesmus quadricauda trong dung môi methanol và n-hexan thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Nghiên cứu này sẽ là cơ sở

xây dựng được các nhóm chất kháng khuẩn dựa trên cơ chế kháng vi khuẩn của vi tảo.Chọn tạo các giống kháng bệnh HXVK cũng đã được thực hiện bởi AVRDC vàcác nhóm nghiên cứu khác [84] Tuy nhiên, sự kháng bệnh của các giống đó không ổnđịnh do sự đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh và các yếu tố môi trường nhưnhiệt độ cao [59] và các chủng đặc hiệu [49], [92], [93]

Để khắc phục điều này, phương pháp ghép cà chua trên cây cà kháng bệnh đã

được áp dụng Kỹ thuật ghép cà chua trên gốc cà tím (Solanum intergrifolium) đã được

Nhật Bản áp dụng từ những năm 50 của thế kỷ XX Wang (2000) [96] đã sử dụng 3giống cà tím kháng bệnh HXVK là EG 190, EG 203, EG 219 làm gốc ghép và dùngcành ghép là giống cà chua quả nhỏ: santana, ASVEG#6 Sau đó cây ghép được lâynhiễm nhân tạo và trồng trong nhà lưới Kết quả là trong vụ hè ở giống ASVEG#6 có

từ 20-31,8% số cây bị bệnh so với 100% số cây đối chứng không được ghép bị chết dobệnh HXVK.

Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng gốc ghép để hạn chếbệnh HXVK Chọn gốc cà tím EG 203 ở vùng đất thoát nước kém làm gốc ghép hoặc

sử dụng ngọn là cà chua Red Crown 250 ghép lên cà chua Đà Lạt vừa cho năng suấtcao lại đảm bảo tính kháng bệnh HXVK tốt, giảm tỉ lệ bệnh xuống 2,5% [3]

và 7,5% ở năm thứ 5

Biện pháp xen canh cũng đem lại hiệu quả trong phòng chống bệnh HXVK Xencây giữa khoai tây với ngô hoặc đậu cove đã làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh trênkhoai tây [45]

Vôi thường được sử dụng để phòng trừ các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trongđất Nó có thể tác động đến tiểu khí hậu trong đất, kích thích hoạt động của các vi sinhvật đối kháng Nó có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng chống chịu lại điều kiệnbất thuận

Một số nghiên cứu trong phòng trừ bệnh HXVK như sử dụng thuốc kháng sinh

Streptomycine, sử dụng vi khuẩn đối kháng B.subtilis, P.fluorescent được nghiên cứu

chủ yếu trong phòng thí nghiệm tuy nhiên hiệu quả còn thấp, chưa ổn định và chưađược áp dụng trong sản xuất [47] Tại Mỹ một loại chủng không phải tác nhân gâybệnh của vi khuẩn đã được bán như một tác nhân phòng trừ sinh học Các tác nhânphòng trừ sinh học không gây bệnh trong tương lai sẽ được bán trên thị trường châu

Á.

1.3.4.4 Biện pháp hóa học

Phòng chống bệnh HXVK bằng biện pháp hóa học nhìn chung ít hiệu quả, tốnkém và khó thực hiện do vi khuẩn tồn tại trong đất, xâm nhiễm và sinh sản trong mạch

dẫn của cây Dùng các chế phẩm kháng sinh được coi là biện pháp triển vọng thay thếthuốc hóa học Tuy nhiên, dùng các kháng sinh dễ tạo ra các dạng, chủng vi khuẩn mớikháng thuốc Hơn nữa, giá thành thuốc kháng sinh cao là một trở ngại lớn cho việcứng dụng rộng rãi.

Ngoài ra, một số biện pháp khác nhằm hạn chế sự phát sinh phát triển của vi

khuẩn Ralstonia solanacearum như vệ sinh đồng ruộng, dọn sạch tàn dư cây bệnh.

Việc kết hợp các biện pháp canh tác với các biện pháp vệ sinh có thể làm giảm và làmchậm quá trình xâm nhiễm

Việc bỏ hóa chất trong một vài tháng đồng thời trừ cỏ có hiệu quả trong việcphòng chống bệnh HXVK

1.3.4.5 Một số biện pháp khác

Thu hạt giống khỏe, sạch bệnh trên những cây trồng không bị nhiễm bệnh đểgiống, xử lý hạt giống trước khi gieo trồng, khử trùng cây giống, đất trồng, dụng cụ đểdiệt vi khuẩn là cách phòng tránh lây lan bệnh HXVK trên đồng ruộng

Độ ẩm của hạt cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh pháttriển của vi khuẩn, độ ẩm của hạt < 8,9% hầu như vi khuẩn gây hại không phát sinhđược Xử lý hạt giống trong nước nóng 50oC trong 25 phút làm giảm hiệu quả vikhuẩn bám vào hạt giống

Bón phân hợp lý và cân đối đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng ở từng thời kì sinhtrưởng của cây cà chua Bón phân ủ có thể làm giảm tỷ lệ bệnh HXVK, đó là do được

vệ sinh đồng ruộng và do cấu trúc và độ màu của đất được cải thiện Các vật chất hữu

cơ cao trong đất cải thiện điều kiện sinh sống cho các vi sinh vật, trong đó gồm cả

những vi sinh vật đối kháng có thể chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum Ở Đài

Loan người ta đã nghiên cứu tác dụng của việc bón bột khô và tàn dư của các loại hành

và tàn dư cây tỏi nhằm cải tạo đất ảnh hưởng đến việc phòng trừ bệnh HXVK Nghiêncứu cho thấy nếu bón thêm 1% bột hành khô (không có rễ) cho đất trong chậu trồng càchua sẽ làm giảm đáng kể bệnh HXVK Tuy nhiên khi đưa thí nghiệm ra ngoài đồngruộng thì tác dụng của biện pháp này không thể hiện rõ Việc bón phân xanh cây mùtạt vào đất cũng cho hiệu quả kìm hãm bệnh HXVK

Nhằm nâng cao năng suất và phẩm chất cây trồng, theo Đỗ Tấn Dũng (2001) [13]phải xây dựng hệ thống tổng hợp các biện pháp phòng trừ một cách đúng đắn, đảm bảothu hoạch có năng xuất cao, phẩm chất tốt và ổn định Tuyển chọn và tạo ra các giốngchống chịu bệnh, sạch bệnh, chất lượng tốt Kỹ thuật canh tác ngoài tác dụng làm chocây sinh trưởng, phát triển đạt năng suất cao, đồng thời hạn chế, tiêu diệt bệnh hại Do

đó cần áp dụng cụ thể ngay từ khi gieo hạt cho đến khi thu hoạch Đất vườn ươm sạch

sẽ không có tàn dư cây bệnh Luân canh cây cà chua, khoai tây với cây trồng nước

(lúa) hoặc cây trồng cạn không là ký chủ, lên luống cao dễ thoát nước tránh ngập úng.Kết hợp với công tác bón phân cân đối, chăm sóc chu đáo như bón lót tro bếp, hoặcvôi có tác dụng làm giảm tỷ lệ bệnh Ngoài ra cần chú trọng việc điều tra, nhổ bỏ kịpthời cây bị héo rũ, tiêu độc chỗ cây bệnh bằng bón vôi, formo l2% hoặc Cuso Cầnthiết thì dùng thuốc để phun phòng Streptomycine 50-200 ppm hoặc bón, tưới một sốchế phẩm sinh học Trichoderma viride.

1.3.5 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới

Bệnh héo xanh vi khuẩn là một trong các bệnh gây hại nghiêm trọng đến năngsuất và chất lượng cây lạc, cây khoai tây ở nhiều nước trên thế giới Vi khuẩn được

Smith nghiên cứu và đặt tên là Ralstonia solanacearum từ năm 1896 Bệnh HXVK là

loại bệnh quan trọng và điển hình nhất ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và những vùng

có khí hậu ôn đới trên thế giới [51], [81] Bệnh gây nên những thiệt hại nghiêm trọng

về kinh tế, làm giảm năng suất trên nhiều cây trồng từ 15-95%, thậm chí 100% trêncây cà chua [38], đến 70% trên cây khoai tây [87] và 90% trên cây lạc [71] BệnhHXVK phân bố rộng rãi, phổ biến và gây tác hại nghiêm trọng ở vùng nhiệt đới, ánhiệt đới và những vùng có khí hậu ấm và ẩm trên thế giới [53], [65] Trên cây lạc,bệnh HXVK đã được công bố ở Indonesia vào năm 1905 và mức độ gây hại có thể làmgiảm năng suất 90% đối với lạc, 16% đối với cà chua và 18% đối với khoai tây.Hàng năm ước tính thiệt hại do bệnh HXVK trên lạc từ 50.000 đến 150.000 tấn [72]

Ở Trung Quốc, bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng vàphân bố rộng rãi không chỉ có trên cây họ cà như cà chua, cây cà, khoai tây, thuốc lá,

gừng mà còn gây hại phổ biến trên cây thân gỗ như ôliu (Olea europoeo), cây dâu (Morus alba) [54].

Trên cây lạc bệnh HXVK được phát hiện từ những năm 1930 ở những vùng trồnglạc phía nam Với diện tích trồng lạc 3,3 triệu ha, hàng năm có tới 200.000 ha (khoảng6% trong tổng diện tích) bị nhiễm bệnh với mức độ phân bố rộng rãi ở 17 tỉnh trồnglạc Mức độ nhiễm bệnh rất khác nhau và thay đổi theo vùng với 1-5% ở các vùng cóluân canh lạc - lúa, 10-30% ở những vùng khô, còn những vùng bị nặng tỷ lệ này lênđến 50% [76] Bệnh gây thiệt hại ước tính từ 45.000-65.000 tấn lạc hàng năm[88] Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hạinghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng [74] Trên cây lạc tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình

từ 5-20% và là nguyên nhân chính làm diện tích trồng lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn1.318 ha năm 1986 với sản lượng tương ứng từ 19.437 tấn giảm còn 5.000 tấn

Bệnh HXVK cũng được phát hiện trên các cây trồng khác như: cà chua, khoai

tây, thuốc lá, cây cà [70] Bệnh HXVK do vi khuẩn Ralstonia solanacearum là một

bệnh hại nghiêm trọng có phân bố rộng rãi ở Thái Lan Bệnh làm giảm năng suất đáng

kể đối với cà chua, khoai tây, gừng, cà, ớt, thuốc lá, lạc, vừng [91]

Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Smith) gây ra là một

vấn đề nghiêm trọng trong ngành công nghiệp sản xuất khoai tây ở Malawi dolàm giảm năng suất và chất lượng bảo quản của củ sau khi thu hoạch Để định lượngmức độ và tỷ lệ mắc bệnh, một cuộc khảo sát về kiến thức của nông dân về việc xácđịnh sự lây lan cũng như việc kiểm soát căn bệnh này đã được tiến hành với 81 nôngdân và 489 mẫu củ thu thập ngẫu nhiên trong 8 chợ lớn để xác định bệnh tiềm ẩn bằngphương pháp DAS-ELISA Kết quả cho thấy 100% nông dân đã nhận thức được sựxuất hiện của bệnh héo xanh do vi khuẩn trên cánh đồng của họ và phương thức lâylan Mức độ nhiễm bệnh của vi khuẩn gây bệnh héo xanh được đánh giá là cao hơn25% so với các loại vi khuẩn khác [61]

1.3.6 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở trong nước

Sau năm 1945, công tác nghiên cứu bệnh cây ở Việt Nam ngày càng được quan

tâm Riêng bệnh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã có nhiều cơ quan khoa học

trong nước quan tâm Đặc biệt như: Viện Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nôngnghiệp Hà Nội, Viện Khoa học Kỹ thuật Việt Nam (cũ), Viện Nghiên cứu Rau Quả,Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa Nhìn chung, những nghiên

cứu về bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum ở Việt Nam còn chưa nhiều, chưa toàn diện và chưa sâu Hiện nay, việc nghiên cứu Ralstonia solanacearum cũng đã trở

thành một vấn đề quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật

Những thông tin đầu tiên về bệnh HXVK như một bệnh hại quan trọng trên câylạc được thể hiện trong báo cáo Đặng Thái Thuận (1968) [31] Trong báo cáo kết quảđiều tra bệnh cây năm 1967-1968 của Viện Bảo vệ thực vật cũng đã chỉ rõ bệnhHXVK khá phổ biến ở đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc Việt Nam Đối vớicây cà chua, bệnh HXVK đã và đang là vấn đề nan giải và nghiêm trọng đối với cácvùng trồng rau ngoại thành Hà Nội và các vùng phụ cận

Qua điều tra, khảo sát bệnh trong những năm 1990-1993, Nguyễn Xuân Hồng(1993) [17] đã cho biết: bệnh HXVK hại lạc xuất hiện phổ biến hầu hết ở các vùng,mức độ bị bệnh có sự khác nhau giữa các vùng sinh thái Bệnh hại nghiêm trọng ở một

số vùng trọng điểm như Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động từ 15-35% vàcác vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là 20-30% Tác giả đã sử dụngphương pháp lây bệnh nhân tạo bằng sát thương rễ trên cây lạc 2 tuần tuổi để đánh giákhả năng kháng bệnh của các dòng/giống lạc

Nghiên cứu về tính phổ biến của bệnh HXVK trên cây trồng cạn, tác giả Đỗ TấnDũng (1995b) [14] cho rằng bệnh HXVK phát sinh phát triển và gây hại nghiêm trọng

trên cây cà chua, khoai tây, lạc Trên cây thuốc lá tỷ lệ nhiễm bệnh do Ralstonia solanacearum có phần nhẹ hơn Đỗ Tấn Dũng đã cho biết những kết quả nghiên cứu

ban đầu về bệnh HXVK hại cây cà chua, đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh,

phương pháp chuẩn đoán nhanh và một số biện pháp phòng chống ban đầu trên một sốcây trồng cạn như lạc, thuốc lá, cà chua, v.v

Lê Lương Tề (1997a) [25] đã nghiên cứu về triệu chứng của bệnh héo xanh, đặctính sinh học và quy luật phát sinh phát triển của bệnh và một số hướng phòng trừ Tác

giả đã nêu ra phạm vi ký chủ của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà

chua, khoai tây, lạc, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và cây đay

Trong quá trình chuyển dịch cơ cấu cây trồng với việc xuất hiện ngày càng nhiều

“vành đai xanh” để đáp ứng nhu cầu cung cấp rau và sản phẩm rau, quả, nông sản thựcphẩm cho các thành phố thì việc hình thành những vùng chuyên canh rau màu là tấtyếu Đó cũng là tiền đề quan trọng cho việc phát sinh, phát triển và lan truyền củabệnh với tốc độ ngày càng nhanh Bệnh HXVK phổ biến ở các vùng sản xuất cà chua,khoai tây, thuốc lá, lạc với mức độ nhiễm bệnh biến động tùy thuộc chủng loại câytrồng, vùng sinh thái và có tính mùa vụ, tùy thuộc điều kiện thời tiết Ở Việt Nam bệnhgây hại nghiêm trọng trong mùa nóng ẩm (tháng 4 đến tháng 10) và có xu thế nhẹ ởnhững tháng mùa khô (tháng 11 đến tháng 3) Riêng ở khu vực Đức Trọng (LâmĐồng) có hơn 15% diện tích khoai tây bị nhiễm bệnh HXVK

1.3.7 Các nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà chua ở Việt Nam

Lê Lương Tề và cs (2002) [24], bằng kỹ thuật PCR và đánh giá tính kháng bệnh

héo xanh của một số giống cà chua, tác giả đã phát hiện được vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập từ cây cà chua có triệu chứng héo xanh điển hình thu thập từ 6

tỉnh miền Bắc và xác định được các dòng/giống cà chua có nguồn gen CRA66, 84-26-3, UPCA1169, PT127805A và nhóm Hawaii 7997 là những giống có tính khángcao - trung bình, có nhiều triển vọng trong công tác chọn tạo giống cà chua khángbệnh HXVK

CRA-Theo kết quả nghiên cứu của Chu Văn Chuông (2005) [7], tỷ lệ bệnh HXVK trên

cà chua ở đồng bằng sông Hồng vụ Đông sớm và vụ Xuân Hè dao động từ 13-28%, vụĐông dao động từ 10-18% Sử dụng các giống cà chua mang gen kháng và ghép càchua trên gốc cà tím kháng héo xanh sẽ mang lại hiệu quả tốt trong phòng chống bệnhHXVK Ngoài ra, tác giả cũng đề xuất một quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh HXVKhại cà chua

Vừa qua, Ngô Quang Vinh (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) đãthử ứng dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào điều kiện Việt Nam và đã thuđược kết quả rất có triển vọng Nội dung chính là tìm được cây cà chua hay cà tímkháng bệnh héo rũ tốt để làm gốc ghép, rồi dùng cây cà chua có năng suất cao, quả cóhình dạng đẹp để làm cành ghép Sau đó ghép ngọn cây cà chua này lên gốc ghépkháng được bệnh, ta sẽ có cây cà chua kháng được bệnh héo rũ Công việc này đượcnhiều bà con nông dân ở hai huyện Đức Trọng và Đơn Dương (tỉnh Lâm Đồng)

thực hiện và đã thu được những ruộng cà chua sạch bệnh, không tốn thuốc nên càchua của họ sản xuất ra được gọi là cà chua an toàn, năng suất cao 1,5-2 lần so vớiruộng đối chứng.

Bên cạnh việc nghiên cứu bệnh HXVK trên cà chua và những biện pháp quản lý,phòng chống bệnh HXVK một cách hiệu quả thì trong thời gian qua chúng ta mới chỉnhập nội giống và sản xuất hạt giống cà chua với mục đích ăn tươi là chính Việc xácđịnh được bộ giống cà chua chế biến đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn chế biến như độBrix, độ axit và các tiêu chuẩn khác vẫn còn mới mẻ Việc kết luận được một bộ giống

cà chua chế biến thích nghi với điều kiện đất đai, sinh thái, khí hậu từng nơi để có khảnăng chống chịu sâu bệnh và các điều kiện ngoại cảnh, có năng suất cao, chất lượngtốt là vô cùng quan trọng

1.4 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1.4.1 Tổng quan đa dạng sinh học - đa dạng di truyền

Theo công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" có nghĩa là: sựkhác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn,trong đại dương và các hệ sinh thái thủy vực khác, cũng như các phức hệ sinh thái màcác sinh vật là một thành phần, thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong một loài,giữa các loài và giữa các hệ sinh thái."

Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay Gìn giữ và bảo tồn đadạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo môisinh của các sinh vật trên Trái Đất Khái niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiềucấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái, là sự đa dạnggiữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa các cá thể trongcùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất nhưng đa dạng di truyền có vai trò vô cùngquan trọng trong tiến hóa và thích nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đadạng di truyền đều có những tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnhhưởng đến đa dạng sinh học

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trongmột loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyềnchính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn bazo cơ bản, thành phần axit nucleic,tạo thành mã di truyền

Đa dạng di truyền là kết quả của quá trình biến đổi trong vật chất di truyền sinhvật (trình tự DNA, số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể) theo các con đường tự nhiên (lai,phân ly - tái tổ hợp) hay bởi bàn tay con người (lai - chọn tạo giống, chuyển gen) Tất

cả những quá trình này gây nên những biến đổi trong gen và tần số alen, dẫn đếnnhững thay đổi trong kiểu hình của sinh vật

Đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa hết sức quan trọng trong công nghệ sinhhọc nông nghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học cóthể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗtrợ quá trình lai - chọn tạo giống thông qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lainhằm thu được ưu thế lai cao nhất.

1.4.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới; đadạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về hệ sinhthái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được duy trì vàbảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó

Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính:

- Giá trị ổn định (Portfolio Value): Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các hệthống nông nghiệp ở quy mô toàn cầu, quốc gia và địa phương Sự thiệt hại của mộtgiống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây trồng khác

- Giá trị lựa chọn (Option Value): Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cầnthiết chống lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạnghữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi Giá trị của đa dạng di truyềnđược thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm của tàinguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả năngthích nghi

- Giá trị khai thác (Exploration Value): Đa dạng di truyền được xem là kho dự trữtiềm năng các tài nguyên chưa biết đến Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả các hệsinh thái hoang dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống

Ngoài ra, đa dạng di truyền còn có giá trị về thẩm mỹ (thưởng thức, giải trí) vàgiá trị về đạo đức Có một số loài có cả giá trị sử dụng, thẩm mỹ và đạo đức; song vềgiá trị cũng không phải đều nhau giữa các mặt giá trị và giữa các loài [22]

1.4.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông qua việcxác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thịsinh hóa, chỉ thị phân tử như chị thị isozyme và gần đây là chỉ thị DNA

Các chỉ thị DNA có thể được chia làm hai nhóm chính sau: chỉ thị phân tử dựatrên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa vào các băng DNA trên gel điện di có thểphát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử và chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhânbản DNA bằng kỹ thuật PCR như RAPD, AFLP, SSR, Trong những năm gần đây,nhiều chỉ thị thuộc nhóm này đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Các phân tử protein enzyme là do gen quy định Trong quá trình tiến hóa, dướitác dụng của điều kiện môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hìnhthành các alen khác nhau và nó mã hóa cho quá trình tổng hợp các phân tử proteinkhác nhau [11].

Có thể chia izozyme thành 2 dạng:

- Izozyme đơn gen: các izozyme này chịu sự kiểm soát của 1 gen

- Izozyme đa gen: các izozyme chịu sự kiểm soát của nhiều gen (đa gen)

Việc phân tích izozyme chúng ta phát hiện những alen đồng trội và đây làphương pháp tương đối rẻ tiền, dễ tiến hành hơn các phương pháp sử dụng chỉ thịDNA Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi izozyme, chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạnnhất định của quá trình phát triển cá thể và thực tế nó cũng chỉ là sản phẩm của gennên chưa phản ánh được chính xác bản chất di truyền của các cá thể Do vậy, việc sửdụng chỉ thị izozyme còn có những hạn chế nhất định [12]

1.4.3.2 Chỉ thị di truyền

Các chỉ thị phân tử được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu các đoạnOligonucleotide và đều có một số đặc điểm chung là:

+ Không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường

+ Thường liên kết với các tính trạng trội hoặc siêu trội

+ Mang tính ổn định và được di truyền qua các thế hệ

Chỉ thị phân tử rất đa dạng, phong phú và được chia thành các nhóm như sau:+ Chỉ thị dựa trên cơ sở phương pháp lai DNA hay chỉ thị RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism) Dựa vào các băng DNA trên gel điện di có thể pháthiện được các thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn)

+ Nhóm chỉ thị phân tử dựa trên nguyên lý khuếch đại các gel mong muốn bằng

kĩ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSA, AFLP…

1.4.3.2.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fregment Length Polymorphism)

*Nguyên lí của phương pháp RFLP

Phương pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt giới hạn) do Botsteinphát minh 1980 Nguyên lý của phương pháp dựa trên các đặc tính cơ bản sau:

- Tính chất cắt đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE)

- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung.Nguyên lí của phương pháp RFLP là: DNA của bộ gen sau khi xử lý bằngenzyme giới hạn sẽ bị cắt thành các đoạn có kích thước khác nhau Sau khi điện di, cácđoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này sẽtrở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng cellulose hoặc nylon với vị tríkhông thay đổi Trong quá trình lai DNA tiếp theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạnDNA) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên mànglai - kĩ thuật lai Southerm Khi phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thểđược thực hiện qua sự khác nhau của các băng trên màng lai

*Ứng dụng của RFLP: RFLP là chỉ thị được dùng phổ biến nhất và nhiều nhất,

có thể kể ra các ứng dụng đó là:

- Xác định con lai F1 trong quần thể con lai có lẫn các cá thể tự phối

- Đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật

- Xác định các dòng giống khác nhau

- Xác định biến dị xôma Các biến dị này là do ảnh hưởng của các đột biếnkhông xác định và có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy invitro

- Thiết lập bản đồ phân tử các gen cần quan tâm trong quá trình nghiên cứu [9]

1.4.3.2.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

*Nguyên lý của phương pháp

AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc) là phươngpháp dựa trên cơ sở của kĩ thuật PCR Nguyên lý của phương pháp này là gắn cácđoạn DNA ngắn (adapter) vào 2 đầu của mạch DNA sau khi đã được cắt bằng enzymegiới hạn Sau đó thiết kế mồi theo các đoạn DNA ngắn đó có gắn thêm một hoặc một

số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel polyacrylamit, kết quả thu được thường

là 50-100 băng DNA/1 mẫu thí nghiệm Số lượng các đoạn phân tử DNA được khuếchđại phụ thuộc vào lượng C và G có trong primer C và G càng nhiều các đoạn DNA

được khuếch đại càng ít Tương tự, nếu kích thước genome càng nhỏ số đoạn phân tửđược khuếch đại càng ít.

*Ứng dụng: AFLP là phương pháp xác định độ đa hình cao, xây dựng bản đồ chỉ thị

DNA có hiệu quả nhất so với các chỉ thị khác tiết kiệm thời gian, dễ dàng lặp lại và có thể

sử dụng để phân tích DNA từ bất kì nguồn gốc nào hay bất kì mức độ phức tạp nào.Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành rất đắt nên phần nào hạnchế khả năng sử dụng của nó [12]

1.4.3.2.3 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)

Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉthị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nốitiếp và chỉ gồm 1-6 bp [69] Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotide trongmỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại cóthể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn

Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền củacây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năngsuất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng

- Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR

Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượnglớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locusđược kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòngchảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền

SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa

trồng (O Sativa), nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo

giống , do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định Hiện nay, hơn 15.000chỉ thị SSR đã được thiết lập

SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trongquá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chínhxác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so vớinhững marker khác như AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệF1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gel trở nên dễ dànghơn SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu ditruyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền

Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primerchỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn baogồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.

1.4.3.2.4 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)

Chỉ thị RAPD chạy dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primerngắn (khoảng 10 nucleotit) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiênnhững đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer

*Nguyên lý của RAPD

Nguyên lý của phương pháp là: sử dụng một đoạn oligonucleotide có kích thước8-12 (thông thường là 10) nucleotide không cần biết trước trình tự làm mồi cho phảnứng PCR Các đoạn oligonucleotide đó do vậy có thể làm mồi xuôi, hoặc có thể là mồingược Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở bất kì vị trínào mà có trình tự bổ sung với nó Theo tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm 10nucleotide thì xác suất bắt cặp của nó là:1/410 =1/1.048.576, có nghĩa là một đoạnDNA khuôn có 1.048.576 cặp nucleotide thì có 1 trình tự bắt cặp với mồi Giả sử một

hệ genome đơn bội của lúa có kích thước 550.000.000 bp thì với loại mồi ngẫu nhiêntrên có thể có 524 vị trí bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn DNA đượcnhân lên Trong thực tế số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụthuộc vào độ dài đoạn được nhân và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trênDNA của bộ gen

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu 2 cá thể có bộ genhoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR-RAPD với bất kì mồi nào cũngcho các băng DNA giống nhau Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau về bộ gen thì vớimột số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa chúng Sự khác nhau này thể hiện sự đahình di truyền của các cá thể cần nghiên cứu Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trongcác phòng thí nghiệm di truyền phân tử

Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước:

- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc,UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gầngũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu [5]

* Một số vấn đề thường gặp khi thực hiện phản ứng RAPD

Nồng độ primer tối ưu thường nằm trong khoảng từ 0,2-0,3 mM

Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên gel điện di Vìvậy nồng độ DNA mẫu xem là thích hợp cho mỗi phản ứng: 10-50 ng/25ul thể tíchphản ứng.

PCR buffer thường được cung cấp theo Taq-polymerase và có thể hoặc không có

Mg2+ Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khácnhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau, sự thay đổi nồng độ Mg2+ thường thay đổi sốlượng băng DNA trên gel

Taq-polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhaurất lớn Vì vậy, loại Taq-polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác vàđược xác định qua thực nghiệm Việc chọn loại Taq-polymerase phù hợp là rấtquan trọng

Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụthuộc và máy PCR và độ dày của eppendorf RAPD thường được tiến hành với 45chu kỳ [68]

* Ưu điểm của phương pháp RAPD

Về mặt kỹ thuật: phương pháp RAPD không đòi hỏi ta phải biết trước trình tựgen của sinh vật cần nghiên cứu Số lượng DNA cần thiết ít và không cần quá tinhsạch Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản

Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kếthợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận diện chỉthị phân tử có độ tin cậy cao [19]

* Hạn chế của phương pháp RAPD

RAPD có độ chính xác không cao và không ổn định: khả năng nhân bản trongphản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [19]

*Ứng dụng của phương pháp

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,mặc dù cho kết quả có độ tin cây không cao nhưng vẫn được sử dụng do ưu điểm dễthực hiện và chi phí thấp

- Đánh giá đa dạng di truyền: đã được áp dụng trên các đối tượng: khoai tây, càchua dâu tây, đậu nành, Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thínghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao

- Phân tích con lai F1giữa bố mẹ đa hình với một mồi nào đó Khi đó con lai F1

sẽ có tất cả các băng DNA của bố và mẹ

- Lập bản đồ gen liên kết.

- In dấu vân tay DNA

- Phân tích di truyền của các quần thể

1.4.4 Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn Ralstonia

solanacearum

So sánh về trình tự DNA của tiểu phần riboxom 16S trong nghiên cứu về tính đa

dạng gen của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập tại Nhật Bản và một số

nước Đông Nam châu Á Tsuchiya và cs (2004) [94] đã xác định loài vi khuẩn

Ralstonia solanacearum thuộc nhóm 1 của Nhật Bản (bao gồm các chủng của biovar

N2, 3 và 4 thuộc race 1) có quan hệ gần gũi với các chủng của biovar 3, 4 và 5 thuộcdivision I (Châu Á và Australia), còn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm 2 (biovar N2thuộc race 3) của Nhật Bản cũng có quan hệ gần với biovar 2 và N2 của Indonesiathuộc subdivision 2b

James et al (2003) [58] đã kiểm tra hóa sinh 9 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum và kết quả cho thấy 6 chủng thuộc biovar 3 và 3 chủng thuộc biovar 3a.

Các chủng này thuộc vào race 1 hoặc 3 Phân tích RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên chothấy giữa các chủng có tính đa hình cao Mồi OPF 8 chỉ có 1 băng duy nhất ở vị trí1,45kb cho race 3 Đây có thể được coi như một dấu hiệu để nhận biết nhanh chóng

race 3 của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum.

Prasannakumar M K và cs (2012) [80] đã thu thập 57 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên nhiều ký chủ ở các vùng trồng rau khác nhau ở Ấn Độ.

Nhóm nghiên cứu đã xác định được 54 chủng vi khuẩn này thuộc race 1, biovar 3 Đặcbiệt có 3 chủng, trong đó có 2 chủng vi khuẩn phân lập trên cây gừng và 1 chủng phânlập trên cà chua không có phản ứng oxy hóa với dulcitol và lactose Do đó, 3 chủngnày được xếp vào một nhóm phân loại mới, race 1 và biovar 3b Đây được xem lànghiên cứu đầu tiên tại Ấn Độ Bên cạnh đó, nhóm tác giả còn sử dụng 15 mồi RAPD

để phân tích mối quan hệ di truyền của 57 chủng trên, kết quả đã chia 57 chủng vikhuẩn thu thập được thành 7 nhóm chính

Một nghiên cứu khác của Sagar V (2014) [83] cũng đã chỉ ra kết quả tương tựvới nghiên cứu của Prasannakumar (2012) khi phân nhóm được cho 15 chủng vi khuẩnthu thập ở Hasan và Chikmagalur vùng Karnataka, Ấn Độ thuộc race 1 Dựa vào kỹ

thuật PCR tác giả cũng xác định chính xác 15 chủng vi khuẩn là vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc phylotype I.

Nghiên cứu về bệnh HXVK hại khoai tây ở Đài Loan đã cho thấy tác hại củabệnh làm giảm năng suất khoai tây từ 30-80% Nghiên cứu đặc tính sinh học của 10chủng vi khuẩn phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau kết quả cho thấy các nguồn

vi khuẩn phân lập được kiểm tra đều có tính độc cao đối với khoai tây và đều thuộcphylotype I biovar 4 [98].

Yingqui Liu (2009) [99] khi đánh giá đa dạng di truyền của 120 chủng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum thu thập từ các vùng trồng thuốc lá tại Nhật Bản đã cho kết

quả: 3 chủng thuộc phylotype IV và 117 chủng thuộc phylotype I

Nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại của bệnh HXVK hại lạc, xác định race,

biovar của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở phía Bắc Việt Nam, Nguyễn Xuân

Hồng và cs (1997) [18] đã cho rằng bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùngđất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa nước thì mức độ nhiễm bệnhnhẹ hơn Tất cả các mẫu phân lập được đều thuộc race 1, biovar 3 và biovar 4

Nguyễn Thị Vân và cs [35] tiến hành phân tích đa dạng di truyền một số isolates

vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc thông qua chỉ thị phân tử RAPD Kết quả cho thấyvới 11 isolates nghiên cứu đem phân tích với 10 mồi RAPD ngẫu nhiên đã có sự saikhác về mức độ phân tử từ 2-34% giữa các isolates

Theo Trương Quốc Ánh và cs (2012) [2] sử dụng các chỉ thị phân tử SSR để xácđịnh được marker SSR306 liên kết với gen kháng bệnh héo rũ trên nhiễm sắc thể số 4cho đa hình giữa giống kháng Vimina 2 và giống nhiễm Seed tomato

Đinh Thị Phòng và cs (2008) [23] bằng kỹ thuật RAPD đã sử dụng 20 mồi ngẫunhiên để đánh giá sự đa dạng DNA genome của 6 chủng vi khuẩn gây bệnh trên câylạc được thu thập ở các địa phương khác nhau Kết quả đối chiếu trên cả 20 mồi đềuchỉ ra sự sai khác di truyền của 6 chủng khuẩn phân lập đó Nhóm tác giả cũng đã

phân tích sự đa dạng genome của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây

bệnh héo xanh cây lạc bằng kỹ thuật RADP để làm cơ sở khoa học cho việc xác địnhnhận dạng độc tính của các nòi gây bệnh ở một số địa phương khác nhau để tìm ra cácgiải pháp phòng trừ thích hợp

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mục tiêu chung

- Đề tài nhằm xác định các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên một số

cây họ Cà được trồng tại các tỉnh phía Nam Việt Nam

- Đánh giá được độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum

phân lập được trên một số cây họ Cà

2.1.2 Mục tiêu cụ thể

- Thu thập được đúng mẫu bị nhiễm bệnh HXVK trên một số cây họ Cà ở các

tỉnh phía Nam

- Phân lập và làm thuần được các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên

các mẫu bệnh thu thập được

- Xác định được sự khác biệt về di truyền giữa các chủng vi khuẩn bằng kỹ thuậtRAPD

- Xác định được độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên

cây cà chua

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum

được thu thập tại các tỉnh phía Nam.

- Thu thập mẫu bị nhiễm bệnh HXVK trên một số cây họ Cà ở các tỉnh phía Nam

- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập được.

- Xác định các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng cặp mồi phân tử

đặc hiệu

- Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum

bằng chỉ thị phân tử

2.2.2 Đánh giá độ độc tính của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum được

thu thập tại các tỉnh phía Nam.

- Thực hiện lây nhiễm nhân tạo các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum với

một số giống cà chua được trồng phổ biến tại các tỉnh phía Nam để xác định độc tính

của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập được.

2.3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuẩn héo xanh được thu thập từ các ruộng trồng cà chua, khoai tây, ớt, cà dê,dưa hấu, cà tím ở các tỉnh Lâm Đồng, Quảng Ngãi, thành phố Hồ Chí Minh, Vĩnh Long,Ninh Thuận, Cần Thơ, Tiền Giang Địa điểm mẫu thu thập được thể hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1. Danh sách các mẫu vi khuẩn được thu thập ở các tỉnh phía Nam

ST

T

Ký hiệu

1 KT1 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B2) Lâm Đồng Khoai tây

2 KT2 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B2) Lâm Đồng Khoai tây

3 KT3 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B2) Lâm Đồng Khoai tây

4 KT4 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B2) Lâm Đồng Khoai tây

5 KT5 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12

6 KT6 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B2) Lâm Đồng Khoai tây

7 KT7 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B7c) Lâm Đồng Khoai tây

8 KT8 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B7c) Lâm Đồng Khoai tây

9 KT9 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B7c) Lâm Đồng Khoai tây

10 KT10 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12

11 KT11 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B7c) Lâm Đồng Khoai tây

12 KT12 Trung tâm nghiên cứu Rau Hoa, Phường 12Đà Lạt (Vườn B7c) Lâm Đồng Cà chua

18 C18 Thôn Tân An, xã Hiệp An, huyện Đức Trọng,Lâm Đồng Lâm Đồng Cà chua

19 C19 Thôn Tân An, xã Hiệp An, huyện Đức Trọng,Lâm Đồng Lâm Đồng Cà chua

20 C20 Thôn Tân An, xã Hiệp An, huyện Đức Trọng,Lâm Đồng Lâm Đồng Cà chua