Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng (THT) lợn và E.coli được chiết tách từ lòng đỏ trứng gà bằng công nghệ mới

LH các hội KHKT VIệt nam Bộ Khoa hỌC & CÔNG NGHỆHội KHKT THú y VIệt NAm Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng lợn và E.coli đ−ợc chiết tách từ lòng đỏ t

LH các hội KHKT VIệt nam Bộ Khoa hỌC & CÔNG NGHỆ

Hội KHKT THú y VIệt NAm

Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử

nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng lợn và E.coli đ−ợc chiết tách từ lòng đỏ

trứng gà bằng công nghệ cao

CHủ trì đề tài: GS.TSKH Phan Thanh Ph−ợng

Tình hình nghiên cứu trong nước

về bệnh THT

„ Bệnh THT lợn được phát hiện thế kỷ 19.Nhiều tác giảnhư: Nguyễn Viết Lãm ; Phan Thanh Phượng ;

Hoàng Đạo Phấn đã dày công nghiên cứu

„ Song cho đến nay dịch bệnh THT vẫn còn xảy ra

nghiêm trọng

„ Việt Nam có khoảng gần 20 triệu lợn,

„ Số lợn bị bệnh THT khoảng 0,5%;

„ Số chết do bệnh THT khoảng 0,2%

„ Con bÖnh ®−îc ®iÒu trÞ b»ng ho¸ d−îc,

hiÖu qu¶ phßng trÞ ch−a cao.

„ Th−êng g©y nhên thuèc rÊt khã ch÷a trÞ

vÒ bÖnh E coli

„ NhiÒu t¸c gi¶ nh− : NguyÔn thÞ Néi,1986; Lª v¨n T¹o vµ CS.; NguyÔn kh¶ Ngù,1999 ; TrÇn thÞ H¹nh ,2000 ;Lý Liªn Khai ,2001; §Æng

T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

về kháng thể phòng trị bệnh

„ ở Liên Xô ,từ những năm 50 của thế

kỷ trước đã dùng kháng huyết

thanh để điều trị các bệnh truyền

nhiễm cho gia súc ,gia cầm

„ Với điều kiện các chủng sử dụng

để chế kháng huyết thanh phải

tương ứng với các Serotyp gây các bệnh gia súc gia cầm.

T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

„ Phòng các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm

do virut, vi trùng gây ra đạt hiệu quả cao.

„ IgY của gà −u việt hơn hẳn IgG của động vật có vú

CÊU TRóC

Hình 1 Cấu trúc kháng thể IgY Chú thích:

limited flexibility: vùng biến đổi có giới hạn

A hinge: khớp nối

I Cấu trúc và đặc điểm IgY của chim (bird)

II IgG của loài có vú (mammal).

Từ năm 1969, Leslie và Clem đã nghiên cứu

sự khác nhau giữa IgG từ lòng đỏ trứng

và IgG của loài có vú nên đề xuất thuật ngữ IgY cho loài chim.

−u viÖt khi s¶n xuÊt IgY qua trøng gµ

„ 1 Chỉ cÇn thu nhặt trứng không cần lấy máu hoặc giết con vật được gây tối miễn dịch.

„ 2 Trong huyết thanh loài có vú có nhiều hormone và vật thể prion gây bệnh lý tổ chức cho vật nuôi

−u việt khi sản xuất IgY qua trứng gà

„ 3 Gà đúng vai trũ động vật thớ

nghiệm

„ 4 Là nhà mỏy sản xuất khỏng thể,

rẻ hơn so với động vật cú vỳ.

„ 5 Việc gõy tối miễn dịch cho gà dễ

thao tác hơn nhiều so với động vật có vú

−u viÖt khi s¶n xuÊt IgY qua trøng gµ

6 Khai thác kháng thể trong thời gian dài hơn

7 IgY ch÷a bÖnh ®−êng ruét hiệu qủa cao , c¶ cho người

- Hơn hẳn các kháng sinh truyền thống

- Vì kháng sinh dễ bị nhờn thuốc, còn kháng thểthì không

8 Sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng thu hoạch được một lù¬ng kháng thể cao hơn nhiều so víi p.ph¸p truyÒn thèng với gÝa thành hạ (bảng 1) (Moca

Narat, Cộng hòa Sec, 2003).

toàn phần thu được

Lượng mẫu thu

14 trứng X 15 ml =

210 ml lòng đỏ trứng

thu trứng hàng ngày

1

Gà

−u viÖt khi s¶n xuÊt IgY qua trøng gµ

# Nếu dùng IgG lµm ph¶n øng miÔn

dÞch cã thÓ cho K.Q dương tính giả

#Nếu dùng IgY sẽ kh«ng cho kết qủa dương tính giả, ưu việt hơn

−u viÖt khi s¶n xuÊt IgY qua trøng gµ

- Do sự khác nhau trong cấu trúc của

kháng thể IgY so với IgG

- IgY có nhiều ưu việt để ứng dụng trong

chẩn đoán, nghiên cứu, công nghệ sinh

học

- Không những cho y tế mà cả trong thú y

- Kháng thể thu từ lòng đỏ trứng gà có thể kháng lại hàng loạt kháng nguyên

Tính cấp thiết của đề tài

Tính cấp thiết của đề tài

„ Xu thế hiện đại cần thay thế các hoá dược bằng các chế phẩm sinh học để tránh sự nhờn thuốc, tránh tồn dư khángs sinh & hoá dược.

„ Nhằm bảo vệ sức khoẻ cho người tiêu dùng và cho xuất khẩu.

„ Việc chế và sử dụng kháng thể trong chăn thú

y là cấp thiết và thiết thực.

„ øng dông kh¸ng thÓ phßng trÞ bÖnh cho lîn t¹i

Mục tiêu của đề tài

„ Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng ( THT ) và bệnh do E.Coli nhằm khống chế 2 bệnh này

„ Tiếp thu công nghệ tách chiết IgY với quy trình sản xuất lớn, với giá thành sản phẩm thấp hơn trước, đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi lợn

Phương pháp nghiên cứu

„ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của gà đẻ trứng giống ISA với kháng nguyên tụ huyết trùng (THT) # tạo miễn dịch cơ sở

# gây tối miễn dịch.

- Xác định hiệu giá kháng thể kháng tụ huyếttrùng bằng phương pháp IHA - sau khi gây miễn dịch cơ sở

- Xác định hiệu giá kháng thể kháng tụ huyếttrùng bằng phương pháp IHA - sau khi gây tốimiễn dịch

Gây tối miễn dịch bằng các chủng E.Coli gây bệnh

được phân lập tại các cơ sở chăn nuôi

„ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch gà đẻ trứng

bằng # kháng nguyên E.Coli vô hoạt: K88 , K99

và 987P ( gây miễn dịch cơ sở ).

# tăng cường bằng các chủng E.Coli cường độc nói trên (gây tối miễn dịch).

# Xác định hiệu giá kháng thể kháng K88 ; K99 ; 987 bằng phương pháp ngưng kết nhanh trênphiến kính hoặc IHA

Nội dung nghiên cứu

„ Xác định hiệu giá kháng thể ở gà mẹ và lòng đỏ

trứng ở gà đ−ợc tối miễn dịch,

„ Chọn thời điểm thu trứng miễn dịch để nghiên cứu

„ Chiết tách IgY từ lòng đỏ trứng gà đ−ợc tối miễn

dịch bằng công nghệ cao trong phòng T.Nghiệm

„ Xác định kháng thể thụ động tồn tại trong

cơ thể động vật thử nghiệm: 5 ngày, 10 ngày & 15 ngày

„ Xác định chế độ bảo quản chế phẩm ở

nhiệt độ 40c – 80c.

„ ỉng dụng kháng thể trong thực địc

KÕt qu¶ nghiªn cøu

Tình hình dịch tễ bÖnh THT qua hai năm

2005 và 2006

- Tần số m¾c bÖnh cao nhất tại Hà Tây

- Hà Nội có tỷ lệ mắc bệnh và chết rất thấp, khi khảo sát 3 tỉnh: Hà Nội, Hà Tây và Vĩnh

Phúc

- Số tháng mắc bệnh nhiều nhất là các tháng

7, 8, 9, 10 và 11

- Số tháng mắc bệnh ít nhất là các tháng 3, 4, 5,6 và 12

5 65 70

Số huyện

100

0 20.75 79.24

100

3.6 46.4 50.0

%

2127

106 222 1799

1440

13 445 982

100

4.98 10.43 84.5

100

1.0 30.9

68.19

%

16739

110 2357 14272

17480

122 5057 12301

100

0.71 14.08 85.26

100

0.69 28.93

70.37

%

1779

12 153 1614

2933

6 1374 1553

100

0.67 8.6 90.72

100

0.2 46.85 52.949

%

Kết quả nghiên cứu

chiết tách I g Y

„ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cùng một lúc 2 loại kháng nguyên THT và E.Coli trên đàn gà đẻ trứng giống ISA

+ Đã gây miễn dịch cho gà bằng các kháng nguyên vôhoạt chủng FgHC và các chủng E.Coli K88; K99 ; 987P ( miễn dịch cơ sở )

+ Qua 21 ngày sau khi chủng xác định hiệu gía kháng thể ( HGKT ) ở gà mẹ và trong lòng đỏ trứng miễn dịch

CHẤT LƯỢNG CÁC CHỦNG TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ E.COLI DÙNG ĐỂ CHẾ KHÁNG THỂ CHO LỢN

„ Chủng THT lợn: Trong đề tài này chúng tôi sử dụng chủng FgHC Đây là chủng

Quốc gia ,nên chất lượng bảo đảm ,không cần các khảo sát đặc biệt.

„ Các chủng E.Coli :

„ Các chủng E.Coli tự phân lập, lµmph¶n øng

víi kh¸ng huyÕt thanh chuÈn để chọn chủng nghiên cứu.

CHẤT LƯỢNG CÁC CHỦNG TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ E.COLI DÙNG ĐỂ CHẾ KHÁNG THỂ CHO LỢN

„ Khảo sát tính sinh miễn dịch của các chủng E.Coli:

987P nuôi cấy trên thạch BHI.Sau 24 giờ nuôi cấy,tiến hành kiểm tra thuần khiết, nếu đạt yêu cầu, tiến hành thu hoạch ngay

„ Kiểm tra đậm độ CFU trong canh trùng 1ml

sinh phẩm chứa 4,5 – 5,0 triệu CFU.Sinh phẩm

được vô hoạt bằng 0,5% formol và bổ sung 20% keo phèn

Quy trình chế tạo kháng thể

dạng bột

Bước 1: CHUẩN Bị

„ Chuẩn bị kháng nguyên của các chủng E.Coli ( mang các yếu

tố F4, F5, F6 ) & THT ( FgHc ) có tính kháng nguyên và miễndịch cao , nuôi cấy riêng rẽ từng chủng một Dùng canh trùng

ngưng kết hồng cầu gián tiếp ) là việc tạo miễn dịch cơ sở đãxong

Bước 5 : Chế kháng thể dạng bột mịn:

-Dùng dung môi thích hợp để tách bỏ dầu trong lòng đỏ trứng

- Phối chế với tá dược cần thiết Tiến hành phun sấy khô Ta thu được dạng bột mịn

- Tiến hành xác định HGKT để kiểm tra chất lượng sảnphẩm

Quy trình chế tạo kháng thể

dạng đông khô

„ Bước 6 : Chế kháng thể dạng đông khô:

- Dùng dung môi thích hợp và ly tâm để tách bỏ dầu trong lòng đỏ trứng

- Dùng dung môi thích hợp để tách IgY ra khỏi huyễn dịch lòng đỏ trứng

- Dùng ly tâm loại bỏ dung môi và thu

cặn

Lấy cặn pha với PBS vô trùng.

- - Định liều l−ợng rồi tiến hành đông khô.

- Xác định HGKT thành phẩm.

- Nhập kho.

„ Trị bệnh :

+ Dùng ngay khi lợn bị bệnh, liều dùng

10g/con/ngày , KT được pha với nước ấm đã

đun sôi , sử dụng liên tục 3 - 5 ngày

+ Nếu bệnh nặng có thể cho uống với liều gấp

đôi, chia 2 lần/ngày, liên tục 3 - 5 ngày.

Kh¶o s¸t hiÖu qu¶ phßng trÞ bÖnh

E.Coli b»ng KT d¹ng bét TrÞ bÖnh b»ng kh¸ng thÓ so víi trÞ bÖnh

Kh¶o s¸t hiÖu qu¶ phßng trÞ bÖnh tô huyÕt trïng b»ng kh¸ng

thÓ nhÞ liªn E.Coli & THT lîn d¹ng bét mÞn

70,0 03

07 DiÒu trÞ b»ng

kh¸ng sinh

10 115

100,0 0

11 Cho uèng KT víi

liÒu ®iÒu trÞ

11 120

91,67 01

11 Cho uèng KT víi

liÒu ®iÒu trÞ

12 115

Tû lÖ sèng (% )

Lîn chÕt

Lîn khái bÖnh

Néi dung thö nghiÖm

Sè lîn Ngµy tuæi

Kh¶o s¸t hiÖu qu¶ phßng trÞ bÖnh

Ngµy tuæi

12 12 35 36

Sè lîn

Đ iÒu trÞ b»ng kh¸ng sinh

80,0 100,0 100,0 100,0

Tû lÖ khái bÖnh sau 3 ngµy ®iÒu trÞ ( % )

Kh¶o s¸t hiÖu qu¶

trÞ bÖnh THT b»ng kh¸ng thÓ d¹ng bét so víi kh¸ng sinh

• Đàn khác dùng kháng sinh khống chế ngay

* Hoà vào nước uống 10g O.X.T-1000/30kg thể trọng /ngày, dùng liền 3 ngày; không khỏi; phải đổi thuốc khác.

* Hoà vào 10 lít nước uống 5g

Ampi-Anticoli cho uống liên tục 5 ngày,số lợn còn

lại khỏi bệnh, ăn uống bình thường

Kết quả phòng trị bệnh THT bằng KT nhị liên E.Coli & THT lợn dạng đông khô

80,0 02

08 Diều trị bằng

kháng sinh

10 117

100,0 0

11 Tiêm KT với liều

điều trị

12 112

100,0 0

11 Tiêm KT với liều

điều trị

10 120

Tỷ lệ sống (% )

Lợn chết

Lợn khỏi bệnh

Nội dung thử nghiệm

Số lợn Ngày

tuổi

So sánh phòng trị bệnh THT bằng KT nhị liên dạng đông khô với kháng sinh

( 1 lọ đông khô nhỏ pha với 1ml nước cất vô trùng )

+ Tiêm 2 lần ngày liều 1ml /lợn đã khỏi bệnh ngay

+ Tỷ lệ sống đạt 100%

+ KT đông khô hiệu quả cao và nhanh

trọng, tiêm bắp

+ Sau 2 ngày điều trị đã chết 2 con

+ Ngày thứ 5 thì cả đàn khoẻ mạnh

+.Tỷ lệ sống đạt 80%

Khuyến cáo phòng trị bệnh E Coli

+Lợn từ 10 ngày tuổi trở lên cho uống :1 tháng

dùng 2 đợt, mỗi đợt 5 ngày ,cách nhau 10

ngày với liều 5g/con ngày ; dùng liên tục suốt quá trình nuôi.

Khuyến cáo phòng trị bệnh THT

bằng kháng thể nhị giá

- Chỉ sử dụng cho lợn 90 ngày tuổi trở lên

- Vì bệnh THT gây chết đột ngột, tiêm ngay kháng thể

đặc hiệu dạng đông khô để khống chế bệnh

- Đạt đ−ợc nhiều −u việt hơn điều trị bằng kháng sinh.

Đào tạo sinh viên tốt nghiệp

1- SV Đỗ Đức Nhân đã tốt nghiệp với đề tài:

„ Biến động hiệu giá kháng thể và so sánh hiệu quả bảo vệ lợn sơ sinh dến 21 ngày tuổi sau khi dùng kháng thể E.Coli & tụ huyết trùng

so với kháng sinh.

2- SV.Chu Đình Mậu đã tốt nghiệp với đề tài:

„ Nghiên cứu biến động hàm l−ợng kháng thể ở lợn con sau cai sữa đ−ợc tiêm sinh phẩm

88 - 99

KẾT LUẬN CHUNG A-T×nh h×nh dÞch tÔ THT & E.Coli

1-Tỷ lệ lợn mắc bệnh THT và bệnh tiêu

chảy tại các cơ sở chăn nuôi :

Đối với bệnh THT lợn:

„ Qua khảo sát hai năm 2005 & 2006 cho

thấy : Tại Hà nội hầu như các cơ sở chăn

nuôi lợn không bị bệnh THT.Tại Vĩnh phú

Sù cÊp thiÕt ph¶i chÕ kh¸ng thÓ

Đối với bệnh do E.Coli :

„ Hầu như cơ sở chăn nuôi nào lợn cũng bị phân trắng và bệnh tiêu chảy Thường

thường tỷ lệ mắc bệnh là 30 – 40 % Có nơi 80 -90% bị bệnh và tỷ lệ chết phải

đến 30 -50%.Đặc biệt vì chưa có vacxin

phòng bệnh ,nên tỷ lệ bị bệnh khá cao.Do

đó , việc chế kháng thể để khống chế là cÊp thiết.

„ Vì vậy Ban chủ nhiệm đề tài quyết định ký Hợp đồng với Công ty cổ phần Công nghệ sinh học thú y để thêm nguồn kinh phí đủ chế kháng thể nhị liên THT & E Coli.

2. Trong huyết thanh loài có vú có nhiều

hormone và vật thể prion gây bệnh lý tổ chức cho vật nuôi

3. Gà đóng vai trò động vật thí nghiệm hoặc nói cách khác, nó là nhà máy sản xuất kháng thể, rẻ hơn so với động vật có vú.

kháng thể đặc hiệu bằng ngần ấy loại kháng nguyên.

6. Khai thác kháng thể trong thời

gian dài hơn.

KẾT LUẬN CHUNG

7. Đặc biệt chữa các bệnh đường ruột không

những cho thú y mà cho người đem lại hiệu qủacao, hơn hẳn các kháng sinh truyền thống Vì

kháng sinh dễ bị nhờn thuốc, còn kháng thể thìkhông, do có tính đặc hiệu cao

8. So sánh với việc sản xuất kháng thể đa dòng ở

động vật có vú thì sản xuất kháng thể từ lòng

đỏ trứng thu hoạch được một lượng kháng thểcao hơn nhiều với giá thành hạ (bảng 2) (MocaNarat, Cộng hòa Sec, 2003)

Lợn từ sơ sinh đến 10 ngày tuổi đó dùng KT liên tục 10

ngày đầu , đó phũng được bệnh phõn trắng

Lợn trên 10 ngày tuổi có thể sử dụng phác đồ sau:

Phũng bệnh : Một tháng dùng hai đợt mỗi đợt 5 ngày, cách

nhau 10 ngày với liều 5g/con/ngày

Li ều điều trị : 10g / ngày / con dùng liên tục 3 – 5 ngày Khi bệnh nặng tăng liều gấp đôi.

Hiệu quả phũng trị bệnh Với bệnh THT :

- Chỉ sử dụng cho lợn 90 ngày tuổi trở lên

- Vì bệnh THT gây chết đột ngột, dùng ngay

kháng thể đặc hiệu để khống chế bệnh

- Đ ạt đ−ợc nhiều −u việt hơn điều trị bằng kháng sinh.

Hiệu quả phũng trị bệnh

- Thời gian điều trị nhanh hơn : 1-3 ngày.

- Không phải đổi thuốc, mất thời gian

khống chế bệnh, tránh đ−ợc nhờn thuốc

- Tỷ khỏi bệnh đạt 91,67% - 100%

§µn gµ thÝ nghiÖm g©y tèi miÔn

Đo nhiệt độ cho gà thí nghiệm

Chän trøng chiÕt t¸ch kh¸ng thÓ

Röa dông

cô hÊp sÊy

v« trïng

Chế kháng kháng thể E.Coli &

THT dạng bột mịn đóng túi

Ly t©m siªu tèc chiÕt t¸ch kh¸ng thÓ

MỘT SỐ HÌNH ẢNH LỢN

Kháng thể dạng bột pha

với nước ấm đã đun sôi chuẩn bị

cho lợn uống

Lợn con sơ sinh & dưới 10 ngày tuổi bắt cho uống kháng thể mới đủ liều

Kháng thể dạng đông khô pha với

nước cất để tiêm

Lợn sơ sinh 1 ngày tuổi để phòng bệnh phân trắng cho uống kháng thể dạng bột

được pha với nước ấm đã đun sôi

Lợn sơ sinh 1 ngày tuổi để phòng bệnh phân trắng cho uống kháng thể dạng bột

được pha với nước ấm đã đun sôi

Đàn lợn bị tiêu chảy 70% số con,

lợn gầy gò, chậm lớn

Đây là những lợn bị tiêu chảy nặng, lượng kháng thể bột dùng để pha cho uống với liều phải gấp 2, gấp 3 lợn bị tiêu chảy nhẹ

Kháng thể dạng bột được pha với nước

ấm đã đun sôi thành huyễn dịch trắng đục,

thơm như sữa lợn rất thích uống.

Đàn lợn được uống Kháng thể,khỏi tiêu chảy, hay ăn chóng

lớn, hồng da

mượt lông