Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp sers

Để ngăn ngừa sự kết đám và sự oxi hóa cũng như làm tăng khả năng tương thích sinh học của chúng, hạt nano từ Fe3O4 cần được chức năng hóa bề mặt bởi những lớp vỏ là các chất có hoạt tính

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HOÀNG NAM

TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Thầy giáo TS Nguyễn Hoàng Nam và Thầy giáo TS Nguyễn Đình Thắng Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, các thầy luôn tận tình chỉ bảo và giúp em định hướng

để hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn NCS Lưu Mạnh Quỳnh, NCS Chu Tiến Dũng đã trực tiếp hướng dẫn cũng như đưa ra những lời khuyên thực sự hữu ích cho luận văn Kết quả của luận văn là một trong những thành quả của quá trình lao động trí tuệ

tích cực của nhóm nghiên cứu “Nghiên cứu chế tạo, chức năng hóa, tính chất của

hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng trong y sinh học” trong định hướng “Nghiên

cứu ứng dụng vật liệu nano trong y sinh” do TS Nguyễn Hoàng Nam chủ trì và được

tài trợ bởi đề tài “Nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng

trong y sinh” mã số CA.14.11A

Tôi xin cảm ơn sinh viên Bạch Thị Mai - K58 KHVL, Khoa Vật lý đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và chế tạo vật liệu Tôi cũng xin cám ơn học viên cao học K24 Nguyễn Thị Thơ tại Khoa Sinh học đã hỗ trợ luận văn trong quá trình nuôi cấy và định lượng tế bào

Tôi xin được cảm ơn các anh chị và các bạn sinh viên tại Trung tâm Khoa học Vật liệu và Khoa Sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu của mình

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, tập thể cán bộ của Trung tâm Khoa học Vật liệu – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian em làm thí nghiệm tại trường!

Em cũng xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật

lý cũng như lãnh đạo Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị để em hoàn thành luận văn này

Bản luận văn này được thực hiện tại Trung tâm Khoa học Vật liệu – Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội Luận văn sử dụng một số phép đo thực hiện trên các hệ LABRAM3 hãng HORIBA Jobin Yvon,

NanoSEM NOVA NPE 119, kính hiển vi huỳnh quang – trường tối AXIO Scope

A1, Zeiss được đầu tư theo chương trình “Tăng cường năng lực nghiên cứu, đào

tạo lĩnh vực khoa học, công nghệ nano và ứng dụng trong y, dược, thực phẩm, sinh học, bảo vệ môi trường và thích ứng biến đổi khí hậu theo hướng pháp triển bền vững”

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Hà nội, năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về hạt nano Fe 3 O 4 và hạt nano kim loại Ag 5

1.1.1 Vật liệu sắt từ 5

1.1.2 Tính chất siêu thuận từ 5

1.1.3 Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4 7

1.1.4 Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4 7

1.1.5 Hạt nano Bạc và tính chất 8

1.1.6 Cộng hưởng Plasmon bề mặt [14] 8

1.1.7 Tán xạ Raman [10] 9

1.1.8 Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag 13

1.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào 14

1.2.1 Bệnh ung thư 14

1.2.2 Các phương pháp phát hiện bệnh ung thư 14

1.2.3 Các thụ thể tế bào (ErbB receptors) 15

1.2.4 EGFR- Epidermal growth factor receptor [49] 17

1.2.5 Kháng thể 18

1.2.6 Kháng thể anti-EGFR và cơ chế gắn kết kháng thể anti-EGFR với hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 19

1.2.7 Tế bào HaCaT và SK-Mel 28 20

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 23

2.1 Chế tạo hạt nano chức năng Fe 3 O 4 /Ag……… ……23

2.1.1 Hóa chất sử dụng 23

2.1.2 Chức năng hóa hạt nano Fe3O4 với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) tạo nhóm amine NH2 tự do Fe3O4-NH2 23

2.1.3 Chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag 24

2.1.4 Chức năng hóa bề mặt hạt nano composite Fe3O4/Ag bằng 4-aminothiophenol (4-ATP) - Fe3O4/Ag-NH2 25

2.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe 3 O 4 /Ag trong đánh dấu tế

bào………26

2.2.1 Hóa chất sử dụng 26

2.2.2 Gắn hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 với kháng thể anti-EGFR… ……… 26

2.2.3 Gắn hạt nano đa chức năng với hai dòng tế bào HaCaT và SK-Mel 28 27

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1. Hạt nano composite đa chức năng Fe 3 O 4 /Ag………33

3.1.1 Hạt nano Fe3O4 chức năng hóa với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)……… 33

3.1.2 Hạt nano composite Fe3O4/Ag 35

3.1.3 Chức năng hóa hạt nano composite Fe3O4/Ag với 4-aminothiophenol 40

3.2 Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe 3 O 4 /Ag trong đánh dấu tế bào……….42

3.2.1 Hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn với kháng thể anti-EGFR 42

3.2.2 Đưa hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn kháng thể anti-EGFR lên hai dòng tế bào Hacat và SK-Mel 28 46

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Đường cong từ hoá sắt từ ( -) và siêu thuận từ ( -) 6

3 Hình 1.3

Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt của

4 Hình 1.4 Mô hình tán xạ Raman của phân tử CH4 10

5 Hình 1.5 Mô phỏng hoạt động của các loại ErbB 15

6 Hình 1.6

Hình vẽ mô phỏng cấu trúc các loại ErbB và các

7 Hình 1.7 Mô hình của một kháng thể điển hình 19

11 Hình 1.11 Mô hình tóm tắt mục tiêu luận văn 22

12 Hình 2.1 Mô hình phản ứng chức năng hóa Fe3O4 với APTES 23

13 Hình 2.2 Quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức năng

14 Hình 2.3 Mô tả phương pháp phân tích cường độ sáng của tế bào bằng phần mềm Image J 30

15 Hình 2.4 Đồ thị tính toán cường độ sáng của tế bào và nền 31

17 Hình 3.2 Ảnh TEM của các hạt nano Fe3O4 34

19 Hình 3.4 Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4/Ag 36

20 Hình 3.5 Phổ tán sắc năng lượng EDS của mẫu Fe3O4/Ag 36

Đường cong mômen từ phụ thuộc từ trường ở nhiệt

độ phòng của Fe3O4 (a) và Fe3O4/Ag (b) 40

Phổ Raman của mẫu hạt Fe3O4/Ag-NH2 trước và

28 Hình 3.13

Phổ Raman của hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR

53

37 Hình 3.22 So sánh cường độ sáng trung bình của hai tế bào HaCaT và SK-Mel 28 54

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1

Bảng các loại HER receptor và các bệnh ung thư

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

6 Phổ FTIR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

7 Phổ SERS Phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt

8 TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua

9 UV-Vis Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực y học hiện nay, tình trạng mắc bệnh ung thư ở các quốc gia đang trở thành vấn đề quan tâm của toàn thế giới Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (World Health Organisation - WHO) năm 2012, đã có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư Trong đó, số lượng các ca tử vong do ung thư chủ yếu là: ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung thư thực quản, … Dự đoán số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14 triệu trong năm 2012 lên 22 triệu trong vòng hai thập kỷ tới [7] Hơn 60% số các ca ung thư mới hàng năm trên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và Nam

Mỹ, chiếm 70% tổng số các ca tử vong ung thư [48] Tại Việt Nam trong những năm trở lại đây, tình trạng mắc bệnh ung thư đang ở mức báo động đứng đầu trên thế giới Cũng trong năm 2012, tổng số ca tử vong do ung thư là 91.600 ca, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở nam giới là gan, phổi, dạ dày, đại trực tràng và mũi họng; còn các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: ung thư vú, phổi, gan, cổ tử cung và dạ dày [49]

Với tình trạng phát triển bệnh ngoài kiểm soát như vậy đòi hỏi các y bác sĩ

và các nhà nghiên cứu tìm ra một phương pháp để có thể phát hiện sớm các tế bào mang bệnh giúp hỗ trợ điều trị hiệu quả hơn Hiện nay, đã có các phương pháp giúp chẩn đoán sớm các tế bào ung thư như: phương pháp thử sinh học, phép thử nội soi

tế bào, và đặc biệt là phương pháp đánh dấu bằng lý sinh học nano [50]

Trong vài thập niên trở lại đây, công nghệ nano đang là một hướng nghiên cứu dành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học Một nhánh quan trọng của công nghệ nano không thể không nhắc tới, đó là lý sinh học nano, trong đó, vật

liệu nano được sử dụng để chẩn đoán và điều trị bệnh Các nghiên cứu ứng dụng vật

liệu nano trong Y – Sinh ở nước ta đã đạt được một số kết quả đáng khích lệ Điển

hình là:

- Nhóm của GS.TS Nguyễn Xuân Phúc với đề tài “Nghiên cứu chế tạo chất lỏng từ trên nền hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong diệt tế bào ung thư” [4]

- Nhóm của PGS TS Nguyễn Ngọc Long với các kết quả sử dụng hạt nano vàng trong việc phát hiện sớm tế bào ung thư vú [36]

- Nhóm của GS TSKH Nguyễn Hoàng Lương với đề tài nghiên cứu hạt nano vàng chức năng hóa với các phân tử 4-aminothiophenol trong việc chẩn đoán

tế bào ung thư biểu mô sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt [35]

- Nhóm của PGS TS Nguyễn Hoàng Hải với đề tài “Sử dụng hạt nano từ tính mang thuốc để tăng cường khả năng ức chế vi khuẩn của thuốc kháng sinh Chloramphenicol” [1]

Có thể thấy các hạt nano với các tính năng đặc biệt của chúng đã được chú ý nghiên cứu nhằm ứng dụng trong y sinh tại Việt Nam Trong số đó, các hạt từ Fe3O4

có kích thước nano, micro mét được ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, sắp xếp thứ

tự DNA và phân tách tế bào, … [11, 46] Vật liệu nano Fe3O4 được biết đến như một loại vật liệu với những tính năng vượt trội được kể đến đó là hiệu ứng kích thước và tính siêu thuận từ Khi kích thước của vật liệu giảm đến cỡ nano mét thì tỉ

số giữa diện tích bề mặt và thể tích của vật liệu tăng cao đáng kể do đó làm tăng khả

năng kết dính giữa bề mặt hạt nano với các phân tử hữu cơ [19] Cùng với đó với

tính siêu thuận từ, hạt nano Fe3O4 có thể dễ dàng được tập trung lại bằng từ trường ngoài và điều này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như tách chiết, chẩn đoán…[11] Các hạt nano từ Fe3O4 có xu hướng kết đám lại với nhau trong chất lỏng mang bởi tồn tại sự tương tác lưỡng cực từ mạnh giữa các hạt và lực VanderWaals, ngoài ra chúng còn dễ bị oxi hóa Để ngăn ngừa sự kết đám và sự oxi hóa cũng như làm tăng khả năng tương thích sinh học của chúng, hạt nano từ Fe3O4 cần được chức năng hóa bề mặt bởi những lớp vỏ là các chất có hoạt tính bề mặt hoặc polymerđể có thể đáp ứng cho nhiều ứng dụng khác nhau

Trong các nghiên cứu nói trên, bên cạnh hạt nano từ tính và nano bán dẫn thi các hạt nano kim loại quý cũng đóng vai trò quan trọng về ứng dụng Một trong những kim loại quý hiếm có thể kể đến đó là kim loại bạc (Ag) Các hạt nano Ag với hiệu ứng plasmon bề mặt điển hình cho tín hiệu Raman đặc trưng ở các liên kết gần bề mặt hạt nano Ngoài ra, việc chức năng hóa thêm nhiều lớp vỏ trên bề mặt

Nhằm mục tiêu ứng dụng các tính năng đặc biệt của nhiều loại hạt nano cùng một lúc, nhóm nghiên cứu đã kết hợp cả hai loại hạt nano từ Fe3O4 và hạt nano kim loại Ag được chức năng hóa với các phân tử 4-ATP tạo thành hạt nano composite

đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2. Thông qua nhóm chức năng (-NH2), các hạt nano composite đa chức năng này có thể liên kết đồng hóa trị với các protein như human serum albumin (HSA), kháng thể, bovine serum albumin (BSA)…[10, 46, 51], sau

đó sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) và phương pháp chụp ảnh hiển

vi trường tối để đánh dấu tế bào mang bệnh

Trong khuôn khổ luận văn này, với mong muốn chế tạo ra một vật liệu nano mang đầy đủ cả hai tính chất kim loại và từ có thể ứng dụng để đánh dấu và tách chiết tế bào trong y sinh, đồng thời có thể sản xuất với giá thành rẻ và quy trình đơn giản, nhóm nghiên cứu đã định hướng sử dụng phương pháp hoá ướt để chế tạo hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag Hạt nano đa chức năng này mang đầy đủ tính chất kim loại quý của hạt nano Ag gắn 4ATP cho tín hiệu Raman và tính chất từ của vật liệu Fe3O4 nên vừa có thể sử dụng tìn hiệu Raman để đánh dấu vừa có thể khắc phục được khả năng tập trung hạt theo mong muốn, giảm thời gian lọc rửa Nhóm chức –NH2 được gắn trên bề mặt hạt nano Ag có tính tương thích sinh học cao, dễ dàng gắn kết với các protein kháng thể anti-EGFR sau đó được đưa thử nghiệm lên hai dòng tế bào HaCaT và tế bào ung thư da SK-Mel 28 để nhận biết và đánh giá mức độ biểu hiện EGFR của hai dòng tế bào bằng hai phương pháp vật lý là chụp ảnh hiển vi trường tối và đo phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS)

Đề tài luận văn: “Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh

dấu tế bào bằng phương pháp SERS” có bố cục như sau:

Mở đầu

Mục lục

Chương 1 - Tổng quan: Trình bày sơ lược về hạt nano composite đa chức

năng Fe3O4 /Ag-NH2, hạt nano có cấu trúc lõi vỏ và ứng dụng của hạt nano trong y sinh học

Chương 2 - Thực nghiệm: Trình bày phương pháp chế tạo mẫu, các thiết bị

thực nghiệm được sử dụng để nghiên cứu các tính chất và ứng dụng của vật liệu nano

composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào HaCaT và SK-Mel 28

Chương 3 - Kết quả và thảo luận: Những kết quả đạt được trong quá trình

chế tạo và ứng dụng hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào Các kỹ thuật khảo sát tính chất và những biện luận kết quả

Kết luận

Tài liệu tham khảo

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hạt nano Fe 3 O 4 và hạt nano Ag

1.1.1 Vật liệu sắt từ

Vật liệu sắt từ là các vật liệu trong đó có các mô men từ sắp xếp song song với nhau Vì vậy trạng thái sắt từ cũng là trạng thái từ hoá tự phát Theo lý thuyết Weiss thì ngay cả khi không có từ trường ngoài trong vật liệu sắt từ đã có sự từ hoá

tự phát đến bão hoà Nguyên nhân của sự từ hoá tự phát đó là do các mô men từ tương tác với nhau rất mạnh mẽ Tương tác này tương đương với tác dụng của từ trường ngoài lớn cỡ 104

- 105 Oe làm cho các mô men từ có xu hướng sắp xếp song song với nhau [5]

Nhiệt độ Curie trong các chất sắt từ là nhiệt độ chuyển pha sắt từ - thuận từ.Dưới nhiệt độ Tc tương tác giữa các mô men từ thắng được kích thích nhiệt do đó vật liệu thể hiện tính sắt từ Trên nhiệt độ Tc năng lượng kích thích nhiệt đủ lớn để phá vỡ trạng thái liên kết sắt từ giữa các mô men từ làm cho phân bố các mô men từ trở lên hỗn loạn và vật liệu thể hiện tính chất thuận từ [9]

1.1.2 Tính chất siêu thuận từ

Đối với một vật liệu sắt từ khi ở kích thước lớn, các hạt có xu hướng phân chia thành các domain từ để giảm năng lượng dị hướng và ta có các hạt đa domain Khi kích thước hạt giảm xuống dưới một giá trị nào đó và hạt chuyển thành đơn domain sẽ xảy ra tình huống trong đó năng lượng kích thích nhiệt (có xu hướng phá

vỡ sự định hướng mô men từ của các hạt) trở nên trội hơn năng lượng dị hướng từ (có tác dụng định hướng mô men từ của các hạt) Khi đó mô men từ của các hạt sẽ

định hướng một cách hỗn độn do đó mô men từ tổng cộng bằng không Chỉ khi có

từ trường ngoài tác dụng thì mới có sự định hướng của mô men từ của các hạt và

tạo ra mô men từ tổng cộng khác không Tính chất này là đặc trưng cho các vật liệu thuận từ nhưng ở đây mỗi hạt nanô có chứa nhiều nguyên tử nên có mô men từ lớn hơn mô men từ nguyên tử nhiều lần, vì vậy tính chất này được gọi là tính chất siêu thuận từ

Đường cong từ trễ của vật liệu siêu thuận từ cũng tuân theo hàm Langevin như trường hợp thuận từ Đường cong này có hai đặc điểm đó là: lực kháng từ Hc = 0,

từ độ dư Mr = 0 nghĩa là không có hiệu ứng trễ Hình 1.1 diễn tả sự thay đổi đường cong từ hoá của vật liệu sắt từ khi kích thước hạt giảm Trong giới hạn đơn domain khi kích thước hạt giảm thì Hc giảm cho đến khi Hc = 0, kích thước tại đó Hc = 0 chính là giới hạn siêu thuận từ Hình 1.2 biểu diễn sự thay đổi của Hc khi đường kính hạt giảm

Do sự cạnh tranh giữa năng lượng dị hướng và năng lượng kích thích nhiệt

mà các hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ khi kích thước thoả mãn điều kiện (1.1):

K

T k

V p 25 B (1.1)

với Vp là thể tích hạt, kB là hằng số Boltzmann (kB = 1,38.10-23 J/mol.K), T là nhiệt

độ của mẫu, K là hằng số dị hướng từ Dựa vào điều kiện (1.1) ta có thể đánh giá giới hạn kích thước để hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng khi biết giá trị của K Ngược lại với các hạt có kích thước xác định (có Vp xác định) tồn tại nhiệt độ chuyển pha sắt từ - siêu thuận từ còn gọi là nhiệt độ Blocking (TB):

B

p B

k

KV T

25

 (1.2)

H c

d p

d s

d m

Đa domain

Đ

ơn domạin S iêu thuận

Trên nhiệt độ TB điều kiện (1.1) được thoả mãn hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ, dưới nhiệt độ này điều kiện đó không được thoả mãn và hạt thể hiện tính chất sắt từ [31]

1.1.3 Vật liệu oxit sắt từ Fe 3 O 4

Vật liệu Fe3O4 kích thước < 20 nm là vật liệu siêu thuận từ Khi ở kích thước hạt lớn, hệ ở trạng thái đa đômen (tức là mỗi hạt sẽ cấu tạo bởi nhiều đômen từ) Khi kích thước hạt giảm dần, Fe3O4 sẽ chuyển sang trạng thái đơn đômen (mỗi hạt

sẽ là một đômen) Hiện tượng siêu thuận từ xảy ra khi kích thước hạt giảm quá nhỏ, năng lượng định hướng nhỏ hơn nhiều năng lượng nhiệt, vì vậy năng lượng nhiệt phá vỡ sự định hướng song song của các mômen từ, và các mômen từ của hệ hạt sẽ định hướng hỗn loạn như trong chất thuận từ

Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt nano từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [4] Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu Các

tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài

1.1.5 Hạt nano Bạc và tính chất

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn Tương tự các hạt nano kim loại quý khác, các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt

1.1.6 Cộng hưởng Plasmon bề mặt [16]

Một trong những tính chất quan trọng của các hạt nano kim loại, đó là hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt là hiệu ứng đặc trưng của các hạt nano kim loại Vì trong kim loại có nhiều điện tử tự do nên khi hấp thụ ánh sáng chiếu vào các điện tử tự do này sẽ dao động tập thể cùng pha với điện trường ánh sáng Dao động đó gọi là dao động Plasma điện tử Khi quãng đường tự do trung bình của các điện tử nhỏ hơn kích thước của chúng, các dao động này thông thường bị dập tắt bởi các sai hỏng mạng hay chính các nút mạng trong tinh thể nguyên tử kim loại Nhưng khi kim loại ở kích thước nano thì kích thước của chúng lại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình

do đó hiện tượng dập tắt không còn nữa mà các điện tử sẽ dao động cộng hưởng vói ánh sáng kích thích

Do vậy tính chất quang của hạt nano kim loại có được do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng hình dáng, kích thước, độ lớn của hạt nano và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Ngoài ra mật độ hạt nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang Nếu mật độ loãng có thể coi như gần đúng các hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải kể đến tương tác giữa các hạt (Hình 1.3)

Hình 1.3 Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề

mặt của hạt nano kim loại

có thể có những thông tin về mức năng lượng dao động của nguyên tử, phân tử hay mạng tinh thể

1.1.7.1 Cơ sở lý thuyết tán xạ Raman

Trong quang phổ Raman, mẫu được chiếu xạ bởi chùm laser cường độ mạnh trong vùng tử ngoại-khả kiến (v0) và chùm ánh sáng tán xạ thường được quan sát theo phương vuông góc với chùm tia tới Ánh sáng tán xạ bao gồm hai loại : một được gọi là tán xạ Rayleigh, rất mạnh và có tần số giống với tần số chùm tia tới (v0); loại còn lại được gọi là tán xạ Raman, rất yếu (10-5 chùm tia tới) có tần số là

0 m

v v , trong đó v mlà tần số dao động phân tử Vạch v0 vmđược gọi là vạch Stockes

và vạch v0v mgọi là vạch phản Stockes Do đó, trong quang phổ Raman, chúng ta đo

tần số dao động (v m) như là sự dịch chuyển so với tần số chùm tia tới (v0) (Hình 1.4) Khác với phổ hồng ngoại, phổ Raman được đo trong vùng tử ngoại-khả kiến mà ở đó các vạch kích thích (laser) cũng như các vạch Raman cùng xuất hiện

Hình 1.4 Mô hình tán xạ Raman của phân tử CH 4

Theo lý thuyết cổ điển, tán xạ Raman có thể được giải thích như sau: Cường

độ điện trường E của sóng điện từ (chùm laser) dao động theo thời gian có dạng:

Theo lý thuyết cổ điển, số hạng thứ nhất mô tả một lưỡng cực dao động mà

nó bức xạ tần số v0(tán xạ Rayleigh); số hạng thứ hai là tương ứng với tán xạ Raman với tần số v0 v m (phản Stockes) và v0 vm(Stockes)

  bằng không thì sự dao động không thể tạo ra phổ Raman Nói

chung, để có phổ Raman thì tỷ số này phải khác 0

1.1.7.2 Tán xạ Raman tăng cường bề mặt – (Surface Enhanced Raman Scatering-

SERS) [44]

So với các quá trình tán xạ đàn hồi (năng lượng của photon không đổi) thì xác suất xảy ra tán xạ Raman là rất nhỏ Như vậy, để quan sát được vạch Raman, ta phải tăng cường độ của vạch Raman và tách vạch Raman khỏi vạch chính Việc tách phổ có thể thực hiện khá đơn giản bằng một kính lọc, hay phức tạp hơn một chút là phép biến đổi Fourier

Để có được cường độ vạch Raman lớn, hiện nay có 2 phương pháp cộng hưởng thường được áp dụng trong tán xạ Raman để khuyếch đại vạch Raman lên

Phương pháp đầu tiên được dùng là CARS, viết tắt của Coherent Antistokes Raman Scattering Nguyên tắc của phương pháp này là chiếu hai chùm sáng (laser)

có độ chênh lệch năng lượng và xung lượng đúng bằng năng lượng và xung lượng của lượng tử dao động Tương tác giữa hai chùm này sẽ làm số hạt lượng tử dao động tăng lên nhiều, dẫn đến xác suất va chạm không đàn hồi tăng lên Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này không cao

Phương pháp thứ hai là SERS (viết tắt của Surface Enhanced Raman Scattering – tán xạ Raman tăng cường bề mặt) tức là tăng cường độ vạch Raman bằng plasmon bề mặt (surface plasmon) Plasmon bề mặt là một dạng lượng tử của trường điện từ trong môi trường plasma có hằng số điện môi âm, ví dụ như trong

kim loại với tần số sóng điện từ nhỏ hơn tần số plasma của electron trong kim loại Khi sóng điện từ truyền dọc bề mặt một tấm kim loại với tần số sóng nhỏ hơn tần số plasma của electron trong kim loại, tương tác của sóng và plasma electron (một trạng thái mà tất cả các electron chuyển động như một thể thống nhất) làm sóng điện từ có thể thâm nhập vào môi trường (gần bề mặt) và định xứ ở đó Dùng plasmon bề mặt có thể tăng cường độ điện trường một cách cục bộ Vì thế, khi đưa nguyên tử cần đo phổ Raman vào khu vực điện trường cao đó, tương tác giữa nguyên tử và trường điện từ sẽ mạnh hơn, dẫn đến phổ Raman có cường độ lớn hơn

1.1.7.3 Ứng dụng của SERS

Do đặc tính của hiệu ứng tán xạ Raman tăng cường bề mặt chỉ xảy ra trên bề mặt các hạt nano [26] Và những liên kết càng gần bề mặt hạt nano sẽ cho các đỉnh tán xạ đặc trưng của các liên kết đó Ngoài ra, việc bọc thêm nhiều lớp vỏ trên bề mặt của hạt nano cũng không làm thay đổi cường độ của các đỉnh tán xạ đặc trưng

Vì vậy một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt là có thể được dùng để đánh dấu chẳng hạn đánh dấu tế bào ung thư

vú [36] , tế bào ung thư da [6] và nhận biết các tế bào mang bệnh trong y sinh [38]

Bên cạnh đó, phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt còn được ứng dụng để nghiên cứu quá trình động học trên bề mặt hạt nano kim loại, trong đó hạt nano kim loại quý như vàng, bạc được ưu tiên nhờ khả năng tăng cường hiệu ứng rất mạnh

Ngoài những ứng dụng kể trên, thì phương pháp này cũng được sử dụng để kiểm tra lại cơ chế của các phản ứng đã biết, đồng thời nghiên cứu quá trình động học của các phản ứng chưa biết Thông thường, trong một phản ứng việc xác định

sự tồn tại của các liên kết và độ bền của các liên kết trong sản phẩm sau phản ứng là rất quan trọng Bằng phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt ta hoàn toàn có

thể chỉ ra sự tồn tại đồng thời của các chất ở trạng thái trung gian với sản phẩm sau

phản ứng Đồng thời đưa ra đánh giá về hiệu suất phản ứng và kết luận về sản phẩm

sau phản ứng hoàn toàn phù hợp với các dự đoán ban đầu

1.1.8 Hạt nano composite đa chức năng Fe 3 O 4 /Ag

Hạt nano composite Fe3O4/Ag kết hợp cả hai loại hạt nano đơn lẻ Fe3O4 và hạt nano kim loại Ag, mang đầy đủ những tính chất đặc biệt lý thú bao gồm: tính siêu thuận từ của vật liệu Fe3O4 giúp phân tách và chọn lọc tế bào, tính chất quang của hạt nano kim loại nói chung và hạt bạc nói riêng có khả năng ứng dụng để đánh dấu

tế bào [13, 32]

Hiện nay, việc nghiên cứu các hạt nano có cấu trúc lõi-vỏ đang được rất nhiều nhóm nghiên cứu trong nước và trên thế giới quan tâm, đồng thời đã đạt được những thành tựu nhất định có thể kể đến như:

- Nhóm nghiên cứu Xueping Zhang đã chế tạo thành công hạt nano composite bằng phương pháp hóa ướt đơn giản [52]

- Nhóm nghiên cứu E Iglesias-Silva của trường đại học Santiago đã tổng hợp thành công hạt nano Fe3O4 bọc Ag sử dụng chất khử Glucose [21]

- Hay nhóm nghiên cứu Ling-Yan Zhang và Ting Chu tại trung tâm kiểm định pháp y Trung Quốc đã chế tạo thành công vật liệu composite cấu trúc lõi-

vỏ Fe3O4@Ag sử dụng chất khử NaBH4 đồng thời khảo sát ở các pH từ 3-9 nhằm ứng dụng trong việc nhận biết dấu vân tay [28]

- Nhóm nghiên cứu Wansong Yu thuộc đại học khoa học và công nghệ thực phẩm tại Trung Quốc đã nghiên cứu và chế tạo hạt nano Hybrid Fe3O4/Ag,

sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) để phát hiện hàm lượng Furazolidone tồn dư trong thức ăn cho cá [47]

Trong đề tài này, chúng tôi chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag-NH2 dùng chất khử NaBH4 để khử các ion Ag+

thành Ag bám trên bề mặt của hạt nano từ

Fe3O4 thông qua liên kết NH2 trên bề mặt hạt nano sắt từ đồng thời khảo sát ở các

pH khác nhau tương ứng là 5, 7, 9 và 11 Tuy nhiên, việc khảo sát tính chất hạt nano composite phụ thuộc vào pH không được trình bày cụ thể trong luận văn này, qua khảo sát tính chất vật lý của các mẫu có pH khác nhau, chúng tôi thấy rằng: tại pH=11, hạt nano composite có sự ổn định từ tính, các hạt nano Ag bám tốt hơn trên

bề mặt của hạt từ Fe3O4 đảm bảo điều kiện ứng dụng trong sinh học Tuy nhiên, để

có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa bề mặt

bởi các nhóm chức để có thể gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme,… Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, streptavidin, cacboxyl, thiol…[2] Trong luận văn này chúng tôi sử dụng nhóm chức amin -NH2phục vụ cho mục đích gắn kết với kháng thể trước khi đưa lên tế bào

1.2.1 Bệnh ung thư

Bệnh ung thư khởi nguồn từ sự biến đổi đột ngột DNA của các tế bào bình thường Khi phát hiện lỗi trên DNA, lập tức cơ thể sẽ có phản ứng sửa chữa, phá hủy, hoặc ngăn chặn quá trình phát triển của tế bào mang mầm DNA lỗi đó Nhưng trong các tế bào bị ung thư cơ chế sửa lỗi hoặc hạn chế phát triển của tế bào không hiệu nghiệm [33] Đây là một trong những nguyên nhân gây bệnh ệnh ung thư, hay

sự phát triển không thể kiểm soát của một nhóm tế bào Thông thường các bệnh ung

thư bắt nguồn từ sự đột biến gene do các tác nhân môi trường, ví dụ như chất độc hại trong khói thuốc là, tia X hoặc tia phóng xạ Các tế bào ung thư thường tập hợp lại thành những khối u riêng biệt Tuy nhiên, cũng có những trường hợp các tế bào này không tích tụ lại như trong trường hợp của ung thư bạch cầu Những trường hợp phát triển mạnh của ung thư xuất hiện khi các tế bào mang mầm bệnh xâm nhập vào trong máu hoặc các cơ quan sản sinh ra hồng cầu, rồi phát triển lan ra các mô tế bào

khác Chúng ta thường gọi trường hợp này là di căn

Những hiện tượng u, viêm chưa thể qui kết là các bệnh ung thư Ví dụ những khối u lành tính không gây hiệu ứng lan ra các bộ phận khác trong cơ thể, và trong một vài trường hợp hiếm có, chúng không gây nguy hiểm đến tính mạng [41]

1.2.2 Các phương pháp phát hiện bệnh ung thư

Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện bệnh ung thư Khi gặp các hiện tượng u, viêm, sau khi khám sơ bộ và nghi ngờ là bệnh nhân mắc phải bệnh, bác sĩ

có thể áp dụng các phương pháp thử sinh học (biopsy), phép thử nội soi tế bào (endoscopy), và các phép chụp (imaging) [50]

Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, cũng như Công nghệ sinh

học hiện đại, các phương pháp phân tử (molecular diagnostics) không những giúp

cho ta xác định được căn bệnh mà còn giúp cho ta tìm hiểu được hoạt động của gene và protein của các tế bào ung thư [8] Cùng với việc phát triển các phương pháp điều trị bệnh ung thư, sự phụ thuộc của độ nguy hiểm, khả năng chữa trị đặt ra

sự cấp thiết của việc xác minh sớm căn bệnh Do đó việc ứng dụng những chất vừa

có khả năng đánh dấu, vừa có khả năng tách chiết vào việc phát hiện các mầm tế bào ung thư trở nên ngày càng quan trọng

1.2.3 Các thụ thể tế bào (ErbB receptors)

Một trong những cơ chế phát triển tế bào là tương tác thông tin giữa các tế

bào với nhau Mối liên kết này được đảm bảo bởi các phối tử Các phối tử này nằm

ở hệ thống dịch ngoại bào mang thông tin từ tế bào gốc tới các tế bào đích thông qua hệ

thống protein màng tế bào (membrane protein), dựa trên tương tác protein-protein Các

protein màng tế bào đó ta còn gọi là các receptor (Hình 1.5) Theo phương pháp trên các thông tin liên bào có thể truyền đến nhân bào [50]

Hình 1.5 Mô phỏng hoạt động của các loại ErbB

Hiện tại người ta đã nhận biết được tổng cộng 4 loại ErbB lần lượt đánh số theo thứ tự ErbB1/HER1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 và ErbB4/HER4 Mỗi

một loại trên lại liên kết với các phối tử khác nhau Ví dụ ErbB1 liên kết với EGF, T

GF − α [16] (Hình 1.6)

Hình 1.6 Hình vẽ mô phỏng cấu trúc các loại ErbB và các phối tử của chúng

Mỗi một loại ErbB đặc trưng cho sự phát triển của các loại tế bào khác nhau, bên cạnh đó, chúng cũng là nguyên nhân gây ra các loại ung thư riêng biệt Trong các tế bào bình thường, tỷ lệ các ErbB receptor hợp lí sẽ giúp cho sự phát triển bình thường của bản thân chúng, đóng góp vai trò rất quan trọng vào quá trình phân bào của các bộ phận cơ thể Khi gặp các hiện tượng bất thường, sự mất cân bằng của cơ thể dẫn đến cơ chế ổn định phát triển tế bào bị đột biến, mất hiệu quả, thì lúc đó các

tế bào sẽ phát triển vượt qua khỏi sự khống chế của chính chúng, tạo thành các u,

mô Đây chính là bắt đầu của bệnh ung thư [50] Bảng 1.1 dưới đây biểu thị các loại bệnh ung thư ứng với các kiểu hình hoạt động của kháng thể tế bào

Bảng 1.1 Bảng các loại HER receptor và các bệnh ung thư đi liền với chúng

ErbB1/HER1/

EGFR

Phát triển và gia tăng khả năng phát triển không ngừng

Ung thư đầu và cổ, não, bàng quan, bụng, ngực, phổi, dạ con,

cổ tử cung, nhãn cầu, thực quản, tuyến tiền liệt, tuyến tụy,

ErbB2/HER2 Tự phát triển và kết

hợp với HER1 có thể gây bệnh ung thư vú

Ung thư vú, ung thư buồng trứng

ErbB3/HER3 Tự phát triển và liên

kết với HER2 gây bệnh ung thư vú

Ung thư vú, ruột kết,

1.2.4 EGFR- Epidermal growth factor receptor [50]

EGFR - Epidermal Growth Factor Receptor là một trong bốn loại receptor kể trên Protein mang tế bào này liên kết với EGF (Epidermal Growth Factor) và TGF-

α (Transforming Growth Factor) là hai phối tử đóng vai trò quan trọng trong phát triển tế bào Thông tin nhận được từ hai phối tử trên sau khi đưa vào trong tế bào sẽ kích họat quá trình sinh trưởng của tế bào

Sự phát triển đột ngột về số lượng EGFR trong các bệnh ung thư được phát hiện tại viện LICR (Ludwig Institute for Cancer Research - Viện nghiên cứu ung thư Ludwig) EGFR được phát hiện ở hầu hết các loại ung thư (Bảng 1.2) Trong các tế bào bình thường thì lượng EGFR nằm trong khoảng 40000 đến 100000 trên một tế bào Trong nhiều trường hợp lượng EGFR tăng lên đột ngột ở các tế bào ung thư, chúng có thể tăng lên tới 2 triệu phân tử trên một tế bào

Bảng 1.2 Bảng so sánh % tế bào có đột biến về số lượng EGFR

đột biến về số lƣợng EGFR

Như vậy, mức độ biểu hiện EGFR của các dòng tế bào là khác nhau tùy thuộc vào từng dòng tế bào Việc phân biệt mức độ biểu hiện EGFR của các tế bào với nhau đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết các tế bào khỏe mạnh và tế bào mang bệnh giúp hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh, có ý nghĩa to lớn trong y học

1.2.5 Kháng thể

Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất

Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng

(H, heavy, tiếng Anh, màu hồng trong hình 1.7) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light, tiếng Anh, màu xanh lá trong hình 1.7) cũng giống hệt nhau Một phần cấu

trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó [43]

Hình 1.7 Mô hình của một kháng thể điển hình

1.2.6 Kháng thể anti-EGFR và cơ chế gắn kết kháng thể anti-EGFR với hạt

Anti-EGFR là kháng thể của EGFR, được chế tạo trên hệ thống kháng thể (IgG- imunoglobulin) của chuột Bản chất của chúng là nhận biết và liên kết với các EGFR trên màng tế bào, vì anti-EGFR có khoảng 20-40% section trùng khớp với EGFR [50] (Hình 1.8)

Hình 1.8 Cấu trúc 3 chiều của anti-EGFR

Ngoài ra anti-EGFR cũng có thể liên kết với bề mặt hạt nano kim loại thông qua liên kết cộng hóa trị mà không mất đi hoạt tính liên kết với EGFR của mình Cơ chế chính xác liên kết giữa hạt nano kim loại và kháng thể - antibody vẫn còn rất

mơ hồ Theo kết quả của nhóm Caswell et.al [18] các kháng thể có cấu trúc đinh

và liên kết với các hạt nano theo chiều thẳng đứng Chân đinh gắn vào hạt nano bằng liên kết cộng hóa trị, phần còn lại là phần nhận biết kháng nguyên (theo liên kết nhận biết kháng nguyên – kháng thể) Hình 1.9

Hình 1.9 Mô hình liên kết giữa hạt nano gắn kháng thể anti-EFGR với các thụ

thể trên bề mặt tế bào

1.2.7 Tế bào HaCaT và SK-Mel 28

Trong luận văn này, chúng tôi lựa chọn hai dòng tế bào da là HaCaT và SK-Mel

28 để thử nghiệm đưa hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR lên bề mặt Theo các tài liệu

đã công bố, đây là hai trong số những dòng tế bào có biểu hiện EGFR [15, 37]

Tế bào HaCaT là tế bào da thuộc dòng keratinocyte chiếm khoảng 90% tế bào mô da HaCaT được tạo ra thông qua chuyển gen bằng simian virus-40 (SV40) hoặc chuyển gen bằng cách nào đó mà ngẫu nhiên tạo ra dòng tế bào này Với nhiều đặc điểm giống như tế bào da bình thường bên cạnh đó HaCaT còn có khả năng

năng nhân lên nhiều lần nhưng đây không phải tế bào ung thư vì nó vẫn có chức năng bình thường giống tế bào khác, sản sinh keratin, chuyển hóa vitamin D, biệt hóa [42]

Keratinocyte (còn được gọi là tế bào Keratin) thường thấy ở lớp biểu bì, lớp ngoài cùng của da Keratinocyte chiếm đa số trong biểu bì

SK-Mel28 là dòng tế bào được tách ra từ tế bào ung thư da người dòng melanoma (thường được dịch là ung thư tế bào hắc tố) [30]

Hai dòng tế bào này có nguồn gốc từ 2 loại tế bào khác nhau của mô da, dòng HaCaT từ keratinocyte còn SK-Mel từ melanocyte Melanocyte nằm dưới keratinocyte, hai tế bào này có chức năng khác nhau Melanocyte là loại tế bào có trong mô biểu bì với mật độ khá ít, thường tập trung ở tầng sinh sản Melanocyte tạo màu cho da, lông, tóc nhờ tạo ra các hạt sắc tố melanin và ngấm vào keratin (Hình 1.10)

Hình 1.10 Mô hình tế bào Keratinocyte và Melanocyte trong da

1.3 Mục tiêu của luận văn

Với mục tiêu chế tạo vật liệu nano đa chức năng nhằm định hướng ứng dụng trong phân tách và đánh dấu tế bào, kết hợp nhiều tính năng ưu việt của các hạt nano đơn chức năng, trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi định hướng dùng phương pháp hóa ướt để chế tạo vật liệu nano composite Fe3O4/Ag Hạt nano

Fe3O4/Ag chế tạo được sẽ được chức năng hóa với các phân tử 4-ATP aminothiophenol), tạo cầu nối NH2 có tính tương thích sinh học cao để gắn kết với các phân tử protein, hình thành cấu trúc hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2

(4-Việc thửnghiệm được tiến hành trên tế bào ung thư da SK-Mel 28 và tế bào

da không mắc bệnh HaCaTbằng hai phương pháp vật lý để đánh dấu tế bào là chụp ảnh hiển vi trường tối và phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS), từ đó so sánh và khảo sát mức độ biểu hiện EGFR của hai dòng tế bào HaCaT và SK-Mel

28 (Hình 1.11)

Hình 1.11 Mô hình tóm tắt mục tiêu luận văn

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 2.1 Chế tạo hạt nano chức năng Fe 3 O 4 /Ag

2.1.2 Chức năng hóa hạt nano Fe 3 O 4 với 3-aminopropyltriethoxysilane

(APTES) tạo nhóm amine NH 2 tự do Fe 3 O 4 -NH 2

Hạt nano Fe3O4 sau khi chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa được mang

đi khảo sát các tính chất vật lý bao gồm: cấu trúc tinh thể bằng nhiễu xạ tia X, hình thái học bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), và đường cong từ hóa phụ thuộc từ trường ngoài (VSM) Sau đó mẫu Fe3O4 được tiến hành chức năng hóa bề mặt với APTES Mô hình phản ứng như sau:

Quy trình tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Cân 21 mg Fe3O4 phân tán trong 80 ml cồn đem rung siêu âm 1,5 giờ thu được dung dịch kí hiệu là F

Bước 2: Tiếp tục nhỏ lần lượt 4,5 ml APTES và 5,5 ml NH4OH vào 80 ml cồn, sau đó rung siêu âm trong 20 phút thu được dung dịch kí hiệu là A

Bước 3: Đổ dung dịch F vào dung dịch A sau đó cho vào máy rung siêu âm trong 2 giờ Dùng nam châm lọc rửa bằng cồn Chuẩn dung dịch về pH=11 Sản phẩm cuối cùng thu được là dung dịch hạt nano Fe3O4 chức năng hóa với APTES có gốc amine NH2 tự do Fe3O4-NH2

 Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD): xác định cấu trúc tinh thể của vật liệu

 Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM): xác định hình thái của vật liệu

 Khảo sát đường cong từ hóa được đo ở nhiệt độ phòng bằng hệ từ kế mẫu rung (VSM): xác định tính chất từ và từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4

2.1.3 Chế tạo hạt nano composite Fe 3 O 4 /Ag

Quy trình tiến hành thí nghiệm như sau:

Bước 1: Nhỏ 4 ml AgNO3 vào dung dịch Fe3O4-NH2 rung siêu âm 30 phút sau đó ngâm khoảng 14 - 16 tiếng Các ion Ag+ khi đó được cho là bị hấp phụ trên

bề mặt của các hạt nano Fe3O4-NH2 Kí hiệu mẫu là A1

Bước 2: nhỏ 4 ml NaBH4 20 mM vào dung dịch A1 để khử ion Ag+ thành

Ag Sau đó cho vào hệ máy lắc, tốc độ lắc 300 vòng/ phút trong 1h ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Lọc rửa và phân tán mẫu trong 30 ml cồn Sản phẩm thu được là dung dịch hạt nano composite Fe3O4/Ag

Hạt nano từ Fe3O4 sau khi được bọc bởi các hạt nano Ag bên ngoài tạo thành hạt nano composite Fe3O4/Ag, chúng tôi tiến hành khảo sát tính chất vật lý của hạt bằng các kỹ thuật sau đây:

 Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis): xác định vị trí đỉnh hấp thụ quang

 Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)

 Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS)

 Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

 Đường cong từ hóa được đo ở nhiệt độ phòng bằng hệ từ kế mẫu rung (VSM)

2.1.4 Chức năng hóa bề mặt hạt nano composite Fe 3 O 4 /Ag bằng

4-aminothiophenol (4-ATP) - Fe 3 O 4 /Ag-NH 2

Quy trình thí nghiệm như sau:

Bước 1: Nhỏ 120 µl 4-ATP 0,4 M vào dung dịch hạt nano composite

Fe3O4/Ag cho vào máy lắc tốc độ lắc 300 vòng/ phút trong 1h30 phút rồi để ngâm trong 14-16 tiếng

Bước 2: Lấy dung dịch ra lọc rửa và phân tán lại trong 30 ml cồn Sản phẩm cuối cùng thu được là dung dịch hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 Quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 được mô tả ở hình dưới đây:

 Kỹ thuật phân tích:

 Phổ Tán xạ Raman