CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MẦU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y SINH

Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trần Hồng Nhung

2 PGS.TS Tống Kim Thuần

Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Hội, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện 2: PGS.TS Lê Anh Tuấn, Viện Tiên tiến Khoa học và Công

nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phản biện 3: PGS.TS Mai Anh Tuấn, Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học

Vật liệu, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại:

Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 10, Đào Tấn, Ba Đình, Hà Nội

vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2015

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

MỞ ĐẦU

chứa được một số lượng lớn phân tử màu hữu cơ trong một hạt silica đơn Nền silica lại ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương thích sinh học cao Sử dụng các phương pháp và quy trình thích hợp, một số lượng lớn chất màu có thể đưa vào trong một hạt nano silica đơn (từ hàng chục tới hàng nghìn phân tử màu) Do đó, các hạt nano silica chứa chất màu có độ chói và khuếch đại tín hiệu quang cao gấp nhiều lần so với phân tử màu đơn

lẻ Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang Nếu lựa chọn các ứng dụng phân tích sinh học thích hợp, các hạt nano silica có thể tạo ra những cải thiện đáng kể trong độ nhạy phân tích Hơn nữa, do bị cầm giữ trong nền silica, các chất màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường Mặt khác, do nền silica chứa rất ít oxy tự do nên phân hủy quang cũng được giảm thiểu Độ bền quang cao cho phép các hạt nano silica được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài Hơn nữa, các hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các

Bằng cách điều chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt; số lượng tâm màu trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó người ta có thể tạo ra một nhóm lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu Bản thân silica là chất thân thiện với môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt đa chức năng: vừa phát hiện và vừa mang thuốc trị bệnh Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân

tích và đánh dấu sinh học Do vậy, đề tài của luận án đã được chọn là: Chế

tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y - sinh

Mục tiêu nội dung nghiên cứu của luận án: (i) Chế tạo và nghiên

cứu các tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ định hướng ứng dụng làm chất đánh dấu sinh học (ii) Ứng dụng các hạt nano

silica chế tạo được làm chất đánh dấu để phát hiện vi khuẩn E coli

O157:H7 và tế bào ung thư vú bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

N ội dung nghiên cứu chính của luận án: Luận án được tiến hành

bằng phương pháp thực nghiệm với các nội dung sau: (i) Nghiên cứu chế tạo hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ với các nhóm chức năng trên bề mặt hạt bằng phương pháp sol-gel (ii) Khảo sát cấu trúc hóa học trên cơ sở

đặc trưng quang học của vật liệu nhằm nghiên cứu, đánh giá các ưu điểm của vật liệu chế tạo được các các phân tử màu tự do (iii) Ứng dụng các hạt nano trong y - sinh học: Đánh dấu vi khuẩn E coli O157:H7, tế bào ung thư

tế bào vi khuẩn E coli O157:H7 và tế bào ung thư vú KPL4

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: Luận án là một công

trình nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng Đối tượng nghiên cứu của luận án là loại vật liệu nano quang ứng dụng trong phân tích y -sinh Các kết quả của luận án hứa hẹn bổ sung nhiều thông tin lý thú trong nghiên cứu

dụng hạt nano trong việc xác định định lượng vi khuẩn và tế bào ung thư

mà luận án đã đưa ra là kết quả đầu tiên ở nước ta Các kết quả này làm tiền

đề cho các nghiên cứu về phát hiện và điều trị ung thư

Bố cục luận án: Luận án gồm 147 trang, các kết quả chính của luận

án đã được công bố trong 5 công trình khoa học trên các tạp chí chuyên

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN

1.1 Chất màu hữu cơ

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Các chất màu hữu cơ (các chất hữu cơ phát huỳnh quang) từ lâu đã được

sử dụng trong các thí nghiệm hóa sinh và lý sinh, trong các nghiên cứu sinh học

và y học bằng các phương pháp huỳnh quang do độ nhạy của bản thân các kỹ thuật huỳnh quang Các chất màu dùng trong đánh dấu sinh học là các chất

vùng tử ngoại đến gần hồng ngoại gần Cấu trúc hóa học của chúng được đặc trưng bởi tổ hợp các vòng benzen, vòng pyridin, vòng azine, vòng pyron,… nằm trong cùng một mặt phẳng

1.1.2 Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học

Các phân tử chất màu có rất nhiều trạng thái là các tổ hợp phức tạp các trạng thái điện tử, trạng thái dao động và trạng thái quay Do vậy không thể xác định chính xác các mức năng lượng của phân tử chất màu Dựa vào

mẫu điện tử của Bohr, Jablonski đã đưa ra giản đồ các mức năng lượng đơn giản hóa phản ánh những đặc điểm quan trọng chủ yếu của các chuyển dời

tương ứng với số lượng tử spin toàn phần S = 0 và S = 1 Ở trạng thái singlet, hai điện tử ở cùng một mức năng lượng sẽ có spin đối song Ngược lại khi một điện tử nằm ở trạng thái triplet, spin của nó song song với spin còn lại

1.2 Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ

1.2.1 Các hạt nano silica và latex

Hạt nano silica và latex (hạt nano polymer) là các hạt nano chứa tâm màu (i) Chất màu có thể được gắn trên bề mặt hoặc đưa vào bên trong hạt nano (ii) So với các chất màu hữu cơ thì các hạt nano này có độ bền quang cao hơn (iii) Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của của các hạt nano silica

và latex có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang Vì vậy, hạt nano silica và latex có độ bền quang tương đối tốt và không nhấp nháy

1.2.2 Các hạt nano silica/ormosil

Các hạt nano silica bên cạnh có các ưu điểm như đã nêu ở trên, còn tồn tại một số nhược điểm đó là : (i) có nhiều lỗ xốp nên tính đồng nhất quang học không cao, (ii) phân tử màu dễ bị thoát ra ngoài Để khắc phục nhược điểm này, người ta dùng nền ormosil (organically modified silicate) là nền thủy tinh sol-gel có chứa thành phần hữu cơ liên kết với nguyên tử Si bằng liên kết bền vững – liên kết cộng hóa trị Nền loại này được điều chế bằng phương pháp sol-gel từ các alkoxysilic có chứa một nhóm hữu cơ liên kết với

Si bằng liên kết bền (Si-C) không bị phân li trong quá trình thủy phân

Các hạt nano silica sử dụng trong các ứng dụng y - sinh học thường được

tạo các nhóm chức năng amine, carboxyl hay thiol bằng cách sử dụng các

năng tương hợp sinh học

1.2.3 Các phương pháp chế tạo

Các hạt nano silica chứa màu hữu cơ thường được tạo ra theo ba phương

1.2.4 Các đặc trưng hóa lý

1.2.4.1 Vật liệu nền

Nền hạt nano silica có hai vai trò: thứ nhất là phân tán tâm màu trong các

lỗ xốp, thứ hai là bảo vệ tâm màu khỏi sự xâm nhập của môi trường bên ngoài

và khỏi sự phân hủy quang khi có ánh sáng kích thích do nền này có nồng độ oxy tự do thấp hơn 3 bậc so với dung môi Vì vậy, chất lượng nền là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng hạt nano silica trong vai trò là chất đánh dấu huỳnh quang

1.2.4.2 Độ chói và độ bền quang

lớn các phân tử màu bên trong nền silica, vì vậy cường độ huỳnh quang của một hạt nano silica nói chung có thể lớn gấp tới hàng nghìn lần cường độ huỳnh quang của một phân tử màu cùng chất trong dung môi Có thể điều khiển độ chói bằng việc thay đổi số phân tử chất màu trong mỗi hạt nano silica, với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang (ii) Độ bền quang là một chỉ số đặc biệt quan trọng đối với việc sử dụng các hạt nano vào ứng dụng trong sinh học Các phép đo và quan sát trong sinh

của tế bào Nền silica có vai trò như một lớp vỏ bảo vệ chất màu khỏi tác dụng trực tiếp của ánh sáng kích thích, do đó các tâm màu chứa trong các hạt silica

có độ bền quang lớn hơn nhiều so với những chất màu truyền thống tương ứng

trong cùng một điều kiện

Điều này làm cho các hạt nano silica chứa tâm màu rất phù hợp cho các ứng dụng mà yêu cầu phép phân tích với độ nhạy cao và được kích thích với cường độ cao hoặc kéo dài

1.2.5 Các hạt nano silica hợp sinh

Để các hạt nano nói chung và hạt nano silica có thể ứng dụng trong sinh học thì chúng phải thỏa mãn một số yêu cầu cơ bản sau: (i) phân tán được trong nước; (ii) có các nhóm chức năng và hóa học bề mặt thích hợp; (iii) có lớp bảo vệ; (iv) không làm ảnh hưởng tới chức năng nhận biết của phân tử sinh học và không làm ảnh hưởng tới khả năng gắn kết với phân tử thụ cảm; (v) không làm ảnh hưởng tới hình thái và cấu trúc phân tử sinh học nên kích thước của các hạt nano phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn nào đó

Các hạt nano silica được gắn kết với các phân tử sinh học theo hai cách chính: trực tiếp và không trực tiếp

Gắn kết trực tiếp: các phân tử sinh học hút bám lên bề mặt hạt nano qua

liên kết không cộng hóa trị, cách gắn kết này là không đặc hiệu

Gắn kết không trực tiếp: sử dụng một chất khác (protein, kháng thể,

peptide…) để làm cầu nối nối phân tử sinh học và hạt nano Chất này gồm hai đầu tích cực: một đầu gắn với hạt nano và một đầu gắn với phân tử sinh học

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Phương pháp sol-gel được sử dụng để chế tạo các mẫu hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ (RB và FITC) Các hạt được chức năng hóa bề mặt với các nhóm chức tương thích sinh học như: amine, carboxyl hay thiol bằng cách

trong phản ứng đồng trùng hợp với TEOS hoặc MTEOS Bên cạnh đó, các hạt nano silica cũng được chức năng hóa bằng cách bọc lên hạt một lớp vỏ polyethylene glycol (PEG), protein như bovine serum albumin (BSA) hay

tương thích sinh học Cấu trúc hóa học được khảo sát thông qua phép đo phổ hấp thụ hồng ngoại Hình thái, kích thước của hạt được khảo sát qua ảnh SEM, TEM, phép đo DLS và FCS Các tính chất quang của vật liệu được nghiên cứu thông qua phổ hấp thụ (UV-Vis), phổ huỳnh quang, phép đo thời gian sống phát quang Các phương pháp ứng dụng trong y – sinh học được khảo sát thông qua các thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy và kính hiển vi quang học

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ 3.1 Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề mặt theo phương pháp micelle thuận

Các hạt nano silica chế tạo theo phương pháp micelle thuận được chức

trùng hợp với MTEOS, đồng thời hạt cũng được bọc lớp vỏ PEG và protein BSA, SA để vừa tạo các nhóm chức năng, vừa bảo vệ hạt trong môi trường sinh học

3.1.1 Hình dạng, kích thước hạt: Các hạt nano silica chế tạo được có dạng

tựa cầu, kích thước từ 20 – 110 nm

3.1.2 Cấu trúc hóa học: Cấu trúc hóa học của hạt được xác định bởi các

các nhóm vạch đặc trưng cho dao động của các nhóm chức trên bề mặt hạt

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

4 5 3

Từ phổ hấp thụ và huỳnh quang, các thông số và các đặc trưng quang học của tâm màu RB trong các hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau được tính toán : Hiệu suất lượng tử, thời gian sống phát quang, tốc độ

3.1.2.2 Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang

Hiệu suất lượng tử (HSLT) Q và thời gian sống phát quang (TGSPQ) τ của dãy mẫu này đều tăng so với phân tử RB tự do trong nước Các số liệu cũng cho thấy HSLT tăng chủ yếu do tốc độ HPBX Γr tăng và TGSPQ τ tăng chủ yếu do tốc độ HPKBX Γnr giảm (Hình 3.10) Các kết quả này phù hợp với quy luật của phân tử màu trong các môi trường lỏng, chứng tỏ các nhóm chức không ảnh hưởng mạnh tới tính chất quang của các phân tử màu trong hạt

Hình 3.10 Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr /Γnr

3.2 Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương pháp micelle thuận

Phổ hấp thụ và huỳnh quang của các mẫu hạt nano silica chứa chất màu RB có dạng giống với phổ hấp thụ và huỳnh quang của chất màu RB

tự do trong nước nhưng đỉnh phổ hấp thụ dịch từ 1 nm đến 6 nm và đỉnh phổ huỳnh quang dịch từ 4 nm đến 10 nm về phía sóng dài Sự dịch đỉnh này chứng tỏ sự tương tác của chất màu RB với nền silica là yếu, không ảnh hưởng nhiều đến tính chất quang của chất màu RB trong hạt nano

Từ các thông số của mẫu như phổ hấp thụ, huỳnh quang, số phân tử màu trong một hạt nano, độ chói đã được khảo sát Các kết quả cho thấy: (i) Với cùng một độ hấp thụ, nghĩa là số phân tử tâm màu được kích thích là như nhau trong tất cả các mẫu được khảo sát thì cường độ huỳnh quang của các mẫu hạt nano đều cao hơn cường độ huỳnh quang của phân tử RB tự do trong nước Có nghĩa là hiệu suất phát quang của các phân tử màu trong hạt nano cao hơn hiệu suất phát quang của các phân tử màu RB tự do trong nước Hiện tượng tăng cường cường độ huỳnh quang này được giải thích là

do trong nền silica, các phân tử màu được phân bố trong các lỗ xốp do đó giảm thiểu được hiện tượng dập tắt huỳnh quang do va chạm và phân hủy quang do tương tác với oxy Cần nói thêm là độ hấp thụ và cường độ huỳnh

Γr /Γ nr

quang được đo ở nồng độ 5.10-5 mol/l đối với phân tử RB tự do trong nước,

chất màu RB tự do trong dung môi thì hiện tượng dập tắt huỳnh quang do

tốc độ hồi phục bức xạ (HPBX) Γr và không bức xạ (HPKBX) Γnr đã được tính toán cho các mẫu Các kết quả cũng cho thấy HSLT và TGSPQ của phân tử RB trong các hạt nano đều cao hơn của RB trong nước HSLT tăng

do sự tăng của thời gian sống τ và tốc độ HPBX Γr

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Hình 3.13 và 3.14 Phổ hấp thụ và huỳnh quang chuẩn hóa của mẫu hạt nano silica với các kích thước khác nhau

Hình 3.16 Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr /Γnr

Có thể kể ra các nguyên nhân gây ra HPKBX của các phân tử RB:

Γr /Γ nr

- Do va chạm giữa các phân tử màu Kênh này được giảm thiểu khi phân tử màu được nằm trong lỗ xốp của nền silica

quanh là nước thì huỳnh quang sẽ bị mất do phân tử màu tương tác với oxy

tự do trong nước trên trạng thái triplet Nền silica chứa rất ít oxy tự do, ít hơn 3 bậc so với trong nước, do đó hồi phục không bức xạ qua kênh này sẽ giảm hẳn khi đưa phân tử màu vào nền silica Mặt khác, trên bề mặt các lỗ xốp có các nhóm -OH, nếu phân tử RB tương tác mạnh với nền silica thì hồi phục không bức xạ cũng có thể tăng do phản ứng với nhóm -OH Phân tích trên cho thấy, tính chất quang (HSLT và TGSPQ) của các mẫu càng cao nếu tương tác giữa chất màu RB và nền là yếu, và ngược lại

3.3 Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) và streptavidin (SA)

Để bảo vệ hạt cũng như tạo các nhóm chức năng tương thích sinh học, hạt nano silica chứa tâm màu đã được bọc protein BSA và SA, các kết quả khảo sát tính chất quang cho thấy, lớp bọc protein không ảnh hưởng đến tính chất quang của tâm màu trong hạt Đồng thời luận án cũng đã trình bày kết quả khảo sát lượng BSA và SA đủ để bọc lên hạt

BSA đủ để bọc lên hạt là 1,0–1,2 mg/ml Lượng BSA > 1,2 mg/ml sẽ gây ra

sự dư thừa BSA ảnh hưởng tới độ đồng nhất quang học của dung dịch Số liệu BSA này chỉ đúng với một loại hạt với kích thước và nồng độ cụ thể

3.4 Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo

3.4.1 Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với APTES

Kết quả đo phổ hấp thụ của dung dịch FITC@APTES với lượng