Phân tích gen mã hóa cho protein NHX liên quan đến tính chịu mặn ở lúa

Để góp phần nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, chức năng của họ protein NHX ở lúa, qua đó sàng lọc, tuyển chọn và nhân dòng những giống lúa có khả năng thích nghi cao với độ mặn chúng tôi ch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Huy Dương

PHÂN TÍCH GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN NHX LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Huy Dương

PHÂN TÍCH GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN NHX LIÊN QUAN

LỜI CẢM ƠN

Trươc tiên tôi xin gửi lời cảm ơn, biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Phúc, người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài và tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học đã dạy dỗ và và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất tại bộ môn trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm thuộc bộ môn

Di truyền học, phòng Genomics đã tạo điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, hiện đại nhất phục vụ cho nghiên cứu đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới cử nhân Trần Xuân An, người đã giúp

đỡ tận tình tôi trong quá trình thực hành các thí nghiệm cần thiết cho đề tài luận văn thạc sĩ

Luận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ quỹ NAFOSTED

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 11 năm 2015

Học viên

Nguyễn Huy Dương

Mục Lục

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về cây lúa 2

1.2 Khả năng chịu mặn ở cây lúa 2

1.2.1 Ảnh hưởng của mặn đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa 2

1.2.2 Đáp ứng của thực vật nói chung và cây lúa nói chung đối với điều kiện mặn 3

1.3 Họ protein NHX ở thực vật 7

1.3.1 Nguồn gốc và tiến hóa của họ protein NHX ở thực vật 7

1.3.2 Chức năng của họ protein ở thực vật 9

1.3.2.1 Điều hòa pH 9

1.3.2.2 Chống chịu mặn 9

1.3.3 Họ protein NHX ở lúa 10

1.4 Khái niệm và chức năng các yếu tố điều hòa cis ở thực vật 12

1.5 Tình hình nghiên cứu họ gen NHX trên thế giới và Việt Nam 13

1.6 Một số công cụ tin sinh được sử dụng trong nghiên cứu in silico 14

1.6.1 Các công cụ tìm kiếm cơ sở dữ liệu 14

1.6.2 Các công cụ dự đoán cấu trúc các phân tử protein 15

1.6.3 Các công cụ đánh giá kết quả dự đoán cấu trúc các phân tử protein 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB : 18

2.2.2 Phương pháp điện di trên gel Agarose 18

2.2.3 Phương pháp PCR 19

2.2.4 Sử dụng các cơ sở dữ liệu và phần mềm tin sinh để nghiên cứu in silico gen mã hóa cho protein NHX và phân tích kết quả nghiên cứu 20

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsNHX 22

3.1.1 Dữ liệu về họ gen OsNHX 22

3.1.1.1 Vị trí phân bố các gen trên NST 22

3.1.1.2 Cấu trúc của các gen thuộc họ gen NHX 23

3.1.1.3 Phân tích cấu trúc của protein 25

3.1.2 Phân tích vùng promoter các gen thuộc họ gen OsNHX 33

3.1.2.1 Nhận diện các yếu tố cis thuộc vùng promoter 33

3.1.2.2 Thiết kế logo motif của một số yếu tố cis liên quan đến tính chịu mặn 37

3.1.3 Phân tích in silico dữ liệu biểu hiện các gen OsNHX 39

3.1.3.1 Sự biểu hiện của các gen thuộc họ gen OsNHX trong điều kiện bình thường 39

3.1.3.2 Sự biểu hiện các gen thuộc họ OsNHX trong điều kiện stress 43

3.2 Kết quả phân tích đa hình vùng promoter của gen OsNHX3 45

3.2.1 Kết quả phản ứng PCR 45

3.2.2 Kết quả giải trình tự 45

3.2.3 Đánh giá mức độ đa hình vùng promoter các giống lúa nghiên cứu 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

Tài liệu tham khảo 53

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Các gen chống chịu mặn ở thực vật 5

Bảng 1.2 Các gen điều hòa liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật 6

Bảng 1.3 Số lượng và vị trí các protein thuộc họ protein NHX ở một số loài thực vật 8

Bảng 2.1 Danh sách 12 giống lúa dùng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng PCR vùng promoter gen OsNHX3 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 20

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 21

Bảng 3.1 Thông tin về cơ sở dữ liệu các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa 22

Bảng 3.2 So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotid các gen thuộc họ OsNHX 25

Bảng 3.3 So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid các protein họ OsNHX 25

Bảng 3.4 Chỉ số đánh giá mô hình 3D của các protein thuộc họ OsNHX 33

Bảng 3.5 Vị trí trình tự TSS và các yếu tố cis vùng promoter các gen thuộc họ OsNHX 34 Bảng 3.6 Dữ liệu tạo dòng cDNA biểu hiện gen OsNHX4 42

Bảng 3.7 Vị trí và kiểu thay thế trình tự nuleotid vùng promoter gen OsNHX3 ở các giống lúa nghiên cứu 48

Bảng 3.8 Sự thay đổi yếu tố điều hòa cis do thay thế nucleotide trong vùng promoter gen OsNHX3 ở 11 giống lúa 51

Danh mục hình

Hình 1.1 Các con đường điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật 4

Hình 1.2 Thành phần họ protein OsNHX tham gia điều hòa hằng định ion nội bào 11

Hình 3.1 Sơ đồ phân bố các gen OsNHX trên NST ở lúa 23

Hình 3.2 Cấu trúc exon/intron các gen thuộc họ gen NHX ở lúa 24

Hình 3.3a Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX1 27

Hình 3.3b Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX2 28

Hình 3.3c Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX3 28

Hình 3.3d Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX4 28

Hình 3.3e Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX5 29

Hình 3.4a Mô hình 3D protein OsNHX1 30

Hình 3.4b Mô hình 3D protein OsNHX2 30

Hình 3.4c Mô hình 3D protein OsNHX3 31

Hình 3.4d Mô hình 3D protein OsNHX4 31

Hình 3.4e Mô hình 3D protein OsNHX5 31

Hình 3.5 Phân tích điểm Ramachandran của protein OsNHX3 32

Hình 3.6 Logo consensus yếu tố ABRE 38

Hình 3.7 Logo consensus yếu tố G-box 38

Hình 3.8 Logo consensus yếu tố MBS 38

Hình 3.9 Logo consensus yếu tố CAAT 388

Hình 3.10 Logo consensus yếu tố TATA-box 39

Hình 3.11 Logo consensus yếu tố GCN4 39

Hình 3.12a Sự biểu hiện của gen OsNHX tại các mô cơ quan ở lúa 40

Hình 3.12b Biểu hiện gen các gen OsNHX qua các giai đoạn phát triển của lúa 41

Hình 3.13 Sự biểu hiện của gen OsNHX4 ở một số mô, cơ quan lúa 42

Hình 3.14 Sự biểu hiện gen OsNHX1 (a) và OsNHX2 (b) trong điều kiện stress mặn 43

Hình 3.15 Sự biểu hiện gen OsNHX3 (c) và OsNHX5 (d) trong điều kiện stress mặn 44

Hình 3.16 Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi pro-NHX3 45

Hình 3.17 Kết quả giải trình tự promoter gen OsNHX3 của giống lúa CD2 45

Hình 3.18 So sánh trình tự promoter của 11 giống lúa với trình tự database 46

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CREs Cis Regulatory Elements Yếu tố điều hòa cis

CTAB Cetyl Trimethyl Amoni Bromide

dNTPs Deoxyribonucleotide Triphosphate

ddNTP Dideoxyribonucleotide Triphosphate

DPE Downstream Promoter Element Yếu tố promoter xuôi dòng

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ethylen tetraaxetic axit

EST Expressed Sequence Tag Tag các trình tự biểu hiện

IRRI The International Rice Research

Institute

Viện nghiên cứu lúa quốc tế

NCBI National Center for Biotechnology

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RGAP Rice Genome Annotation Project Dự án chú giải hệ gen lúa

TSS Transciption Start Site Vị trí khởi đầu phiên mã

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam lúa là cây trồng bản địa có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện sinh thái khác nhau Tuy nhiên năng suất lúa phụ thuộc vào rất nhiều yếu tốnhư phân bón, giống, kỹ thuật canh tác và khác từ môi trường sinh thái như khí hậu, độ mặn, độ chua và độ màu mỡ của đất Độ mặn là một trong những yếu tố có nguy cơ ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển bình thường và năng suất của cây lúa Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng độ mặn cao trong đất không chỉ gây độc cho tế bào mà chúng còn ảnh hưởng đến khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng khác và sự hằng định nội môi cơ quan, tế bào thực vật qua đó làm giảm năng suất và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa Do đó lựa chọn cây lương thực nói chung và cây lúa nói riêng theo hướng thích nghi với điều kiện sinh thái ngập mặn là một trong những nhiệm vụ chiến lược góp phần đảm bảo an ninh lương thực

Trong nhiều năm qua, công tác chọn tạo giống đã đạt được những thành tựu nhất định, song các phương pháp được ứng dụng chủ yếu là lai tạo và gây đột biến thực nghiệm nên kết quả vẫn còn nhiều hạn chế, chưa đáp ứng được yêu cầu cải tạo những giống lúa có chất lượng, có khả năng chống chịu với các bất lợi từ môi trường sinh thái Bên cạnh đó việc đi sâu nghiên cứu cơ sở di truyền của gen chịu mặn, đặc biệt là các gen tham gia trao đổi Ion Na+/H+ vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu

Họ protein NHX được xem là họ protein có liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật

đã được nghiên cứu trong những năm gần đây, tuy nhiên ở lúa họ protein này ở lúa vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu một cách đầy đủ Để góp phần nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, chức năng của họ protein NHX ở lúa, qua đó sàng lọc, tuyển chọn và nhân dòng những giống lúa có khả năng thích nghi cao với độ mặn chúng tôi chọn đề tài:

“Phân tích gen mã hóa cho protein NHX liên quan đến tính chịu mặn ở lúa”

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu in silico họ gen mã hóa cho protein OsNHX ở lúa

2 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsNHX3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính được trồng phổ

biến ở nước ta và nhiều nước trên thế giới Về mặt nguồn gốc và phân loại, lúa trồng

ngày nay thuộc họ hòa thảo (Poaceae), chi Oryza, được con người thuần hóa từ lúa hoang dại cách đây khoảng 130 triệu năm trước Chi Oryza có 21 loài lúa hoang dại và 2 loài lúa trồng (Oryza sativa và Oryza glaberrima) [17] Loài Oryza sativaban đầu được trồng chủ yếu ở châu Á sau đó lan rộng ra toàn cầu trong khi loài Oryza glaberrima chỉ được trồng phổ biến ở vùng đông Phi Loài Oryza sativa có bộ NST lưỡng bội 2n= 24, với hai phân loài là Indica và Japonica Hai phân loài này khác nhau về các đặc điểm

hình thái, sinh lý và mức độ đa dạng di truyền [21]

Lúa được xem là một sinh vật mô hình dùng trong nghiên cứu di truyền và chọn giống phân tử bởi lúa có hệ gen khá nhỏ (khoảng 430Mb), có mức độ tương đồng hệ gen cao với những cây trồng có giá trị kinh tế khác[2] Với sự phát triển mạnh mẽ của các công cụ tinh sin trong sinh học phân tử, lúa được nghiên cứu rộng rãi và xây dựng thành công nhiều cở sở dữ liệu và quy trình nghiên cứu Vào năm 2005, lúa là cây lương thực đầu tiên được giải mã thành công toàn bộ hệ gen [32]

1.2 Khả năng chịu mặn ở cây lúa

1.2.1 Ảnh hưởng của mặn đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa

Khả năng chịu mặn là một quá trình đáp ứng sinh lý phức tạp thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển, có sự tham gia của nhiều yếu tố, cơ chế khác nhau trong

tế bào, mô và cơ thể thực vật Cơ chế chống chịu mặn và khả năng thích nghi của thực vật đối với điều kiện mặn được minh chứng qua nhiều công trình nghiên cứu [33],[26], [25], [22] Mặn ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây lúa ở nhiềumức

độ khác nhau tùy từng giai đoạn sinh trưởng phát triển Ở cấp độ tế bào, nồng độ muối cao có thể độc cho tế bào, gây mất cân bằng pH và áp suất thẩm thấu từ đó làm ức chế các phản ứng sinh lý sinh hóa của tế bào Ở cấp độ cơ thể, mặn làm giảm khả năng hấp

thu nước của rễ, làm giảm diện tích lá dẫn đến giảm khả năng quang hợp và năng suất cây lúa [25]

Người ta nhận thấy, lúa ở giai đoạn nảy mầm có khả năng chịu mặn cao Tuy nhiên khi bước vào giai đoạn cây con, đẻ nhánh và trổ bông, tính chịu mặn của cây kém hơn giai đoạn nảy mầm Độ mặn cao ảnh hưởng đến sự gia tăng chiều dài của lá, số lượng nhánh

và trọng lượng khô của lá, rễ Ở giai đoạn sinh sản mặn ảnh hưởng đến sự hình thành hoa, sự thụ phấn và sự nảy mầm của hạt phấn, làm cho tỉ lệ hạt lép gia tăng Mặn làm giảm chiều dài bông, số hạt/bông và trọng lượng 1000 hạt đưa đến năng suất giảm [28]

1.2.2 Đáp ứng của thực vật nói chung và cây lúa nói riêng đối với điều kiện mặn

Thực vật có thể đáp ứng stress mặn ở các tế bào riêng lẻ hay phối hợp chống chịu

ở mức độ mô, cơ quan và cơ thể Sự bắt đầu của phản ứng tế bào/ cơ thể thực vật đối với tác động từ môi trường bên ngoài bằng việc nhận tín hiệu, truyền tín hiệu và cuối cùng đưa ra các phản ứng sinh lý sinh hóa nhằm đáp ứng điều kiện stress đó Ở cấp độ tế bào, tín hiệu stress đầu tiên được nhận biết ở bề mặt màng tế bào bởi những phân tử thụ thể (receptor) như G-protein, các kinase, hoặc histidine kinase Kết quả của sự tác động này làm hoạt hóa nhiều phân tử tín hiệu thứ cấp như Ca2+, inositol phosphates và abscisic acid (ABA) Những tín hiệu thứ cấp này sau đó sẽ được truyền vào trong nhân để cảm ứng nhiều gen có vai trò đáp ứng với stress [33]

Phản ứng với tín hiệu stress có thể xảy ra sớm hoặc muộn tùy vào gen, giai đoạn phát triển hay cường độ của tín hiệu stress Sự đáp ứng stress có thể diễn ra trong vài phút đối với các gen đáp ứng sớm Sản phẩm của các gen này thường là các yếu tố phiên mã,

có tính tạm thời và chúng sẽ điều khiển các gen đáp ứng stress muộn Sản phẩm của các gen phản ứng muộn thường tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường Sản phẩm của chúng là những protein như chất chống đông (antifreeze protein), chaperons, và các enzyme kháng ôxi hóa (antioxidant), khử độc tố (detoxification)

Cơ chế chống chịu mặn ở thực vật là một hiện tượng phức tạp có sự tham gia của nhiều yếu tố bằng nhiều con đường khác nhau Quá trình này đòi hỏi sự với sự phối hợp hoạt động chính xác của nhiều phân tử tín hiệu như các protein sửa đổi, protein tiếp hợp (adaptor) và các protein giá thể (scaffold) Ngoài ra các phân tử nhỏ như canxi, glycine,

betaine, proline, ROS, ABA và các bơm ion cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chống chịu stress ở thực vật [33]

Hình 1.1 Các con đường điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật [33]

Theo Hasegawa (2000) và cộng sự, các gen liên quan đến tính chịu mặn có thể chia làm 2 nhóm chức năng Một là các gen mã hóa cho các phân tử protein tác hiệu (effectors), là những yếu tố có liên quan trực tiếp đến khả năng thích nghi, chống chịu điều kiện stress mặn Hai là các gen mã hóa yếu tố điều hòa hoạt động của effectors Mặc

dù có rất nhiều gen tham gia vào quá trình chống chịu stress mặn song có thể nhận thấy nhóm gen tham gia mã hóa protein vận chuyển các ion Na+

, H+ và K+ bao gồm 3 họ gen

là HKT, NHX và SOS (Hình 1.1) Bảng 1.1 và 1.2 liệt kê một số gen quan đến tính chịu

mặn ở thực vật [22]

Bảng 1.1 Các gen chống chịu mặn ở thực vật [22]

Bảng 1.2Các gen điều hòa liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật [22]

1.3 Họ protein NHX ở thực vật

1.3.1 Nguồn gốc và tiến hóa của họ protein NHX ở thực vật

Một trong những đặc tính cơ bản của sự sống đó là khả năng điều hòa pH, thể tích

và thành phần ion trong tế bào sinh vật Quá trình này diễn ra nhờ sự trao đổi, cân bằng giữa các ion, đặc biệt là sự trao đổi proton và các ion hóa trị một do vai trò của siêu họ protein CPA (cation proton antiporter) đảm nhận NHX được xem là một trong ba họ protein thành viên thuộc siêu họ protein vận chuyển (CPA), tham gia vào nhiều quá trình sinh học như sinh trưởng phát triển, điều hòa pH, kiểm soát chu kỳ tế bào và tham gia vào cơ chế chống chịu mặn [8], [6]

NHX là họ protein có tính bảo tồn cao trong quá trình tiến hóa, chúng có mặt ở hầu hết các nhóm sinh vật từ đơn bào đến những sinh vật bậc cao như thực vật và động vật (NHE đối với động vật) Dựa trên sự giống nhau về trình tự amino acid người ta đã chia họ protein NHX làm hai nhóm là nhóm protein màng tế bào và nhóm protein màng nội bào [9] Ở thực vật hầu hết họ protein NHX đều thuộc nhóm có mặt tại nội bào Từ nhóm này người ta lại xếp chúng vào hai lớp khác nhau dựa vào sự định vị của chúng trong tế bào Lớp thứ nhất gồm những protein nằm trên màng không bào, có chức năng vận chuyển ion Na+ vào không bào, trong khi đó nhóm thứ hai gồm những protein định vị

ở một số bào quan như hệ gônghi [30]

Ở Arabidopsis, họ protein NHX gồm 6 thành viên được phân chia thành hai lớp Lớp NHX thứ nhất gồm các protein từ AtNHX1 đến AtNHX4 định vị ở màng không bào [27] và có ái lực cao với Na+ hơn so với K+ [4] Lớp hai gồm các protein AtNHX4 và

AtNHX5 định vị ở hệ gônghi và có ái lực với K+ cao hơn Na+ [7], [34] Gen đầu tiên

được tạo dòng là AtNHX1, có liên quan đến khả năng chống chịu mặn và chịu hạn (Gaxiola và cộng sự., 1999) Sau đó nhiều thành viên khác thuộc họ gen NHX đã được phân tích ở các sinh vật khác như ở Oryza sativa (Fukuda và cộng sự, 1999, 2004),

Populus euphratica (Ye và cộng sự, 2009), Zea mays (Zorb và cộng sự, 2005) và Glycine max (Chen và cộng sự, 2014) Bảng 1.3 [11]

Các phân tích về cấu trúc miền protein cho thấy hầu hết các protein họ NHX ở thực vật đều có khoảng 10-12 miền protein xuyên màng, với khoảng 550 gốc amino acid

So sánh trình tự amino acid ở nhiều loài khác nhau người ta cũng nhận thấy đầu N các protein NHX có mức độ tương đồng cao nhất, trong khi đầu C có mức độ tương đồng thấp hơn Người ta cho rằng đầu N của họ protein NHX tham gia vào cấu tạo kênh xuyên màng và vị bám của các ion kim loại do đó có tính bảo thủ, chọn lọc cao trong khi đầu C với chức năng điều hòa hoạt động của protein nên có tính linh hoạt hơn và ít bảo thủ hơn [23], [6]

Bảng 1.3 Số lượng và vị trí các protein thuộc họ protein NHX ở một số loài thực vật [11]

Loài

Các kiểu protein NHX Màng không bào

(Vacuolar)

Màng thể nội bào (Endosomal)

Màng tế bào (Plasma membrane)

1.3.2 Chức năng của họ protein NHX ở thực vật

1.3.2.1 Điều hòa pH

Điều hòa pH là một trong những hoạt động quan trọng của tế bào Ở thực vật, pH

tế bào được xác định bởi hoạt động của các bơm proton và quá trình trao đổi chất làm phát sinh các ion H+

và OH- Vai trò điều hòa pH của họ protein NHX được minh chứng thông qua nghiên cứu về sự biến đổi màu sắc hoa phụ thuộc vào pH không bào Người ta

nhận thấy màu sắc hoa của loài Ipomea tricolor cv thay đổi từ đỏ tía đến xanh là do sự

thay đổi pH không bào từ 6,6 đến 7,7

Quá trình trao đổi chất trong tế bào có thể tạo ra các ion H+

và OH- tích lũy nhiều bên trong tế bào đôi khi gây rối loạn sự hoạt động của enzyme do đó cần phải được cân bằng bởi sự điều hòa pH nội bào Sự thay đổi pH trong tế bào gắn liền với hoạt động của kênh vận chuyển cation / proton và sự thay đổi các kênh này giúp cho pH thay đổi nhanh chóng (Raven,1985) Các nghiên cứu điện sinh lý đề xuất rằng các transporter có thể tham gia vào một trong các cơ chế kiểm soát pH tế bào chất, pH không bào hoặc là gradient ion đều chịu cảm ứng bởi điều kiện stress mặn [27]

1.3.2.2 Chống chịu mặn

Sự khu trú Na+ và Cl- vào không bào là cơ chế thích nghi ở thực vật được bảo tồn

ở thực vật nước ngọt cũng như nước mặn [40] Khả năng chịu mặn của thực vật có được

là nhờ sự hạn chế tích lũy ion Na+

ở thân và giảm sự vận chuyển Na+ lên thân, lá Ở mức

độ tế bào nồng độ Na+ tại không bào luôn được duy trì ở ngưỡng thấp hơn mức có khả năng gây độc cho tế bào chất là nhờ hoạt động của các protein NHX [30] Vài trò vận chuyển Na+, H+ trong tế bào do các protein được mã hóa bởi các gen thuộc họ gen NHX

ở thực vật đảm nhiệm, trong đó kênh vận chuyển Na +/H + và K +/ H + là hai kênh vận chuyển quan trọng trong quá trình điều tiết duy trì nồng độ cân bằng của ion trong cơ chế

chịu mặn của cây Phân tích khả năng chịu mặn của cây Arabidopsis, người ta thấy họ

protein NHX tham gia vào sự vận chuyển ion K + / H + và Na +/H + , tăng cường đưa hàm lượng ion Na+ vào bên trong không bào, tích lũy ion K + vào nội mô tế bào, giúp cây thực hiện chức năng điều tiết tốt trong quá trình chịu mặn [35]

1.3.3 Họ protein NHX ở lúa

Họ protein NHX đóng vai trò quan trọng đối với sinh trưởng và phát triển của cây lúa, đặc biệt là trong điều kiện môi trường đất nhiễm mặn Với việc phân bố ở những bào quan quan trọng trong tế bào, họ protein OsNHX có khả năng kiểm soát pH tế bào, vận chuyển ion Na+ vào không bào, tham gia trao đổi Na+/H+ ở hệ gônghi, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng tốt trong môi trường mặn độc hại

Những nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của các antiporter NHX ở nấm men, động vật và thực vật vẫn chưa được xây dựng một cách hoàn chỉnh tuy nhiên dựa trên kiểu cấu trúc mẫu protein PaNhaP của vi khuẩn Pyrococcus abyssii người ta đã phác họa những nét đặc trưng cơ bản của các Na+/H+ antiporter ở Eukaryota (Woehlert và cộng sự, 2014)

Phân tích in silico hệ gen lúa người ta đã xác định được 13 antiporter trong đó 9

antiporter tham gia vào quá trình trao đổi Na+/H+ và 4 antiporter tham gia trao đổi K+/H+

[19] Họ gen NHX ở lúa gồm 5 thành viên được định danh từ OsNHX1 đến OsNHX5 Trong số 5 gen này, OsNHX1 là gen đầu tiên được tạo dòng bởi Fukuda và cộng sự vào

năm 1999 [13], [20]

Những nghiên cứu đầu tiên về vai trò của các protein OsNHX được tiến hành trên

lúa và nấm men Saccharomyces cerevisiae bởi Fukuda và cộng sự 2004 Kết quả phân

tích cho thấy khi xử lý cây lúa với nồng độ Na+ cao, hàm lượng sản phẩm phiên mã của

gen OsNHX1 cũng tăng lên Điều này chứng tỏ gen OsNHX1 chịu ảnh hưởng bởi stress mặn và chủ yếu là kiểu stress ion Đánh giá mức độ biểu hiện gen OsNHX1 ở các mô cơ quan, người ta nhận thấy gen OsNHX1 biểu hiện mạnh mẽ ở các mô chồi hơn là ở rễ Tại các mô, cơ quan protein OsNHX1 tham gia điều hòa hàm lượng Na+

nội bào nhờ khả năng khu trú ion này vào không bào qua đó giúp duy trì tỉ số K+/Na+ cao trong tế bào,có lợi cho sự hấp thu nước và trao đổi chất [13],[27] Các thành viên khác thuộc lớp một

định vị ở không bào như OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX4 cũng có chức năng tương tự như OsNHX1 mặc dù mức độ biểu hiện và cấu trúc có sự khác biệt nhau (Hình 1.2) [19]

Hình 1.2 Thành phần họ protein OsNHX tham gia điều hòa cân bằng ion nội bào [19]

Họ protein OsNHX điều hòa cân bằng pH ở lúa gồm các thành viên từ OsNHX1 đến

OsNHX4 tham gia trao đổi Na + /H + ở không bào, protein OsNHX5 tham gia trao đổi

Na + /H + ở lưới nội chất (ER) và hệ gônghi

1.4 Khái niệm và chức năng các yếu tố điều hòa cis ở thực vật

a) Khái niệm yếu tố điều hòa cis

Yếu tố điều hòa cis (Cis-regulatory elements) là những trình tự đặc hiệu trong

vùng promoter của gen, có vai trò tương tác với các yếu tố phiên mã (transcription factors) để tham gia điều hòa hoạt động của gen [37]

b) Phân loại các yếu tố điều hòa cis (CREs)

Có nhiều cách để phân loại CRE như dựa vào vị trí, đặc điểm và chức năng của chúng Tuy nhiên người ta thường xếp các yếu tố cis thành 2 nhóm đó là nhóm các yếu tố điều hòa chung và yếu tố đặc hiệu Nhóm các yếu tố điều hòa chung thường nằm ở vùng lõi promoter như TATA-box, Y-patch, DPE…Nhóm các yếu tố điều hòa đặc hiệu thường

là các yếu tố nằm ở vùng lân cận hoặc vùng xa của promoter và đáp ứng với những điều kiện môi trường cụ thể như nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng và các tác nhân gây bệnh [18] c) Đặc điểm các yếu tố điều hòa cis [18], [29]

- Là những trình tự ngắn tồn tại thành từng cụm có kích thước 4-12bp

- Có tính bảo thủ cao ở nhiều loài và nhóm sinh vật

- Có vị trí tương đối cố định so với TSS và tương quan cố định giữa các cis elements Ví dụ: TATA- box thường nằm ở vị trí từ -20 đến – 49 so với TSS, CAAT-box thường nằm

ở vị trí -80 đến -150 so với TSS

d) Chức năng của các yếu tố cis ở thực vật [18], [10]

Các yếu tố điều hòa cis là nơi bám và hoạt động của các yếu tố phiên mã do đó đối với thực vật các CRE có 3 chức năng chính:

-Hình thành phức hệ khởi đầu phiên mã khi tham gia tương tác với RNA pol II

-Tham gia điều hòa hoạt động phiên mã của gen trong những điều kiện môi trường khác nhau như stress mặn, hạn, ánh sáng và các tác nhân sinh học (biotics)

- Điều hòa sự sinh trưởng và phát triển

1.5 Tình hình nghiên cứu họ gen NHX trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới gen mã hóa cho các protein vận chuyển, trao đổi NHX đang rất được quan tâm nghiên cứu Cơ sở dữ liệu của họ gen NHX ở thực vật đã được công bố trên nhiều trang web như NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Phytozome, RAPG7 Từ những năm 1990, đã có nhiều công trình nghiên cứu để làm sáng tỏ vai trò của các gen có liên quan đến tính chịu mặn [36], [16] Những năm gần đây các nghiên cứu về họ gen NHX hướng đến việc phân tích nguồn gốc phát sinh chủng loại và đánh giá mức độ biểu hiện của gen trong điều kiện stress mặn [20], [30] [15]

Họ gen NHX đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như Arabidopsis (AtNHX), cà chua (LeNHX), Lúa mỳ (TaNHX) ngô (ZmNHX) [39], [14], [3] Ở lúa Gen

OsNHX1 lần đầu tiên được tạo dòng bởi Fukuda và cộng sự vào năm 1999 đã làm sáng tỏ

cơ chế chịu mặn có liên quan đến họ gen OsNHX [12] Các phân tích sự biểu hiện của gen OsNHX1 ở nấm men cho thấy thể đột biến gen OsNHX1 nhạy cảm với nồng độ K+

cao trong tế bào Hơn nữa khi xử lý các giống lúa với nồng độ Na+, K+ cao đã làm xuất

hiện các sản phẩm phiên mã của gen OsNHX1 trong tế bào [13] Tuy nhiên ngoài gen

OsNHX1 đã được tạo dòng thì các gen khác vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Bên cạnh

đó những nghiên cứu về promoter, protein và biểu hiện của các gen khác thuộc họ gen

OsNHX vẫn chưa được quan tâm đầy đủ

Ở Việt nam, các nghiên cứu về tính lúa chịu mặn chủ yếu tập trung vào việc đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa Mặc dù đã có những nghiên cứu liên quan đến

cơ chế tính chịu mặn của cây lúa nhưng chưa có nhiều nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử [1] Hơn nữa, chưa có nhiều nghiên cứu trong nước đi sâu tìm hiểu cơ chế phân tử và vai trò của gen mã hóa cho các protein vận chuyển ion Na+ Tại trường Đại học Khoa học Tự

nhiên, TS Đỗ Thị Phúc và cộng sự và bước đầu tiến hành nghiên cứu về họ gen OsNHX ở lúa với công trình nghiên cứu về đa hình vùng mã hóa gen OsNHX2 trên một số giống lúa

ở Việt Nam Nghiên cứu in silico được xem là một công cụ hữu ích góp phần phân tích,

mô phỏng và thiết kế thí nghiệm hiệu quả trong các nghiên cứu sinh học Trong lĩnh vực

di truyền chọn giống phương pháp in silico được xử dụng để tìm kiếm cơ sở dữ liệu của

gen như trình tự gen, protein, các marker phân tử liên quan đến tính chịu mặn, chịu hạn

của gen Tuy nhiên việc sử dụng các phân tích in silico để mô phỏng và phân tích cơ sở

dữ liệu vẫn chưa được áp dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu thực vật đặc biệt là đối

với họ gen OsNHX ở lúa

1.6 Một số công cụ tin sinh được sử dụng trong nghiên cứu in silico

1.6.1 Các công cụ tìm kiếm cơ sở dữ liệu

Dữ liệu công nghệ sinh học về đối tượng nghiên cứu bao gồm dữ liê ̣u sơ cấp và thứ cấp Dữ liệu sơ cấp bao gồm tất cả các dữ liê ̣u thu được qua phân tích trực tiếp bởi các nhà khoa học Ví dụ: Trình tự nucleotide , amino acid, trình tự promoter thông tin về các hợp chất hữu cơ Dữ liệu thứ cấp gồm những dữ liê ̣u và thông tin đã được phân tích , khái quát hóa, hê ̣ thống hóa hay thông tin mô phỏng cho từng đối tư ợng, nhóm đối tượng

cụ thể Dữ liệu thứ cấp cũng có thể thu được thông qua phân tích hàng loạt các dữ liệu thực nghiê ̣m rời ra ̣c, xử lý kết quả cu ̣ thể để khái quát thành quy luâ ̣t ho ặc tích hợp chúng thành bộ cơ sở dữ liệu để tiện tra cứu

Dữ liê ̣u về trình tự nucleotide và genome c ủa họ gen OsNHX được phân tích dựa

trên các cơ sở dữ liệu như NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.htlm,

Phytozome v10 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) và

RGAP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu)

Việc tìm kiếm cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide, protein hầu hết đều dựa trên phương pháp So sánh trình tự - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Quá trình BLAST diễn ra theo hai giai đoạn đó là tìm kiếm trình tự tương đồng và đánh giá kết quả tìm kiếm bằng điểm số E- Score (Expect- Score) Giá trị E càng lớn chứng tỏ khả năng tương tự của các bắt cặp càng cao

Đối với các yếu tố điều hòa cis quá trình tìm kiếm cũng dựa trên nguyên tắc tương đồng về trình tự nucleotide của đối tượng nghiên cứu với trình tự đã được đưa vào cơ sở

dữ liệu Một số cơ sở dữ liệu về yếu tố điều hòa cis ở thực vật như PLACE PLANT, hay PLANT CARE hoạt động theo nguyên lý này Tuy nhiên đối với những trường hợp không xác định được vị trí TSS thì quá trình tìm kiếm các yếu tố cis thuộc vùng lõi promoter sẽ trở nên khó khăn hơn khi đó người ta phải sử dụng phương pháp khác để tìm kiếm vùng promoter của gen Một phương pháp được cho là khắc phục được phần nào những hạn chế của phương pháp trên đó là tìm kiếm yếu tố cis dựa vào việc phân tích năng lượng tự do được tìm thấy trong vùng promoter khi gen tiến hành hoạt động phiên

mã Phương pháp này được sử dụng để tìm kiếm vùng promoter của gen OsNHX4

(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)

Dữ liệu sẵn có về biểu hiện các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa được phân tích in

silico bằng một số công cụ online như: http://www.ricearray.org/ ,

http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE Cơ sở dữ liệu được lưu trữ dưới dạng các số hiệu

Để tìm kiếm cơ sở dữ liệu về biểu hiện của gen cần phải biết số hiệu locus của gen được

lưu trữ trên một số dababase như RGAP7 Ví dụ gen OsNHX1 có số hiệu locus là

Os07g47100 thì số hiệu trên http://www.ricearray.org/ là Os.4700.1.S1_at Từ dữ liệu sẵn

có, thiết kế các thí nghiệm theo mục tiêu tìm kiếm Cụ thể với cơ sở dữ liệu khổng lồ gồm hơn 57 nghìn mẫu dò (probe) liên quan đến sự biểu hiện các gen ở nhiều mô, cơ quan, các giai đoạn đoạn phát triển khác nhau cũng như điều kiện môi trường khác nhau chúng tôi chỉ nghiên cứu sự biểu hiện của gen trong điều kiện stress mặn và ở một số mô,

cơ quan

1.6.2 Các công cụ dự đoán cấu trúc các phân tử protein

Cấu trúc bậc hai của phân tử protein được xây dựa trên trình tự amino acid trong cấu trúc bậc một của phân tử protein Ở cấu trúc bậc hai, các amino acid được phân chia thành các nhóm tích điện âm, điện dương, các nhóm ưa nước, kị nước Cấu trúc bậc hai gồm các kiểu xoắn α, gấp nếp β, sắp xếp thành các miền protein và tương tác với nhau để thực hiện bậc cấu trúc cao hơn

Nguyên lý dự đoán dựa trên việc so sánh trình tự amino acid của protein cần dự đoán với trình tự protein được xây dựng trong mô hình gốc Xác định mức độ tương đồng

về trình tự acid amin, xác định các nhóm amino acid ưa nước, kị nước, tích điện âm hay dương để xây dựng mô hình Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai, cấu trúc các miền xuyên màng cho phép dự đoán chức năng sinh học của chúng và phân loại chúng theo nhóm chức năng Ngoài ra còn có thể sử dụng mô hình để dự đoán sự thay đổi amino acid sẽ làm ảnh hưởng như thế nào đến cấu trúc và chức năng của protein

Mô hình protein xuyên màng của các protein OsNHX được xác định bởi các cơ sở

dữ liệu http://wlab.ethz.ch/protter/# và http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl

1.6.3 Các công cụ đánh giá kết quả dự đoán cấu trúc các phân tử protein

Mô hình bậc 3 của protein được cung cấp dưới dạng file PDB Dựa trên dữ liệu input PDB, chương trình ProSA sẽ tiến hành đánh giá mô hình này bằng phương pháp tinh thể học X-quang (X-ray crystallography) hoặc phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và rút ra giá trị Z-score Người ta sử dụng giá trị Z-score của mô hình protein cần đánh giá so sánh với Z-score của mô hình mẫu để xác định xem mô hình cần đánh giá có được chấp nhận hay không?

Ngoài ra để đánh giá kết quả dự đoán cấu trúc bậc ba của phân tử protein người ta còn có thể sử dụng chương trình VADAR ver1.8 Chỉ số Ramachandran trong chương trình VADAR ver1.8 dùng để phân tích số liệu về phân bố thực nghiệm của tập hợp các điểm quan sát được trong một cấu trúc protein cụ thể Mỗi điểm (plot) là giá trị kết hợp của góc phi và psi Nếu kết quả phân tích chỉ số Ramachandran cho thấy có ít nhất 90% gốc amino acid nằm trong vùng lõi thì mô hình protein đó được đánh giá đạt yêu cầu về mặt hóa lập thể của cấu trúc đó (stereochemical quality)

Để dự đoán mô hình cấu trúc bậc 3 của họ protein NHX chúng tôi sử dụng cơ sở

dữ liệu từ PFAM và chương trình Phyre2

(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng 12 giống lúa khác nhau được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp và Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách 12 giống lúa dùng trong nghiên cứu

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

Nhóm các hóa chất sử dụng tách chiết ADN tổng số từ lá lúa : Tris-HCl, EDTA, CTAB, NaCl, Chloroform, Isoamylalcohol, Isopropanol , EtOH, TE

Nhóm hóa chất dùng cho PCR: Taq ADN polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu

Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE, loading dye, ethydium bromide

Kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction

Các hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng

có uy tín trên thế giới như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning, Thermo

Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu bao gồm:

Nghiền mẫu lá lúa bằng Máy nghiền Retsch – RETSCH – Đức

Máy PCR 9700 Applied Biosystems - Mỹ

Máy PCR Kyratec – Úc

Máy ly tâm lạnh Hettich zentrifugen– Đức

Máy soi gel Doc XR Biorad - Mỹ

Ngoài ra, còn sử dụng một số thiết bị khác như bể điện di, bể ổn nhiệt, máy vortex,

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB :

Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa bằng dung dịch đệm CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994) [31], chúng tôi đã điều chỉnh tối ưu một số bước như sau:

Ngiền khoảng 2 gam lá lúa trong nitở lỏng thành dạng bột mịn, sau đó chuyển vào ống eppendorf Cho 500 μl dung dịch đệm 2x CTAB vào ống eppendorf có chứa mẫu lá lúa đã nghiền và ủ ở 65°C trong vòng 15 phút Chờ nguội, bổ sung 500ml CI (chloroform: isoamylalcohol = 24:1) và trộn đều Ly tâm 10000v/10p ở 4°C Thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 Trộn đều sau đó để trong đá 10 phút Ly tâm 14000v/5p ở 4°C sau đó loại bỏ dịch pha trên và rửa tủa bằng 500 μl EtOH 700C, ly tâm 14000 vòng / 5 phút ở 4°C Thu tủa

và để khô tủa ở nhiệt độ phòng Cuối cùng bổ sung 50µl TE buffer để bảo quản

2.2.2 Phương pháp điện di trên gel Agarose

Mục đích của phương pháp điện di này là để kiểm tra sơ bộ chất lượng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thước sản phẩm PCR so sánh với thang DNA chuẩn Quy trình điện di gồm :

Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lò vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và không tạo bọt Để gel nguội ở khoảng 50-550C rồi đổ gel vào bể điện di có cài sẵn đá lạnh để làm đông gel, sau đó cắm lƣợc điện di Sau 15-20 phút gel đông có thể rút lƣợc ra và đổ đệm TAE1X cao hơn bề mặt gel từ 2-5mm

Tra các mẫu DNA theo thứ tự ghi sẵn vào các giếng điện đi, đậy nắp bể điện di và cắm điện cực khởi động máy điện di Tiến hành chạy điện di với dòng điện một chiều khoảng 90V trong 30 phút Sau khi kết thúc điện di tiến hành soi gel bằng máy chiếu tia

UV, quan sát và chụp hình bản gel điện di

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Thực hiện 35 chu kỳ

Biến tính ở 940C 30 giây Gắn mồi ở nhiệt độ 550C 30 giây Kéo dài mạch ở 720

C 1 phút 30 giây Chu kì kéo dài cuối cùng ở 720C 5 phút

2.2.4 Sử dụng các cơ sở dữ liệu và phần mềm tin sinh để nghiên cứu in silico gen mã

hóa cho protein NHX và phân tích kết quả nghiên cứu

Để thu thập dữ liệu về số hiệu locus, trình tự gen, mRNA và protein chúng tôi sử dụng các cơ sở dữ liệu như NCBI

Phytozome v10 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) và

RGAP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu) Sử dụng các thuật toán blast để so sánh trình

tự protein, nucleotide từ NCBI với các cơ sở dữ liều Phytozome, RGAP7 để xác định các

thành viên trong họ gen OsNHX ở lúa

Từ dữ liệu về các gen liên quan, phân tích sự tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự acid amin bằng công cụ Unipro UGEN (http://ugene.net/)

Dựa trên nguyên lý về đặc điểm trình tự của các yếu tố cis và tính bảo thủ của

chúng ở các nhóm loài thực vật chúng tôi đã tìm kiếm các yếu tố cis trong vùng promoter các gen thuộc họ OsNHX trên database :

http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/,

Đối với gen OsNHX4 do không có thông tin về trình tự TSS nên chúng tôi đã sử

dụng công cụ xác định vùng promoter dựa trên sự phân tích về năng lượng tự do được tìm thấy trong vùng promoter khi gen tiến hành hoạt động phiên mã (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)

Mô hình protein xuyên màng được xác định bởi các cơ sở dữ liệu

http://wlab.ethz.ch/protter/# và http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl

Để giải thích mô hình cấu trúc bậc 3 của họ protein NHX chúng tôi sử dụng cơ sở

dữ liệu từ PFAM và chương trình Phyre2

Chương trình VADAR ver1.8 dùng để đánh giá chất lượng mô hình 3D protein Nếu kết quả phân tích chỉ số Ramachandran cho thấy có ít nhất 90% gốc amino acid nằm trong vùng lõi thì mô hình protein đó được đánh giá đạt yêu cầu về mặt hóa lập thể của cấu trúc đó (stereochemical quality)

Dữ liệu về biểu hiện các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa được phân tích in silico

bằng một số công cụ online như: http://www.ricearray.org/ , bin/RiceGE

http://signal.salk.edu/cgi-Sử dụng công cụ so sánh trình tự promoter (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ ) để rút ra sự sai khác về trình tự promoter của các giống lúa nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsNHX

3.1.1 Dữ liệu về họ gen OsNHX

Dựa trên dẫn liệu cây phát sinh chủng loại và chức năng phân tử protein người ta

đã xác định được rằng họ gen NHX ở thực vật là một thành viên thuộc nhóm 1 (CPA1)

của siêu họ gen mã hóa protein vận chuyển ion/proton (CPA) Siêu họ gen này có mặt ở hầu hết các nhóm sinh vật từ đơn bào cho đến những sinh vật bậc cao [30]

Họ gen OsNHX được xác định dựa trên cơ sở Blast, so sánh các trình tự protein,

mRNA từ nhiều nguồn khác nhau như NCBI, rice Phytozome v10, RGAP7,

RAPdb…Phân tích kết quả chúng tôi đã xác định được họ gen OsNHX ở lúa gồm 5 gen thành viên là OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 (Bảng 3.1) Kết quả

này cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác [5], [30]

Bảng 3.1Thông tin về cơ sở dữ liệu các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa

Các gen Số hiệu locus trên

NCBI

Số hiệu locus trên RGAP7 Kích thước gen

(bp)

OsNHX1 AB021878 LOC_Os07g47100 4924

OsNHX2 AB531435 LOC_Os11g42790 4105

OsNHX3 AB531433 LOC_Os05g05590 6188

OsNHX4 NM_001187824 LOC_Os06g21360 4280

OsNHX5 AB531434 LOC_Os09g11450 10171

3.1.1.1 Vị trí phân bố các gen trên NST

Vị trí phân bố locus các gen của họ gen OsNHX được mô phỏng bằng công cụ

Chromosome Map Tool (http://viewer.shigen.info/oryzavw/maptool/MapTool.do) Theo

đóOsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4, OsNHX5 lần lượt phân bố trên các NST số 7,

11, 5, 6, và 9 (hình 3.1) Trong đó các gen OsNHX1và OsNHX4 nằm trên NST sợi (+),

các gen còn lại nằm trên sợi (-) (Nguồn http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)

Hình 3.1Sơ đồ phân bố các gen OsNHX trên NST ở lúa

3.1.1.2 Cấu trúc của các gen thuộc họ gen NHX

Sơ đồ tổ chức các gen thuộc họ gen NHX được mô phỏng dựa trên kích thước gen,

số lượng các exon/intron và thông tin về vùng 5’UTR, 3’UTR của mỗi gen được xử lý từ nhiều nguồn dữ liệu khác nhau như RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu),

Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) và PIECE database (http://wheat.pw.usda.gov/piece/index.php)

So sánh cấu trúc của 5 gen thuộc họ gen OsNHX chúng tôi ghi nhận các gen

OsNHX1 và OsNHX3 có cùng số Exon/Intron (14 exon), trong khi đó cả 2 gen OsNHX2

và OsNHX4 đều chứa 13 exon Sự khác biệt này là do exon số 5 (242bp) ở gen OsNHX2

được phân tách thành 2 exon với kích thước nhỏ hơn (47bp và 195bp) có mặt ở các gen

OsNHX1 và OsNHX3 Riêng gen OsNHX5 có cấu trúc dài nhất với 18 exon và hầu như

khác biệt với 4 gen còn lại Phân tích kích thước và vị trí mỗi exon các gen từ OsNHX1 đến OsNHX4 cho thấy chúng có nhiều điểm tương đồng khi có đến 7 exon giống nhau về kích thước và trật tự phân bố Thậm chí hai gen OsNHX1 và OsNHX3 có độ tương đồng

cao hơn khi có 12/14 exon giống nhau Sự giống nhau giữa 12 exon này chứng tỏ chúng

có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa Vùng 5’UTR của mỗi gen có cấu trúc khác nhau có thể liên quan đến mức độ biểu hiện của gen (Hình 3.2)

Hình 3.2 Cấu trúc exon/intron các gen thuộc họ gen NHX ở lúa

So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide các gen thuộc họ gen OsNHX chúng tôi cũng nhận thấy các gen OsNHX1 và OsNHX2; OsNHX2 và OsNHX3 có mức độ

tương đồng cao nhất 52%) Trong khi gen OsNHX5 có mức độ tương đồng thấp so với các gen OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX3 (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotid các gen thuộc họ OsNHX

Phân tích đặc điểm cấu trúc các gen có vai trò quan trọng trong việc xác định nguồn gốc tiến hóa của họ gen và nghiên cứu sự đáp ứng đặc hiệu của gen đối với các điều kiện stress từ ngoại cảnh

3.1.1.3 Phân tích cấu trúc của protein

a) So sánh trình tự amino acid được mã hóa bởi các gen thuộc họ gen OsNHX

Trình tự amino acid của được mã hóa bởi 5 gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa được

thu thập và xử lý từ cở sở dữ liệu RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu) và

Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) Qua phân tích

dữ liệu cho thấy, protein thuộc họ gen OsNHX có số amino acid vào khoảng từ 528 đến

549 với mức độ tương đồng về trình tự amino acid dao động từ 19,75% đến 72,61% Các

protein OsNHX1 đến OsNHX3 có độ tương đồng cao nhất (>70%), trong khi protein

OsNHX5 có độ tương đồng thấp nhất khi so sánh với 4 protein còn lại (Bảng 3.3)

Bảng 3.3 So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid các protein họ OsNHX

Độ tương đồng OsNHX5 OsNHX4 OsNHX3 OsNHX2 OsNHX1

b) Dự đoán cấu trúc xuyên màng các phân tử protein thuộc họ protein OsNHX

Cấu trúc bậc 2 của các protein OsNHX được biểu thị dưới các dạng xoắn, các miền xuyên màng, miền bên trong hay bên ngoài bào quan và những miền có chức năng quan trọng Sử dụng một số cơ sở dữ liệu dự đoán mô hình cấu trúc protein như, FFAS03, SWISS-MODEL và Phyre2 chúng tôi đã xác định rằng các protein OsNHX được giải thích dựa mô hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein PaNhaP của vi khuẩn

Pyrococcus abyssii Kết quả phân tích này cũng phù hợp với dữ liệu từ Pfam cho phép

chúng tôi khẳng định họ protein PaNhaP ở vi khuẩn và họ protein OsNHX có điểm chung

về nguồn gốc phát sinh chủng loại Xác định các miền protein xuyên màng họ protein OsNHX bằng công cụ mô phỏng cấu trúc protein tại http://wlab.ethz.ch/protter/# và

http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl Kết quả mô phỏng cho biết protein OsNHX1, OsNHX3và OsNHX2 (Hình 3.3a, 3b và 3.3c) đều có 12 miền xuyên màng Mặc dù Protein OsNHX4 và OsNHX5 đều có 11 miền xuyên màng tuy nhiên chúng lại khác biệt nhau rõ rệt về mặt cấu trúc (3.3d và 3.3e) Trong 5 phân tử protein chỉ có protein OsNHX5 là có tín hiệu peptid ở đầu N (Hình 3.3e) Kiểu dạng hình học các protein OsNHX1 và OsNHX3 cho thấy sự giống nhau rõ rệt về sự sắp xếp trật tự các miền xuyên màng, trong màng, ngoài màng và cả vị trí xảy ra sự N-glyco hóa

Hình 3.3a Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX1

Hình 3.3b Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX2

Hình 3.3c Mô hình cấu các miền protein xuyên màng OsNHX3

Hình 3.3d Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX4

Hình 3.3e Mô hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX5

Hình 3.3a đến 3.3c (OsNHX1 đến OsNHX3) cho thấy chúng đều có 12 miền xuyên màng chứng tỏ chúng được xếp cùng nhóm chức năng đó là trao đổi Na+

/H+ ở màng không bào Mặc dù protein OsNHX4 có 11 miền protein nhưng những miền quan trọng như miền 3, 6, 7 đều giống với các miền 3,6,7 của các protein OsNHX1, OsNHX2

và OsNHX3 Do đó các protein OsNHX1 đến OsNHX 4 đều thực hiện chức năng ở màng không bào Riêng OsNHX5 (hình 3.3e) có tín hiệu peptid ở đầu N và có các miền 3,6,7 khác với 4 protein còn lại Do đó OsNHX5 trao đổi Na+/H+ ở màng hệ Gônghi

Khả năng hoạt động của các antiporter NHX nói chung được kiểm soát bởi một vị trí bám đặc hiệu bởi phân tử amiloride tại miền TM3 của hầu hết các protein tương đồng

họ NHX Vị trí này có trình tự đặc trưng là LFFIYLLPPI, có tính bảo thủ cao và ảnh hưởng đến khả năng kìm hãm hoạt động các antiporter [24], [38]

Mức độ tương đồng về trình tự amino acid và kiểu dạng hình học cấu trúc protein cũng thể hiện sự khác biệt giữa các miền Đầu N có sự tương đồng cao hơn trong khi đầu

C có sự tương đồng thấp hơn đặc biệt là các vị trí sau miền TM12 trở đi

c) Dự đoán cấu trúc bậc 3 các phân tử protein thuộc họ gen OsNHX

Để xác định mô hình cấu trúc bậc 3 họ protein NHX chúng tôi tiến hành alignment trình tự acid amin của các protein từ OsNHX1 đến OsNHX5 với các cơ sở dữ liệu FFAS03, SWISS-MODEL và PFAM Phân tích mô hình protein từ Phyre2 kết hợp với so sánh với các cơ sở dữ liệu trên, chúng tôi đã định xác rằng mô hình cấu trúc bậc 3 protein OsNHX được giải thích dựa mô hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein

PaNhaP của vi khuẩn Pyrococcus abyssii Kết quả phân tích cho thấy mô hình 3D protein

từ OsNHX1 đến OsNHX5 có mức độ tương đồng với mô hình gốc (c4cz8A) lần lượt là: 23%, 22%, 23%, 19% và 21% (các hình 3.4a, 3.4b, 3.4c, 3.4d và 3.4e)

Hình 3.4a Mô hình 3D protein OsNHX1 Hình 3.4b Mô hình 3D protein OsNHX2

Hình 3.4c Mô hình 3D protein OsNHX3 Hình 3.4d Mô hình 3D protein OsNHX4

Hình 3.4e Mô hình 3D protein OsNHX5

d) Đánh giá mô hình cấu trúc 3D của các protein thuộc họ protein OsNHX ở lúa

Mô hình 3D các phân tử protein thuộc họ OsNHX được phân tích định lượng bằng các chương trình như ProSA-web và VADAR ver1.8 Đánh giá cơ sở dữ liệu các protein OsNHX bằng cách tính toán chỉ số Z-score của mỗi mô hình protein 3D OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 so sánh với mô hình mẫu (Phụ lục 1)

Kết quả đánh giá định lượng cơ sở dữ liệu bằng ProSA cho thấy protein OsNHX1 có giá trị Z-score là -3.7 gần với giá trị của mô hình mẫu c4cz8A (Z-score là -4.68) Các protein