Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung các loại đường lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharids bởi chủng vi khuẩn

Biểu đồ kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminis TC25, TC28, TC30 trên môi trường MRS bổ sung 2% lactose, 1% glucose...28 Hình 4.2.. Biểu đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

Khoa Cơ khí - Công nghệ

Sinh viên thực hiện : Huỳnh Phước Toàn

Thời gian thực hiện : 05/01/2015 đến 08/05/2015

Địa điểm thực hiện : PTN Khoa Cơ khí – Công nghệ

Giáo viên hướng dẫn : ThS Trần Bảo Khánh

Bộ môn : Công nghệ sau thu hoạch

NĂM 2015

LAB : Lactic acid bacteria

MRS : The Man, Rogosa and Sharpes

OD : Mật độ quang

TCA : Axit tricloacetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tính chất của vi khuẩn EPS [16] 9Bảng 3.1 Môi trường MRS Broth 1000ml 21Bảng 4.1 Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đường glucosecủa chủng L farciminis TC30 31Bảng 4.2 Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đường lactosecủa chủng L farciminis TC30 34Bảng 4.3 Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đườngsaccharose của chủng L farciminis TC30 37Bảng 4.4 Bảng môi trường MRS borth bổ sung đường trong nước dừa 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp 5

Hình 2.2 Vi khuẩn Lactobacillus farciminis 7

Hình 2.3 Cấu trúc Succinoglycan từ Sinorhizobium meliloti [54] 10

Hình 2.4 Cấu tạo Exopolysaccharides 10

Hình 2.5 Cơ chế sinh tổng hợp EPS 12

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc đơn của chủng L farciminic TC25, TC28, TC30 .20

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23

Hình 4.1 Biểu đồ kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminis TC25, TC28, TC30 trên môi trường MRS bổ sung 2% lactose, 1% glucose 28

Hình 4.2 Kết quả so màu bằng phương pháp phenol-sunfuric khi khảo sát chọn chủng sinh EPS cao nhất 29

Hình 4.3 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L farciminis TC30 31

Hình 4.4 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lactose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L farciminis TC30 34

Hình 4.5 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L farciminis TC30 37

Hình 4.6 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong nước dừa bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L farciminis TC30 41

Hình 4.7 Biểu đồ kết quả so sánh giữa các môi trường có khả năng sinh EPS cao của chủng L.farciminis 43

Hình 4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh EPS bởi chủng L farciminis TC30 44

Lời Cảm Ơn

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em

đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ hết lòng của các cá nhân và tập thể

Em xin gửi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến tất cả mọi người

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, khoa Cơ Khí –Công Nghệ và thầy cô trường Đại học Nông Lâm Huế đã tận tình giảng dạy, tạomọi điều kiện cho em suốt 4 năm học qua Những kiến thức và kinh nghiệm củathầy cô truyền đạt là nền tảng giúp cho em thực hiện tốt đề tài này

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Trần Bảo Khánh,người cô đã tận tâm hướng dẫn, trực tiếp dẫn dắt em từ lúc định hướng chọn đềtài cũng như trong suốt quá trình hoàn thiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ban lãnh đạo cũng như toàn thể anh chị

em công tác tại phòng thí nghiệm khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã giúp đỡ, tạo điềukiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận Cuối cùng, em xinchân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, tập thể lớp BQ45 và những người thân luônquan tâm, ủng hộ, khích lệ trong quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu

Do còn hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như kinh nghiệm nên khóaluận không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiếnđóng góp của các thầy, cô và các bạn để khóa luận được hoàn thành tốt hơn.Một lần nữa, em xin được bày tỏ sự cảm kích trước những tình cảm vàcông lao đó

Huế, tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Huỳnh Phước Toàn

MỤC LỤC

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Lactobacillus [55] 3

2.1.1 Giới thiệu về Lactobacillus 3

2.1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus 3

2.1.1.2 Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus [55] 5

2.1.2 Giới thiệu về Lactobacillus farciminis 6

2.1.3 Tiềm năng của exopolysaccharides từ vi khuẩn lactic [32] 7

2.2 Tổng quan về exopolysaccharides 8

2.2.1 Giới thiệu exopolysaccharides 8

2.2.2 Cấu tạo, cấu trúc Exopolysaccharides [12],[40] 10

2.2.2.1 Cấu trúc EPS từ chủng Succinoglycan 10

2.2.2.2 Cấu tạo của EPS 10

2.2.3 Sinh tổng hợp EPS.[40] 12

2.2.3.1 Homo- EPS sinh tổng hợp 12

2.2.3.2 Hetero-EPS sinh tổng hợp [40] 13

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất EPS vi khuẩn lactic 14

2.2.4.1 Thành phần môi trường 14

2.2.4.2 Oxy tự nhiên 15

2.2.4.3 pH 15

2.2.4.4 Nhiệt độ 15

2.2.4.5 Giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn 15

2.2.5 Chức năng, ứng dụng Exopolysaccharides 16

2.2.5.1 Ứng dụng của EPS trong công nghiệp, thực phẩm 16

2.2.5.2 Tác dụng của exopolysaccharides đối với sức khỏe con người 16

2.2.5.3 Một số ứng dụng khác 17

2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất EPS trên thế giới và Việt Nam [5] 17

2.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất EPS trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình sản xuất EPS ở Việt Nam [5] 18

PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

3.1 Nguyên vật liệu – hóa chất – thiết bị nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.2 Hóa chất, môi trường 20

3.1.2.1 Môi trường 20

3.1.2.2 Hóa chất 21

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 21

3.1.3.1 Dụng cụ 21

3.1.3.2 Thiết bị 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.1 Phương pháp vi sinh 24

3.2.1.1 Hoạt hóa và giữ giống [4] 24

3.2.2.2 Phương pháp tăng sinh 25

3.2.2 Phương pháp vật lý 25

3.2.2.1 Phương pháp đo mật độ quang[52] 25

3.2.2.2 Phương pháp xác định pH 25

3.2.2.3 Phương pháp ly tâm 25

3.2.3 Phương pháp hóa học 25

3.2.3.1 Kết tủa protein bằng TCA 25

3.2.3.2 Phương pháp kết tủa EPS bằng dung môi (etanol 99o) [33] 26

3.2.3.3 Phương pháp phenol - sulfuric để định lượng EPS tinh khiết [25],[1] 26

3.2.3.4 Phân tích hàm lượng nước dừa bằng DNS [47] 26

3.2.5 Phương pháp toán học 26

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Kết quả khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminis TC25, TC28, TC30 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao 27

4.2 Kết quả khảo sát điều kiện môi trường thích hợp để chủng vi khuẩn L.

farciminis TC30 đã được tuyển chọn sinh EPS cao 29

4.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nguồn cacbon để chủng vi khuẩn L farciminis TC30 sinh EPS cao 30

4.2.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose khác nhau trong môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30 30

4.2.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30 33

4.2.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30 36

4.2.1.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong nước dừa bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30 39

4.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh exopolysaccharide bởi chủng L farciminis TC30 đã tuyển chọn 42

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học – công nghệ, con người ngày càngtiếp cận gần hơn, đến thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói riêng

Và một trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides.Exopolysaccharides là polymer có trọng lượng phân tử cao bao gồm thành phầnmonosaccharrides, được tiếc ra bởi một loại vi sinh vật vào môi trường xungquanh [54] Do sự đa dạng, phong phú trong thành phần, exopolysaccharides đãđược ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Ngoài

ra nó còn góp phần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, trong xử lý môitrường Sự quan tâm về vi khuẩn acid lactic sản xuất exopolysaccharides đãtăng lên gần đây bởi vì đây là những loại sinh vật thực phẩm sản xuất polymerquan trọng trong việc xác định các đặc tính lưu biến của các sản phẩm côngnghiệp như sữa chua, pho mát và món tráng miệng làm từ sữa Khi thêm vào sảnphẩm thực phẩm exopolysaccharides mang chức năng như chất làm đặc, ổnđịnh, chất chuyển thể sữa, tác nhân làm đông , và tác nhân giữ nước Bên cạnh

đó exopolysaccharides của vi khuẩn lactic còn đóng vai trò quan trọng trong sứckhỏe người và động vật như hoạt tính tăng cường khả năng miễn dịch, khángvirus, chống oxy hóa, chống ung thư và chống cao huyết áp

Lactobacillus farciminis là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình, chúng

được tìm thấy trong tự nhiên và trong các loại thực phẩm chẳng hạn như các sảnphẩm thịt (đặc biệt là xúc xích) và trong men bánh mì [55] Ngoài ra chúng đượctìm thấy trong các món ăn truyền thống nổi tiếng nhất của Hàn Quốc như kimchi [38] Do đặc tính của vi khuẩn lactic là khả năng sinh sản và tổng hợppolysaccharide ngoại bào là rất nhanh Nếu chúng đựợc nuôi cấy trong điều kiệnthích hợp thì khả năng sinh polysaccharide của chúng là rất cao và sẽ đem lạiđược nguồn polysaccharide dồi dào giúp mở ra được tiềm năng ứng dụng củaexopolysaccharide từ vi sinh vật vào các lĩnh vực khác nhau

Để thu được exopolysaccharides cao nhất thì ta phải chọn ra được chủng

Lactobacillus farciminis mạnh nhất và được nuôi trong điều kiện tốt nhất Vì

vậy em chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung các loại đường lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharids bởi chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn từ Lactobacillus farciminis TC25, TC28, TC30 ” để làm đề tài khóa luận

tốt nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu

- Tuyển chọn các chủng Lactobacillus farciminis có tiềm năng sinh tổng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về Lactobacillus [55]

2.1.1 Giới thiệu về Lactobacillus

Lactobacillus là một trong những nhóm vi khuẩn lactic có lợi và an toàn

đối với con người Lactobacillus tồn tại ở nhiều nơi trong tự nhiên Ở dạ đường dày – ruột người, Lactobacillus là một trong những nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế Hiện nay, nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus có lợi cho con người, có nguồn

gốc từ đường dạ dày – ruột người, được nghiên cứu để có thể đưa vào cơ thể conngười qua đường tiêu hóa

Để tồn tại được trong đường tiêu hóa của người, vi khuẩn Lactobacillus

phải có khả năng chịu đựng môi trường acid trong dạ dày người Đề tài ở đâynghiên cứu khả năng chịu đựng môi trường acid trong dạ dày của vi khuẩn

Lactobacillus, nhằm chọn lọc được những vi khuẩn Lactobacillus hữu ích có

khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa của người, được sử dụng để làm tăngcường sức khỏe cho con người

2.1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus

Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic, là những vi khuẩn có khả

năng lên men các carbohydrate thành năng lượng và acid lactic

Vi khuẩn Lactobacillus được phân loại như sau:

dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc

Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm

khi di động Chúng có khả năng tạo ra acid lactic như một sản phẩm cuối cùngchủ yếu

Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh trưởng

chậm trong không khí Đôi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được kích thíchbằng cách thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy

Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc

biệt, chúng phát triển rất tốt trên môi trường có chứa nhiều phức chất

Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 400C.Nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ là 5 – 530C

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được môi trường có tính

acid pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8

Lactobacillus có một số đặc tính sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính,

khử nitrate âm tính (đôi khi dương tính với pH > 6), có khả năng lên menglucose…

Người ta có thể dựa trên các sản phẩm của quá trình biến dưỡng để phân

chia các loài Lactobacillus thành 2 nhóm:

- Các loài lên men đồng hình

- Các loài lên men dị hình

Các loài thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% acid lactic từ glucose,trong khi các loài lên men dị hình chỉ tạo ra 50% acid lactic và một lượng đáng

kể carbone dioxide, acetate và ethanol Các loài Lactobacillus lên men đồng hình gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus

leichmannii… và các loài lên men dị hình gồm: Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum… Mặc dù

tất cả các loài Lactobacillus đều tạo ra acid lactic, nhưng các loài khác nhau có thể tạo ra các acid lactic khác nhau về đồng phân hóa học Lactobacillus giữ vai

trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm, các sản phẩm chế biến từ sữa và

rượu bia Người ta thường tìm thấy vi khuẩn Lactobacillus ở cả động vật và thực vật Ở người, Lactobacillus thường hiện diện ở ruột và âm đạo.

Hình 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp [55]

2.1.1.2 Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus [55]

Trong công nghệ thực phẩm

Vi khuẩn Lactobacillus tham gia sản xuất nhiều sản phẩm lên men như: rau

quả muối chua, yaourt, phomat… Chúng đóng vai trò bảo quản thực phẩm khỏi

sự hư hỏng, cung cấp chất dinh dưỡng cho thực phẩm hoặc tạo mùi vị đặc trưngcho sản phẩm

Trong các sản phẩm từ sữa, vi khuẩn Lactobacillus có thể hoạt động một

mình hoặc kết hợp với các vi khuẩn lactic khác Sữa acidophilus là sản phẩm lên

men từ sữa với sự phối hợp hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus để tạo nên sản phẩm

sữa chua

Rau quả muối chua là món ăn phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Nhiềuloại rau quả muối chua là món ăn thường ngày trong các gia đình ở Việt Namnhư: cà muối, dưa cải chua, dưa cải bắp… Kimchi là sản phẩm lên men củanhiều loại rau quả khác nhau của Hàn Quốc…Trong quá trình muối chua rau

quả, các vi khuẩn Lactobacillus trong rau quả tạo ra một lượng acid đáng kể góp

phần làm chua rau quả và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hư hỏngthực phẩm

Ngoài ra, vi khuẩn Lactobacillus cũng tham gia vào quá trình sản xuất bánh

mì Nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus được phát hiện trong bột chua làm bánh

mì gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus

delbrueckii subsp Delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhammosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfrancisco và Lactobacillus fermentum.

Lợi ích của Lactobacillus đối với sức khỏe con người [55]

Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus

có tác dụng tốt đối với sức khỏe của con người Các nhà khoa học đã chứng

minh một số loài Lactobacillus có khả năng ngăn chặn và chữa trị bệnh tiêu

chảy cấp tính ở trẻ em

Một số loài vi khuẩn Lactobacillus cũng có khả năng chống lại vi khuẩn

Helicobacter pylori, một loài vi khuẩn có thể gây viêm dạ dày, loét hệ thống tiêu

hóa và ung thư dạ dày

Ngoài ra, các nghiên cứu cũng cho thấy, một số loài Lactobacillus có khả

năng làm giảm bệnh viêm ruột ở người, giảm dị ứng thực phẩm, ngăn chặnnhiễm trùng đường tiết niệu, ngăn chặn các rối loạn ở đường niệu sinh dục, ngănchặn các bệnh tim mạch

2.1.2 Giới thiệu về Lactobacillus farciminis

Lactobacillus farciminis là nhóm vi khuẩn lên men đồng hình nó có trong

tự nhiên và trong các loại thực phẩm chẳng hạn như các sản phẩm thịt (đặc biệt

là xúc xích) [55], men bánh mì và là một trong những loài vi khuẩn acid lacticphổ biến nhất hiện nay trong quá trình sản xuất của kim chi, các món ăn truyền

thống Hàn Quốc nổi tiếng nhất[38] Lactobacillus farciminis có khả năng sản

xuất oxit nitric (NO) trong ống nghiệm Mặc dù vai trò của oxit nitric (NO)trong việc kiểm soát quá trình viêm nhiễm đường tiêu hóa vẫn còn gây tranh cãi,các nhà nghiên cứu INRA đã chứng minh rằng tác dụng chống viêm quan sát vềbệnh viêm ruột kết được dựa trên cơ chế hoạt động được chủ yếu liên quan đến

việc sinh NO bởi Lactobacillus farciminis vi khuẩn trong lòng ruột.

Các nhà nghiên cứu đã tiến hành khảo sát sự tác động của Lactobacillus

farciminis trên các phản ứng miễn dịch và các tế bào biểu mô L.farciminis giảm

sự gia tăng này trong tính thấm ruột bằng cách ức chế sự co của khung tế bào(mạng lưới các sợi trong tế bào) thông qua sự ức chế của chuỗi myosine Nghiên

cứu đã cho thấy sử dụng Lactobacillus farciminis bằng đường tiêu hóa có thể

làm giảm nồng độ của cytokinines giúp chống viêm đường tiêu hóa.[55]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc cho vi khuẩn Lactobacillus farciminis vào

thức uống trong nhiều ngày có thể làm giảm đau và làm giảm viêm đại tràng Cácnghiên cứu gần đây cũng đả giải thích rõ ràng hơn về các cơ chế liên quan

Hình 2.2 Vi khuẩn Lactobacillus farciminis [50]

Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu cũng chứng minh rằng Lactobacillus

farciminis làm giảm cơn co thắt cơ bụng trong tình trạng viên ruột kết ở chuột,

có thể dùng trong điều trị bệnh lý viên mãn tính hay cấp tình ở ruột [8][55]

L farciminis có thể được dùng trong các dạng chế phẩm thực phẩm như

các sản phẩm lên men như các sản phẩm từ sữa trong trường hợp này

L farciminis có thể là một phần của các men được sử dụng trong sản phẩm,hoặc được thêm vào sản phẩm sau khi lên men [14] Chúng cũng có thể bổ sungtrực tiếp vào thức ăn nước uống với liều dùng thích hợp từ 106-1010 CPU/ ngày

Ngoài ra Lactobacillus farciminis có thể làm chất phụ gia bổ sung vào thức ăn của lợn con [7] [17].

2.1.3 Tiềm năng của exopolysaccharides từ vi khuẩn lactic [32]

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng lượng EPS và đặc tính của nó phụ thuộcrất nhiều vào vi sinh vật và điều kiện, thành phần môi trường nuôi cấy Ngoài ra,EPS được thu nhận từ vi khuẩn lactic có trọng lượng phân tử tương đối cao và

Vi khuẩn acid lactic được biết đến thông qua các ứng dụng của chúng trongthực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp hóa chất Gần đây khả năngsinh EPS của vi khuẩn lactic được đặc biệt quan tâm và mở rộng Nhữngexopolysaccharides có giá trị thương mại rất lớn do các tính chất lý hóa có khảnăng ứng dụng trong công nghiệp Thực phẩm liên quan đến vi khuẩn lacticđược 'công nhận là an toàn "(GRAS) và LAB được xem là 1 trong những vikhuẩn thích hợp cho việc sản xuất của EPS [32] Vì vậy chúng đã cho thấy mộttiềm năng rất lớn cho việc sản xuất chế phẩm này.

2.2 Tổng quan về exopolysaccharides

2.2.1 Giới thiệu exopolysaccharides

Exopolysaccharides là polymer có trọng lượng phân tử cao được cấu tạo từcác đường đơn, chúng kết hợp với bề mặt tế bào dưới dạng hình thức viên nanghoặc tiết vào môi trường ở dạng chất nhờn gọi là vỏ bao hoặc chất nhờnexopolysaccharides [39] Polysaccharides vi sinh vật bao gồm nhiều loạipolysaccharides trong tế bào, các polysaccharides cấu trúc và polysaccharidesngoại bào hoặc EPS Exopolysaccharides thường bao gồm các monosacarides vàmột số nhóm thế không carbohydrate (như acetate, pyruvate, succinate vàphosphate)

EPS trong môi trường tự nhiên không có khả năng như là một chất dự trữ,

vì hầu hết các vi khuẩn hình thành chất nhờn mà không có khả năng sản xuấtnăng lượng [10] Do sự đa dạng, phong phú trong thành phần mà EPS đã đượcứng dụng phong phú trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm[54] Ngoài ra EPS còn có các tính chất sau

Bảng 2.1 Tính chất của vi khuẩn EPS [16]

Tính chất Chức năng liên quan của vi khuẩn EPS tới màng sinh học

Độ bám dính Exopolysaccharidesmặt của các màng sinh học. có độ bám dính cao làm tăng khả năng liên kết bềTập hợp tế

EPS có tính chất lưu biến đặc biệt như chất ổn định, chất tạo

độ nhớt, tạo gel hoặc chất nhũ hóa và rất có tiềm năng trongphụ gia thực phẩm Các tính chất lưu biến của EPS được sảnxuất bởi vi khuẩn lactic là do khối lượng phân tử của chúng,khối lượng phân tử đa dạng, các gốc đường trong thành phần,các liên kết giữa các đường monomerr và sự hiện diện củacác nhóm bên [15]

2.2.2 Cấu tạo, cấu trúc Exopolysaccharides [12],[40]

2.2.2.1 Cấu trúc EPS từ chủng Succinoglycan

Hình 2.3 Cấu trúc Succinoglycan từ Sinorhizobium meliloti [54]

2.2.2.2 Cấu tạo của EPS

Sự đa dạng của polysaccharide được phân loại dựa trên liên kết hóa học,chức năng và khối lượng phân tử,… EPS được phân thành hai nhóm: homo-EPS

và hetero-EPS

Hình 2.4 Cấu tạo Exopolysaccharides

Homo-EPS: chỉ có duy nhất một loại monosaccharide Thành phần cũngnhư cấu tạo của monomer đường có thể thay đổi các thuộc tính củaexopolysaccharides Mono-carbohydrate tạo thành exopolysaccharides thường làD-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fructose, L-rhamnose, L-arabinose, N-acetyl- amin D-glucose và N-acetyl-D-galactose amin cũng như các acid uronicacid D-glucuronic, acid D-galacturonic, acid D-manuronic và acid L-guluronic[11] Sự khác biệt giữa các homopolysaccharides chủ yếu là khác nhau về cấutrúc của nó như khả năng phân nhánh, trọng lượng phân tử, và giống sản xuất.Hai nhóm quan trọng của homo-EPS được sản xuất bởi LAB đó là:

(I) glucans, chủ yếu gồm thành phần glucose với liên kết 1,6 và

α-1,3, cụ thể là dextrans, được sản xuất bởi Leuconostoc mesenteroides

dextranicum subsp Mesenteroides và Leuconostoc mesenteroides subsp Mutans

và sản xuất bởi Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus.

(II) Fructans, chủ yếu gồm các phân tử fructose β-2,6-liên kết, như

Levan sản xuất bởi Streptococcus salivarius [40].

Hetero- EPS [12],[40]

Thành phần hóa học của hetero-EPS rất đa dạng Hetero-EPS là polymerrr

sinh học chứa các đơn vị lặp đi lặp lại nhiều lần chủ yếu gồm glucose, galactose, L-rhamnose Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấutrúc của các đơn vị lặp lại của mỗi chủng là không giống nhau, ngoại trừ trong

D-trường hợp của Lactobacillus kefiranofaciens subsp Loài này, được phân lập từ

hạt kefir, một thực phẩm sữa lên men từ các khu vực Bắc Caucasus, tạo ra mộtlượng lớn các polysaccharides

2.2.3 Sinh tổng hợp EPS.[40]

Hình 2.5 Cơ chế sinh tổng hợp EPS[27]

2.2.3.1 Homo- EPS sinh tổng hợp

Homo – EPS được tổng hợp bên ngoài các tế bào bằng emzymeglycosyltransferaza (GTF) hoặc fructosyltransferase (FTF) Sản xuất Homo-EPS

có trọng lượng phân tử cao từ LAB cũng sử dụng enzyme GTF để tổng hợp glucans từ sucrose Quá trình này sử dụng sucrose như một cơ chất, và nănglượng cần thiết cho quá trình thủy phân từ sucrose Không có yêu cầu nănglượng khác cho quá trình sản xuất EPS để sinh tổng hợp enzyme bởi vì tổng hợpEPS từ GTF hoặc FTF không liên quan đến quá trình vận chuyển hoặc việc sửdụng các tiền chất carbohydrate Do đó, một lượng lớn sucrose có thể dễ dàngđược chuyển đổi để tổng hợp EPS

α-Phản ứng tổng hợp Glucan được xúc tác bởi GTF có thể được viết như sau:Sucrose + H2O → glucose + fructose

Sucrose + carbohydrate mạch ngắn → oligosaccharide + fructose

Sucrose + glucan (n) → glucan (n + 1) + fructose

Dưới tác dụng xuác tác của enzyme GTF, Lactobacillus sản xuất một loạt

các glucans bao gồm các polymer với liên kết 1,6 gọi là (dextran), liên kết 1,3 gọi là (mutan), và cả hai liên kết α-1,6 và α -1,4 gọi là (alternan) Trọnglượng phân tử tương đối của glucans từ chủng lactobacilli khoảng 1 × 106 - 5 ×

α-107 Da Ngoài ra, các enzyme GTF không bão hòa bởi cơ chất và chuyển phảnứng quá trình thủy phân sucrose dưới nồng độ sucrose trên 100 nM

Phản ứng tổng hợp fructan được xúc tác bởi FTF có thể được viết như sau:Sucrose + H2O → fructose + glucose

Sucrose + carbohydrate mạch ngắn → oligosaccharide + glucose

Sucrose + fructan (n) → fructan (n + 1) + glucose

Fructans thường có trọng lượng phân tử tương đối trên 5 × 106 Da Tương

tự như GTFs, FTFs không bão hòa bởi cơ chất và chuyển phản ứng quá trìnhthủy phân sucrose dưới nồng độ sucrose trên 200 nM

2.2.3.2 Hetero-EPS sinh tổng hợp [40]

Hetero-EPS không được tổng hợp bởi các enzyme ngoại bào, nhưng thayvào đó là tổng hợp của một chuỗi phức tạp của các tương tác liên quan đến cácenzyme trong tế bào EPS được thực hiện bằng cách trùng hợp của các đơn vị lặp

đi lặp lại, và các đơn vị lặp lại được cấu tạo bằng cách bổ sung các nucleotideđường ở màng tế bào chất Đường là nguyên liệu khởi đầu cho chuỗi tổnghợp Chủng LAB có thể sử dụng monosacarides khác nhau và disaccharides nhưnguồn năng lượng, thông qua việc sử dụng hiệu quả các loại đường

Đường đưa vào tế bào được chuyển đổi thành nucleotide đường Cácđường monosacarit được chuyển đổi thành nucleotide đường cho các phản ứngtrùng hợp, bao gồm cả UDP (uridine diphosphate), dNTP (thymidinediphosphate), và GDP (guanosine diphosphate)

Phản ứng trùng hợp như vậy được xúc tác bởi pyrophosphorylasesglycosyl Glu-1P (Gal-1P) + UTP → UDP-Glu (UDP-Gal) + pyrophosphateUDP-glucose sau đó được chuyển đổi sang UDP-galactose bởi epimerasesthành UDP-glucose-4-epimerase

Phản ứng này có thể đảo ngược: UDP-glucose ↔ UDP-galactose

Liên kết Glycosidic được hình thành trên màng ở tế bào chất Việc vậnchuyển này tạo nên sự bổ sung các đơn vị lặp đi lặp lại với phân tử hetero-EPS Sựgián đoạn của gen glycosyl transferase không sản xuất hetero-EPS đột biến Nhưvậy, glycosyl transferases được cho là rất quan trọng cho quá trình tổng hợp EPS

Trong quá trình sản xuất EPS các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy

có thể ảnh hưởng đáng kể đến năng suất cũng như kích thước và thành phần hoáhọc của các EPS cụ thể là giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nguồn carbon,nguồn nitơ, tỷ lệ oxy, nhiệt độ

2.2.4.1 Thành phần môi trường

Cacbon

EPS có thể được hình thành từ nhiều hợp chất chứa carbon Nó là nguồndinh dưỡng được sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất EPS Tuy nhiên, tácđộng của nguồn carbon về thành phần hóa học đến việc hình thành EPS đang làvấn đề gây tranh cãi Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, sử dụng một loạt cácloài vi khuẩn, để đánh giá vai trò của nguồn carbon đến thành phần hóa họcEPS Một số nghiên cứu đã tìm thấy thành phần exopolysaccharide là khôngthay đổi với việc sử dụng nguồn cacbon khác nhau [6]

Nitơ

Trong quá trình sản xuất EPS vi sinh vật có thể sử dụng nhiều nguồn nitơbao gồm amoni, nitrat, nitrit, và các acid amin Theo Sutherland, muối amoni vàcác acid amin là phổ biến nhất Sản lượng EPS là khác nhau nếu ta sử dụng cácnguồn nitơ khác nhau Khi thay đổi nguồn nitơ ban đầu cũng đã được chứngminh là ảnh hưởng đến việc hình thành kích thước phân tử EPS [6]

Tỷ lệ Carbon / Nitơ

Trong khi carbon và nitơ đều cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào bìnhthường thì tỷ lệ giữa chúng cũng ảnh hưởng sản xuất polysaccharide Nghiêncứu khác nhau có thấy rằng sản xuất EPS được ưa thích hợp trong những điềukiện hạn chế nitơ Theo Corpe cho biết sản lượng EPS được tối đa khi tỷ lệcarbon : nitơ là 10: 1 [38]

Các chất dinh dưỡng khác

Ngoài nguồn carbon và nitơ là những thành phần chính cần thiết cho vikhuẩn phát triển và tổng hợp EPS thì còn có một loạt các chất dinh dưỡng khácbao gồm kali, magiê, canxi, photpho Một số nghiên cứu đã tìm thấy rằng cácchất dinh dưỡng không sử dụng nguồn carbon, nitơ, phosphate, hoặc lưu huỳnh

sẽ hạn chế sản xuất exopolysaccharide [6]

2.2.4.2 Oxy tự nhiên

Đối với vi khuẩn hiếu khí, oxy là điều cần thiết cho sự tăng trưởng, và có vaitrò quan trọng trong sản xuất EPS Oxy có trong môi trường bị hạn chế bởi tỷ lệkhuếch tán từ khí quyển và phụ thuộc vào độ nhớt Do đó, trong quá trình sản xuấtcần phải sục khí Tuy nhiên, tác động của việc sục khí vào sản xuất EPS là không

rõ ràng Một số các nghiên cứu chỉ ra rằng sản xuất EPS là tối ưu trong điều kiệnsục khí thấp nhưng những người khác đã chỉ ra rằng sản xuất là polysaccharide tối

đa trong điều kiện sục khí cao, khi hạn chế oxy không áp đặt [6]

2.2.4.3 pH

Nồng độ pH ảnh hưởng rất lớn trong quá trình sản xuất EPS pH tối ưu choviệc sản xuất exopolysaccharide có thể khác với pH tối ưu cho vi khuẩn pháttriển Một số tác giả chỉ ra rằng kết quả pH trong quá trình sản xuất làm giảmđáng kể sản lượng EPS tạo thành, đặc biệt là trong môi trường có tính acid.Trong khi pH tối ưu cho sản xuất EPS phụ thuộc vào loài vi khuẩn Những kếtquả này khẳng định sự cần thiết cho việc kiểm soát pH trong nghiên cứu tổnghợp EPS [6]

2.2.4.4 Nhiệt độ

Vai trò của nhiệt độ đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong sản xuất làexopolysaccharide là rất quan trọng Sản xuất EPS thường đạt kết quả tốt bởimột nhiệt độ tối ưu Một số tác giả cho thấy rằng khi nhiệt độ tăng thì việc tổng

hợp polymerrr tế bào sẽ bị chậm lại [6].

Garcia-Garibay và Marshall nhận thấy rằng sự sản xuất polymer tương ứng

của chủng Lactobacillus delbrueckii NCFB 2772 phát triển trong môi trường

sữa gầy ở nhiệt độ 48oC cao hơn so với ở nhiệt độ tối ưu tăng trưởng (37 – 42oC)(tương đương 11mg dextran / 1 đơn vị khuẩn lạc) [18]

2.2.4.5 Giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn

Đối với nhiều vi khuẩn giai đoạn tăng trưởng ảnh hưởng lớn đến quá trìnhsản xuất EPS Một số kinh nghiệm cho thấy một số loài vi khuẩn sản xuất EPStối đa trong giai đoạn tăng trưởng, trong khi đối với những người khác sản xuấtEPS đạt tối đa trong giai đoạn ổn định Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong khisản lượng EPS thay đổi theo giai đoạn phát triển của vi khuẩn thì thành phầnEPS cũng không bị thay đổi [6]

2.2.5 Chức năng, ứng dụng Exopolysaccharides

Nhiều tính chất có lợi của EPS đã được nghiên cứu và sử ụng trong côngnghệ thực phẩm củng nhue sức khỏe con người

2.2.5.1 Ứng dụng của EPS trong công nghiệp, thực phẩm

EPS sản xuất bởi các chủng LAB được sử dụng trong sản xuất các móntráng miệng sữa chua, phô mai, sữa Tác dụng của EPS khác nhau phụ thuộc vàothành phần monosaccharide của chúng, loại mối liên kết hiện tại, mức độ phânnhánh và trọng lượng phân tử EPS bắt nguồn từ LAB đóng vai trò rất quan trọngtrong việc cải thiện tính lưu biến, kết cấu, các vấn đề như độ nhớt thấp, gãy gelhoặc tách whey thường xuyên gặp phải trong quá trình sản xuất sữa chua có thểđược giải quyết bằng các ứng dụng của EPS [32] Ví dụ, Các EPS được sản xuất

bởi L.plantarum 70810 có thể cải thiện kết cấu và hương vị của sữa đậu nành lên

men EPS tăng khả năng giữ nước và độ nhớt của sản phẩm, tính kết cấu proteinsữa đậu nành, dẫn đến sự ổn định trong sữa đậu nành lên men ở 4°C [23]

EPS đã được sử dụng trong sản phẩm pho mát ít béo để cải thiện các tínhchất lưu biến của kết cấu và các loại pho mát Sự loại bỏ chất béo làm cho mạnglưới protein ít đặc hơn, do đó ảnh hưởng đến kết cấu pho mát Các nghiên cứu

đã chỉ ra rằng việc sử dụng EPS trong sản xuất pho mát làm cho sản phẩm cómức độ ẩm cao tương tự với pho mát đầy đủ chất béo và làm cho chúng trở nênmịn màng, mềm mại Trong khi không có EPS thì làm cho chúng khô và dạnghạt [20]

Ngoài ra EPS cũng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để cải thiện kết cấu.Một ví dụ cho việc sử dụng công nghiệp của exopolysaccharides là ứngdụng dextran trong bánh mì panettone và các ngành công nghiệp bánh như cảithiện kết cấu của thực phẩm giàu tinh bột

2.2.5.2 Tác dụng của exopolysaccharides đối với sức khỏe con người

EPS được sản xuất bởi LAB có vai trò chức năng khác nhau trong sức khỏecon người và động vật bao gồm điều hòa miễn dịch, kháng virus, chống oxyhóa, và hạ huyết áp, làm giảm cholesterol, chống loét Các tính chất này đã đượcnghiên cứu rộng rãi Bên cạnh đó khả năng prebiotics dựa vào LAB vàoligosaccharides có những lợi ích sức khỏe khác như dextran được sinh tổng

hợp bởi Leuconostoc mesenteriodes thì được sử dụng như những sản phẩm thay

thế huyết tương có hiệu quả nhất cho các trường hợp bị sốc máu và mất máu.Ngoài ra EPS từ LAB có tiềm năng để phát triển và khai thác như một thựcphẩm chức năng đối với cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [40],[29],[30]

2.2.5.3 Một số ứng dụng khác

Ngoài các chức năng được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm

và trong y tế, sức khỏe, dược phẩm thì một số EPS còn được ứng dụng mở rộngqua các lĩnh vực khác như: công nghiêp dệt may, mỹ phẩm, xử lý môi trường…

Exopolysaccharides viên nang có thể bảo vệ vi khuẩn gây bệnh và gópphần vào khả năng lây bệnh nhân tạo của chúng Phần đính kèm của vi khuẩn cốđịnh nitơ ở rễ cây và các phần tử trong đất, có ý nghĩa quan trọng đối với vùngxung quanh trong đất của vùng rễ và lây nhiễm của thực vật, có thể được trunggian bởi exopolysaccharides

EPS của vi sinh vật cung cấp đặc tính gần giống như chất gôm hiện đang sửdụng Bên cạnh đó đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong việc phát hiện và phát triển cácEPS nên việc thay thế phần lớn gôm bởi hệ vi sinh vật đang được tiến hành [54]

2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất EPS trên thế giới và Việt Nam [5]

2.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất EPS trên thế giới

Lịch sử của exopolysaccharides vi khuẩn bắt đầu trong giữa thế kỷ 19 với

sự khám phá của một exopolysaccharide trong rượu vang, mà sau này được biết

đến như là dextran và prokaryote được sản xuất từ chủng Leuconostoc

mesenterides Trong suốt thời gian đó một số exoplysaccharides khác phát hiện

bao gồm cellulose, alginate và xanthan [31]

Cùng với sự phát triển về nghiên cứu và ứng dụng các polymer sinh họctrong nhiều lĩnh vực khác nhau, rất nhiều trung tâm lớn về hóa họcpolysaccharide ở Nhật, Châu Âu, Nam Mỹ và nhiều nơi khác trên thế giới đã

được hình thành Các hướng nghiên cứu về polymerrr sinh học trên thế giới tập

(Streptococus themophilus và Lactobacillus bulgaricus )” của Viện khoa học

Bungari thì hàm lượng exopolysaccharide của hỗn hợp ba chủng nói trên đạtđược là 19,3 g/l và trọng lượng sinh khối khô là 21 g/l sau 84h nuôi cấy ở 280C.Hỗn hợp nuôi cấy của ba chủng được nuôi trong thiết bị lên men hiện đại (có hệthống cung cấp khí tự động ), môi trường có chứa 44 g/l Lactoza, 4 g/l

Fukuda và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến

tính chất lý hóa của EPS được sinh tổng hợp từ L fermentum TDS030603 Kết

quả cho thấy EPS đạt cao nhất sau 24 – 48 giờ và suy giảm dần sau 72 giờ ủtrong môi trường MRS Tác giả cũng công bố khối lượng phân tử của EPS thuđược là 2,8x104 Da Trong môi trường có các thành phần đường khác nhau thìEPS thu được có khối lượng phân tử lớn hơn 106 Da Thành phần monomerr củaEPS này gồm glucose và galactose với tỉ lệ 2,6:2,8 [15]

Nghiên cứu về khả năng tổng hợp EPS của chủng L helveticus ATCC

15807, Torino và cộng sự (2005) đã phát hiện rằng quá trình sinh tổng hợp EPS

bởi L helveticus ATCC 15807 đạt được cao hơn ở pH 4,5 khi nguồn carbon sử

dụng là đường lactose thay vì đường glucose Tác giả cũng công bố rằng khốilượng phân tử của EPS thu được là 1,2 - 1,9x106 Da và thành phần monomercủa EPS này gồm glucose và galactose theo tỉ lệ 2:1 [41]

Một nghiên cứu nữa về: “Qúa trình lên men sản xuất polysaccharide” theo

US Patent 4692480 Polysaccharide được nghiên cứu là Xanthangum từ hai

chủng Xanthomonas juglandis NCPP1B 413 và Xanthomonas campestris NC1B

11781 Chủng X juglandis NCPP1B 413 được nuôi cấy trong thiết bị lên men

hiện đại (có hệ thống cung cấp khí tự động, 300C, pH 7,0) Với môi trường cóchứa 102 g/l glucoza, 2 g/l (NH4)2SO4 thì hàm lượng polysaccharide của chủng

là 27 – 30 g/l Còn chủng X campestris NC1B 11781, sau 48h nuôi cấy hàm

lượng polysaccharide đạt 16 – 20 g/l Chủng được nuôi cấy ở 300C trong thiết bịlên men hiện đại, môi trường có bổ sung 43 g/l lactoza, 1,5 g/l (NH4)2SO4 [5]

2.3.2 Tình hình sản xuất EPS ở Việt Nam [5]

Bên cạnh tác dụng cải thiện một số tính chất lưu biến của thực phẩm nhưlàm tăng độ đặc, độ nhớt, tăng khả năng tạo gel, sự có mặt các hợp chấtexopolysaccharide trong thực phẩm còn có vai trò như là prebiotic tốt cho sứckhỏe Hơn nữa, exopolysaccharide của vi khuẩn lactic còn có vai trò quan trọngtrong sức khỏe người và động vật như hoạt tính tăng cường khả năng miễn dịch,kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư và chống cao huyết áp Cho đến naychưa tìm thấy tài liệu nào về việc nghiên cứu khai thác exopolysaccharide sinhtổng hợp bởi vi khuẩn lactic ở Việt Nam Tuy nhiên ở nước ta hiện nay cũng cónhiều tổ chức khoa học đã tiến hành nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các sảnphẩm của EPS vào các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp dầu khí và y học từcác chủng vi sinh khác Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam cũng đã có một số đề tài về nghiên cứu về sinh tổng hợp và ứng dụng

các chủng vi sinh vật sinh EPS vào việc sản xuất một số chế phẩm sinh học vàkết quả thu được rất khả quan.

PGS.TS Tống Kim Thuần và cộng sự (Phòng Công nghệ vật liệu Sinh học)

đã thành công trong việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh giữ ẩm đất

Lipomycin M từ chủng nấm men sinh EPS Lipomyces starkeyi PT7.1 phân lập

từ Việt Nam Khả năng giữ độ ẩm cho đất của chế phẩm này có được là nhờ cácpolymer ngoại bào (glucan) được hình thành trong quá trình hoạt động sống củanấm men PT7.1 Các polymer ngoại bào này có thành phẩn chủ yếu là cácpolysaccharide được hình thành từ quá trình ngưng tụ các monosaccharide tạocầu nối glucoside EPS của chúng làm tăng độ kết cấu của đất, có khả năng giữnước, chống rửa trôi và làm giảm sự bay hơi nước Kết quả ứng dụng chế phẩmLipomycin M trên đất khô hạn của Mê Linh, Vĩnh Phúc và một số tỉnh TâyNguyên cho thấy, chúng làm tăng độ ẩm đất lên 12 – 16% và cải thiện được một

số tính chất hóa lý của đất Với thành công bước đầu về việc sử dụng chủng vi

sinh vật Lipomyces sinh polysaccharide làm tác nhân giữ ẩm đất, chúng tôi hoàn

toàn tin tưởng vào sự thành công của hướng nghiên cứu mới này

PGS.TS Lại Thúy Hiền và cộng sự (Phòng VSV Dầu mỏ) đã nghiên cứuqui trình sản xuất Xanthan-gum từ vi khuẩn sinh polysacaride ngoại bào

Xanthomonas campestris phân lập từ nhà máy đường Thanh Hóa Các tác giả đã

đưa ra qui trình sản xuất Xanthan gum trong nồi lên men qui mô 20 lít bằngnguyên liệu trong nước và TS Phan Văn Đoàn (Viện nghiên cứu dầu khí) đãnghiên cứu một số tính chất hóa lý của xanthangum Chế phẩm xanthan - gumnày đã được ứng dụng thử nghiệm thành công trong việc khoan thăm dò và khaithác dầu khí (hút nước trong các giếng dầu nhằm nâng cao hiệu suất khai thácdầu thô)

PHẦN 3.

PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên vật liệu – hóa chất – thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminis được ký hiệu TC25, TC28, TC30

được cấp từ phòng thí nghiệm khoa Cơ khí – Công Nghệ

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc đơn của chủng L farciminic TC25, TC28, TC30 3.1.2 Hóa chất, môi trường

3.1.2.1 Môi trường

Môi trường MRS thạch : môi trường MRS Broth bổ xung them 2% agar.Môi trường TSA giữ giống: 70% MRS Broth + 30% glyxerol

Nước muối sinh lý 1000ml: 10g pepton 1% + 8,5g NaCl 0.85%

Môi trường MRS Broth 1000ml [4]

Bảng 3.1 Môi trường MRS Broth 1000ml

Các hóa chất tinh chế EPS: Cồn 960, cồn 990, acid trichlohidrit

Các hóa chất pha môi trường: NaCl, HCl, NaOH…

- Tủ an sinh học LABtech

- Nồi hấp khử trùng

- Máy đo pH Hana

- Máy đo quang phổ kế UV/VIS – nhật

- Máy ly tâm ống fancol để bàn K241R

- Tủ lạnh Toshiba

- Máy vortex

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Ly tâm thu dịch nổi, kết tủa protein bởi

độ glucose (2%, 3%, 4%, 5%, 6%)

MRS bổ sung nồng

độ lactose (2%, 3%, 4%, 5%, 6%)

MRS bổ sung nồng độ saccharose (2%, 3%, 4%, 5%, 6%)

MRS bổ sung đường trong nước dừa (25%, 50%, 75%, 100%)

Trong thời gian 12 giờ,

24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,

Thuyết minh sơ đồ: từ chủng Lactobacillus farciminis gốc ta tiến hành

tăng sinh trong ống ependot chứa môi trường MRS borth sau đó tiến hành cấy

trang các chủng vi khuẩn L farciminis (TC25, TC28, TC30) từ các ống tăng

sinh lên đĩa MRS agar để thu khuẩn lạc đơn, chọn khuẩn lạc đơn tốt rồi tiếnhành nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC, pH = 6 – 6,2 Sau khi nuôi cấy, dịch nuôicấy được ly tâm ở 5000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 10 phút nhằm mục đíchthu sinh khối Loại bỏ môi trường và rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch 1%pepton và 0,85% NaCl Sinh khối sau đó được đưa vào môi trường nuôi cấy ởmật độ 106 CFU/ml

Quá trình nuôi cấy để sinh EPS được thực hiện trong ống fancol có chứa10ml môi trường MRS nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, thời gian nuôi là 48 giờ vớicác môi trường khảo sát sau: môi trường MRS bổ sinh 1% glucose và 2%

lactose để chọn chủng vi khuẩn L farciminis sinh tổng hợp EPS cao, môi trường

MRS bổ sung (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng glucose, môi trường MRS bổsung (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng lactose, môi trường MRS bổ sung (2%,3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng saccharose, môi trường MRS bổ sung (25%, 50%,75%, 100%) lượng đường trong nước dừa, sau đó ta chọn môi trường bổ sungđường sinh tổng hợp EPS cao để tiến hành khảo sát trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ

48 giờ, 60 giờ và 72 giờ để biết được thời gian nuôi cấy thích hợp để chủng L.

farciminis sinh tổng hợp EPS cao Kết thúc thời gian nuôi cấy, dịch nuôi cấy

được ly tâm tách sinh khối tế bào ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10phút để thu dịch nổi có chứa EPS

Dịch nổi có chứa EPS được kết tủa protein bởi 30% TCA, để qua đêm ởnhiệt độ 4oC Sau đó, dịch nổi được tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ

4oC trong vòng 10 phút để loại bỏ protein

Sau khi loại bỏ protein dịch có chứa EPS được bổ sung thêm ethanol lạnh

99o để kết tủa EPS, tỷ lệ dịch nổi : ethanol = 1:2, để qua đêm ở 4oC Tiến hành lytâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút, sau đó ta hòa tan tủabằng nước 500C rồi tiến hành tinh sạch cồn lần 2 với tỉ lệ dịch : etanol là 1:2.Tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để thuEPS Sau đó, hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol-sunfuric

3.2.1 Phương pháp vi sinh

3.2.1.1 Hoạt hóa và giữ giống [4]

Chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminic phân lập từ thực phẩm lên men

truyền thống ở huế được giữ giống trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 30%glycerol và được bảo quản ở nhiệt độ -200C

3.2.2.2 Phương pháp tăng sinh

Cách tiến hành: từ chủng Lactobacillus farciminis gốc ta tiến hành tăng

sinh trong ống eppendoff chứa môi trường MRS borth sau đó tiến hành cấy

trang các chủng vi khuẩn L farciminis (TC25, TC28, TC30) từ các ống tăng

sinh lên đĩa peptri chứa MRS agar để thu khuẩn lạc đơn, chọn khuẩn lạc đơn tốtrồi tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC, pH = 6 – 6,2 Sau đó đưa về OD = 1rồi tiến hành nuôi 48 giờ để sinh EPS

3.2.2 Phương pháp vật lý

3.2.2.1 Phương pháp đo mật độ quang[52]

Mục đích: định lượng tế bào vi sinh vật.

Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể được xác định một cáchgián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang

Cách tiến hành:

Sau khi nuôi 24 giờ, ta tiến hành ly tâm thu sinh khối, rửa 2 lần trong dungdịch 1% pepton và 0.85% NaCl và tái huyền phù Tiến hành vortex pha loãngrồi cho vào cuvec tiến hành đo OD

- Khối lượng tế bào được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nmvới mẫu trắng (blank) là nước muối sinh lý vô trùng Mẫu được pha loãng bằngnước muối sinh lý vô trùng

- Cách pha loãng để đưa về OD = 1

Số ml cần hút = số ml môi trường nuôi cấy× 10 6/ số OD × 8 × 108

3.2.3.1 Kết tủa protein bằng TCA

- Cơ chế: ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa

(thu nhận proton) và khi ta cho TCA vào, các ion mang điện tích âmtrichloroacetate sẽ liên kết với các protein tích điện dương làm cho chúng kết

- Cách tiến hành: Sau khi lên men 48h, ta ly tâm 5000 vòng 10 phút ở 4oC

thu được dịch nổi sau đó cho TCA 50% vào.

Lượng TCA cho vào tương ứng 70ml dung dich cần 30ml TCA(100%)

3.2.3.2 Phương pháp kết tủa EPS bằng dung môi (etanol 99 o ) [33]

Cơ chế: phương pháp kết tủa bằng ethanol (Zheng và cộng sự, 2008) được

sử dụng để xác định lượng EPS sản sinh ra bởi vi khuẩn EPS có thành phần chủ

yếu là các polysaccharide (Tsuneda và cộng sự,2003) Ethanol phá vỡ quá trình

hydrate hóa của các polysaccharide và các ion tích điện trong nước Điều nàycho phép các phân tử polysaccharide đến gần nhau hơn, tương tác và tạo thànhkhối ổn định và có thể thu được bằng cách ly tâm

Cách tiến hành: vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường MRS

broth 48 giờ Ethanol lạnh được cho vào dịch vi khuẩn sau ly tâm (5.000 rpm, 4

oC, 10 phút) với tỷ lệ 2: 1 và giữ lạnh ở 40C trong vòng 24 giờ Lượng EPS kếttủa được thu bằng cách ly tâm ở 5.000 rpm, 4ºC trong 10 phút

3.2.3.3 Phương pháp phenol - sulfuric để định lượng EPS tinh khiết [25],[1]

- Nguyên tắc: dựa vào phản ứng thuỷ phân PS thành mono, mono tạo màu

với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490 nm

Chưng cách thủy 2 phút rồi để nguội, tiến hành đo OD 540 nm

Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose với buớc song490nm Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch EPS ở bước sóng 490 nm.Kết hợp với phương trình đường chuẩn, suy ra hàm lượng EPS tinh khiết cóchứa trong mỗi mẫu EPS tổng thô

3.2.3.4 Phân tích hàm lượng nước dừa bằng DNS [47]

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử vớithuốc thử dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệthuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ởbước sóng 540 nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết vớithuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nước dừa

3.2.5 Phương pháp toán học

- Xử lý bằng phần mềm SPSS 20 để hệ thống hóa các số liệu nghiên cứu.

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminis

TC25, TC28, TC30 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao

Cấu trúc của EPS được tạo thành từ các đơn vị mono-carbohydrate như D –glucose, D – galactose, D – mannose, L – fucose, L – rhamnose, L – arabinose,

N – acetylamin, D – glucose và N – acetyl – D – galactose amin cũng như cácacid uronic acid D – glucuronic, acid D – galacturonic, acid D – manuronic vàacid L – guluronic [24] Trong đó có D-glucose, D-galactose là kết quả của sựthủy phân đường lactose như kết quả của Zhang và cộng sự (2011), đã nghiên

cứu về khả năng phát triển và quá trình sinh tổng hợp EPS bởi L fermentum F6

trong môi trường chứa sữa gầy, phát hiện thấy rằng cấu trúc của EPS được tổng

hợp bởi L fermentum F6 trong môi trường sữa gầy có thành phần monomer gồm

glucose và galactose với tỉ lệ 4:3 [46] Từ đó chúng tôi kết hợp môi trườngMRS borth bổ sung 2% lactose, 1% glucose để tiến hành khảo sát khả năng sinh

tổng hợp của chủng L farciminis Để khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của các chủng L farciminis TC25, TC28, TC30 chúng tôi

tiến hành nuôi cấy vi khuẩn từ các ống chủng gốc từ phòng thí nghiệm đã đượcchuẩn bị, tiến hành ria đĩa chọn khuẩn lạc đơn và ủ 24h ở 370C, sau đó tiến hànhnuôi trong môi trường dinh dưỡng MRS có bổ sung 2% lactose, 1% glucose vànuôi ở 48 giờ, nhiệt độ 37oC Đem dịch nuôi cấy đi ly tâm loại bỏ sinh khối, tiếpđến kết tủa loại bỏ protein bằng TCA Sau đó kết tủa lại 2 lần bằng etanol 990 đểthu tủa EPS Để xác định hàm lượng EPS tiến hành so màu bằng phương phápphenol – sunfuric Sau khi tiến hành thí nghiệm kết quả được thể hiện trong hình4.1 (xem thêm phụ lục 5.1)

Hình 4.1 Biểu đồ kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi

khuẩn Lactobacillus farciminis TC25, TC28, TC30 trên môi trường MRS bổ

sung 2% lactose, 1% glucose

Nhìn vào hình 4.1 ta có thể thấy, với điều kiện nuôi cấy trong môi trườngMRS có bổ sung 2% lactose, 1% glucose với thời gian 48 giờ, ở nhiệt độ 37oC,

kết quả cho thấy cả 3 chủng L farciminis đều có khả năng sinh tổng hợp EPS và cho hàm lượng EPS lớn, với mỗi chủng L farciminis khác nhau thì khả năng sinh EPS sẽ khac nhau Trong đó chủng L farciminis TC30 cho ta hàm lượng

EPS cao nhất lên đến 151,911a µg/ml, tiếp đến là chủng L farciminis TC28 với

hàm lượng EPS là 113,000b µg/ml, và thấp nhất là chủng L farciminis TC25 với

hàm lượng EPS chỉ đạt được là 85,458c µg/ml

Sau khi ly tâm cồn lần 2 ta xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp

phenol – sunfuric của các chủng L farciminis TC25, TC28, TC30 kết quả so

màu cho thấy hàm lượng EPS càng cao thì màu sắc thể hiện càng đậm, hàmlượng EPS càng thấp thì màu sắc thể hiện càng nhạt như ở hình 4.2