Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được tuyển chọn từ 4 chủng lactobacillus plantarum w1, w3, w5, n5

Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi tiến hành để tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được... - Khả

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoa học – công nghệ ngày càng tiến bộ đã thúc đẩy con người càng tiếpcận gần hơn với thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói riêng Điều này

đã tạo nên những thành công trong nghiên cứu ứng dụng vi sinh của các nhàkhoa học Một trong những thành quả nghiên cứu có thể kể đến đó là ứng dụngcác đặc tính và chế phẩm được tạo ra vi khuẩn lactic vào trong công nghiệp thựcphẩm và nhiều lĩnh vực khác

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có mặt phổ biến trong các sản phẩm lênmen Chúng là tác nhân của các quá trình lên men lactic, các loài vi khuẩn nàycòn có tiềm năng sinh probiotic, có khả năng tổng hợp bacteriocin vàexopolysaccharide Trong đó, exopolysaccharide đã mang lại nhiều ứng dụngquan trong các lĩnh vực khác nhau Bên cạnh, đóng vai trò cho hoạt động sốngcủa tế bào, exopolysacchride được sử dụng để làm các chất phụ gia hoàn thiệncấu trúc của sản phẩm như: chất tạo gel, chất làm dày, chất ổn định và hoànthiện tính lưu biến của các sản phẩm thực phẩm [32] Ngoài ra, EPS còn có cáchoạt động sinh học như hoạt tính chống ung thư, kích thích miễn dịch, hoạt độnggiảm cholesterol và các hoạt động chống oxy hóa [40]

Exoplysaccharide có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như từthực vật hay vi sinh vật Tuy nhiên việc tách chiết EPS từ nguồn thực vật cónhiều hạn chế, do chúng liên kết với một số thành phần trong tế bào thực vật nênquá trình tách khó khăn và khi đưa vào sử dụng thì phải qua xử lí bằng một sốphương pháp hóa học, ezyme để hoàn thiện tính chất của chúng Trong khi đóviệc tách chiết EPS từ vi sinh vật lại có nhiều ưu điểm hơn như chu kỳ sinhtrưởng và phát triển ngắn, môi trường nuôi cấy tiền, dễ điều khiển quá trình sảnxuất Nên nếu chúng ta xác định được điều kiện thích hợp nhất để khả năng sinhexopolysaccharide cao nhất thì sẽ đem lại được nguồn polysaccharide dồi dào và

mở ra được tiềm năng ứng dụng của polysaccharide từ vi sinh vật vào các lĩnhvực khác nhau

Sản lượng, kích thước và thành phần hoá học của các polysaccharide đượchình thành exopolysaccharide chủ yếu phụ thuộc vào các chủng, điều kiện nuôicấy và thành phần môi trường được sử dụng [15] Xuất phát từ thực tế nêu trên,

chúng tôi tiến hành để tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được

tuyển chọn từ 4 chủng Lactobacillus plantarum W 1 , W 3 , W 5 , N 5 ” Nhằm xác

định các điều kiện tốt nhất để các chủng Lactobacillus plantarum sinh tổng hợp

EPS, tạo tiền đề cho các quá trình nghiên cứu ứng dụng tiếp theo

Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide từ bốn chủng

Lactobacillus plantarum (W1, W3, W5, N5) để tuyển chọn được chủng có khảnăng sinh tổng hợp EPS cao nhất

- Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng

hợp exopolysaccharide bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn.

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp EPS

bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (LAB) được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Chúngkhông đồng nhất về mặt hình thái, các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng

và kích thước khác nhau Chúng gồm cả vi khuẩn dạng hình que và dạng hìnhcầu Đường kính của các cầu khuẩn lactic từ 0,5- 1,5 µm, các tế bào hình cầu ởdạng đơn xếp thành cặp, đám hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước các

tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 µm, các tế báo đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặcthành chuỗi Tuy nhiên về mặt sinh lí, vi khuẩn lactic tương đối đồng nhất.Chúng đều là các vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử, nhìn chungkhông di động, thử nghiệm catalase âm tính, không có các cytochrome và hôhấp kỵ khí tùy tiện [1], [2], [13] Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ quátrình phân giải cacrbohydrate tạo thành axit lactic, ngoài sản phẩm chính là axitlactic, chúng còn sản sinh ra axit acetic, ethanol, các hợp chất thơm, bacteriocin,exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác

Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưngkhông có khả năng lên men các loại cacbonhydrate phức tạp và tinh bột, chỉ có

loài L.delbrueckii là đồng hóa được tinh bột Một số vi khuẩn lactic dị hình sử

dụng được pentose và axit xitric Sự phát triển của vi khuẩn lactic cần sự có mặtcủa pepton, amino axit hay muối amoni Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinhdưỡng giàu vitamin, amino axit và khoáng chất Vì vậy người ta thường nuôichúng trên môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa số lượng khá lớn cao nấm,dịch đường [4] Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì tạo thành axit lactic khácnhau trong môi trường và sức chịu axit cũng khác nhau Đa số các trực khuẩnlactic đồng hình tạo thành axit lactic cao hơn liên cầu khuẩn Các trực khuẩn này

có thể phát triển ở pH 3,8-4,5 hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở vùng

pH 5,5- 6 Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (50Choặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25-350C, cácloài ưa ấm nhiệt độ tối thích là 40-450C

Chúng được phân bố rộng và có thể tìm thấy trong thực vật, trong các sảnphẩm sữa tươi và sữa được chế biến, các sản phẩm thịt được chế biến và lên men,các loại rau quả lên men và đường tiêu hóa của người, động vật và chim [1]

2.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Orla-Jensen sử dụng các đặc điểm sau đây là cơ sở để phân loại vi khuẩnlactic: hình thái, hình thức lên men đường glucose, khả năng phát triển ở cácnhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đường Ông phân chúng thành bốn chi:

Lactobaccillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [13] Ngày nay

người ta bổ sung thêm một chi nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi

2.1.2.1 Lactobacillus

Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, có chứa 166

loài [12] Tế bào của chúng có dạng hình que thay đổi từ trực khuẩn rất ngắnđến rất dài, mảnh và tương đối dày, thường uốn cong và có thể đứng dưới dạngcác tế bào đơn độc hoặc đứng thành chuỗi từ ngắn đến dài Chúng kỵ khí khôngbắt buộc hay vi hiếu khí Chúng ưa ấm (nhưng một số loài là dinh dưỡng lạnh),nhiệt độ sinh trưởng có thể dao động từ 1 đến 500C Nhưng hầu hết những loàiđược sử dụng làm giống trong lên men thực phẩm có kiểm soát sinh trưởng tốttrong khoảng 25- 400C Một số loài tham gia vào sự lên men tự nhiên của một sốloại thực phẩm ở nhiệt độ thấp, có thể sinh trưởng tốt ở 10-250C

Lactobaccillus có thể lên men lactic đồng hình hoặc dị hình.Chúng lên men

được đường lactose, saccharose, fructose, glucose hoặc galactose và một số loài

có thể len men được đường pentose Tùy loài, khi chúng sinh trưởng trên mộtnguồn cacbonhydrate có thể làm giảm pH tới giữa 3,5 và 5, 0

Chúng có vai quan trọng trong việc duy trì sự ổn định và cân bằng hệ visinh trong cơ thể, tạo ra những lợi ích sức khỏe cho vật chủ, ức chế một số visinh vật gây bệnh Nhiều loài được sử dụng làm chất bảo quản sinh học cho thực

phẩm nhưng cũng có loài gây hư hỏng thực phẩm L delbrueckii subsp.

bulgaricus, L plantarum, L helveticus được sử dụng trong chế biến sinh học

thực phẩm như được dùng để lên men sữa, rau, thịt và sản xuất bột làm bánh L.

acdophilus, L reuteri, L Casei subsp casei sử dụng làm chế phẩm probiotic.

L plantarum, L fermentum… có thể tổng hợp exopolysaccharide tạo hương vị,

cấu trúc tốt cho các sản phẩm sữa khác nhau Một số chủng có khả năng sinhbacteriocin[1],[13]

2.1.2.2 Leuconostoc

Chi Leuconostoc gồm những vi khuẩn có tế bào hình cầu đến hình hạt đậu

được xếp thành cặp hoặc chuỗi ngắn, kỵ khí không bắt buộc, ưa ấm nhưng một

số loài và chủng có thể sinh trưởng ở (hoặc dưới)30C Các loài sinh trưởng tốtgiữa 200C và 30 0C, với một phạm vi từ 1 tới 37 0C Một số loài có thể tồn tại ở

600C trong 30 phút Leuconostoc lên men lactic dị hình và lên men glucose với

pH giảm tới 4,5 đến 5,0 Nhiều loài (điển hình là Leu mesenteroides subsp.dextranicum) sản sinh dextran khi sinh trưởng trên đường saccharose Chúngkhông thủy phân arginin và sử dụng citrate có trong trái cây, rau, sữa để sản sinhdiaxetyl góp phần hình thành nên hương thơm của bơ

Leu mesenteroides đã được ứng dụng sản xuất một loại bacteriocin có tác

dụng chống lại vi khuẩn Listeria monocytogenes (gây ngộ độc thực phẩm)

nhưng không gây ảnh hưởng đến vi sinh vật hữu ích khác Leu mesenteroides

ssp cremoris và Leu lactic được sử dụng trong lên men sữa và lên men rau [1,],

[16]

2.1.2.3 Pediococcus

Chi Pediococcus là những cầu khuẩn, thường dính lại với nhau thành cặp

đôi hoặc bốn, kỵ khí không bắt buộc, ưa ấm và sinh trưởng tốt giữa 250C và

400C Một số loài sinh trưởng ở 500C và có thể sống sót sau khử trùng Pauster.Chúng lên men lactic đồng hình, lên men glucose và tùy thuộc vào loài, chúng

có thể lên men saccharose, arabinose, ribose và xylose Một số loài làm giảm pHxuống 3,6 nên chúng được xem là những vi khuẩn chịu axit Nhìn chung, chúngkhông lên men lactose

Pediococcus acidilactici và Ped pentosaceus được dùng để lên men rau,

quả, thịt, ngũ cốc và các loại thực phẩm khác Chúng cũng tham gia vào sự chín

và sự tạo thành hương vị của một vài loại phomat dưới dạng các giống thứcấp,có khả năng sinh bacterioxin và được dùng để sản xuất chế phẩm bảo quản

cá Ped damnosus là tác nhân chính làm hỏng bia, vì khi nó phát triển sẽ tạo

thành diacetyl và acetoin làm bia có vị giống bơ [1]

2.1.2.4 Streptococcus

Chi Streptococcus là những vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc hình trứng,

đứng thành cặp hoặc thành chuỗi dài, kỵ khí bắt buộc, ưa ấm và sinh trưởng tốt

ở 37 tới 40 0C nhưng cũng có thể sinh trưởng ở 520C Chúng sống được ở 600C

trong 30 phút Streptococcus chủ yếu lên men lactic đồng hình, lên men đường

glucose và có thể làm giảm pH xuống 4,0 Chúng còn lên men đường fructose,mannose và lactose nhưng nói chung không lên men galactose và saccharose[1]

Mặc dù có sự phân tách và tạo thành chi mới, chi Streptococcus vẫn là một

chi rất lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo Nhìn chung chi này được phân

thành ba nhóm: sinh mủ, miệng và liên cầu khuẩn Streptococci “khác” Nhóm

sinh mủ có chữa một số tác nhân gây bệnh nổi bật như Str pyogenes và Str.

agalactiae Str pyogenes là tác nhân gây bệnh và liên quan tới các bệnh phát

sinh từ thưc phầm, có mặt dưới dạng hội sinh trong đường hô hấp của người

Một tác nhân khác là Str pneumonia trước đây thuộc nhóm này nhưng đã chuyển qua nhóm miệng Streptococcus thermophilus được sử dụng trong lên

men sữa, có thể có mặt trong sữa tươi và được xếp vào nhóm Streptococcusmiệng [19]

2.1.2.5 Bifidobacterium

Bifidobacterium là các trực khuẩn, tế bào có hình dạng và kích thước khác

nhau, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi dài ngắn khác nhau, xắp xếp thành dạngchữ V hoặc dạng ngôi sao Chúng hô hấp kỵ khí, mặc dù một số loài có thể chịuđược O2 khi có mặt CO2 Các loài sinh trưởng tối ưu ở 37 đến 410C với một biên

độ nhiệt sinh trưởng từ 25 đến 450C Chúng thường không sinh trưởng ở pH trên

8 và dưới 4,5 Chúng lên men glucose, lactose, galactose và một số pentose.Chúng có ích đối với đường tiêu hóa Một số loài được sử dụng để tạo chế

phẩm probiotic như Bif bifidum, Bif infantis, Bif adolescentis Chúng có mặt

với số lượng lớn trong phân của trẻ sơ sinh 2-3 ngày tuổi và thường có mặt với

số lượng lớn ở trẻ đang bú mẹ Chúng thường gặp trong ruột già Một số trong

đó Bifidobacterium bifidum, Bif infantis, Bif adolescentis, Bif brevis và Bif.

Lomgum [1].

2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

2.1.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng về cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại cacbonhydrate từ các hexose(glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccharose, lactose,maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồncacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chấtcho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ như axit lactic, axit malic, axitpyruvic, axit fumaric, axit acetic, etanol và CO2.[6] Một số vi khuẩn lactic lênmen dị hình, phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng axit gluconic

và galacturonic làm nguồn dinh dưỡng cacbon nhờ sự xúc tác của hệ enzymetương ứng tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic Quá trình này cũng tạo raaxit lactic, axit axetic và CO2 [5]

2.1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng về nguồn nitơ:

Tất cả các thành phần quan trọng trong tế bào đều chứa nitơ (protein, axitnucleic…), vì vậy nitơ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy vi sinh vật.Phần lớn các vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơphức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Chỉ có một số ít loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từnguồn nitơ vô cơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển bìnhthường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cầndịch thủy phân casein từ sữa, pepton, peptid, cao thịt, cao nấm men… Trongcông nghiệp, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệuquả nhất [5], [13]

2.1.3.3 Nhu cầu về vitamin:

Đa số các vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được vitamin trong khi vai tròcủa vitamin đối với chúng lại rất có ý nghĩa Vitamin đóng vai trò là cáccoenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nó vừa kích thích sự pháttriển vừa điều hòa quá trình cân bằng năng lượng của cơ thể Chính vì vậy trongmôi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta thường bổ sung nguồn cơ chấtchứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô, cao nấm men vànhiều chất khác [5]

+ Nhu cầu muối vô cơ :

Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, các vi khuẩn lactic cần đếnrất nhiều chất vô cơ như sắt, đồng, natri, kali, photpho, iot, lưu huỳnh, magie vàđặc biệt là mangan Mangan là tác nhân ngăn cản sự tự phân của tế bào và cầnthiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn Ion Zn2+ có thể tham gia vàoquá trình hình thành một hoặc nhiều protein của tế bào (chủ yếu là enzyme ) vàlàm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme này Kết quả cũng xảy ra tương tự khithay thế Zn2+ bởi các ion Mg2+ và Ca2+ Các ion kim loại có tác động tương hỗlẫn nhau Chẳng hạn việc sử dụng nồng độ thích hợp Mn2+ sẽ loại trừ được sựđầu độc các ion kim loại nặng nếu các ion này có mặt trong môi trường [13]

2.1.3.4 Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Sự phát triển của vi khuẩn lactic còn cần đến các hợp chất hữu cơ như cácbazơ nitơ hay các axit hữu cơ Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đếntốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit citric và axit axetic Nên hiện nayngười ta sử dụng các muối citrat làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập

và bảo quản chủng vi khuẩn lactic và sử dụng axit acetic dưới dạng các muốiacetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic Các loạiaxit béo như axit oleic, linoleic và lionlenic cũng có tác dụng điều hòa sự sinhtrưởng của vi khuẩn lactic Chính vì điều này trong môi trường đặc hiệu MRS cóTween 80 là dẫn xuất của axit oleic.

2.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

2.1.4.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Quá trình lên men của vi khuẩn lactic đóng một vai trò quan trọng trongngành công nghiệp thực phẩm, bởi vì chúng đóng góp đáng kể vào hương vị, kếtcấu và còn là nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm (McKay và Baldwin,1990) [38] Chúng được sử dụng trong chế biến các sản phẩm sữa (như là sữachua, kefir, phomat, bơ…), muối chua rau quả, sản xuất bánh mỳ đen, sản xuấtrượu vang, thịt cá đóng hộp và xúc xích Trong chế biến các sản phẩm sữa,

người ta lợi dụng khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản

xuất sữa chua hay lợi dụng khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của

chủng Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat Trong chế biến rau quả muối chua,

lên men lactic giúp bảo quản, làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan củasản phẩm Trong sản xuất bánh mỳ đen, sử dụng quá trình lên men của vi khuẩnlactic để tạo vị chua và hương thơm đặc trưng cho bánh mỳ đen

Ứng dụng LAB và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong việc phòng ngừa

hư hỏng và kéo dài hạn sử dụng thực phẩm đã được tăng lên trong thập kỉ qua(Stiles, 1996) [38] Chúng lên men nguồn cacbonhydrate có trong nguyên liệutạo ra axit lactic nên làm tăng nồng độ axit trong nguyên liệu nên có tác dụng ứcchế sự hoạt động của vi sinh vật gây hư hỏng kéo dài thời gian bảo quản

Vi khuẩn lactic còn có khả năng tạo ra bacteriocin, là một loại kháng sinh,rất bền nhiệt có khả năng ức chế mạnh với vi khuẩn gây Gram dương gây bệnh

và hư hỏng thực phẩm cũng như nấm men Bên cạnh đó, bacteriocin cũng ứcchế sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram âm (Arihara et al 1996,; Cardi, 2002;Stevens et al., 1991) và được sử dụng rộng rãi như chất bảo quản sinh học trong

cả thực phẩm lên men lẫn không lên men Một số chủng LAB là probiotic cókhả năng cải thiện sức khỏe của con người đặc biệt là hệ tiêu hóa, do đó chúngthường được bổ sung vào trong các sản phẩm sữa [38,] LAB có khả năng sinhexopolysaccharide mà chúng thường được coi là an toàn (GRAS) Do đó, EPSđược bài tiết bởi LAB được xem là polymer sinh học an toàn và cung cấp mộtnguồn thay thế cho polysaccharide sử dụng trong thực phẩm hoặc các ngành

công nghiệp khác [43] Ngoài ra, người ta còn sử dụng các LAB như

Lactobacillus delbrueckii để sản xuất một lượng lớn axit lactic và muối lactate

làm chất phụ gia thực phẩm

2.1.4.2 Ứng dụng trong chăn nuôi

Ủ chua thức ăn rau xanh mà thực chất là quá trình lên men lactic tự nhiên,vừa có tác dụng chế biến, bảo quản, giảm sự tổn thất chất dinh dưỡng thức ăn và

bổ sung một số vitamin do vi sinh vật tổng hợp Ủ thức ăn là thức ăn thô xanhđược xếp vào hố kín không có không khí Trong quá trình ủ, các vi khuẩn biếnđổi các đường saccharose, fructose, pentose thành axit lactic, axit acetic và cácaxit hữu cơ khác Chính các axit này làm hạ môi trường pH của thức ăn xuốngkhoảng 3,8- 4,5 nên các loại vi khuẩn và enzyme thực vật đều bị ức chế Do đó

có thể bảo quản thức ăn được lâu hơn Ủ xanh thức ăn có ý nghĩa kinh tế lớn,nhờ đó có thể thu hoạch thức ăn vào bất kì thời điểm nào, ngoài ra thức ăn ủxanh còn giữ được chất dinh dưỡng nhiều hơn so với thức ăn phơi khô [9]

2.1.5.3 Một số ứng dụng khác

Bên cạnh các ứng dụng đã nêu trên, vi khuẩn lactic còn được ứng dụngtrong các lĩnh vực khác như: trong y học, công nghiệp vật liệu, trong sản xuất

mỹ phẩm

2.2 Tổng quan về Lactobaccillus plantarum

Lactobaccillus plantarum là một loài vi khuẩn thuộc một chi rất lớn và

tương đối đa dạng của Lactobacillus [28] Lactobaccillus plantarum là vi gram

dương, không sinh bào tử, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc chuỗi,sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [47], [48]

L plantarum lên men dị hình không bắt buộc và có thể lên men nhiều loại

cacbonhydrate khác nhau L plantarum có một yêu cầu tăng trưởng cao với

mangan và có thể tích lũy mangan ở mức cao trong nội bào (Archibald và

Fridovich 1981) L plantarum có khả năng chịu axit (Daeschel và Nes 1995) Thực tế, L plantarum có thể chịu được axit khi pH dưới 4,0 trong các thực

phẩm lên men và nó cũng tồn tại trong điều kiện axit ở dạ dày con người

(Johansson và cộng sự, 1993) L plantarum có một bộ gen tương đối lớn Điều

này cho thấy khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem

và cộng sự, 2003) L plantarum thường gặp với số lượng lớn trong thực phẩm lên men lactic như dưa cải muối chua, ô liu muối, kim chi Nó cũng tồn tại

trong nước bọt và đường tiêu hóa của con người [28] Tính chất đặc trưng duy

nhất của L plantarum là khả năng dị hóa arginine và sinh ra nitric oxide L.

plantarum không có khả năng phân giải amino axit nào ngoại trừ tyrosine và

arginine và có đến 6 con đường khác nhau chuyển hóa arginine và điều sinh ranitric oxide Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như

Canidida abicans, E Coli, Shigella, Helicobacterpylory, các amip và kí sinh

trùng [48]

L plantarum làm giảm nội độc tố do E coil tiết ra bằng các ngăn chặn sự

bám dính của E coli vào màng nhầy L plantarum có khả năng giúp tiêu hóa

chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen và trong men bia… Do đó chúng cải thiện

tốt những vấn đề về tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [48] L Plantarum có

thể sản xuất protein có tính chất kháng khuẩn như bacteriocin Bacteriocin cótiềm năng mở rộng để bảo quản thực phẩm do nhu cầu ngày càng tăng cho cácsản phẩm thực phẩm tự nhiên và an toàn vi sinh, cũng như để điều trị bệnh conngười như bổ sung hoặc thay thế tiềm năng cho thuốc kháng sinh hiện đang sử

dụng L plantarum được sử dụng như là pobiotic làm giảm vi khuẩn có hại để

ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, khả năng bámdính vào đường ruột và tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt vi

ra môi trường như một chất nhờn (r-EPS)[20]

Các vi khuẩn lactic, tảo, nấm và thực vật có khả năng tổng hợppolysaccharides ngoại bào và bài tiết ra khỏi tế bào như là polymer hòa tanhoặc polymer không hòa tan [ 47] Vi khuẩn và vi tảo có khả năng bài tiết EPStốt hơn so với nấm men và nấm mốc.Vi khuẩn lactic (LAB) thường được coi là

an toàn Do đó, EPS được bài tiết bởi LAB có thể được coi là polymer sinh học

an toàn và polysaccharide của vi sinh vật cung cấp một nguồn thay thế cho cácpolysaccharide sử dụng trong thực phẩm hoặc các ngành công nghiệp khác[43] EPS là polysaccharides tiết ra từ các tế bào, hoặc sản xuất bên ngoài tếbào bởi các enzyme ngoại bào [40].

2.3.2 Phân loại exopolysaccharide

EPS thường khác nhau bởi thành phần monosaccharide, mối liên kết giữađơn vị đường, chiều dài chuỗi, sự hiện diện của các mạch nhánh lặp lại và thaythế [24] Dựa vào thành phần monosaccharide có trong mạch chính của EPS,EPS được chia làm hai loại gồm homopolysaccharide (như cellulose, dextran,mutan, alternan, pullulan, levan, inulin, curdlan…) và heteropolysaccharide (nhưgellan, xanthan, kefiran) [40]

 Homopolysaccharide

Homopolysaccharide bao gồm một loại monosaccharide duy nhất glucose hoặc D-fructose ) và được tổng hợp từ saccharose ở ngoài tế bào bởi

(D-enzyme glycansucrase hoặc levansucrase được tiết ra bởi các vi khuẩn Sự khác

nhau giữa các homopolysaccharide chủ yếu là do cấu trúc mạch, trọng lượngphân tử và cấu trúc nhánh [27], [40] Homopolysaccahride được chia thành bốn

nhóm: (1)α-D- Glucans gồm dextran (Leu mesenteroides subsp mesenteroides

và Leu mesenteroides subsp Dextranicum) chứa liên kết α-1,6 dư lượng glucose

thay đổi mức độ phân nhánh thường xuyên ở vị trí 3, ít hơn ở các vị trí 2 và 4;

mutan( Str mutans và Str Sobrinus) và alternan (Leu Mesenteroides) gồm có

liên kết α-1,3 và α-1,6 Khả năng hòa tan của mutan phụ thuộc vào tỷ lệ khácnhau của các loại mối liên kết; mutan tan trong nước chứa nhiều mối liên kết α-1,6 và mutan không tan trong nước chứa nhiều mối liên kết α-1,3 (2)β-D-glucans gồm của liên kết β -1,3 phân tử glucose với liên kết β -1,2 nhánh, sản

xuất bởi Pediococcus spp và Streptococcus spp (3)Fructan gồm liên kết β-2,6 phân tử D-fructose như Levan sản xuất bởi Streptococcus salivarius, levan gồm

các phân tử fructose liên kết β-2,6 với một số nhánh liên kết β-2,1 (4)Nhữngloại khác như polyglycan [40], [23]

 Heteropolysaccharide

Heteropolysaccharide bao gồm các loại monosaccharide khác nhau, chủ

yếu là D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, và các dẫn xuất của chúng Nó được

tổng hợp bên trong tế bào từ đường nucleotide và sau đó được vi khuẩn tiết rangoài [27],[40] Mối liên hệ giữa các đơn vị monosaccharide trong mạch

polymer của heteropolysaccharide là mối liên kết β-1,4 hay mối liên kết β-1,3 vàα- 1,2 hay mối liên kết α -1,6 [40].

Xanthan gum: được tiết ra bởi vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas và bao

gồm glucose trong mạch chính với mạch nhánh là trisaccharide có chứa dưlượng acid glucuronic, mannose, pyruvate và acetyl Gellan và polymer có liên

quan: sản xuất bởi chi Sphingomonas, mạch chính là tetrasaccharide có chứa

rhamnose, glucose và acid glucuronic Gellan, welan, rhamsan và diutan đượcphân biệt bởi sự thay đổi trong thành phần và mối liên kết của các mạch nhánh(ví dụ: gellan chứa nhóm thế acetyl và glyceryl, trong khi welan có nhómrhamnose hoặc mannose trong mạch nhánh) [27]

Kefiran tan trong nước được sản xuất bởi Kefiranofaciens Lactobacillus, L.kefirgranum, L parakefir, L kefir và L delbrueckii subsp bulgaricus Kefirancấu tạo glucose và galactose với tỉ lệ xấp xỉ bằng nhau [30]

2.3.3 Tính chất của exopolysaccharide

Các tính chất lưu biến của EPS được sản xuất bởi LAB được cho là do khốilượng phân tử của nó, phân tử phân phối rộng rãi, các dư lượng đường trong thànhphần, mối liên kết giữa các monomer đường và sự hiện diện của nhóm bên [20].Các tính chất đặc biệt của các exopolysaccharide có được là do các thành phần cấutrúc đặc biệt của EPS gồm glucose và mannose liên kết bởi α và β (1,3) [24] EPS

có tính chất hóa lý đặc biệt và tính chất lưu biến như chất tạo độ nhớt, chất ổnđịnh, chất tạo gel hoặc chất nhũ hóa, làm cho nó như là một chất phụ gia thựcphẩm tiềm năng [43]

Tính chất tạo độ nhớt của EPS phụ thuộc vào cấu trúc và khối lượng của nó

và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như muối, cường độ ion, pH và nhiệt độ Để sửdụng EPS trong cho các sản phẩm khác nhau, các kiến thức về tính chất lưu biếncủa nó tại các pH khác nhau và ion có thể cung cấp các điều hữu ích ứng dụngcho các sản phẩm thực phẩm khác nhau Các thuộc tính lưu biến của EPS nàymới được khám phá trong nước, sữa, muối và cũng có lúc pH khác nhau EPStạo độ nhớt trong môi trường dung dịch CaCl2 tương đối cao hơn trong dungdịch NaCl Sự khác nhau về độ nhớt này có thể là do sự sắp xếp khác nhau giữacác phân tử polymer tích điện ở trong dung dịch, mà gây ra mức độ khác nhaucủa lực đẩy tĩnh điện hoặc lực hút tĩnh điện giữa các chuỗi polymer Trong khinghiên cứu tác động của pH đến độ nhớt của polysaccharide Gauri và cộng sự(2009) đã báo cáo về độ nhớt của EPS tăng trong dung dịch pH axit so vớinhững dung dịch có tính kiềm pH Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi

Kanmani và cộng sự (2011), ông cũng quan sát thấy độ nhớt giảm khi pH=6 và

độ nhớt tăng khi pH giảm xuống bằng 3(pH có tính axit) Điều này có ý nghĩaquan trọng trong ứng dụng EPS trong sản xuất các sản phẩm sữa lên men khi mà

pH cuối cùng của sữa lên men là pH có tính axit [11]

EPS tan trong nước, có khả năng giữ nước tốt và liên kết với dầu Các tínhchất này là do cấu trúc của các chuỗi polymer trong EPS mà có thể giữ mộtlượng nước lớn thông qua liên kết hydro [11] Khả năng giữ nước của EPS đểgiúp chống hiện tượng khô bột nhào, hiện tượng đông đặc của các sản phẩmtinh bột nấu chín và sữa lên men Các thí nghiệm cho thấy rằng sự kết hợp củaexopolysaccharides ở nồng độ cụ thể khác nhau, từ 0,1 đến 1% trong các loạithực phẩm giàu tinh bột có thể làm tăng độ nhớt của thực phẩm, cải thiện kếtcấu của các thực phẩm Sự kết hợp của EPS ở nồng độ 1% có thể làm giảm sựkhô cứng 50% và tăng độ nhớt của 28% Mali và cộng sự (2003) đã mô tả việcgiảm sự khô cứng của bột nhão khi bảo quản lạnh về lạnh, sau khi thêmxanthan gum [24]

2.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp exopolysaccharide

Hầu hết EPS được vi khuẩn tổng hợp trong tế bào và được tiết ra môitrường ở bên ngoài tế bào như là các đại phân tử Một vài trường hợp ngoại lệnhư evan và dextran được vi khuẩn tổng hợp bên ngoài tế bào do hoạt động củacác enzym ngoại bào làm chuyển đổi các chất nền vào mạch polymer ở môitrường ngoại bào Con đường sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn bao gồm hấp thụ

cơ chất, con đường chất chuyển hóa trung tâm và tổng hợp polysaccharide(hình 2,1)

Hấp thụ cơ chất: Tùy thuộc vào loại cơ chất, nó có thể được đưa vào bêntrong các tế bào thông qua một hệ thống vận chuyển thụ động hay chủ động(Hình 2.1a) Ví dụ, glycerol đi qua màng tế bào nhờ quá trình khuếch tán do sựgiảm nồng độ của nó; trong khi đó, sự vận chuyển của hầu hết các loại đườnggắn với động lực proton thông qua hệ thống vận chuyển ATP (ví dụ, các nhómvận chuyển các loại đường), theo đó quá trình thủy phân ATP cung cấp nănglượng để vận chuyển cơ chất ngược dòng gradien nồng độ của chúng Sau đó,các cơ chất được chuyển hóa bởi phosphoryl hóa trong tế bào, hoặc nó có thểđược vận chuyển và bị oxy hóa thông qua một con đường periplasmic oxy hóatrực tiếp Những con đường periplasmic oxy hóa chỉ tồn tại trong một số vikhuẩn nhất định, trong khi đó con đường phosphoryl hóa trong tế bào này rấtphổ biến ở nhiều vi khuẩn Cả hai hệ thống này đã được báo cáo trong một sốchủng sản xuất EPS và chúng có thể hoạt động cùng một lúc nếu có sẵn cơ chất

Con đường chất chuyển hóa trung tâm: trong tế bào chất, các cơ chất đượcchuyển qua quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí,sau đó pyruvate được chuyển thành Acetyl-CoA rồi đi vào chu trình Krebs(Hình 2.1b) Các chất chuyển hóa chính được hình thành từ những chuyển hóanày, chủ yếu là chất chuyển hóa cấp 1 sẽ được sử dụng như tiền chất để tổnghợp các phân tử sinh học nhỏ (ví dụ axit amin hoặc monosaccharide).

Tổng hợp các polysaccharide đòi hỏi sự sinh tổng hợp các tiền chất đã hoạthóa như là monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu đường nucleosidediphosphate (đường NDP), nó có nguồn gốc từ các loại đường phosphoryl hóa.Những tiền chất này (ví dụ như UDP-Glc, UDP-Gal và GDP-Man) đượcchuyển hóa tương tác qua thông qua những phản ứng đồng phân hóa, phản ứngoxi hóa, phản ứng decarboxy hóa, phản ứng khử, và phản ứng chuyển vị (Hình2.1c) Sự tiết EPS của vi khuẩn là một quá trình khó khăn, polymer có trọnglượng phân tử cao được lắp ráp trong tế bào chất phải đi qua màng tế bào, màkhông ảnh hưởng các tính chất quan trọng rào chắn Ngược lại, với sự đa dạngcủa cấu trúc phân tử của EPS, những con đường cho polymer hóa, sinh tổng hợpEPS và bài xuất EPS ra môi trường ở hầu hết các vi khuẩn Gram âm đã đượcbáo cáo theo một trong hai cơ chế (hình 2.1 d):

Hình 2.1 Cơ chế sinh tổng hợp exopolysacharide [14]

- Con đường vận chuyển phụ thuộc Wzx-Wzy, đơn vị lặp lại được tổng hợpbởi quá trình chuyển tuần tự các monosaccharide từ đường NDP thành chấtmang polyprenylphosphate lipid Các đơn vị lặp lại trưởng thành được vậnchuyển qua màng nằm trong tế bào (Wzy) đến bề mặt tế bào chất nơi mà quá trìnhpolymer hóa diễn ra do hoạt động của một polymerase giả định (Wzy) Đối vớinhiều loại vi sinh vật, con đường chuyển vị mở rộng vỏ tế bào được hình thành doenzyme polysaccharide copolymerase (PCP) quyết định chiều dài chuỗi polymer vàmột protein giải phóng màng polysaccharide bên ngoài tế bào (OPX) dẫn đến sựhình thành các kênh.

- Con đường vận chuyển phụ thuộc ABC, polysaccharide được polymerhóa ở bề mặt tế bào chất của màng nằm bên trong tế bào thông qua việc bổ sungliên tục các đơn vị đường đến đầu không khử của chuỗi polymer Polymer đượcgiải phóng qua màng bên trong tế bào thông qua hệ thống vận chuyển ABC, tiếpđến là sự chuyển vị của nó trên toàn bào chất và màng tế bào nằm ở ngoài thôngqua và protein giải phóng OPX [14]

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất exopolysaccharide của vi khuẩn [36]

Các yếu tố của môi trường và điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng đếnnăng suất sản xuất exopolysaccharide, kích thước và thành phần hoá học của cácpolysaccharide được hình thành Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuấtexopolysaccharide bao gồm nguồn cacbon, nguồn nitơ, tỷ lệ oxy, nhiệt độ, giaiđoạn tăng trưởng của vi khuẩn và pH

2.3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Exopolysaccharide có thể được được hình thành từ nhiều loại cơ chấtcarbon Sản lượng EPS khác nhau dựa trên loại cacbon được sử dụng Một sốnghiên cứu đã tìm thấythành phần hóa học của exopolysaccharide là không thayđổi đối với việc sử dụng cơ chất cacbon khác nhau, trong khi những người khác

đã tìm thấy là nó có thay đổi khi sử dụng các cơ chất carbon khác nhau [36] Các

monosaccharde cấu thành EPS sản xuất bởi chủng Lactobacillus helveticus là

như nhau khi thay đổi nguồn cacbonhydrate (Torino và cộng sự, 2005), nhưng

các monosacchire cấu thành EPS sản xuất bởi L.delbrueckii subsp bulgaricus

thay đổi khi thay đổi nguồn cacbonhydrate (Petry và cộng sự, 2000) [20].

2.3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Vi sinh vật sản xuất exopolysaccharide có thể sử dụng nhiều nguồn nitơnhư: amoni, nitrat, nitrit và các axit amin Theo Sutherland, muối amoni và các

axit amin là phổ biến nhất Sản lượng EPS khác nhau khi sử dụng nguồn nitơkhác nhau Khi thay đổi nguồn nitơ ban đầu sẽ ảnh hưởng đến kích thước phân

tử của exopolysaccharide được hình thành

2.3.5.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Cacbon : Nitơ

Trong khi cacbon và nitơ đều cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào bìnhthường, tỷ lệ của chúng trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến khảnăng sản xuất polysaccharide Nhiều nghiên cứu khác nhau cho thấy rằng sảnxuất EPS chiếm ưu thế hơn trong những điều kiện hạn chế nitơ ( tỷ lệ cacbon :nitơ cao) [36]Corpe đã báo cáo rằng sản lượng exopolysaccharide được tối đakhi tỷ lệ cacbon : nitơ là 10:1[35]

2.3.5.4 Ảnh hưởng sự có mặt của oxy

Sự tăng trưởng của vi khuẩn có xu hướng tăng khi khuấy với tốc độ caotrong điều kiện kị khí không bắt buộc Tuy nhiên, tác động của việc khuấy đảomôi trường nuôi ảnh hường đến sản xuất EPS là không rõ ràng Dudman vàKucuk chỉ ra rằng sản xuất EPS là tối ưu trong điều kiện tốc độ khuấy thấp Tuynhiên, những người khác đã chỉ ra rằng sản xuất polysaccharide tối đa trong điềukiện khuấy cao trong điều kiện kị khí không bắt buộc

2.3.5.5 Giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn

Đối với nhiều vi khuẩn, sản xuất EPS cũng thay đổi theo thời gian, như làmột hàm số của giai đoạn tăng trưởng Một số exopolysaccharides được sản xuấttrong suốt giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn, một số khác chỉ được sản xuấttrong giai đoạn logarit và giai đoạn cố định Đối với nhiều loài vi khuẩn, giaiđoạn tăng trưởng và sản xuất exopolysaccharide xảy ra đồng thời Một số loàisản xuất EPS đạt tối đa trong giai đoạn hàm số mũ, trong khi đối với loại khác,sản xuất EPS đạt tối đa trong giai đoạn cố định Các nghiên cứu khác nhau đãchỉ ra rằng trong khi sản lượng EPS thay đổi theo giai đoạn tăng trưởng của vikhuẩn, thành phần exopolysaccharide không thay đổi theo chu kỳ tăng trưởnghàng loạt

2.3.5.6 Ảnh hưởng của pH

Cả sự tăng trưởng và tỷ lệ sản xuất exopolysaccharide của vi khuẩn phụthuộc theo độ pH của môi trường phát triển PH tối ưu cho sản xuấtexopolysaccharide có thể khác với pH tối ưu cho vi khuẩn phát triển Kucuk vàKivanc chỉ ra rằng giá trị giới hạn của pH giảm xuống đáng kể trong sản lượngEPS, đặc biệt là trong phạm vi có tính axit Kết quả tương tự đã được quan sát

bởi Virmani và cộng sự, Williams và Wimpenny; trong khi pH tối ưu cho sảnxuất exopolysaccharide phụ thuộc vào các loài vi khuẩn riêng biệt, đối với hầuhết loài pH ở gần trung tính

2.2.5.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vai trò nhiệt độ tăng trưởng của vi khuẩn trong sản xuất exopolysaccharide

là biến số Sản xuất exopolysaccharide thường chiếm ưu thế khi tăng trưởng ởnhiệt độ tối ưu Sutherland cho thấy rằng khi tăng trưởng tế bào chậm lại (tức làtại nhiệt độ tăng trưởng thấp hơn), tế bào tổng hợp polymer sẽ bị chậm lại Vìvậy, nhiều isoprenoid phosphate có sẵn sẽ hoạt động vận chuyển lipid cho tổnghợp exopolysaccharide Đó là đề xuất rằng sự sẵn có của các isoprenoid lipidkiểm soát tỷ lệ tổng hợp EPS; do đó, nếu điều này đúng, thì nên tăng sản xuấtEPS ở nhiệt độ thấp hơn Tuy nhiên, các nghiên cứu khác được tìm thấy sản xuấtEPS tối đa xảy ra ở điều kiện nhiệt độ tối ưu hoặc nhiệt độ trên tối ưu Macedo

và cộng sự, tìm thấy mối quan hệ giữa tăng trưởng và sản xuất EPS như mộthàm của nhiệt độ Ở nhiệt độ dưới tối ưu, EPS sản xuất có liên quan sự tăngtrưởng; tuy nhiên, ở nhiệt độ trên tối ưu, sản lượng EPS đã không được kết hợpvới sự tăng trưởng tế bào

2.3.4 Ứng dụng của exopolysaccharide

2.3.4.1.Ứng dụng của EPS trong công nghệ thực phẩm

EPS có chức năng như tác nhân tạo nhớt, chất ổn định, chất nhũ hoá, cáctác nhân tạo gel hoặc các tác nhân giữ nước trong thực phẩm [35] EPS được sảnxuất bởi LAB được ứng dụng trong việc cải thiện tính lưu biến, tính ổn định,kết cấu và các đặc tính cảm quan của sữa chua và các sản phẩm sữa lên menkhác Các vấn đề thường gặp trong sản xuất sữa chua như độ nhớt thấp, trạngthái gel bị phá vỡ hoặc sự đông đặc cao trong quá trình lên men hay lưu trữ sảnphẩm (Whey bị tách) có thể được giải quyết bằng cách sử dụng các giống khởiđộng có khả năng sinh EPS [29] Sữa chua có chứa EPS thì kết cấu ít bị pháhủy hơn khi bơm có học, khuấy trộn và làm đầy máy Ứng dụng EPS sản sinh

từ LAB vào sản xuất sữa chua sẽ dẫn đến việc sản xuất sữa chua mà không cần

bổ sung chất ổn đinh và đáp ứng được yêu cầu người tiêu dùng là sản phẩmhoàn toàn từ tự nhiên Vì vậy EPS đóng vai quan trọng trong sản xuất sữa chuauống, sữa chua creamy với hàm lượng thấp chấy béo hoạc không có chấtbéo[ 40] EPS từ LAB cung cấp một chất làm đặc sinh học thay thế cho cácchất phụ gia hóa học và cải thiện kết cấu của sản phẩm sữa ít chất béo Độ nhớt

biểu kiến trong sữa gầy lên men bởi chủng Lc Lactis subsp Lactis sinh EPS

cao hơn so với khi lên men sử dụng chủng không sinh EPS Người ta cũngchứng minh rằng sử dụng kết hợp chủng sinh EPS và không sinh EPS thì sảnphẩm có chất lượng tốt hơn, tăng khả năng giữ nước và tăng độ nhớt [29].Phomát sản xuất bằng cách sử dụng các chủng sinh EPS thì phomat mịn màng,béo, ẩm và mềm Trong khi các loại phomat được sản xuất mà không dùngchủng sinh EPS thì có khuynh hướng khô và dạng hạt rời Các EPS sản xuấtbởi vi khuẩn lactic cải thiện các tính chất cảm quan của nhiều loại pho mátgiảm và ít chất béo khác nhau.Nó kéo dài thời gian lưu lại của sản phẩm sữa ởtrong miệng và nâng cao hương vị của sản phẩm [30].

EPS hiệu quả cải thiện các thông số lưu biến của bột và chất lượng bánh

mì Việc hình thành tại chỗ của EPS từ saccharose dẫn đến các chất chuyển hóatiếp tục như manniitol, glucose, và acetate có thể đóng góp vào việc cải thiện

chất lượng bánh mì [ 29] EPS được sản xuất bởi Lactobacillus ảnh hưởng tốt

đến các thuộc tính của bánh mì như tạo điều kiện hấp thụ nước, làm mềm cácthành phần gluten của bột, cải thiện cấu trúc, tăng khối lượng của bánh, làmchậm sự ôi bánh mì và kéo dài hạn sử dụng EPS được sản xuất từ bột lên menchua bởi LAB sẽ cải thiện tính lưu biến bột, kết cấu bánh mì và có thể thay thếcho các hydrocolloid đắt tiền thường được dùng để cải thiện kết cấu bánh mì[30] EPS được sản xuất bởi một số loại vi khuẩn biển có thể tạo nhũ tương ổnđịnh EPS này đã được chứng minh là hiệu quả hơn so với các chất nhũ hoáthương mại có sẵn [35]

2.3.4.2 Ứng dụng của EPS trong y học và một số lĩnh vực khác

Tác dụng prebiotic: EPS tăng nồng độ của Bifidobacteria cho thấy mộttiềm năng prebiotic Nghiên cứu của Salazar và cộng sự cho thấy rằng EPS được

tổng hợp bởi Bifidobacteria trong đường ruột đóng vai trò như cơ chất lên men

vi sinh vật trong môi trường ruột người, thay đổi tương tác giữa các quần thể visinh ruột [29]

 Chống viêm loét dạ dày và giảm cholesterol: EPS tinh khiết từ S.

thermophilus CRL 1190 đã được tìm thấy hiệu quả trong việc phòng ngừa viêm

dạ dày mãn tính Các tác giả chứng minh rằng tương tác của EPS và protein cótác dụng bảo vệ dạ dày Nagaoka và cộng sự đã báo cáo tác dụng chống loét dạ

dày bởi các EPS được sản xuất từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacillus và

Streptococcus [29] Sữa lên men bởi chủng Lc Lactis ssp cremoris SBT0495

sản xuất EPS có tác dụng làm giảm cholesterol Nghiên cứu đã chứng minh với0,1% Xanthan gum có thể hấp thụ 2.9 mg/dl cholesterol [29]

 Đặc tính chống gây đột biến: EPS liên kết với các tế bào của chủng L.

Plantarum, liên kết với các chất gây đột biến và các amin dị vòng ; làm bất hoạt

chúng Một số ít nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm trên động vật về tác dụngsinh lý hoặc miễn dịch khi cho chúng ăn hoặc dùng thuốc EPS [29]

 Đặc tính chống ung thư và chống oxy hóa : EPS từ các nguồn tự nhiên

an toàn như LAB có thể phục vụ như là một thay thế tốt với các tác nhân chống

khối u nhân tạo[41] EPS sản xuất Lactobacillus plantarum C88 có khả năng

nhặt (scavenging) cAC gốc hydroxyl, gốc tự do DPPH, và khả năng giảm H2O2

gây oxy hóa dẫn đến thiệt hại trong 2 tế bào Caco [46] EPS của L paracasei

subsp paracasei NTU 101 và L plantarum 102 NTU được chứng minh chất

chống oxy hóa tiềm năng [29]

 Ngoài ra, EPS được ứng dụng trong quy trình xử lí nước thải côngnghiệpvà thành phố EPS là tác nhân keo tụ được sử dụng để thay thế cho cácchất keo tụ có nguồn gốc hóa học (Al2O3 và các polymer hữu cơ) vì thế đảm bảo

an toàn cho sức khỏe con người EPS cũng tham gia vào sự hấp thụ của các ionkim Các EPS có thể liên kết nhiều ion kim loại, bao gồm Fe2+, Zn2+, Cu2+ và

Co2+[29]

2.3.4.3 Ứng dụng của một số loại EPS

Dextran được sử dụng trong ngành công nghiệp bánh kẹo để cải thiện độ

ẩm, duy trì độ nhớt và ngăn chặn sự kết tinh đường Trong kẹo cao su và kẹojelly, nó hoạt động như một chất tạo gel Trong kem nó hoạt động như mộtchất ức chế sự hình thành tinh thể và trong các hỗn hợp bánh nó tạo ra cấu trúcbánh và tính chất cảm quan như mong muốn [29] Trong y học là tác nhângiảm cholesterol, chất thay thế huyết tương, chất tăng cường lưu thông máu.Ngoài ra, nó cũng được ứng dụng ứng dụng trong công nghệ phân tách, trong

hệ thống nhũ tương, vận chuyển vi mô trong mô hay nuôi cấy tế bào,trongphương pháp sắc kí, trong ngành công nghiệp giấy, quá trình mạ kim loại, giúpthu hồi dầu tốt hơn và được sử dụng để sản xuất vật liệu sinh học [40] Dextran

được sản xuất bởi Mesenteriodes Leuconostoc, đã được sử dụng để chuẩn bị

một trong những sản phẩm thay thế huyết tương hiệu quả nhất cho ứng dụng bịsốc và mất máu [39]

Levan là làm đặc sinh học trong ngành công nghiệp thực phẩm, chất tạonhớt và chất ổn định sử dụng trong sản xuất bánh kẹo, kem Các Levan từ L.sanfranciscensis LTH 2590 thể hiện tác dụng probiotic [29] Trong y học, levan

thể hiện đặc tính chống ung thư, giảm cholesterol trong máu [40] Nó cũng đượcứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, mỹ phẩm và thuốc [39].

Xanthan gum được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với các tínhnăng như chất tạo nhớt, chất ổn định,chất nhũ hóa và chất đình chỉ đối với thựcphẩm Nó được sử dụng trong các sản phẩm từ sữa, đồ uống, bánh kẹo, quần áo,bánh mì, xi-rô [ 29] Đặc tính lưu biến cao của xanthan gum cho phép nó được

sử dụng như tác nhân kiểm soát tính lưu biến trong các hệ thống chứanước(aqueous)và làm chất ổn định cho nhũ tương và huyền phù [35] Trong yhọc, nó như tác nhân kháng virus và chống ung thư, tác nhân giảm cholesterol,chất thay thế huyết tương, chất độn máu trong huyết tương Xanthan gum cònứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác Nó được sử dụng trong các sảnphẩm thức ăn chăn nuôi, cũng như khai thác dầu, sản xuất dược phẩm, mỹphẩm, giấy, sơn và các ngành công nghiệp dệt may Nó được sử dung trong thuhồi dầu mỏ loại hai và ba, trong sơn, thuốc trừ sâu và chất tẩy rửa, dược phẩm,

mỹ phẩm, mực in để kiểm soát độ nhớt, sự lắng cặn và sự tạo gel [39 ]

Alginate có khả năng tạo gel, tạo màng trong thực phẩm [39] Nó được ứngdụng trong y học để làm băng gạc phẫu thuật, điều trị vết thương và phát hànhthuốc có kiểm soát [30]

Gellan là chất ổn định và tác nhân khuấy đục đối với thực phẩm Gellan làtác nhân tạo gel làm đặc môi trường nuôi cấy, đặc biệt là trong nghiên cứu visinh vật biển[ 29] Nó đang được nghiên cứu để làm chất thay thế agar, gel điện

di cũng được và cũng ứng dụng trong dược phẩm[40]

Curdlan và Succinoglycan là một tác nhân tạo gel trong thực phẩm.Curdlan được ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm Nó cùng vớizidovudine (AZT) thể hiện hoạt động kháng virus cao và đầy hứa hẹn (làmthuốc chống AIDS) [29] Ngoài ra, nó có tác dụng loại bỏ kim loại nặng và được

sử dụng làm chất phụ gia trong sản xuất bêtông [40] Succinoglycan có ứngdụng trong thu hồi dầu và nhiều ứng dụng khác tương tự như curdlan [29]

Inulin thay thế chất béo trong các sản phẩm thực phẩm Inulin có tác dụngprobiotic, nuôi dưỡng các tế bào niêm mạc ruột và ức chế tác nhân gây bệnh,phân phối thuốc chống bệnh ung thư ruột kết, thay thế chất béo trong các sảnphẩm thực phẩm Kefiran cải thiện tính đàn hồi nhớt của gel sữa chua [30].Cellulose được sử dụng trong y học để làm da nhân tạo tạm thời của conngười để chữa lành các vết bỏng hoặc vết thương phẫu thuật Cellulose có vai

trò trong hình hành các mô mạch máu Nó được ứng dụng trong công nghệ phântách và sản xuất màng âm thanh trong thiết bị nghe nhìn [29].

2.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide

Exopolysaccharide đem đến nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, yhọc và nhiều lĩnh vực khác Vì thế, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoahọc trên thế giới đã tập trung nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy và thunhận EPS thích hợp, nghiên cứu về tính chất và ứng dụng các hợp chất này.Một số công trình đã được nghiên cứu như:

Cerning (1995) đã nghiên cứu sản xuất EPS bởi vi khuẩn lactic vàpropionibacteria sữa và nhận thấy rằng điều kiện lên men (nhiệt độ và thời gianlên men), thành phần môi trường (nguồn carbon, nitơ) ảnh hưởng đến năng suấtpolymer và thành phần đường của chúng Thí nghiệm được tiến hành trên các vi

khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong lên men sữa như Streptococcus

thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus và Lactococcus lactis

subsp cremoris [14].

Torino và cộng sự (2005) đã công bố rằng quá trình sinh tổng hợp

exopolysaccharide của chủng Lactobacillus helveticus ATCC 15807 đạt cao hơn

khi pH của môi trường nuôi cấy là 4,5 và có bổ sung nguồn carbon là đườnglactose Exopolysaccharide được sinh tổng hợp trong điều kiện này có phân tửlượng đạt 1,2-1,9x106 Da và có thành phần các monomer bao gồm glucose vàgalactose theo tỉ lệ 2:1 [39]

Wang và cộng sự (2008)công bố kết quả nghiên cứu về tính chất lý hóa của

EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 Công trình này sử dụng chủng L kefiranofaciens ZW3 nuôi trong trong môi trường chứa

whey Sau khi ủ 48 giờ đến 72 giờ, được ly tâm ở 12.000 rpm 4oC trong 15 phút

để loại bỏ các tế bào, lượng EPS trong dịch nổi được xác định bằng phenolsulfuric Phương pháp sử dụng đường chuẩn glucose Kết quả chủng ZW3 sảnxuất EPS đạt hiệu quả cao lên đến 1215mg/l Và nó được sản xuất thậm chí còncao hơn lên đến 1675mg/l nếu môi trường ủ được gia nhiệt ở 100oC trong 30phút và sau đó ly tâm và định lượng EPS [42]

Wang cùng cộng sự (2010) tiếp tục nghiên cứu về khả năng sinh EPS của

chủng Lactobacillus plantarum KF5 được phân lập từ nấm Kefir Tây Tạng Chủng L plantarum KF5 nuôi trong môi trường sữa lỏng, ủ trong 24-48 giờ,

được ly tâm ở 10000 rpm 4oC trong 15 phút Sau khi loại bỏ các tế bào, các dịchnổi được thẩm tách và định lượng EPS được xác định bằng phenol sulfuric

Phương pháp sử dụng glucose làm chuẩn (Dubois et al., 1956) Năng suất chủng

KF5 được xác định là 75,57mg/l dưới điều kiện ủ ban đầu Để tăng năng xuấtEPS, tiếp tục nghiên cứu thay đổi các điều kiện Nuôi cấy trong 30 giờ, pH banđầu 6,3, nồng độ cấy 3%, số lượng EPS được sản xuất bởi KF5 có thể lên tới95,58mg/l, tăng 26,48% so với trong điều kiện lên men ban đầu Nhiều nhànghiên cứu đã báo cáo rằng có ý nghĩa về mối quan hệ giữa các thành phần, điều

kiện nuôi cấy và pH (Kim et al., 2008; Santivarangkna et al., 2008) Lượng EPS được sản xuất bởi chủng L plantarum và L Paraplantarum dao động 140- 297mg/l nuôi ở MRS chứa maltose (Zotta et al., 2008) [43]

Seesuriyachan và cộng sự(2011) đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp

exopolysaccharide bởi Lactobacillus confusus TISTR 1498 khi sử dụng nước dừa

như là nguồn C thay thế và nghiên cứu ảnh hưởng của pepton, cao thịt, cao nấm.Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp exopolysaccharide đạtcao nhất khi môi trường có chứa 100% nước dừa, 20g/l saccharose và 5g pepton,2,5g/l cao thịt, 2,5g/l cao nấm và nuôi cấy ở 350C với pH=5,5 trong 24 giờ [33] Ismail và Nampoothirid (2013)đã cho thấy tính chất của exopolysaccharide

được sinh tổng hợp bởi chủng Lactobactillus plantarum MTCC 9510 là có tiềm

năng probiotic và các tác dụng của hợp chất này lên tính chất lưu biến tinhbột[24] Cũng trong năm này, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động

chống oxy hóa của EPS được sinh tổng hợp từ chủng L plantarum C88 Kết quả

phát hiện thấy rằng EPS này là một chuỗi heteropolysaccharide, có cấu trúc baogồm galactose và glucose với tỉ lệ 1:2, khối lượng phân tử trung bình của EPS này

là 1,15x106 Da Kết quả này cũng cho thấy EPS này có tác dụng chống oxy hóa

vô cùng quan trọng và có tiềm năng trong ngành công nghệ thực phẩm [46] Wang và cộng sự (2014) nghiên cứu tính chất của EPS mới với hoạt tính

chống lại khối u từ L plantarum 70810 Kết quả cho thấy EPS đạt cực đại

khi lên men ở 31oC, 22 giờ và khối lượng phân tử EPS 169,6 kDa EPS này

có khả năng chống ung thư cho thấy hợp chất exopolysaccharide này có khảnăng ức chế các tế bào ung thư gan HepG-2, ung thư dạ dày BGC-823 và ungthư ruột kết HT-29 Từ kết quả đạt được này, nhóm tác giả đã kiến nghị rằng

có thể sử dụng hợp chất này để sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc chốngung thư [41]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi sinh vật nghiên cứu là 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1, Lactobacillus plantarum W3, Lactobacillus plantarum W5, Lactobacillus

plantarum N5 được cấp từ Phòng thí nghiệm vi sinh của Khoa Cơ khí – Công

nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế

3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ

- Nồi hấp cao áp

- Cân điện tử T/R 200

- Máy ly tâm ống fancol để bàn K241R

- Máy đo quang phổ (UV/VIS)- Nhật Bản

- Máy đo pH điện tử (HANNA)- Ý

3.2.2 Hóa chất:

- Các hóa chất để pha môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic và giữgiống: pepton, cao thịt, cao nấm, glucose, sorbitan monooleate (Tween),

K2HPO4, MgSO4.7H2O, NH4, MnSO4, CH3COONa, agar, glycerol, NaCl

- Các loại hóa chất khác như cồn 990, cồn 960, H2SO4 đậm đặc, Phenol 5%, cácloại đường (glucose, saccharose, lactose),axit tricloacetic (TCA)

Tất cả các hóa chất trên được cung cấp bởi hãng Merk và Trung Quốc

3.3 Qúa trình bố trí thí nghiệm

Qúa trình bố trí thí nghiệm được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1, W3,W5,N5 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao.

Qúa trình nuôi cấy để sinh EPS được tiến hành trong các ống fancol cóchứa 10 ml môi trường MRS có bổ sung 1% glucose và 2 % lactose, mỗi chủng

Lactobacillus plantarum được tiến hành nuôi lặp lại 3 lần Mật độ tế bào của các

chủng L.plantarum W1, L.plantarum W3, L.planarum W5, L.platarum N5 trong

môi trường nuôi cấy là 106 CFU/ ml, nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 370C

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung loại đường khác nhau với nồng độ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn Lactobacillus platarum đã tuyển chọn.

Qúa trình nuôi cấy để sinh EPS được tiến hành trong các ống fancol cóchứa 10ml môi trường MRS có bổ sung glucose, lactose, saccharose và đường

trong nước dừa với nồng độ khác nhau Mật độ tế bào của chủng L plantarum

đã tuyển chọn trong môi trường nuôi cấy là 106 CFU/ ml, nuôi trong 48 giờ ởnhiệt độ 370C

Khảo sát tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus

plantarum W1, W3,W5,N5 có khả năng

sinh tổng hợp EPS cao

Chủng thích hợp

Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung loại đường khác nhau với

nồng độ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy đến khả

năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn Lactobacillus

platarum đã tuyển chọn

Môi trường thích hợp

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (12, 24, 36, 48,

60, 72 giờ) đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi

khuẩn Lactobacillus platarum đã tuyển chọn

Thời gian thích hợp

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung saccharose với nồng độ khác nhau vào trong MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn

Tiến hành bổ sung đường saccharose vào môi trường MRS theo 5 côngthức sau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng Mỗi công thức được tiến hành nuôilặp lại 3 lần

Môi trường 1: MRS+ 2% saccharose

Môi trường 2: MRS+ 3% saccharose

Môi trường 3: MRS+ 4% saccharose

Môi trường 4: MRS+ 5% saccharose

Môi trường 5: MRS+ 6% saccharose

3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung glucose với nồng độ khác nhau vào trong MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn

Tiến hành bổ sung đường glucose vào môi trường MRS theo 5 công thứcsau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng Mỗi công thức được tiến hành nuôi lặp lại

3 lần

Môi trường 6: MRS+ 2% glucose

Môi trường 7: MRS+ 3% glucose

Môi trường 8: MRS+ 4% glucose

Môi trường 9: MRS+ 5% glucose

Môi trường 10: MRS+ 6% glucose

3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung lactose với nồng độ khác nhau vào trong MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn

Tiến hành bổ sung đường lactose vào môi trường MRS theo 5 công thứcsau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng Mỗi công thức được tiến hành nuôi lặp lại

3 lần

Môi trường 11: MRS+ 2% lactose

Môi trường 12: MRS+ 3% lactose

Môi trường 13: MRS+ 4% lactose

Môi trường 14: MRS+ 5% lactose

Môi trường 15: MRS+ 6% lactose

3.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung đường trong nước dừa với nồng độ khác nhau vào trong MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L plantarum đã tuyển chọn

Tiến hành bổ sung đường glucose vào môi trường MRS theo 5 công thứcsau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng Mỗi công thức được tiến hành nuôi lặp lại

3 lần

Môi trường 16: MRS+ 0,5% đường trong nước dừa

Môi trường 17: MRS+ 1% đường trong nước dừa

Môi trường 18: MRS+ 1,5% đường trong nước dừa

Môi trường 19: MRS+ 2% đường trong nước dừa

3.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn L platarum đã tuyển chọn.

Qúa trình nuôi cấy để sinh EPS được tiến hành trong các ống fancol có

chứa 10ml môi trường nuôi cấy đã tuyển chọn Mật độ tế bào của chủng L.

plantarum đã tuyển chọn trong môi trường nuôi cấy là 106 CFU/ ml, nuôi ở nhiệt

độ 370C trong các khoảng thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72giờ

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp vi sinh vật [43],[ 3]

(1) (2) (3)

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình nuôi cấy để chủng Lactobaccillus plantarum sinh

EPS

Thuyết minh quy trình: Các chủng gốc của vi khuẩn L Plantarum được ria

lên đĩa MRS agar, nuôi cấy trong 24 giờ ở 370C, pH = 6-6,2, để thu khuẩn lạcđơn Sau đó, khuẩn lạc đơn từ đĩa thạch của các chủng được cấy sang 3 ốngeppendorf, mỗi ống có chứa 1ml môi trường MRS lỏng, rồi nuôi trong tủ ấm ở

370C trong 24 giờ Sau 24 giờ nuôi, eppendorf được ly tâm ở 10000 vòng/phút ở

40C trong vòng 10 phút nhằm mục đích thu sinh khối, loại dịch nuôi cấy Sinhkhối được rửa hai lần và tái huyền phù bằng dung dịch 1% pepton và 0,85%NaCl Dung dịch pepton và NaCl có chứa tế bào vi khuẩn được đem đi đo ODvới bước sóng 600nm để xác định mật độ tế bào Dung dịch này sau đó được

Nuôi cấy tăng sinh (MRS lỏng, ở

thay đổi

Nuôi cấy ở trong môi trường đã tuyển chọn ở 370C trong các khoảng thời gian khác nhau: 12 h, 24

h, 36 h, 48h, 50 h, 60

h

đưa vào môi trường nuôi cấy sinh EPS sao cho mật độ tế bào là 106 CFU/mldịch nuôi cấy Thực hiện nuôi cấy theo các điều kiện khác nhau như sơ đồ (1),(2) và (3) để chủng sinh EPS Sơ đồ (1): tiến hành như mục 3.3.1, để khảo sát

tìm ra chủng L plantarum có khả năng sinh EPS cao nhất Sơ đồ (2): từ chủng

L plantarum đã tuyển chọn, tiến hành nuôi cấy như mục 3.3.2, để khảo sát ảnh

hưởng khi bổ sung các loại đường khác nhau với nồng độ khác nhau vào môi

trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lactobacillus

plantarum này và chọn được môi trường nuôi cấy thích hợp Sơ đồ (3): tiến

hành nuôi cấy như mục 3.3.3 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến

khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn L platarum đã tuyển chọn.

3.4.2 Phương pháp tách chiết EPS [3],[ 43]

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tách chiết EPS

Fancol chứa dịch nuôi cấy đã đủ

Kết tủa protein bởi 30% TCA

Hòa tan tủa trong nước cất 500C,

khoảng 2 ml

1ml dd trên + 1ml dd phenol 5% + 5 ml dd H2SO4 đđ, vortex và cho vào nước sôi 2 phút

Đo OD 490 nmHòa tan tủa trong nước cất 500C

Tính hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose

Thuyết minh quy trình (hình 4.3): Sau thời gian nuôi, dịch nuôi cấy được lytâm tách sinh khối tế bào ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong vòng 10 phút đểthu dịch nổi có chứa EPS Dịch có chứa EPS được kết tủa protein bởi 30% TCA,

để qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau đó, tiến hành ly tâm dịch ở 5000 vòng/phút,nhiệt độ 40C trong vòng 10 phút để loại bỏ kết tủa protein, thu dịch nổi Sau khiloại bỏ protein dịch có chứa EPS được bổ sung thêm ethanol lạnh 990 để kếttủa EPS lần 1, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2, để qua đêm ở 40C, rồi tiến hành

ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để thu kết tủa EPS.Sau đó, EPS được hòa tan lại một lẫn nữa bằng 2ml nước cất 500C, mục đích

để loại bỏ các đường dư của môi trường trong quá trình nuôi cấy và làm choEPS tinh sạch hơn Sau khi hòa tan tủa thêm ethanol lạnh 990 vào dung dịch

đó với tỷ lệ dịch có chứa EPS: ethanol= 1:2 để qua đêm ở 40C để kết tủa EPSlần 2, rồi tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phútthu được EPS thô Sau cùng, tiến hành xác định hàm lượng EPS bằng phươngpháp phenol-sunfuric

3.4.3 Phương pháp hóa học

3.4.3.1 Phương pháp phenol-sunfuric để xác định hàm lượng EPS tinh khiết [3]

 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharide thànhmonosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độhấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490nm

 Cách tiến hành:

Xây dựng đường chuẩn : xem chi tiết ở mục 1.1,phụ lục 1

Hình 3.4 Đường chuẩn glucose được dựng bằng phương pháp phenol-sunfuric

Phương trình đường chuẩn: Y1= 0,008X1+ 0,055

Trong đó: X1: là hàm lượng đường

Y1: là độ hấp thụ quang 490nmXác định hàm lượng EPS : Để xác định hàm lượng EPS tinh khiết có chứatrong mỗi mẫu EPS tổng thô Mẫu EPS thô thu được hòa tan bằng nước cất

500C Lấy 1ml dung dịch trên rồi cho vào ống nghiệm có đậy nút kín Thêm vàomỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắcđều các ống nghiệm Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó

để nguội các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo độ hấp thu quangcủa các dung dịch này ở bước sóng 490nm,với mẫu trằng (blank) có chứa 1mlnước cất 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, thu được cácgiá trị độ hấp thụ quang suy ra hàm lượng EPS tinh khiết có chứa trong mỗi mẫuEPS tổng thô

3.4.3.2 Xác định hàm lượng đường trong nước dừa bằng phương pháp DNS [7]

 Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử vớithuốc thử dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệthuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ởbước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết vớithuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nước dừa

 Cách tiến hành:

- Chuẩn bị thuốc thử DNS: Hòa tan 16 g NaOH trong 600 ml nước cất,thêm vào 10 g axit dinitrosalicylic và khuấy đều Sau đó, hòa tan 30 g muốikalinatritartrate (KNaC4H4O6.4H2O) trong 300 ml nước cất Cuối cùng, hòa tan 2dung dịch trên vào nhau và khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn, định mức bằngnước cất đến 1000 ml, bảo quản trong lọ tối màu ở 40C

sau bằng NaOH 1N, rồi NaOH 0,1N thử với phenolphthalein cho đến khi códung dịch màu hồng.

Mẫu không thủy phân và mẫu thủy phân lần lượt được cho vào bình địnhmức dung tích 100ml, cùng với nước rửa Sau đó cho 2-5ml dung dịch chì acetat30% lắc đều và để lắng trong 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trongsuốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong Dùng Na2SO4 để loại chìacetat thừa Lắc đều và để tủa lắng xuống Thêm nước cất để định mức lên100ml Lắc đều và lọc qua giấy lọc

Dựng đường chuẩn glucose : xem chi tiết mục 1.2, phụ lục 1

Hình 3.5 Đường chuẩn glucose được dựng bằng phương pháp DNS

Phương trình đường chuẩn: Y2= 0,838 X2- 0,048

Trong đó X2: hàm lượng đường khử trong dung dịch đường pha loãng

3.4.4 Phương pháp vật lý

3.4.4 1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) [8]

Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng

sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độtia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh mộtcách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường Ngoài ra, chính bảnthân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng Do đó, lượng ánh sáng đi quacũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng Để đánh giá mật độ tế bàotrong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành

đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy, đối chiếu với môi trường lỏng không

có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh khối vi khuẩn

Cách tiến hành: Chủng vi khuẩn được nuôi trong eppendorf có chứa 1mlmôi trường MRS lỏng, ủ 37oC, 24 giờ Sau thời gian nuôi tiến hành ly tâm ở

10000 vòng/phút ở 40C trong vòng 10 phút để tách dịch thu sinh khối Sinh khốiđược rửa hai lần và tái huyền phù bằng dung dịch 1% pepton và 0,85% NaCl.Dung dịch pepton và NaCl có chứa tế bào vi khuẩn được pha loãng (nếu cần )rồi đem đi đo OD với bước sóng 600nm để xác định mật độ tế bào, với mẫublank là nước muối sinh lí vô trùng