NGHIÊN cứu HOÀN THIỆN bộ KIT PCR 16 GEN gắn HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN cứu dân tộc học và GIÁM ĐỊNH GEN

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR trong nhận dạng cá thể người cũng đã được phát triển mạnh mẽ từ những năm 2000 đến nay với những nghiên cứu về tối ưu điều kiệ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

2

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:

MỞ ĐẦU

Ở mức độ di truyền, người ta đã ước tính được khoảng 99,7% hệ gen người là giống nhau, sự khác biệt giữa hai cá thể được tìm thấy trong 0,3% của toàn bộ ADN còn lại trong cơ thể của mỗi người [38] Hệ gen người có rất nhiều các trình tự ADN lặp lại, trong đó có các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) hay còn được gọi là trình tự lặp lại đơn giản (SSR) hoặc vi

vệ tinh (microsatellite) Các STR này thường có kích thước ngắn khoảng từ 100-400 bp, mang các đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp thường có 2-7 bp và được tìm thấy ở vùng ADN không mã hóa Chúng nằm rải rác trên tất cả 22 cặp NST thường, cũng như trên cặp NST giới tính X và

Y Các STR trên NST thường có tính đa hình cao hơn so với các STR trên NST Y (Y-STR) do thiếu sự tái tổ hợp trên NST này Chúng có một vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) [67]

Vào những năm 1990, các locus STR đầu tiên được sử dụng trong các PTN phân tích ADN nhận dạng cá thể người Ngày nay, kỹ thuật phân tích STR là một công cụ không thể thiếu được trong các PTN phân tích ADN hình sự [50, 66, 123] Hiện nay, có khoảng hơn 20.000 locus STR lặp bốn nucleotide (có 4bp trong mỗi đơn vị lặp lại) được xác định có trong

hệ gen người [44] và bộ CODIS 13 locus STR lõi do FBI (Mỹ) lựa chọn là bộ locus STR trên NST thường được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [67]

Mặt khác, công nghệ phân tích STR trên thế giới phát triển cũng rất đa dạng, bao gồm: Điện di gel polyacrlamide biến tính-nhuộm bạc [27, 99]; đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản [35, 85]; điện di mao quản vi mạch sử dụng microchip [74, 76, 101]; phân tích bằng khối phổ (mass spectrometry) [38, 39] và công nghệ pyrosequencing (giải trình tự bằng tổng hợp) [53, 56, 100] Tuy nhiên, kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản là công nghệ đã được nghiên cứu hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong các PTN phân tích ADN hình sự trên thế giới với những ưu điểm: độ nhạy và chính xác cao; thời gian phân tích mẫu nhanh (được tính bằng phút); việc phân tích mẫu được thực hiện một cách tự động và có thể phân tích với quy mô số lượng mẫu lớn (xây dựng tàng thư ADN) [35]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR trong nhận dạng cá thể người cũng đã được phát triển mạnh mẽ từ những năm 2000 đến nay với những nghiên cứu về tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho các locus STR (từ 2- 4 locus), xây dựng thang alen cho các locus STR (2-3 locus), chế tạo các bộ kit PCR (3-4 locus STR) và sử dụng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc để phát hiện các alen STR [1-3, 7, 9-12] Bên cạnh đó, việc nghiên cứu khảo sát tần suất alen của các locus STR cũng được thực hiện trên dân tộc người Mường (N=107, với ba locus D5S818-D13S317-D7S820) [5] và người Kinh [8, 13] Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu thăm dò ban đầu, các dữ liệu tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người chưa phản ánh đầy đủ cho các quần thể nghiên cứu Mặt khác, công nghệ phân tách và phát hiện các alen STR được sử dụng trong các nghiên cứu này chủ yếu là dùng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc

hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết

 Mục tiêu nghiên cứu

1 Chế tạo bộ kit PCR 16 locus (gen) gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản

2 Ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định ADN

 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Nhóm đối tượng nghiên cứu chính là các cá thể người thuộc ba dân tộc của Việt Nam là: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng

 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản

2 Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở

ba dân tộc người Việt Nam (người Kinh, người Mường và người Khmer)

3 Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1 Bổ sung dữ liệu tần suất alen 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) của người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng vào CSDL STR của người Việt Nam phục vụ cho công tác nghiên cứu di truyền quần thể và giám định ADN tại Việt Nam

2 Tạo ra được các bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản, giúp cho chủ động về công nghệ, đáp ứng các nhu cầu về phân tích ADN nhận dạng cá thể người, xác định huyết thống, làm thẻ ADN cá nhân, xây dựng CSDL tàng thư ADN, nghiên cứu di truyền quần thể ở Việt Nam

 Điểm mới của luận án

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về việc tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang và chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản Bộ kit mới này, đã được ứng dụng thành công ở hai lĩnh vực nghiên cứu chính Đó là:

1 Nghiên cứu di truyền quần thể ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh, thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình, thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng, thu được 145 alen/15 locus Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15 locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu trước

đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103] Kết quả nghiên cứu cũng đã xây dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS 13 locus STR lõi (do FBI-Mỹ lựa chọn) của 3 quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo Cây phả hệ này, đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với

14 quần thể khác nhau trên thế giới Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và người Mường có quan hệ gần gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST)

2 Phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy nguyên cá thể người từ các dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án (dấu vết máu và tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%; đã xây dựng được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân của 10 đối tượng cần kiểm soát an ninh (KSAN) và đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các locus STR sử dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình

sự

Ngày nay, người ta đã phát hiện ra trong hệ gen người có chứa rất nhiều trình tự ADN lặp lại Những trình tự lặp lại này thường nằm giữa các gen, chúng có thể khác nhau về kích thước

ở các cá thể khác nhau mà không ảnh hưởng đến sức khỏe di truyền của cá thể đó [38]

Các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) cũng được tìm thấy trong hệ gen người Các STR này đã trở thành các marker di truyền được sử dụng phổ biến hơn trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình sự vì chúng dễ dàng được nhân bội để phân tích bằng kỹ thuật PCR đa mồi [38]

Các tiêu chí để lựa chọn các locus STR sử dụng trong phân tích ADN hình sự bao gồm [62, 45]:

- Tính dị hợp tử được cao (≥ 70 %);

- Có vị trí riêng biệt trên các NST khác nhau;

- Có khả năng kết hợp với các locus khác để tạo thành các bộ phức nhiều locus

(multiplex);

- Có tỷ lệ stutter thấp (<15%);

- Tỷ lệ đột biến thấp;

- Kích thước của các alen nằm trong khoảng từ 100 bp đến 400 bp

Vào năm 1997, FBI (Mỹ) đã đồng ý lựa chọn bộ CODIS 13 locus STR lõi (CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,

D18S51 và D21S11) làm cơ sở cho việc xây dựng tàng thư ADN quốc gia của Mỹ và phục vụ

cho công tác điều tra phá án trong tương lai [32] Bộ CODIS này cho khả năng trùng lặp là

1.2 Công nghệ phân tích STR sử dụng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản

Đánh dấu huỳnh quang vào các đoạn ADN có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất được sử dụng đánh dấu các alen STR là sử dụng các thuốc nhuộm huỳnh quang để đánh dấu ở đầu 5' của một mồi PCR (mồi xuôi hoặc mồi ngược) Quá trình đánh dấu này, được thực hiện ngay từ khi đặt tổng hợp mồi Sau đó, sử dụng các mồi này để PCR nhân bội các locus STR tương ứng sẽ tạo các sản phẩm PCR được đánh dấu [85] Các sản phẩm PCR này, được điện di phân tách trên hệ thống điện di mao quản Hai sợi ADN được phân tách ra trong quá trình điện di và chỉ sợi ADN được đánh dấu sẽ được phát hiện bằng thiết bị phát hiện huỳnh quang chuyên dụng [35] (xem Hình 1.7)

1.3 Luận giải các vấn đề nghiên cứu của luận án

Qua các bằng chứng và cơ sở khoa học đã được phân tích ở trên cho thấy, các locus STR trên NST thường ở người có một vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình sự (giám định ADN) trên thế giới Bên cạnh đó, ở thời điểm hiện nay, công nghệ phân tích STR bằng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản đã được

Phân tách các màu Huỳnh

quang

ABI Prism spectrograph

Phân tách theo

kích thước

Phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID

2 Lấy mẫu vào mao quản

3 Phân tách mẫu

4 Phát hiện mẫu

5 Phân tích kết quả

1 Chuẩn bị mẫu

Mao quản

(chứa dung dịch polymer)

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen STR với hệ

thống máy điện di mao quản của hãng Applied Biosystems [35]

nghiên cứu hoàn thiện, được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng phân tích ADN hình sự trên thế giới và có nhiều ưu việt hơn so với các công nghệ phân tích khác

Chính vì vậy, trong luận án này đã lựa chọn 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin xác định giới tính để nghiên cứu Công nghệ được sử dụng trong luận án để phân tách và phát hiện các alen STR này là đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster

City, CA) đang được sử dụng phổ biến ở các PTN phân tích ADN tại Việt Nam

Trong luận án này, vấn đề nghiên cứu thứ nhất được đặt ra: Nghiên cứu chế tạo bộ kit

PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thông điện di mao quản Để giải quyết được vấn đề

nghiên cứu thứ nhất này, các nội dung công việc đã được thực hiện, bao gồm: Tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang; Xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu

và Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản

Sau khi vấn đề nghiên cứu thứ nhất được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ hai của luận án được đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di

truyền quần thể ở ba dân tộc người Việt Nam Ba dân tộc được lựa chọn trong nghiên cứu này

là người Kinh sống ở khu vực Hà Nội (6.370.244 người) [126] và thành phố Hồ Chí Minh (6.699.124 người) [126]; người Mường sống ở tỉnh Hòa Bình (501.956 người) [126] và người

Khmer sống ở tỉnh Sóc Trăng (397.014 người) [126] Lý do để lựa chọn ba dân tộc nghiên cứu là: (1) Xuất phát từ nhiệm vụ của đơn vị; (2) Ba dân tộc nghiên cứu đều là các dân tộc

chính và có dân số lớn ở Việt Nam (người Kinh có dân số 73.594.427 người, người Mường có dân số 1.268.963 người và người Khmer có dân số 1.260.640 người [126]); (3) Hiện nay, dựa trên ngôn ngữ sử dụng, 54 dân tộc anh em đang sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam được chia thành 8 nhóm dân tộc chính, trong đó người Kinh và người Mường đều thuộc nhóm Việt-Mường (Vietic) còn người Khmer thuộc nhóm Môn-Khmer (Austroasiatic) [127, 128] Điều này cũng cần phải được kiểm chứng dựa trên các bằng chứng khoa học khác

Các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết vấn đề nghiên cứu thứ hai này, bao gồm: Khảo sát tần suất alen cho 15 locus STR nghiên cứu trong ba quần thể người Kinh, người Mường và người Khmer bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang và So sánh mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với một số quần thể tham khảo khác nhau trên thế giới bằng cây phả hệ di truyền

Sau khi vấn đề thứ hai được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ ba còn lại của luận án

được đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận cá

thể người (giám định ADN) tại Việt Nam Để giải quyết được vấn đề thứ ba còn lại này, các nội

dung nghiên cứu đã được thực hiện như sau: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong một số vụ án; Phân tích một số loại dấu vết ADN thu được từ một số đối tượng cần KSAN và Làm thẻ ADN cá nhân phục vụ công tác an ninh và dân sinh

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Nguồn mẫu sử dụng cho nghiên cứu

8

 Nguồn mẫu dùng cho tối ưu phản ứng PCR đa mồi: Mẫu ADN chuẩn 9947A (10ng/l) của hãng Promega (Code: DD1001)

 Nguồn sử dụng cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen: 514 mẫu máu của 514 cá thể khác

nhau thuộc ba dân tộc nghiên cứu là: người Kinh (300 mẫu gồm 122 nam và 178 nữ) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (104 mẫu gồm 63 nam và 41 nữ) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (110 gồm 60 nam và 50 nữ) sống ở tỉnh Sóc Trăng,

Việt Nam

 Nguồn mẫu sử dụng cho ứng dụng phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định

ADN)

+ Các mẫu sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án do Phòng Kỹ thuật

Hình sự (PC54) - Công an thành phố (CATP) Hải Phòng cung cấp, bao gồm: mẫu dấu vết máu, mẫu tinh trùng và răng của tử thi

+ Ba mươi mẫu dấu vết ADN (9 mẫu tăm bông thu trên miệng cốc uống nước; 5 mẫu ống hút dùng để uống nước; 3 mẫu bàn chải đánh răng; 9 mẫu đầu mẩu thuốc lá và 4 mẫu dao cạo râu) thu được từ 10 đối tượng cần KSAN do Phòng 4 - Cục Bảo vệ Chính trị VI (A67) - Bộ Công an cung cấp

+ Một nghìn mẫu máu của 1.000 cá thể thuộc các nhóm đối tượng mà có nghề nghiệp tiềm ẩn nguy cơ rủi do cao như phi công, tiếp viên hàng không và ngư dân (trong đó, đã bao gồm cả 300 mẫu của người Kinh được lựa chọn cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen)

Tất cả các mẫu sinh phẩm này đều được lưu giữ ở -20oC, tại PTN Công nghệ gen và Vi sinh, Viện Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Bộ Công an

2.1.2 Bộ 16 locus nghiên cứu

Bộ 16 locus nghiên cứu bao gồm 15 locus STR nằm trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin để xác định giới tính

2.1.3 Bộ 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang

Được nêu ở Bảng 2.1 như sau:

Bảng 2.1 Kết quả đặt tổng hợp 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang [83] (Nguồn: IDT, 2012)

Mồi Trình tự nucleotide

(5’>>>>>>>3’)

GC (%)

Tm ( o C)

Tm ( o C)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận án đã sử dụng 2 nhóm phương pháp nghiên cứu chính như sau:

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Tách chiết ADN hệ gen người bằng Chelex [118]

2.2.1.2 Tách chiết ADN hệ gen người bằng phương pháp “salting out”

2.2.1.3 Tách chiết ADN hệ gen người từ mẫu xương bằng kit DNA IQ Systems

2.2.1.4 Định lượng ADN bằng máy quang phổ Nanodrop

2.2.1.5 Phương pháp tối ưu phản ứng PCR đa mồi [81, 83, 89]

2.2.1.6 Phương pháp xây dựng thang alen bằng PCR đa mồi

2.2.1.7 Phương pháp chế tạo kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao

quản

2.2.1.8 Phương pháp PCR sử dụng kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang

2.2.1.9 Kỹ thuật điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer

2.2.2 Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm

2.2.2.1 Kiểm tra mồi bằng phần mềm FastPCR, OligoAnalyzer và BLAST

2.2.2.2 Phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenMapper® ID

2.2.2.3 Xử lý dữ liệu thống kê bằng phần mềm EasyDNA_PopuData

2.2.2.4 Xây dựng cây phả hệ di truyền bằng phần mềm POPTREE 2

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản

3.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang

3.1.1.1 Kết quả tối ưu thành phần PCR đa mồi

Từ các kết quả tối ưu thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang, luận án đã lựa chọn được các thành phần tối ưu được nêu trong Bảng 3.1 như sau:

Bảng 3.1 Thành phần tối ưu được lựa chọn cho PCR đa mồi của 16 cặp mồi nghiên

10

GoTaq® Hot Start polymerase

3.1.1.2 Kết quả tối ưu chu trình nhiệt PCR đa mồi

Từ các kết quả tối chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh

quang, luận án đã lựa chọn được chu trình nhiệt tối ưu là: 96 o C - 2 phút; (94 o C - 1 phút; 60

o C - 1 phút; 72 o C - 1 phút) x 30 chu kỳ; 60 o C - 30 phút và giữ ở 15 o C

3.1.2 Kết quả xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu

Sau khi xây dựng được thang alen cho 16 locus nghiên cứu (thực hiện theo phương pháp được nêu ở Mục 2.2.1.6), chất lượng thang alen được kiểm tra bằng cách như sau: Lấy 1,5l thang alen tinh sạch và 0,5 l ILS-600 trộn với 10,0l Hi-Di Formamide Hỗn hợp này được biến tính bằng máy GenAmpPCR System 9700 ở 95oC trong 3 phút và giữ ở 4o

C trong 5 phút Sau đó, hỗn hợp này được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer Kết quả điện di được phân tích bằng phần mềm GenMapper® software v.3.2.1 và được nêu trong Hình 3.1 như sau:

3.1.3 Kết quả chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang

Thang alen sau khi tinh sạch

Thang alen chưa tinh sạch

Thang alen chưa tinh sạch

Thang alen chưa tinh sạch

Hình 3.1 Kết quả xây dựng thang alen 16 locus nghiên cứu bằng phương pháp PCR đa

mồi, được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer và phân tích bằng phần mềm

GenMapper ® software v.3.2.1 Nhóm 6 locus đánh dấu JOE (D5S818, D13S317, D7S820,

D16S539, CSF1PO và Penta D)

Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang chế tạo thành công được mô tả ở Hình 3.2 như sau:

Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang này, đã được gửi đi thử nghiệm đánh giá tại 02 PTN phân tích ADN của Viện Khoa Học Hình Sự - Bộ Công an và Viện Pháp Y Quân Đội - Bộ Quốc phòng Kết quả thử nghiệm đánh giá cho thấy: Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang (có

ký hiệu KIT PCR HQ 16 plex) có chất lượng tốt với độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng tốt cho việc giám định ADN theo công nghệ đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản, cụ thể như sau:

- KIT PCR HQ 16 plex có nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các bộ kit thương mại

cùng loại đang được sử dụng ở Việt Nam hiện nay (PowerPlex 16 HS System và AmpFlSTR IdentifilerPCR amplification) trên cùng mẫu ADN thử nghiệm là 9947A với dải nồng độ: 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 (ng/20l phản ứng)

- Khả năng sử dụng của KIT PCR HQ 16 plex trong phân tích kiểu gen nhận dạng cá thể

người được thử nghiệm đối với 5 mẫu ADN có nồng độ từ 0,5 đến 1,0 (ng/l) và 2 mẫu đối chứng (chứng dương sử dụng 9947A và chứng âm sử dụng nước deion diH2O) đều cho kết quả phân tích kiểu gen chính xác

- Bộ KIT PCR HQ 16 plex hoàn toàn tương thích với hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer và phân tích kiểu gen bằng phần mềm phân tích kết quả GeneMapper ID v3.2.1 của hãng Applied Biosystems

3.2 Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở ba dân tộc người Việt Nam

3.2.1 Kết quả khảo sát tần suất alen của 15 locus STR trên NST thường ở ba quần thể người Kinh, người Mường và người Khmer

Sau khi chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang, đã được ứng dụng để khảo sát tần suất alen ở ba quần thể nghiên cứu là người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội

và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm EasyDNA_PopuData [60] cho 15 locus STR nghiên cứu được nêu trong Bảng 3.4, Bảng 3.5 và Bảng 3.6 như sau:

Hình 3.2 Mô tả thành phần bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang