NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Các chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm bột lá TNHC: - Hai chỉ tiêu cần thiết của một tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là chỉ tiêu định tính bằng phương pháp dấu vân tay và ch

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID

CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc

Mã số: 62.73.15.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014

Công trình được hoàn thành tại:

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường

họp tại:

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Vào …… giờ …… ngày …… tháng …… năm ……

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM

- Thư viện Đại học Y Dược TPHCM

ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

1 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ

(2013), Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá TNHC (Crinum latifolium L Amaryllidaceae), Tạp chí Dược học, số 441, tr 38-41

2 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Lê Minh Thắng, Kiều Lê Thanh Thảo, Võ Thị Bạch

Huệ (2013), Định lượng đồng thời 6 alcaloid (crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin, 6-hydroxyundulatin) từ cao chiết lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí dược học, số 442, tr 52-56

3 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Trịnh Thị Thanh Nhã, Phan Thanh Dũng, Võ Thị

Bạch Huệ (2013), Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong

lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản, Tạp chí dược học, số 443, tr 53-58

4 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011),

“Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin layer chromatography and column chromatography”, Conference

proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216

5 Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi

Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE inhibitor activity of Crinum latifolium L leaves extracts”, Conference proceeding, The

2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254

6 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011),

“Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 607-611

7 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Ngoc Yen (2011),

“Isolation and identification of alkaloidal composition from the roots of Crinum latifolium L Amaryllidaceae by silica gel coated buffer on chromatographic column technique”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603

8 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011),

“Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference

on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606

4 Quy trình định tính - định lượng alcaloid hoặc flavonoid:

- Luận án đã xây dựng 4 quy trình định lượng alcaloid hoặc flavonoid

trong lá TNHC Trong đó:

- 2 quy trình phân tích đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC/ CE

- 2 quy trình phân tích đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC/ CE

- Phương pháp DVT–SKLM và DVT–HPLC: có thể sử dụng đề phân

biệt chống nhầm lẫn dược liệu khi nguồn cung CĐC chưa ổn định

5 Các chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm bột lá TNHC:

- Hai chỉ tiêu cần thiết của một tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là

chỉ tiêu định tính bằng phương pháp dấu vân tay và chỉ tiêu định lượng

bằng phương pháp HPLC với các CĐC đánh dấu đặc trưng cho TNHC

KIẾN NGHỊ Các kết quả nghiên cứu đạt được là cơ sở khoa học để thực hiện các

nội dung nghiên cứu sâu hơn cho dược liệu TNHC:

1 Từ kết quả các chất đối chiếu đã được thiết lập, các quy trình

phân tích đã được thẩm định và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm đã

được báo cáo trong nội dung của luận án là những cơ sở khoa học

để tiến hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu TNHC” cho Dược

điển Việt Nam trong lần xuất bản sắp tới

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả chiết xuất bằng

phương pháp SFE trên mẫu bột lá TNHC Từ đó tiến hành các thử

nghiệm tối ưu hóa các điều kiện chiết để cho hiệu quả chiết xuất

cao nhất

3 Khảo sát tác dụng sinh học in vitro và in vivo các hợp chất tinh

khiết đã được phân lập để khẳng định thêm công dụng của TNHC

ngoài các công dụng kháng khối u, tăng cường miễn dịch v.v…

đã được công bố trước đây

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

- Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) là

dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng, hoặc dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến tiền liệt

- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được nhiều tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố Tuy nhiên các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn DĐVN IV hiện vẫn chưa có chuyên luận cho cây TNHC Do đó, công tác đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có TNHC vẫn chưa được thực hiện một cách chặt chẽ Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của dược liệu này vẫn chưa được công bố một cách toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất đánh dấu và hoàn toàn chưa có bất kỳ chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia Với mong muốn giải quyết các bất cập hiện tại trong công tác “Đảm bảo chất lượng” cho nguyên liệu TNHC, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh

Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với các nội

dung nghiên cứu như sau:

1 Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid

và phân lập hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung

2 Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh

nữ hoàng cung

3 Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp HPLC và CE

4 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu bột lá Trinh nữ hoàng cung

2 Tính cấp thiết của đề tài: cho đến nay chưa có công trình khoa học

nào xác định toàn diện thành phần hóa học cũng như chưa có tài liệu

xác định các chất đánh dấu và chưa có quy trình định lượng đồng thời

một số chất đánh dấu trong thành phần TNHC Hệ thống kiểm nghiệm

quốc gia chưa cung cấp bất kỳ CĐC nào có nguồn gốc từ TNHC

Tuy nhiên, thực tế thì cây TNHC đang được sử dụng rất phổ biến Vì

vậy các kết quả nghiên cứu của luận án có thể giải quyết được bất cập

trong công tác quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu cũng như

các sản phẩm có thành phần TNHC

3 Những đóng góp mới của luận án:

Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình

nghiên cứu cho cây TNHC như sau:

1 Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC

2 Phân lập đươc 17 hoạt chất từ các bộ phận của TNHC

Trong đó có một alcaloid mới, cấu trúc là 6-ethoxyundulatin Các hợp

chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được phân

lập lần đầu tiên từ cây TNHC

3 Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin,

hippadin, astragalin và isoquercitrin Hiện tại, các CĐC này đều chưa

được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia

4 Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích

alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE Các quy trình này đều chưa

được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới

5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn

kiểm nghiệm TNHC Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều

chưa có chuyên luận này

4 Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1: TQTL

(24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương 4 BL (16);

kết luận (2); kiến nghị (1) Và danh mục công trình (1); TLTK (12)

Đây là ưu điểm của tiêu chuẩn kiểm nghiệm vì HPLC là phương pháp

có độ chính xác cao, được khuyến khích ứng dụng vào kiểm nghiệm các mẫu đa thành phần như mẫu sinh học hay mẫu từ dược liệu Phương pháp dấu vân tay với các chi tiết đặc trưng cho thành phần hoạt chất của TNHC sẽ góp phần đánh giá chặt chẽ hơn chất lượng của dược liệu này

KẾT LUẬN Luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu, tóm tắt các kết quả đạt được như sau:

1 Chiết xuất hoạt chất từ TNHC: xây dựng được 2 quy trình chiết xuất cao toàn phần từ TNHC

- Quy trình 1 là quy trình chiết cao cồn, PĐ alcaloid hoặc flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70%

- Quy trình 2 có sự kết hợp 2 phương pháp SFE và ngấm kiệt

để chiết cao ban đầu với mục đích phân lập CĐC hoặc khảo sát thành

phần hóa học

2 Phân lập hợp chất tinh khiết: 17 hợp chất đã được phân lập

- Trong số này có: 1 alcaloid 6-ethoxyundulatin là hợp chất mới Và

có 7 chất lần đầu tiên được phân lập từ TNHC: 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin, flazin, kaempferol, isoquercitrin, esuletin, p-hydroxybenzoic

Các hợp chất còn lại đã được công bố trước đây trong các bộ phận khác nhau của TNHC

3 Thiết lập chất đối chiếu:

- 6 hợp chất có nguồn gốc từ cây TNHC đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR

- Gồm 4 alcaloid: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin

và 2 flavonoid: astragalin và isoquercitrin

tiến hành đánh giá về quy trình chiết xuất, phân lập để thiết lập CĐC

Các bước thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình

thiết lập CĐC hóa học

- Bên cạnh đó, lycorin và hippadin cũng được thiết lập CĐC do 2 hợp

chất này có độ tinh khiết cao và hiệu suất phân lập lớn Lycorin là

alcaloid có nhiều hoạt tính sinh học và là chất đại diện cho nhiều loài

trong chi Crinum

Hiện tại hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp các CĐC này

trên thị trường Kết quả này có thể đóng góp thêm vào danh mục các

CĐC có nguồn gốc từ dược liệu vốn đang khan hiếm

4.4 Các quy trình định tính – định lượng alcaloid hoặc flavonoid:

Alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC có thể được định tính – định

lượng bằng HPLC hoặc CE đều cho kết quả không sai biệt

- Với quy trình định lượng alcaloid bằng HPLC: nên chú ý pH pha

động ảnh hưởng lớn đến AF và Rs của các pic định lượng Với mẫu

flavonoid cần chú ý đến ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bất

đối AF của 2 pic cần định lượng, acetonitril hiệu quả hơn methanol

- Với quy trình định lượng alcaloid CE: cần chú ý mẫu thử alcaloid

nên được pha trong acid, kỹ thuật rửa giải MEKC ảnh hưởng nhiều

đến kết quả phân tích Trong khi đó mẫu flavonoid chỉ cần kỹ thuật

CZE là đáp ứng các yêu cầu phân tích

- Phương pháp dấu vân tay: có thể ứng dụng để tiêu chuẩn hóa dược

liệu và sản phẩm từ dược liệu khi nguồn cung cấp CĐC chưa đầy đủ

4.5 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC

- Chỉ tiêu định tính hai nhóm hoạt chất chính alcaloid hoặc flavonoid

bằng phương pháp dấu vân tay được

- Chỉ tiêu định lượng hai nhóm hoạt chất chính alcaloid hoặc flavonoid

bằng hương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm định đạt các yêu

cầu của một quy trình phân tích định lượng

NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Thực vật học cây TNHC:

Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi

lơi lá rộng, Náng lá rộng

Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía trên có

thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành Phiến lá dạng bản, màu xanh nhạt, mép lượn sóng Cụm hoa tán, có 10-20 hoa Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng Nhị 6 rời nhau; màu trắng, bao phấn màu vàng 2 ô Bầu hạ, 3 ô Vòi nhụy dạng sợi

- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học:

Có các nhóm hoạt chất chính là alcaloid (36) và flavonoid (8); ngoài

ra còn có nhóm coumarin, carbohydrat

Các tác dụng chính là kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch

- Các phương pháp chiết hoạt chất và khảo sát hóa học Hoạt chất được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt, hoặc ngâm; hoặc đun hồi lưu

Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng kỹ thuật sắc ký cột hoặc sắc ký lớp mỏng chế hóa

Thành phần alcaloid trong TNHC được xác định bằng phương pháp

GC, UV, HPLC

- Phương pháp thiết lập chất đối chiếu:

Theo hướng dẫn của ASEAN

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu là các alcaloid và flavonoid trong cây TNHC

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Các phương pháp chiết xuất:

- Chiết ngấm kiệt, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các

điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu

- Chiết bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát các yếu tố áp

suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ

2.2.2 Phương pháp phân lập chất tinh khiết:

- Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển

- Biện giải cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR

2.2.3 Phương pháp HPLC, CE và dấu vân tay:

Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng

alcaloid và flavonoid trong cây TNHC Quy trình phải đạt các yêu cầu

về thẩm định

- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid

từ lá TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu

- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha

động, kỹ thuật rửa giải

- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ

đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS

- Phương pháp dấu vân tay:

- SKLM: khảo sát các điều kiện phân tích về dung môi và

thuốc thử phát hiện để xác định các đặc trưng cơ bản của DVT– SKLM

của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của TNHC qua hệ

số Rf và màu sắc của các vết đặc trưng

- HPLC: ứng dụng các điều kiện của phương pháp HPLC vào

phân tích vân tay cho dược liệu TNHC Ghi nhận thời gian lưu, phổ

điều chỉnh, lượng mẫu nhỏ, hiệu suất chiết cao hơn các phương pháp khác; thời gian, các bước tiến hành và thiết bị phổ biến trong các PTN

- Chiết cao nguyên liệu từ lá để làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng:

nguyên liệu lá được lựa chọn vì năng suất thu hoạch lớn hơn thân hành hay rễ đồng thời bảo tồn được nguồn giống, phương pháp chiết ngấm kiệt thông dụng ở qui mô công nghiệp, trang thiết bị và cách vận hành đơn giản và có thể thiết kế phù hợp để chiết trên nhiều cỡ mẫu

4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết:

- Luận án sử dụng kỹ thuật chính trong phân lập các hợp chất tinh khiết

là sắc ký cột Alcaloid của TNHC tập trung nhiều trong nhóm alcaloid khung crinin, cấu trúc và độ phân cực tương tự nhau Vì vậy, dung môi rửa giải phải được điều chỉnh tăng độ phân cực chậm để tránh dồn vết

- Chất hấp phụ silica gel được tẩm đệm pH thay đổi tùy tính chất của mẫu; trên cơ sở phương trình Henderson – Hasselbalch với mục tiêu giảm thiểu tối đa sự kéo đuôi của các vết Kết quả khảo sát cho thấy, alcaloid của TNHC thích hợp với silica gel tẩm đệm pH 9; flavonoid của TNHC phù hợp với silica gel tẩm đệm pH 4

- Đối với các mẫu có nhiều tạp chất, cần phải kết hợp nhiều kỹ thuật đồng thời như chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột silica gel pha đảo, sắc ký cột với silica gel pha thuận như trường hợp của ethoxyundulatin và 6-ethoxybuphanidirin

Luận án đã xây dựng được bộ dữ liệu phổ học cho 17 hợp chất từ cây TNHC, đặc biệt là dữ liệu phổ học của một hợp chất alcaloid mới được phân lập trong tự nhiên và 11 alcaloid thuộc khung crinin - khung

alcaloid đại diện cho các loài trong chi Crinum

4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết TNHC:

- Sau quá trình nghiên cứu, nhận thấy crinamidin, 6-hydroxycrinmidin

là 2 alcaloid; astragalin, isoquercitrin là 2 flavonoid có thể được chọn làm các chất đánh dấu cho dược liệu TNHC Vì vậy các chất này được

Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký đối

với dung dịch đối chiếu Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương

đối của thời gian lưu và diện tích pic astragalin và isoquercitrin không

được lớn 2,0%

Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Dựa

vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch

đối chiếu và nồng độ astragalin (C21H20O11) và isoquercitrin

(C21H20O12) đối chiếu, tính hàm lượng của hai flavonoid astragalin và

isoquercitrin trong dược liệu

Đánh giá: dược liệu phải chứa ít nhất 250 µg/g astragalin (C21H20O11)

và 100 µg/g isoquercitrin (C21H20O12) tính trên dược liệu khô kiệt

Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ TNHC

Hai nhóm hoạt chất chính trong cây TNHC được xác định gồm alcaloid

và flavonoid Tùy vào mục tiêu sử dụng hay nghiên cứu các thành phần

này mà lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp

- Chiết cao TNHC để khảo sát thành phần hóa học và thiết lập CĐC:

Đối với nguyên liệu lá: mục tiêu là khảo sát toàn diện thành phần hóa

học, phương pháp SFE được lựa chọn để chiết hoạt chất ở giai đoạn

đầu và dược liệu sau đó được chiết ngấm kiệt Cao chiết sẽ đa dạng

hơn về thành phần do dung môi chiết trãi rộng hơn về độ phân cực

Đối với nguyên liệu rễ hoặc thân hành: kết quả khảo sát cho thấy SFE

cho hiệu quả tương đương với chiết ngấm kiệt Vì vậy hoạt chất được

chiết bằng phương pháp chiết ngấm kiệt

- Chiết hoạt chất để phân tích định tính – định lượng: chiết với sự hỗ

trợ của sóng siêu âm được chọn lựa vì các yếu tố ảnh hưởng ít và dễ

UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng Xác định DVT– HPLC của hai nhóm hoạt chất chính của TNHC

2.2.4 Phương pháp thiết lập CĐC:

Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC hóa học thứ cấp

2.2.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu TNHC:

- Các chỉ tiêu hóa lý thông thường của dược liệu và phương pháp thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN IV

- Chỉ tiêu định tính bằng bằng phương pháp dấu vân tay được khảo sát với 6 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu

- Chỉ tiêu định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được khảo sát với 2 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Các quy trình chiết cao cồn, alcaloid và flavonoid từ TNHC

Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt:

- Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 12 giờ

Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ Rút dịch chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl3 1% Tỷ lệ dung môi/dược liệu là (10 : 1) Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc

- Chiết flavonoid: cao cồn được siêu âm với HCl 1% Lắc với ethyl

acetat đến khi âm tính với TT FeCl3 1% Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid

- Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng

amoniac 25% đến pH 9-10 Lắc với cloroform đến khi âm tính với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid

Chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp:

- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ

thống chiết bằng lưu chất CO2 do Đài loan sản xuất với ba bình chiết

lắp song song, thể tích 20 lít/bình Điều kiện SFE: áp suất 200 bar,

nhiệt độ 50 oC, thời gian chiết 2 giờ, 15% cồn 96% Dịch SFE được

thu hồi dung môi (cao L-SFE) Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1%

Dịch acid được chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE

- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau

khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70% Dịch chiết

cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK

3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC

- Các PĐ alcaloid và flavonoid được chiết từ các bộ phận của cây

TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC

- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân

lập alcaloid; silica gel pH 4 cho mẫu phân lập flavonoid

- Riêng 6-ethoxyundulatin (2) và 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua 3

giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm kém

phân cực từ PĐ AL-SFE Sử dụng 2 lần sắc ký cột, lần đầu sử dụng

chất hấp phụ silica gel RP-18 để loại tạp dầu béo, sau đó là silica gel

cỡ hạt nhỏ và rửa giải bằng n–hexan với tốc độ chậm để tránh dồn vết

Kết quả: phân lập được 17 hợp chất từ các cao TNHC Trong đó:

- 1 alcaloid mới được công bố lần đầu tiên, cấu trúc được xác

định là 6-ethoxyundulatin

- 7 hợp chất đã được công bố từ dược liệu khác, lần đầu tiên

được công bố từ TNHC: kaempferol, isoquercitrin, flazin, esuletin,

p-hydroxybenzoic, 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin

- 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin,

augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, hydroxybuphanidrin,

6-hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin

đối của thời gian lưu và diện tích crinamidin và 6-hydroxycrinamidin không được lớn 2,0%

Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và nồng độ crinamidin (C17H19NO5)và 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) đối chiếu, tính hàm lượng của hai alcaloid crinamidin và 6-hydroxycrinamidin trong dược liệu

Đánh giá: dược liệu phải chứa ít nhất 120 µg/g crinamidin

(C17H19NO5) và 100 µg/g 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) tính trên dược liệu khô kiệt

Định lượng flavonoid:

Pha động: methanol – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80) Dung dịch đối chiếu: hòa tan astragalin và isoquercitrin trong để có

dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 250 µg/ml và 100 µg/ml

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có

mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở

nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội,

acid hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch acid hydrocloric 1% (TT) đến

pH 3 – 4 Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy flavonoid bằng cách lắc

hỗn hợp trong bình lắng với 30 ml ethyl acetat (TT) (x 3 lần) Cô dịch

chiết ethyl acetat đến cạn dung môi, thu được cắn flavonoid Hòa tan phần cắn này trong bình định mức 10 ml với dung môi là pha động, thêm dung môi đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Điều kiện sắc ký:Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được

nhồi pha tĩnh C8 (5 µm)

Detector: PDA, bước sóng 265 nm

Rửa giải isocratic

Tốc độ dòng: 1ml/phút

Thể tích tiêm: 10 µl

B Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến

hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6

Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và

flavonoid

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định lượng alcaloid:

Pha động: Dung môi A: methanol

Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2% TEA

Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin trong

pha động để có dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 150 µg/ml

và 100 µg/ml

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có

mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở

nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội,

kiềm hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch amoniac 25% (TT) đến pH 9

– 10 Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy alcaloid bằng cách lắc hỗn

hợp trong bình lắng với 30 ml cloroform (TT) (x 3 lần) Cô dịch chiết

cloroform đến cạn dung môi, thu được cắn alcaloid Hòa tan phần cắn

này trong bình định mức 10 ml với dung hỗn hợp dung môi A và B (25

: 75), thêm dung môi đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được

nhồi pha tĩnh C8 (5 µm)

Detector: PDA, bước sóng 214 nm

Rửa giải gradient

Tốc độ dòng: 1ml/phút

Thể tích tiêm: 10 µl

Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký đối

với dung dịch đối chiếu Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương

3.3 Thiết lập chất đối chiếu

- Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC

- 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; 2 flavonoid là astragalin và isoquercitrin

3.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC

- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết bằng HPLC:

Điều kiện phân tích: cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m); nhiệt

độ cột: 40 oC; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút

- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động

- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.13 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC

Tên chất khảo sát Thành phần và tỷ lệ pha động Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65) 6-hydroxycrinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65) Lycorin Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 : 90) Hippadin Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 : 30) Astragalin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75) Isoquercitrin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)

Xác định tính phù hợp hệ thống: các hệ số sắc ký đều đạt yêu cầu, quy

trình đạt tính phù hợp hệ thống

Thẩm định quy trình:

- Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thử

- Tính tuyến tính: tiêm 6 nồng độ của mỗi chất từ 10 500 (µg/ml)

Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:

Crinamidin: ŷ = 70299x R2 = 0,9994

6-hydroxycrinamidin: ŷ = 149967x R2 = 0,9996

Hippadin: ŷ = 58426x R2 = 0,9990

Astragalin: ŷ = 21716x R2 = 0,9969

Isoquercitrin: ŷ = 17244x R2 = 0,9991

Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic

của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998)

- Độ chính xác:

Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2 RSD% độ tinh khiết sắc

ký của các pic chính < 2%

Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các CĐC đạt yêu

cầu về độ chính xác

Bảng 3.15 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC

Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%)

Crinamidin 98,71% (RSD% = 0,02)

6-hydroxycrinamidin 96,78 % (RSD% = 0,08)

Lycorin 99,99% (RSD% = 0,03)

Hippadin 99,92% (RSD% = 0,02)

Astragalin 98,29% (RSD% = 0,11)

Isoquercitrin 98,12% (RSD% = 0,03)

- Độ đúng: chưa thực hiện được vì hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc

gia chưa phân phối các chất đối chiếu gốc này

3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu

- Tính chất: các alcaloid là bột kết tinh màu trắng, các flavonoid là bột

kết tinh màu vàng

- DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có ít nhất 6 pic đặc trưng như sau:

Pic Thời gian lưu (phút) diện

tích (%) Phổ UV-Vis

1 9,0 ± 0,5 (6-hydroxycrinamidin) 21,9

Các pic alcaloid đều có phổ UV tương tự:

λmax = 214 nm vai ở 281 nm

2 10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin) 17,8

3 13,5 ± 0,5 (crinamidin) 13,7

4 18,0 ± 0,5 (6-hydroxybuphanidrin) 20,8

5 20,5 ± 0,5 (6-hydroxyundulatin) 18,3

6 23,5 ± 0,5 (undulatin) 7,6 3.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho bột lá TNHC

Một số chỉ tiêu và phương pháp thử để đánh giá chất lượng bột lá TNHC như sau:

Một số chỉ tiêu của TCKN lá TNHC

Lá đã phơi hoặc sấy khô của cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Mô tả: lá khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc biệt,

dài 50 - 90 cm, rộng khoảng 2 - 5 cm Vị đắng

Bột: mùi hăng, vị đắng Mảnh biểu bì mang lỗ khí có tinh thể calci

oxalat hình kim, tế bào hình đa giác thuôn dài Mảnh mạch xoắn Hạt tinh bột riêng lẻ, dạng hình bầu dục, tễ có hình sao Cuộn sợi nhiều, sợi vách dày, khoang hẹp

Độ ẩm: không quá 12% (DĐVN IV - Phụ lục 9.6)

Tro không tan trong acid HCl: ≤ 2% (DĐVN IV - Phụ lục 9.7) Tro toàn phần: không quá 15% (DĐVN IV - Phụ lục 9.8)

Định tính: định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid và flavonoid Có thể thực hiện theo một trong hai phương pháp sau:

A Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: các bước tiến hành và

phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6