Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây Đan sâm tại Gia Lâm Hà Nội

- Xác định được một số các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm khi trồng trên đồng ruộng tại Hà Nội sử dụng cây giống có

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG TRỌT CÂY ĐAN SÂM

(SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG

TRỌT CÂY ĐAN SÂM (SALVIA MILTIORRHIZA

BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

Chuyên ngành: khoa học cây trồng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới Ban Giám đốc Học Viện, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Cây công nghiệp và cây thuốc đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu thực hiện luận án này

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, TS Ninh Thị Phíp là những người hướng dẫn khoa học đã tận tâm giúp

đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện luận án này Cảm ơn Lãnh đạo Cục An toàn thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thành viên trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tác giả luận án

Lê Tiến Vinh

Trích yếu luận án tiến sĩ xi

2.3 Cơ sở xác định các biện pháp kỹ thuật trồng 12

2.3.1 Cơ sở xác định thời vụ, mật độ và phân bón cho cây trồng 12 2.3.2 Phương pháp nhân giống cây Đan sâm 14

2.4 Kỹ thuật nhân giống in vitro 18

2.4.1 Khái niệm và cơ sở của khoa học của phương pháp nhân giống in vitro 18 2.4.2 Tổng quan tài liệu về nghiên cứu nhân giống in vitro 20 2.4.3 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm 23 2.5 Tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp 24 2.5.1 Cơ chế tạo rễ tơ 25 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng cảm ứng tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt

chất thứ cấp của rễ tơ 28 2.5.3 Các nghiên cứu tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ thu nhận hợp chất thứ

2.5.4 Những nghiên cứu về cây Đan sâm ở Việt Nam 35 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 3.1 Vật liệu nghiên cứu 37 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 37 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 37 3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 37 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 37 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 45 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 4.1 Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm 51 4.1.1 Tạo vật liệu khởi đầu 51

4.1.3 Tạo cây hoàn chỉnh 58 4.1.4 Thích nghi cây ngoài vườn ươm 63 4.1.5 Quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm 66 4.2 Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm 67 4.2.1 Ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm 68 4.2.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

4.2.3 Xác định dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR 70

4.2.4 Ảnh hưởng của thành môi phần môi trường đến sinh khối rễ tơ Đan sâm

4.2.7 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng và sự tích lũy

hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14 76 4.2.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm 78 4.2.9 Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến sự tăng trưởng và

sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 80 4.2.10 Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu

của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 82 4.2.11 Quy trình cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm 85 4.3 Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trồng cây Đan sâm từ cây giống in vitro 86 4.3.1 Ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển và năng suất, chất

lượng dược liệu cây Đan sâm 87 4.3.2 Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng

4.3.3 Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển và chất lượng dược

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án 104

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

α - NAA Axít alpha-naphtyl acetic

ABA Axít Abscisic

atm Atmosphere

AUD Đô - la c

B5 Gamborg‟s B5

CAM Complementary and Alternative Medicine - Thuốc bổ sung và thay thế CHM Chinese Herbal Medicine - Thuốc thảo dược Trung Quốc

CT Công thức

CV% Coefficient of variation – hệ số biến động

DXS l-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase

ĐTST Điều tiết sinh trưởng

Đ/c Đối chứng

GA3 Gibberellic acid - Axít gibberellic

ha Hecta

HMGR 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA Indole-3-acetic acid - axít Β - indol acetic

IBA Indole-3-butyric acid - Axít β - indol butyric

LAB Lithospermic axit B

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Một số thực phẩm chức năng chứa dược liệu Đan sâm tại Việt Nam 12 2.2 Các phương pháp nhân giống cây Đan sâm 14 3.1 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 46 3.2 Thành phần phản ứng PCR 46 4.1 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm sau 2 tuần

4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan

sâm sau 4 tuần nuôi cấy 56 4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan

sâm sau 4 tuần nuôi cấy 57 4.6 Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần

4.7 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy 61 4.8 Ảnh hưởng của IAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy 62 4.9 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây in vitro trên môi trường ra rễ đến

tỷ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm trên giá thể xơ dừa: cát (1:1) sau

4.10 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Đan

4.11 Ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ Đan sâm sau 4 tuần 68 4.12 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

4.13 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy 72

4.14 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy 74 4.15 Ảnh hưởng của các loại bình nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ dòng A5.14

sau 10 tuần nuôi cấy 75 4.16 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau

4.17 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tích lũy các hoạt chất mục

tiêu của dòng rễ tơ A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy 78 4.18 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan

4.19 Ảnh hưởng của tổ hợp của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng sinh

khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 80 4.20 Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tích lũy các hoạt chất

mục tiêu dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy 81 4.21 Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan

sâm dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy 83 4.22 Ảnh hưởng của các elicitor đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng

A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy 84 4.23 Ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm tại thời

điểm 10 tháng sau trồng 87 4.24 Ảnh hưởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

4.25 Ảnh hưởng của thời vụ đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan

sâm (sau 10 tháng trồng) 90 4.26 Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm 91 4.27 Ảnh hưởng của mật độ trồng đến năng suất dược liệu Đan sâm 92 4.28 Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển cây Đan sâm 95 4.29 Ảnh hưởng của phân bón đến mức độ nhiếm sâu bệnh trên cây Đan sâm 96 4.30 Ảnh hưởng của phân bón đến năng suất dược liệu Đan sâm 97 4.31 Ảnh hưởng của phân bón đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây

Đan sâm sau trồng 10 tháng 98

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Cây và rễ cây Đan sâm 5 2.2 Cấu trúc Ri – plasmid 26 2.3 Con đường sinh tổng hợp tanshinones trong rễ Đan sâm 34 3.1 Hạt Đan sâm sử dụng trong nghiên cứu 37 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA 47 3.3 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen virD 47 4.1 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm 51 4.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm 53 4.3 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đan sâm 55 4.4 Một số hình thái chồi Đan sâm trong quá trình nhân nhanh: (A): Chồi

Đan sâm sinh trưởng, phát triển bình thường; (B): Chồi biến dị, chồi mọc thành cụm, không tăng trưởng về chiều cao; (C): chồi biến dị, chồi mọc thành cụm, thấp, lá xoăn; (D): chồi biến dị, chồi thấp, thân và lá mọng nước; (E): chồi biến dị, chồi bạch tạng 57 4.5 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm 59 4.6 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm 61 4.7 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi Đan sâm 62 4.8 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích nghi cây Đan sâm ngoài vườn ươm 66 4.9 Ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm:

A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân 68 4.10 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ

4.11 Ảnh điện di kết quả tách chiết DNA tổng số từ rễ Đan sâm 70 4.12 Kết quả khuếch đại gen rolA (A) và gen virD (B) bằng phương pháp

PCR: L: GeneRuler 1kb DNA Ladder; ( ): Đối chứng dương, sản phẩm PCR của Ri plasmid 15834; (-): Đối chứng âm, sản phẩm PCR của DNA genome rễ bất định Đan sâm; H2O: Đối chứng âm, nước; Giếng 1-10 (A): Sản phẩm PCR của DNA genome 10 dòng rễ tơ Đan sâm; Giếng 1, 3, 4,

6, 9, 10 (B): sản phẩm PCR với cặp mồi virDF và virDR của 6 dòng rễ tơ

4.13 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng

4.14 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 74 4.15 Ảnh hưởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 75 4.16 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 77 4.17 Rễ tơ Đan sâm ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau trên môi trường B5 79 4.18 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm:

(A): B5; (B): B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA; (C): B5 + 0,5 mg/l TDZ

4.19 Củ Đan sâm thu hoạch ở các thời vụ khác nhau 89 4.20 Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển của cây Đan sâm 95

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1 Tên nghiên cứu sinh: Lê Tiến Vinh

2 Tên luận án: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống

trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge)

tại Gia Lâm Hà Nội

3 Chuyên ngành: Khoa học cây trồng; Mã số: 62.62.01.10

4 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

5 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm có hệ số nhân cao, chất

lượng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật phù hợp trồng cây Đan sâm ngoài đồng ruộng Tạo các dòng tế bào rễ tơ và xác định được một số yếu tố môi trường ảnh hưởng

đến việc nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm in vitro

6 Các phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành để xây dựng quy trình nhân giống in

vitro cây Đan sâm

Cảm ứng rễ tơ cây Đan sâm bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong rễ tơ bằng phương

pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu Rễ tơ chuyển gen được nuôi cấy trong môi trường MS/B5 với các trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng và phân lớp) để khảo sát khả năng tăng trưởng của rễ tơ Đan sâm Khối lượng rễ tươi được xác định bằng cách cân sau khi đã loại bỏ hoàn toàn môi trường Rễ tươi sau khi thu được sấy ở nhiệt độ 450C đến khối lượng không đổi để xác khối lượng rễ khô (Ge et al.,

2005) Ba hoạt chất mục tiêu gồm tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone, trong rễ tơ Đan sâm được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Các thí nghiệm nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trồng ở ngoài đồng ruộng được

bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, diện tích mỗi ô thí nghiệm 5 m2 Đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển, năng suất

củ Đan sâm Phân tích hoạt chất trong rễ củ Đan sâm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao

áp (HPLC)

7 Kết quả đạt chính và kết luận

- Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm với các thông

số như sau: Môi trường gieo hạt Đan sâm là MS 1,0 mg/l GA; Môi trường nhân nhanh chồi: MS 0,5 mg/l BA; Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: ½ MS + 0,75 mg/l IAA; Giá thể tiếp nhận cây Đan sâm ngoài vườn ươm: xơ dừa: cát (1:1)

- Xác định được vật liệu và điều kiện thích hợp để cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm: Mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ cây Đan sâm; Nồng độ dịch khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2; Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm thích hợp là B5 100 mg/l YE 0,1 mM Methyl Jasmonate, trong điều kiện 16h sáng/8h tối,

cho tốc độ tăng trưởng rễ mạnh, khối lượng rễ tươi tăng 13,96 lần sau 8 tuần nuôi cấy, đồng thời cho hoạt chất mục tiêu tích lũy cao nhất

- Xác định được một số các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm khi trồng trên đồng ruộng tại Hà Nội

sử dụng cây giống có nguồn gốc nuôi cấy mô Trồng cây Đan sâm vào tháng 3 với khoảng cách 30 cm x 35 cm, liều lượng phân bón là 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120

kg P2O5 + 90 kg K2O/ha cho cây sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất dược liệu cao

THESIS ABSTRACT

1 Name of PhD student: Le Tien Vinh

2 Title of thesis: Application of biotechnology and traditional breeding methods on in

vitro propagation, root production and field cultivation of Salvia miltiorrhiza Bunge in

Gia Lam - Ha Noi

4 Training institution: Vietnam National University of Agriculture

5 Research Objectives

Establish the procedure for in vitro propagation of Salvia miltiorrhiza Bunge

which shows high multiplication rate, good quality seedlings as well as determine

optimal techniques to cultivate Danshen on the field Induce in vitro hairy roots of

Danshen and identify some cultural factors affecting hairy root culture

6 Materials and Methods

The in vitro propagation of Salvia miltiorrhiza Bunge was carried out based on

plant tissue culture techniques Putative hairy root lines were detected by PCR technique using specific primers Transgenic hairy roots were cultured on MS/B5 medium with different medium states (solid, liquid, semi-liquid and layered) to examine the growth and development of Danshen hairy roots Fresh weight was determined after completely removing the medium and then kept in an oven at 45°C until constant

weight to determine dry weigh (Ge et al., 2005) Three secondary metabolites including

tanshinone I, tanshinone IIA and cryptotanshinone were quantitative using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods

Randomized Complete Block Design (RCBD) was applied in field experiments, three replications (three 5 m2 plots) Data reflect plant growth and development as well

as root yield were collected and analyzed

7 Main results and conclusions

- A simple and reliable in vitro regeneration procedure for Salvia miltiorrhiza

Bunge was established as follows: The optimal medium for seed germination was MS + 1.0 mg/l GA; the most suitable medium for shoot multiplication was MS + 0.5 mg/l BA;

The optimal medium for in vitro rooting was ½ MS + 0.75 mg/l IAA; The best substrate

to acclimatize in vitro plantlets was 50% of coconut fiber and 50% of sand

- Some factors affecting in vitro hairy root induction and culture of Salvia

miltiorrhiza Bunge were identified: Leaf was found to be the most efficient explant for

transforming and inducing hairy roots; Concentration of bacteria at optical density of 600nm (OD600 = 0.2 indicated maximum percentage of root induction; The optimal cultural medium and conditions for hairy root growth were B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM Methyl Jasmonate with a 16h photoperiod which shows maximum root biomass (13.96- fold higher) after 8 weeks of culture

- Some optimal techniques to plant Danshen using in vitro plantlets on the field in

Hanoi were determined: The best season to plant Danshen was in March (2014); A planting distance of 30 cm x 35 cm was suitable for Danshen cultivation; Two tons of biofertilizers + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha was found to be the most efficient fertilizers for good growth and development of Danshen, high yield as well as good accumulation of secondary metabolites

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) cây thuốc quý trong y học cổ truyền

Người xưa có câu “Nhất vị Đan sâm, cộng đồng tứ vật thang”, nghĩa là một vị Đan sâm công dụng bằng bốn vị: đương quy, địa hoàng, xuyên khung, bạch thược - vốn là bài thuốc bổ huyết kinh điển của Đông y Các nghiên cứu y học hiện đại cho thấy Đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm giãn mạch và tăng lưu động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành các mảng xơ vữa động mạch và nhiều bệnh khác (Du and Zhang, 2015) Ngày nay, con người đang hướng tới sử dụng các hợp chất thiên nhiên có trong cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh và nâng cao sức khỏe Chính vì vậy, nhu cầu sử dụng dược liệu nói chung và cây Đan sâm nói riêng trong hai thập kỷ gần đây gia tăng nhanh chóng Nếu như năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì nay con số đã lên tới 15.000 tấn/năm (Qin, 2006)

Mặc dù giá trị và nhu cầu Đan sâm tăng cao như vậy nhưng nguồn Đan sâm sử dụng làm thuốc ở Việt Nam chủ yếu nhập khẩu từ Trung Quốc Việc nghiên cứu và trồng trọt cây Đan sâm ở Việt Nam còn rất hạn chế Theo báo cáo tại Hội nghị Dược liệu toàn quốc năm 2003 về Phát triển dược liệu bền vững trong thế kỷ 21, trên thị trường dược liệu Việt Nam, nguyên liệu cây thuốc Đan sâm phải nhập khẩu 100% từ Trung Quốc Trong danh mục dược liệu nhập khẩu những năm gần đây, chỉ riêng chi nhánh công ty Nam Hà tỉnh Lạng Sơn đã nhập khẩu lên tới trên 50 tấn dược liệu Đan sâm mỗi năm Nếu như trong nước tự sản xuất được loại dược liệu quý này, thì ngành dược liệu không những sẽ chủ động được nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc, mà còn tiết kiệm được một khoản ngoại

tệ đáng kể, đồng thời góp phần làm tăng thu nhập cho người nông dân

Để đáp ứng và chủ động về dược liệu Đan sâm trong nước, nghiên cứu để đẩy mạnh nhân nuôi là con đường tất yếu Cây Đan sâm có thể nhân giống theo phương pháp truyền thống bằng hạt hoặc vô tính từ củ mẹ Tuy nhiên, phương pháp nhân giống bằng hạt cây Đan sâm gặp nhiều khó khăn như khả năng thụ phấn, tỷ lệ kết hạt thấp, hạt chín rải rác nên khó thu hái và đặc biệt là cây Đan sâm trồng từ hạt mất tới 2 năm mới cho dược liệu Đào Văn Núi và cs (2014) đã thử nghiệm phương pháp nhân giống cây Đan sâm từ củ Tuy nhiên, tỷ lệ củ Đan

sâm nảy mầm chưa thực sự khả quan khi chỉ đạt cao nhất 61,11% với hệ số nhân 1,0 chồi/củ Một nhược điểm khác của phương pháp nhân giống truyền thống là rất khó khăn trong việc phòng trừ các loại dịch bệnh, xử lý tồn dư của thuốc bảo

vệ thực vật hoặc kim loại nặng Hơn nữa, năng suất dược liệu và hàm lượng sản phẩm mục tiêu là các chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái và kỹ thuật trồng trọt

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật cảm ứng và nuôi

cấy rễ tơ in vitro và tối ưu kỹ thuật trồng trọt cây Đan sâm trên đồng ruộng là

những giải pháp hiệu quả nhằm khắc phục khó khăn trong việc cung cấp dược liệu

Đan sâm hiện nay Phương pháp nhân giống vô tính in vitro có nhiều ưu điểm như

hệ nhân giống cao, cây giống giữ nguyên được các đặc tính của cây mẹ, đồng đều, sạch bệnh, sức sống cao khi đưa ra trồng trên đất… đã và đang được ứng dụng rộng rãi vào sản xuất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây dược liệu Trong khi đó,

nuôi cấy rễ tơ cảm ứng nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để thu nhận các

hợp chất mục tiêu có những ưu điểm vượt trội như rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh, bền vững về mặt di truyền và tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng với cây mẹ giúp giảm thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm… hứa hẹn là một

hướng đi đầy triển vọng (Zhao et al., 2010; Gupta et al., 2010; Kai et al., 2011)

Việc áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất, thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học cao đã và đang được nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi trên thế giới như một trong những giải pháp tiềm năng để đáp ứng nhu cầu thảo dược Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất cây giống và nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp Do vậy, đề tài này được tiến hành

có ý nghĩa lớn về mặt khoa học và thực tiễn

1.2 MỤC TIÊU

1.2.1 Mục tiêu chung

Góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây Đan sâm

có hệ số nhân cao, chất lượng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật phù hợp trồng cây Đan sâm ngoài đồng ruộng Đồng thời, tạo được các dòng tế bào rễ tơ Đan sâm và xác định được một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc nhân

nuôi rễ tơ in vitro làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất các hợp chất

thứ cấp phục vụ công nghiệp dược liệu ở Việt Nam

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

(1) Xác định được các thông số kỹ thuật trong quy trình nhân giống in

vitro cây Đan sâm

(2) Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen nhờ vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm tạo được các dòng rễ tơ cây Đan sâm và

một số thông số của quá trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ Đan sâm

(3) Xác định được các biện pháp kỹ thuật trồng cây Đan sâm (thời vụ, mật

độ trồng, dinh dưỡng) thích hợp cho sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu rễ cây Đan sâm

1.3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã xác định được các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình nhân

nhanh in vitro cây Đan sâm, từ đó xây dựng được quy trình vi nhân giống cây

Đan sâm có hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt, đáp ứng nhu cầu cây giống Đan sâm hiện nay trên thị trường Đồng thời, nghiên cứu đã thiết lập được

quá trình tạo và nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro,

góp phần chủ động tạo ra nguồn dược liệu Đan sâm sạch làm tiền đề cho quy trình sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây Đan sâm Đề tài cũng cũng đã xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng dược liệu Đan sâm, góp phần xây dựng quy trình trồng trọt cây Đan sâm cho hiệu quả kinh tế cao Do vậy, có thể nói, đây là công trình nghiên

cứu một cách có hệ thống và công phu về nhân giống in vitro, in vivo cây Đan

sâm, cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về nghiên cứu cây Đan sâm và

xây dựng cơ sở lý luận cho việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối cây

Đan sâm bằng công nghệ sinh học và công nghệ truyền thống Từ đó, góp phần giúp cho các nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu và nghiên cứu các loại cây này trong tương lai

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cho phép hình thành được: (1) Quy trình nhân giống

in vitro cây Đan sâm ; (2) Quy trình tạo, nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm

và (3) Một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt cây Đan sâm Các quy trình, kỹ thuật trên có khả năng ứng dụng thực tiễn cao, góp phần chủ động di thực, bảo tồn,

phát triển được nguồn giống cây dược liệu quý Đan sâm tại Việt Nam Bên cạnh

đó, các sản phẩm do đề tài tạo ra bao gồm nguồn cây giống chất lượng cao và lượng sinh khối rễ lớn Như vậy, đây là những đóng góp thiết thực, góp phần quan trọng trong việc phát triển dược liệu Đan sâm một cách chủ động, bền vững

ở nước ta Chính vì vậy, đề tài có ý nghĩa thực tiễn to lớn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐAN SÂM

2.1.1 Nguồn gốc

Cây Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc ngành Hạt kín – Angiospermae, lớp 2 lá mầm - Dicotyledones, phân lớp Cúc - Asteridae, bộ Hoa môi – Lamiales, họ Hoa môi – Lamiaceae, chi Salvia (Hình 2.1)

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn được biết đến với tên gọi là

Radix Salviae Miltiorrhizae, huyết sâm, huyết căn, xôn đỏ… là một loài thực vật sống lâu năm, loài bản địa của cả Trung Quốc và Nhật Bản Đan sâm sinh sống tại các khu vực có độ cao từ 90 tới 1.200 m trên mực nước biển, ưa các môi trường nhiều cỏ trong rừng, sườn núi, dọc các bờ suối Từ Salvia có nguồn gốc từ tiếng Latinh, "salveo" có nghĩa là "để chữa lành” Tính năng phòng bệnh "ma thuật" của nó là có thể chữa nhiều loại bệnh và phổ biến trong y học cổ truyền

(Kasimu et al., 1998) Phần tên gọi cho loài miltiorrhiza có nghĩa là “nước màu

đỏ chiết ra từ rễ”

Hình 2.1 Cây và rễ cây Đan sâm

Nguồn dẫn theo Lê Phượng dịch (2015)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

Đan sâm là cây thảo, lâu năm, cao khoảng 30 - 70 cm Thân phát triển thẳng đứng và vuông cạnh, phía trên thân cây phân nhánh Toàn thân được bao phủ bởi lớp lông mềm màu vàng và lông tuyến Lá kép lông chim lẻ mọc đối, 3-

5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn Xung quanh cuống lá thường có 5 lá nhỏ,

ít khi 3 lá, lá ở đỉnh thường lớn hơn các lá bên Phiến lá hình trứng, chiều dài 2

- 7 cm, chiều rộng 0,8 - 5 cm; phần đỉnh nhọn, mép lá có nhiều răng cưa Mặt phải phiến lá màu xanh lục, mặt trái màu nhạt hơn, trên mặt phiến lá phủ một lớp lông mịn Chùm hoa ô tròn, mọc ở đầu cành hoặc trên nách lá, gồm nhiều vòng chỗ dày, chỗ thưa xếp thành tầng dọc, dài 10 - 15 cm Cụm hoa mọc vòng, với 6 vòng hoa, mỗi vòng 3 - 10 hoa, thông thường là 5 Các bẹ hoa dạng mác ngược và bao phủ bởi lông tuyến Đài hoa màu tím, hình chuông và một phần ống của nó được bao phủ dày đặc với những sợi lông mềm màu trắng Tràng hoa chẻ đôi, dài 2 - 2,7 cm và có màu xanh tím Môi trên phát triển và có hình dạng liềm, đầu có một vết nứt nhỏ Môi dưới ngắn hơn so với môi trên, đầu có

ba vết nứt, đoạn giữa dài hơn và lớn hơn so với hoa bên Ống tràng hoa có một vòng lông Hoa nở có hai nhị phát triển ở giữa của môi dưới và mở rộng ra từ các tràng hoa Hai nhị hình dạng tuyến tính và phát triển với các bên của môi trên ống Bao phấn bị suy thoái thành hình cánh hoa Bầu nhụy với bốn vết nứt lớn, dài hơn nhị hoa Mỗi hoa nở phát triển thành bốn quả hạch có hình elip với màu nâu sẫm Quả nhỏ xíu, dài, thuôn, dài 3 mm, rộng 1,5 mm Cây ra hoa vào tháng 4 - 6, hình thành quả tháng 7 - 9

Đan sâm có 13 - 21 rễ đỏ, được phát triển từ thân rễ chính Rễ Đan sâm nhỏ dài hình trụ, dài 10 - 20 cm, đường kính 0,5 - 1,5 cm, ăn sâu xuống đất, cong queo, có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nhỏ Rễ có màu đỏ tươi, mặt ngoài nhăn nheo tạo thành rãnh nhỏ song song xuôi theo chiều dài của rễ

Về mặt vi phẫu rễ, lớp bần gồm nhiều lớp tế bào có thành dày Mô mềm

vỏ dày cấu tạo bởi tế bào hình tròn hay bầu dục, thành mỏng, xếp đều đặn theo hướng tiếp tuyến Libe cấp 2 gồm những tế bào nhỏ, thành mỏng, xếp đều đặn và liên tục thành vòng tròn và tập trung dày hơn ở những chỗ tương ứng với các nhánh gỗ Tia ruột rộng, mỗi tia gồm 6 – 35 dãy tế bào có thành mỏng, xếp theo hướng xuyên tâm từ gần trung tâm xuyên qua gỗ đến libe cấp 2

2.1.3 Phân bố

Cây Đan sâm Salvia miltiorrhiza (SM, Danshen) là cây thuốc có nguồn

gốc ở Trung Quốc được trồng hàng trăm năm để điều trị các bệnh về tim mạch

(Gao et al., 2014; Long et al., 2014) Tại Trung Quốc, Đan sâm được trồng ở tỉnh

Tứ Xuyên khoảng 100 năm về trước (Wang et al., 2004) và được trồng phổ biến

ở các tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà Bắc, Liêu Ninh, Giang Tô, Chiết Giang,

Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Quý Châu, Quảng Đông, Sơn Tây Các tỉnh Hà Bắc, Hà Nam, Sơn Đông, Tứ Xuyên, Sơn Tây được coi là nơi sản xuất Đan sâm với chất lượng cao, tốt nhất là ở Tứ Xuyên Đan sâm cũng được trồng ở Nhật Bản, Triều Tiên và Đức (Võ Văn Chi, 2004) Đan sâm phân bố chủ yếu ở vùng

ôn đới ẩm, cận nhiệt đới và nhiệt đới, là cây ưa ẩm, thích hợp trồng trên đất phù

sa, nhiều mùn Đan sâm được di thực vào Việt Nam khoảng những năm 1960, được trồng ở Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Văn Điển (Hà Nội), Bắc Hà (Lào Cai) và một số vườn thuốc khác Hiện nay, Đan sâm được chú ý phát triển để nhân rộng tại Tam Đảo, Sapa và Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến cây thuốc Hà Nội Rễ Đan sâm được thu hoạch vào mùa đông, rễ được đào về sau đó rửa sạch, cắt bỏ cây và rễ con, đem đi phơi hoặc sấy khô

2.1.4 Yêu cầu điều kiện sinh thái của cây Đan sâm

2.1.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm là 15 - 25oC, cây sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 20 - 26oC kết hợp với độ ẩm 80% Cây ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ không khí dưới 10o

C (Shu et al., 2004) Cây bắt đầu phát triển

khi nhệt độ đất đạt 10oC trong mùa xuân Trong mùa thu, khi nhiệt độ xuống dưới

10oC, các phần trên mặt đất se bị héo Tuy nhiên rễ Đan sâm có thể qua đông an toàn ngay cả khi nhiệt độ đất dưới - 15 oC Hạt nảy mầm tốt trong điều kiện nhiệt

độ từ 18 - 22 oC, thời gian kéo dày 15 ngày Mầm bất định bắt đầu hình thành khi nhiệt độ đất đạt 15 - 17oC Trong điều kiện thiếu nắng và nhiệt độ thấp làm chậm

quá trình sinh trưởng và gây ra phát triển dị dạng (Huang et al., 2015)

2.1.4.2 Ánh sáng

Giống với cây thuộc họ hoa môi, Đan sâm là cây ưa sáng thích hợp trồng

có ánh nắng chiếu trực tiếp Cây Đan sâm sinh trưởng tốt trong điều kiện đầy đủ

ánh sáng (Huang et al., 2015)

2.1.4.3 Nước

Nước đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây Đan sâm, ảnh hưởng đến sự hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng đất và điều chỉnh sự

phát triển rễ Đan sâm có nhu cầu nước khác biệt (Gao et al., 2004) Nói chung,

Đan sâm ưa môi trường ẩm ướt vừa phải, khả năng chống chịu lũ lụt và ngập úng

kém Khả năng chống chịu hạn kém (Huang et al., 2015) Những đặc điểm này

làm cơ sở để lựa chọn vùng sinh thái thích hợp cho cây Vì vậy, địa hình trũng

thấp với hệ thống thoát nước kém không thích hợp cho phát triển Đan sâm Mặt khác, điều kiện thời tiết và đất quá khô không thích hợp cho sự phát triển của Đan sâm, đặc biệt là ở giai đoạn nảy mầm vào mùa Xuân và giai đoạn tăng trưởng nhanh về gốc vào mùa Thu (Jiang and Wei, 2004)

Các đặc tính nhu cầu nước và hiệu quả sử dụng nước của cây Đan sâm trong điều kiện đất đai khác nhau đã được nghiên cứu Nước cần thiết trong toàn

bộ chu kỳ tăng trưởng của cây, nhu cầu nhiều nhất thường xảy ra từ tháng sáu đến tháng tám và độ ẩm đất nên được duy trì mức tối đa khoảng 70% ở các giai

đoạn (Gao et al., 2004)

2.1.4.4 Điều kiện thổ nhưỡng

Các nguyên tố vô cơ trong rễ Đan sâm, được thu thập từ khu vực sản xuất khác nhau, và các tính chất hóa lý của đất ở các vùng đã được phân tích Các thuộc tính chính của đất trồng Đan sâm trong khu vực sản xuất khác nhau là thịt pha cát và sét, và độ pH của đất trong khoảng 6,0 - 8,7 Không có thành phần chính rõ ràng cho sự phát triển của Đan sâm đã được tìm thấy trong đất Do đó, Đan sâm có khả năng thích ứng tốt trong môi trường sinh thái đất khác nhau

(Zhao et al., 2004)

Nghiên cứu của Zhao et al.,(2004) cũng chỉ ra rằng thành phần dinh dưỡng

trong các loại đất khác nhau là không cao và thậm chí rất thấp trong một số khu vực sản xuất nhất định Ví dụ, các chất hữu cơ của đất ở tỉnh Sơn Đông là dưới 1%, và tổng nitơ chỉ là 0,04% Bên cạnh đó, một vài địa phương trồng Đan sâm ở tỉnh Tứ Xuyên và tỉnh Hà Nam nơi mà có phốt pho hữu hiệu trong đất nhiều hơn 15ppm, các địa phương trồng khác ở mức thấp (5-10 ppm) Liên quan đến nguyên tố vi lượng, có sự tương quan có thể được tìm thấy giữa các khu vực sản xuất và số lượng nguyên tố vi lượng

Theo Huang et al.,(2015) Đan sâm phát triển tốt trên đất cát pha giàu dinh

dưỡng và thích nghi rộng với điều kiện pH từ hơi a xít đến hơi kiềm Đất trồng Đan sâm thường được chọn là đất có tầng canh tác dày và thoát nước tốt

2.1.5 Giá trị dược liệu

Những nghiên cứu về thành phần hóa học trên Đan sâm bắt đầu từ năm

1930 (Zhou et al., 2005) Ban đầu, người ta quan tâm hơn tới các thành phần hòa tan trong lipid (Chang et al., 1990) Kể từ khi danshensu được phân lập từ nước

sắc thuốc Đan sâm trong những năm đầu của thập niên 1980, các nghiên cứu

được mở rộng thêm trên các thành phần hòa tan trong nước Ngoài ra, Đan sâm cũng có một số flavonoids, triterpenoids và sterols Một số các hợp chất này đã được biết tới là các chất hoạt tính sinh học có thuộc tính dược liệu (Lu and Foo,

2002; Jiang et al., 2005)

Dịch chiết Đan sâm khi được chiết xuất bằng rượu đặc biệt có nhiều các

sắc tố diterpene như phenanthrenequinones (Chang et al., 1990), trong khi đó khi

được chiết xuất bằng nước thì dịch chiết thu được chứa nhiều các hợp chất phenolic (Lu and Foo, 2002)

Các thành phần hóa học chính trong rễ cây Đan sâm gồm các chất hòa tan trong lipid như tanshinone I, tanshinone II, tanshinone II, cryptotanshinone… Đây là các hợp chất có hoạt tính dược học có tác dụng chống thiếu máu cục bộ, kháng khuẩn, chống oxy hóa và các đặc tính kháng u… (Gordon and Weng,

1992; Sze et al., 2005; Wang et al., 2005) Các thành phần hòa tan trong nước

trong rễ cây Đan sâm gồm axit caffeic, các dẫm xuất của axit caffeic, axit salvianolic … Các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, ức chế adenylate

cyclase … (Kohda et al., 1989; Petersen and Simmonds, 2003).

Trong những năm gần đây, các hoạt tính dược lý của Đan sâm đã được

nghiên cứu rộng rãi (Zhou et al., 2005) Hoạt tính dược lý chính của nó bao gồm chống thiếu máu cục bộ (Ji et al., 2000), chống oxy hóa (Zhao et al., 2005), chống khuẩn (Fang et al., 1976) và chống ung thư (Yang et al., 2005) Các tính

năng này chủ yếu được thực hiện thông qua hoạt tính sinh học của các thành phần hòa tan trong lipid như tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone (Ji

et al., 2000) và các thành phần hòa tan trong nước như axít salvianolic B (Lay et al., 2003) Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong hoạt tính dược lý giữa các

thành phần hòa tan trong lipid và các thành phần hòa tan trong nước Trước đây chủ yếu người ta thấy tác dụng kháng khuẩn và điều chỉnh nội tiết, sau này hoạt

tính chống oxy hóa mới được thấy rõ ràng hơn (Zhou et al., 2005) Thêm vào đó,

mỗi thành phần hoạt tính sinh học cụ thể lại có hoạt tính dược lý độc đáo riêng của nó Do đó, một số thành phần hoạt tính sinh học và dẫn xuất của nó như Sodium tanshinone IIA sulfonate (STS) đã phát triển thành các loại thuốc cụ thể

với hiệu quả điều trị nhất định (Wu et al., 1993)

Các hoạt tính chống vi khuẩn của Đan sâm được tìm thấy đầu tiên từ

cryptotanshinone và dihydrotanshinone I (Fang et al., 1976) Sau đó, các hoạt

tính dược học khác như ảnh hưởng trên hệ tim mạch và hệ thần kinh cũng đã

được chứng minh với Sodium tanshinone IIA sulfonate (Li et al., 2004b; Wang

et al., 2005)

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ DƯỢC LIỆU ĐAN SÂM 2.2.1 Trên thế giới

Với nhiều thành phần hoạt chất có tác dụng dược lý cao, Đan sâm đã có lịch

sử 2000 năm sử dụng Ở Trung Quốc, cây Đan sâm có nguồn gốc tự nhiên và trồng trọt đều được sử dụng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, An Huy, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Hồ Bắc, Tứ Xuyên, Quý Châu, Sơn Tây, Quảng Đông… trong đó các tỉnh Sơn Tây, Tứ Xuyên, Hà Bắc, Hà Nam và Sơn Đông là

khu vực sản xuất Đan sâm chất lượng và sản lượng cao Theo Minhui et al (2013) ở Trung Quốc có trên 40 loài thuộc chi Salvia được sử dụng làm thuốc

chữa các bệnh khác nhau hàng ngàn năm nay Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng dược liệu Đan sâm đã tăng nhanh do việc sử dụng rộng rãi các sản phẩm hòa tan trong nước của Đan sâm và do những ưu điểm vượt trội của loại dược liệu này Nếu như năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì năm 2002 là 10.000 tấn trên toàn thế giới, trong số đó, 8.000 tấn tiêu thụ ở Trung Quốc (Wei, 2002) và đã lên tới 80.000 tấn/năm trong thời

gian gần đây (Hu et al., 2005) Có tới 80% công ty dược và bệnh viện y học

Trung Quốc có nhu cầu về dược liệu Đan sâm (Qin, 2006)

Y học cổ truyền Trung Quốc sử dụng Đan sâm như một thành phần hoặc thành phần chính trong các thang thuốc Trong khi đó, từ Đan sâm, y học hiện đại

đã tạo ra hơn 100 chủng loại thuốc và thực phẩm chức năng trong điều trị các bệnh như như viêm gan, viêm thận cấp và mạn tính, hen phế quản, viêm thần kinh ngoại, đau dây thần kinh tam thoa, đau đầu do mạch máu, ù tai do nguyên nhân thần kinh, mụn nhọt và đặc biệt là các bệnh lý tim mạch như thiểu năng tuần hoàn não, tai biến mạch não, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, thiểu năng mạch vành, xuất huyết võng mạc, viêm động tĩnh mạch Ngoài ra, Đan sâm cũng được sử dụng dưới các hình thức như dịch tiêm truyền, viên nén, viên nang, trà tan (Qin, 2006)

Một trong các sản phẩm sử dụng phổ biến nhất có chứa dược liệu Đan sâm là Thiên Sứ Hộ Tâm Đan do các nhà khoa học Trung Quốc bào chế trên cơ

sở kết hợp hai loại thảo dược là Đan sâm và tam thất để phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tăng cholesterol máu… Đặc biệt, Thiên Sứ Hộ Tâm Đan là thuốc đông dược đầu

tiên và duy nhất hiện nay được ơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ (Food and Drug Administration of USA – FDA) thông qua giai đoạn II Nghiên cứu FDA giai đoạn II mang của Thiên Sứ Hộ Tâm Đan đã được hoàn thành trong vòng 18 tháng tại 15 trung tâm nghiên cứu lâm sàng ở Mỹ Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau

4 tuần liên tục sử dụng thuốc thì khả năng gắng sức, số lần xuất hiện cơn đau thắt ngực mỗi tuần, lượng thuốc Nitroglycerin tác dụng nhanh cần dùng của bệnh nhân

đã giảm đi đáng kể Sau 4 tuần sử dụng thuốc, sự khác biệt về khả năng gắng sức của bệnh nhân giữa nhóm dùng thuốc và nhóm không dùng thuốc là có ý nghĩa thống kê về mặt khoa học Số lần xuất hiện cơn đau thắt ngực mỗi tuần cũng đã giảm tới hơn 75% Kết quả nghiên cứu càng được cải thiện rõ rệt sau 8 tuần liên tục

sử dụng Đặc biệt, Thiên Sứ Hộ Tâm Đan có thành phần hoàn toàn từ thảo dược thiên nhiên nên rất an toàn trong quá trình sử dụng Từ đó FDA Mỹ khẳng định " Sử dụng Thiên Sứ Hộ Tâm Đan 10 viên 1 lần, 3 lần 1 ngày liên tục từ 4 đến 8 tuần giúp điều trị và dự phòng hiệu quả, an toàn cơn đau thắt ngực ổn định mạn tính bệnh mạch vành" Bên cạnh đó đã có nhiều bằng chứng chứng minh hiệu quả điều trị của Thiên Sứ Hộ Tâm Đan đối với bệnh nhân gặp phải các vấn đề tim mạch nói chung,

đó là xơ vữa động mạch, huyết áp cao, mỡ máu cao…(Linh Doan, 2012)

Có mặt trên thị trường từ năm 1993, tính đến nay có hơn 2 tỷ liều dùng được kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị trong thời gian ngắn hoặc kéo dài tại 34 Quốc gia trên toàn thế giới như Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam Phi, Việt Nam Tác dụng nhanh chóng và hiệu quả của Thiên Sứ Hộ Tâm Đan được lý giải là nhờ ứng dụng khoa học công nghệ tiên tiến vào sản xuất Đan sâm

và Tam Thất trong Thiên Sứ Hộ Tâm Đan được chiết xuất ra những thành phần

có tác dụng chọn lọc trên tim mạch, được bào chế dưới dạng Viên hoàn giọt tác dụng nhanh, hấp thu nhanh Thiên Sứ Hộ Tâm Đan lần đầu tiên được FDA Mỹ thông qua giai đoạn II là một điểm đáng tự hào, một niềm hi vọng mới trên con đường phát triển ngành Đông dược hiện đại (Linh Doan, 2012)

2.2.2 Tại Việt Nam

Đan sâm được di thực và sử dụng từ những năm 1960 ở Việt Nam và hiện nay loại dược liệu này được trồng ở Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Hà Nội (Văn Điển) và một số vườn thuốc khác (Ngô Quốc Luật và cs., 2014) Theo báo cáo tại Hội nghị Dược liệu toàn quốc năm 2003 về Phát triển dược liệu bền vững trong thế kỷ 21, trên thị trường dược liệu Việt Nam, nguyên liệu cây thuốc Đan sâm phải nhập khẩu 100% từ Trung Quốc Trong danh mục

dược liệu nhập khẩu của năm 2001 và 2002, chỉ riêng chi nhánh Công ty Nam

Hà, tỉnh Lạng Sơn đã nhập khẩu lên tới trên 50 tấn dược liệu Đan sâm mỗi năm Hầu hết các đơn thuốc chữa bệnh từ dược liệu đều có thành phần Đan sâm với liều lượng trung bình 10g/ thang Năng suất của cây trồng này ước tính từ 1,16 – 2,65 tấn khô/ha, hàm lượng tanshinon IIA tích lũy đạt từ 0,21% - 0,87% (Ngô Quốc Luật và cs., 2014) và giá thành ở trong nước là 250 – 300 nghìn đồng/kg khô Hiện nay, đã có rất nhiều các sản phẩm thuốc đông dược có chứa thành phần dược liệu Đan sâm được sản xuất và tiêu thụ trên thị trường Việt Nam (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Một số thực phẩm chức năng chứa dược liệu Đan sâm

tại Việt Nam

Đan sâm, tam thất

Đau thắt ngực do bệnh tim mach, thần kinh liên sườn, rối loạn thần kinh giao cảm, giảm mỡ máu, tan huyết khối, huyết cục, co thắt mạch vành

Đan

sâm-Tam thất

Công ty TNHH Vạn Xuân

Đan sâm, tam thất

Phòng và điều trị chứng đau thắt ngực, thiểu năng tuần hoàn não

Hộ tâm đơn Vinapharm Đan sâm,

tam thất

Dự phòng và điều trị: chứng đau thắt ngực do suy vành và cảm giác ngột ngạt trong ngực, các bệnh mạch vành,

xơ cứng động mạch

Hoạt huyết

Nam dược

Công ty cổ phần Nam dược

Đan sâm Hoạt huyết, bổ huyết, lưu thông tuần hoàn

máu, phòng ngừa và điều trị thiểu năng tuần hoàn não, nhồi máu cơ tim…

2.3 CƠ SỞ XÁC ĐỊNH CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT TRỒNG

2.3.1 Cơ sở xác định thời vụ, mật độ và phân bón cho cây trồng

Mật độ, phân bón và thời vụ trồng đã được khẳng định là những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng nói chung và cây dược liệu nói riêng (Đào Văn Núi và cs., 2014; Adeniyan, 2014) Giải quyết tốt vấn đề về khoảng cách mật độ tức giải quyết tốt mối quan hệ giữa sinh trưởng và phát triển của các

cá thể làm cho quần thể cây khai thác tốt nhất khoảng không gian (không khí,

ánh sáng) và mặt đất (khai thác nước, dinh dưỡng trong đất) nhằm thu được sản lượng cao nhất trên một đơn vị diện tích

Mật độ trồng càng dày thì sự cạnh tranh diễn ra càng quyết liệt Dưới đất, cạnh tranh về dinh dưỡng, nguồn nước, để phát triển bộ rễ để nâng đỡ cây và nuôi cây Trên khoảng không gian, để có thể lấy được ánh sáng khi phải cạnh tranh với các cây khác cây sẽ phải tăng trưởng chiều cao một cách tối đa, chính vì vậy sẽ làm cho thân nhỏ, cây yếu, số cành ít, nhỏ, số cặp lá trên cành giảm, sức chống chịu kém

trước các điều kiện ngoại cảnh, khả năng chống đổ kém (Porter et al., 1997)

Khi trồng ở mật độ thưa cây sẽ không phải cạnh tranh nhau nhiều do vậy cây sẽ có điều kiện phát triển tốt cho năng suất cá thể cao nhưng năng suất quần thể lại giảm, bên cạnh đó cây sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi điều kiện ngoại cảnh do tính quần thể bị giảm, khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận cũng bị ảnh hưởng, cỏ dại tăng Khoảng cách trồng thích hợp sẽ giúp cho cây sử dụng được tối đa các điều kiện của đồng ruộng từ đó giúp cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng tích luỹ của cây tăng từ đó có thể tăng năng suất và tăng sản

lượng cũng như hiệu quả kinh tế (Johnson et al., 1998)

Tác giả Kumar et al., (2011) cho rằng bên cạnh kiểu gen tốt, điều kiện cần

và đủ để tạo cho cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt phải kể đến các yếu tố

thời vụ và phân bón Thời vụ khác nhau chính là nhiệt độ, lượng mưa snh sáng

khác nhau do đó ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển, năng suất cây trồng Thời vụ trồng thích hợp cho phép cây trồng được sinh trưởng phát triển trong điều kiện tốt nhất về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa … và cho năng suất cao nhất và ngược lại Lượng phân bón thích hợp là chìa khóa quyết định

năng suất cây trồng (Tariq et al., 2007)

Chất lượng dược liệu trong cây thuốc được quyết định bởi thành phần các chất trong cây Các chất này được tổng hợp chịu ảnh hưởng của rất nhiều các yếu

tố, trong đó kiểu gen, điều kiện ngoại cảnh (thời vụ) mật độ và đặc biệt là yếu tố phân bón được nhiều tác giả khẳng định có ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng dược

liệu (Baranauskiene et al., 2003; Sifola and Barieri, 2006; Dordas, 2009; Babalar

et al., 2010)

Điều đó khẳng định, muốn một loại cây trồng phát huy hết khả năng sinh trưởng cho năng suất chất lượng dược liệu cao trong sản xuất, việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật trồng phù hợp là

cần thiết.Trong đó mật độ, thời vụ và phân bón là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây Cây Đan sâm là cây trồng mới nhập nội vào Việt Nam, là cây dược liệu quý, nhiều triển vọng để phát triển Tuy nhiên, những nghiên cứu góp phần phát triển loài cây này trong sản xuất còn rất hạn chế Đặc biệt thiếu các nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật Do vậy, thực hiện các nghiên cứu này là cần thiết

2.3.2 Phương pháp nhân giống cây Đan sâm

Cây Đan sâm có thể nhân giống hữu tính bằng hạt hoặc vô tính từ rễ củ,

tách chồi và phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al.,

2002; Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Các phương pháp nhân giống cây Đan sâm

giống hữu tính

Phương pháp nhân giống bằng tách chồi

Phương pháp nhân giống từ rễ

Chuyển cây ra đồng ruộng: cuối tháng 10 hoặc khi cây đạt chiều cao 6-10 cm

Không có thông tin

Giâm củ: tháng 2-3

Chuyển cây ra đồng ruộng: khi cây đạt chiều cao 6-10 cm

Mật độ gieo hạt: hàng cách hàng 12 - 15 cm Mật độ trồng: 33 (30-

35 cm) x 23 (20)

Không có thông tin

Mật độ cây: 30-35 x 20-25 cm

2.3.2.1 Nhân giống bằng hạt

Phương pháp nhân giống bằng hạt ở cây Đan sâm gặp nhiều khó khăn do khả năng thụ phấn và tỷ lệ kết hạt thấp, đồng thời hạt chín rải rác nên rất khó thu

hạt Hơn nữa, cây Đan sâm trồng từ hạt cần tới 2 năm để thu dược liệu (Wang et

al., 2002) Tuy nhiên theo nghiên cứu của An et al (2004), nồng độ tanshinone

IIA trong cây gieo từ hạt cao hơn so với cây nhân giống vô tính

2.3.2.2 Nhân giống từ rễ củ

Đây là phương pháp nhân giống cây Đan sâm truyền thống được sử dụng

rộng rãi ở các vùng trồng Đan sâm hiện nay (Zhang and Zhang, 2004; Jiang et al.,

2004) Đây là phương pháp sử dụng rễ củ tươi cây Đan sâm làm vật liệu nhân giống Nhược điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống thấp Theo nghiên cứu của Đào Văn Núi và cs (2014), tỷ lệ tạo chồi từ rễ củ Đan sâm là 61,11% với

hệ số nhân 1,0 chồi/ mẫu

2.3.2.3 Nhân giống bằng phương pháp tách chồi

Cây Đan sâm nhân bằng phương pháp tách chồi có tốc độ sinh trưởng mạnh hơn so với cây nhân bằng các phương pháp khác Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là cây con tách ra phải có đủ rễ để phát triển và khả năng lây

nhiễm bệnh qua các thế hệ cao (Zhang and Zhang, 2004; Wang et al., 2002)

2.3.2.4 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Với ưu điểm là hệ số nhân giống cao, cây giống có chất lượng đồng đều,

phương pháp nhân giống vô tính in vitro đã và đang được áp dụng để nhân nhanh rất nhiều cây dược liệu (Gao et al., 1992; Canter et al., 2005; Debnath et al., 2006; Sato et al., 2006) Đã có rất nhiều nghiên cứu nhân giống Đan sâm bằng

phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật sử dụng các vật liệu nuôi cấy khác

nhau (Wang et al., 2004; Xu and Sun, 2008; Tạ Như Thục Anh và cs., 2014)

2.3.3 Mật độ trồng

Trong các yếu tố kỹ thuật để tăng năng suất cây trồng, ngoài phân bón và cách bón phân thì mật độ quần thể ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của cây trồng Trong trường hợp cây thuốc, mật độ trồng còn ảnh hưởng đến sự

tích lũy hoạt chất mục tiêu (Liu et al., 2006b; Yu et al., 2006) Mật độ trồng quá

dày sẽ dẫn đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, ánh sáng quyết liệt, ảnh hưởng đến

năng suất (Liu et al., 2006b; Yu et al., 2006) Ngược lại, mật độ quá thưa làm

lãng phí đất và nguồn nước

Liu et al (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến khả

năng sinh trưởng phát triển của cây Đan sâm trồng tại tỉnh Shanxi, Trung Quốc Bảy khoảng cách được khảo sát là 20 × 20 cm, 25 × 20 cm, 25 × 25 cm, 25 × 30

cm, 30 × 25 cm, 35 × 25 cm và 35 × 30 cm Kết quả cho thấy tại khoảng cách 20

x 20 cm, tỷ lệ cây sống thấp nhất (47%) trong khi có đến 88% cây sống ở khoảng cách trồng 25 x 20 cm Khoảng cách trồng gần hơn dẫn đến sự che lấp lẫn nhau của các bộ phận trên mặt đất làm hạn chế sự quang hợp của các lá giữa và dưới dẫn đến sự kém phát triển của cây

Ở chỉ tiêu năng suất rễ, khoảng cách 25 x 25 cm (mật độ 16 cây/m2) cho khối lượng rễ đạt cao nhất, cao hơn 20% so với khối lượng rễ thu được khi trồng cây ở khoảng cách 35 x 30 cm và 60% so với khoảng cách 35 x 25 cm

Bên cạnh việc ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của cây, mật độ trồng còn ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất tanshinone IIA ở cây Đan sâm Nhìn chung, mật độ cao ảnh hưởng đến sự phân bố của rễ trong đất, số lượng rễ nhánh

và chiều dài rễ, do vậy ảnh hưởng đến diện tích bề mặt của lớp ngoại bì của rễ dẫn đến làm tăng hoặc giảm hàm lượng tanshinone IIA trong cây Đan sâm Hàm lượng tanshione IIA đạt cao nhất khi trồng cây Đan sâm ở khoảng cách 25 x 20 cm (20 cây/m2) Ngược lại, hàm lượng tanshinone IIA thấp hơn khi trồng cây ở mật độ cao

hơn (khoảng cách 25 x 25 cm và 35 x 35 cm) (Liu et al., 2006)

Hiện nay, ở các quy trình trồng cây Đan sâm thường sử dụng mật độ trồng khá cao với khoảng cách hàng 25 cm hoặc 30 cm, khoảng cách cây 20 cm hoặc

25 cm Mật độ trồng này kích thích sự tổng hợp hoạt chất tanshione IIA (Wang et

al., 2003; Jiang et al., 2004)

Đối với cây Đan sâm đất trồng cần chọn đất phù sa, đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều màu, cao ráo, thoát hơi nước Sau khi cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 – 25

cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nước Dùng 15 – 20 tấn phân chuồng

ủ với 1,4 – 2,8 tấn tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho một heta Tốt nhất, nên bón theo hốc để tiết kiệm phân và hạn chế cỏ dại Hốc được chuẩn bị với khoảng cách 30 x 30 cm Sau đó đặt mầm giống, lấp đất và tưới giữ ẩm Đan sâm thường trồng trên đất tốt, đủ ẩm nên cỏ dại mọc nhiều Vì vậy, cần thường xuyên làm cỏ, xới xáo cho đất tơi xốp, thông thoáng Chú ý về sau càng phải xới mạnh, cần bón thúc 2 - 3 lần, mỗi lần dùng 80 - 100 kg ure pha loãng để tưới cho mỗi heta, khoảng cách giữa hai lần bón thúc là 25 - 30 ngày (Zhang and Cheng, 1999)

2.3.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của cây Đan sâm

Cây Đan sâm hấp thu rất đa dạng các chất dinh dưỡng Do có bộ rễ phát triển nên khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây Đan sâm rất mạnh, không chỉ từ

các chất ở lớp đất bề mặt, mà cả từ các chất ở các lớp đất sâu (Chen et al., 1991; Chen et al., 1992) nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của cây Đan sâm thông qua

thí nghiệm trồng cây trên cát và cung cấp dinh dưỡng calcium nitrate, ammonium sulphate, potassium dihydrophosphate và magnesium sulfate ở các hàm lượng khác nhau Kết quả cho thấy sinh khối thân lá và rễ cây Đan sâm cao hơn khi tăng lượng dinh dưỡng bổ sung Năng suất rễ cây Đan sâm khi trồng trong điều kiện đủ dinh dưỡng cao hơn 40,7% so với cây Đan sâm khi trồng trong điều kiện

thiếu dinh dưỡng (Chen et al., 1992)

Chen et al (1992) cũng đã xác định nồng độ N và P trong cây và sinh

khối rễ khô tại các liều lượng bón phân khác nhau và tại các thời điểm sinh trưởng khác nhau Hai thời điểm hấp thụ N và P cao nhất của cây Đan sâm là 90 -

100 ngày và 150 - 170 ngày sau khi trồng Ở giai đoạn đầu tiên, cây Đan sâm phát triển mạnh các bộ phân sinh dưỡng, sau đó mới bắt đầu chuyển sang giai đoạn tích lũy hoạt chất thứ cấp, do vậy, bón phân kết hợp N và P ở các liều lượng khác nhau làm tăng đáng kể sinh khối rễ khô so với đối chứng (không bón phân)

90 - 100 ngày sau khi trồng là thời điểm lan rộng của rễ cây Đan sâm, do vậy nhu

cầu N và P của cây cao hơn (Han et al., 2003) Giai đoạn thứ 2 (150 – 170 ngày

sau khi trồng) là thời điểm chuyển tiếp từ giai đoạn chín của hạt sang giai đoạn lan rộng của nhóm rễ thứ 2 và cây hấp thụ nhiều dinh dưỡng hơn Mặt khác, kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra, nồng độ chlorophyll trong cây ở các công thức bón

phân cao hơn so với công thức đối chứng không bón phân N kích thích quá trình quang hợp của cây Đan sâm, kết quả làm nâng cao sự tích lũy chất khô trong cây

(Han and Liang, 2005) Theo Han et al (2003), tăng lượng phân bón có chứa N

và P làm tăng khả năng hấp thu N và P từ đất của cây Đan sâm

Bên cạnh các nguyên tố đa lượng, thì các nguyên tố vi lượng như Bo, Mn

và Fe có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và sự tích lũy hợp chất mục tiêu của cây Đan sâm (Han and Liang, 2005)

2.3.4.2 Ảnh hưởng của phân bón đến sự sinh trưởng, phát triển của cây Đan sâm

Chen et al (1991) bón bổ sung N và P cho cây Đan sâm ở các hàm lượng

khác nhau và nhận thấy khi bón bổ sung 225 kg/ha ammonium sulphate và 300 kg/ha super phosphate cho sinh khối rễ đạt cao nhất, tăng 26,66% so với đối chứng (bón 29,985 kg/ha)

Yang and Teng (2005) nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại phân bón (phân hỗn hợp, phân chuồng và phân vi sinh) đến sự sinh trưởng của rễ cây Đan sâm Kết quả cho thấy, phân chuồng đóng vai trò lớn nhất đến năng suất rễ Sinh khối

rễ tươi đạt được cao nhất (23.200 kg/ha) khi bón phân kết hợp 750 kg/ha phân hỗn hợp, 11.244 kg/ha phân chuồng và 22,5 kg/ha phân vi lượng chứa Bo

2.3.4.3 Ảnh hưởng của phân bón đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu

N và P đóng vai trò trái ngược trong sự tích lũy tanshione IIA và

danshensu Trong nghiên cứu của Han et al (2005); Han and Liang (2005) hàm

lượng tanshione IIA và danshensu giảm khi tăng lượng phân N, trong khi đó hàm lượng tanshinone IIA và danshensu tăng khi tăng lượng phân bón P Khi bón phân cân đối giữa N, P và K sẽ làm tăng tối đa sự tích lũy tanshione IIA

Mặt khác, tăng lượng phân bón chứa nguyên tố vi lượng Fe, Bo, Zn, Mn làm tăng khả năng tích lũy các hoạt chất mục tiêu trong rễ Đan sâm So với công thức đối chứng không bón phân vi lượng, khi bón bổ sung phân vi lượng có thể

làm tăng hàm lượng danshensu lên 60% (Han et al., 2005)

2.4 KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO

2.4.1 Khái niệm và cơ sở của khoa học của phương pháp nhân giống in vitro

Nhân giống bằng nuôi cấy mô, hoặc vi nhân giống (micropropagation) là

tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được

tách khỏi cây đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật Các bộ phận

được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (Ngô Xuân Bình, 2009)

Ưu điểm chính của nuôi cấy mô là cây mô được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt Một ưu điểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số nhân cao hơn nhân giống bằng hom, từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một trong những biện pháp làm sạch bệnh Vì thế mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) ông là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng: Mọi tế bào bất

kỳ của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cá thể hoàn chỉnh Các tế bào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Ngô Xuân Bình, 2009)

Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả

của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao

mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) (Nguyễn Quang Thạch, 2000)

Ngày nay, một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được áp dụng phổ biến bao gồm:

Nuôi cây đỉnh sinh trưởng: Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên) Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó, chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác

Nuôi cấy bằng mô sẹo: trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Nuôi cấy tế bào đơn: Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng

và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng, tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào

mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp

Nuôi cấy tế bào trần: thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose,

có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Khi mất thành tế bào, tế bào trần, hai tế bào trần có thể dung hợp với nhau, tạo ra con lai Có thể sử dụng để cải thiện các đặc tính quý của cây trồng

Nuôi cấy hạt phấn: Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng, nhằm tạo cây đơn bội (Ngô Xuân Bình, 2009)

2.4.2 Tổng quan tài liệu về nghiên cứu nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng

cây dược liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lượng một cách chủ động cho

sản xuất Tuy nhiên để nhân giống thành công cây trồng trong in vitro, rất nhiều

tác giả đã khẳng định, quá trình nhân giống chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh cây từ các bộ phận khác nhau (Sharswat and Chand, 2004) Có rất nhiều môi trường dùng để

nuôi cấy in vitro, nhưng hầu hết trong in vitro đều sử dụng môi trường nuôi cấy là

MS (Murashige and Shoog, 1962), bởi vì môi trường MS là môi trường cây thích

hợp nhất vì nó chứa đựng tất cả các nguyên tố cần thiết cho cây trồng sinh trưởng

trong môi trường in vitro Tác giả Diallo et al (2008) cho rằng việc nghiên cứu tạo môi trường thích hợp là cần thiết giúp tế bào trần tái sinh tốt trong in vitro

Cơ quan thực vật sử dụng nuôi cấy in vitro (lá, cuống lá, lá mầm, phôi,

rễ cũng là một trong những nhân tố quan trọng quyết định thành công nuôi cấy

in vitro (Gubis et al., 2003; Kumar et al., 2011) Có sự khác biệt giữa các cơ quan

thực vật ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro được cho là do mức độ khác nhau về

hormon nội sinh trong cây khác nhau giữa các cơ quan trong cây Lá được cho là

bộ phận sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy vì diện tích bề mặt lớn (Tyagi et al.,

2001) Trong một số nghiên cứu khác, sử dụng bộ phận nuôi cấy là thân cây loài

Kiểu gen là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khả

năng tái sinh tế bào nuôi cấy in vitro (Reddy et al., 2008; Kumar and Reddy,

2011) Các tác giả cho rằng, các loài khác nhau một phần do hormon nội sinh khác nhau, đặc biệt là tác động của hormon cytokinins trong giai đoạn đầu, mặc

dù cơ chế chưa được rõ

Chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy in vitro là hợp chất

hữu cơ tự nhiên được tổng hợp ở thực vật bậc cao, nó có ảnh hưởng lớn đến sự

sinh trưởng, phát triển của cây trong in vitro Cân bằng giữa auxin và cytokinin là

một trong những quan trọng nhất cho quá trình hình thành rễ và mầm bật định

(Kumar and Reddy, 2011) Hầu hết trong nhân giống in vitro đều sử dụng

cytokinins là kinetin, BA và 2 ip Auxin (IAA, IBA, NAA hoặc 2,4 D) cũng thường xuyên được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm thúc đẩy sự hình thành callus và điều hòa sự hình thành và phát triển Đặc biệt chú trọng kết hợp với cytokinin (dẫn theo Kumar and Reddy, 2011)

Điều kiện môi trường vật lý cũng tác động đến in vitro Phản ứng của cây

nuôi cấy mô với quá trình trao đổi khí và độ ẩm bên trong bình nuôi được ghi nhận bởi Read and Preece (2003) Trao đổi khí CO2 trong bình, ảnh hưởng đến quá trình quang hợp, hô hấp của cây Các tác giả khẳng định rằng độ ẩm tương đối trong bình thích hợp từ 98 - 100% (Kumar and Reddy, 2011)

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố môi trường điều khiển sự sinh trưởng

và phát triển của cây trong điều kiện in vitro, bởi vì liên quan đến hoạt động

quang hợp, quang hô hấp và quá trình phát sinh hình thái (Read and Preece, 2003) Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình sinh trưởng của rễ và

mầm, trong khi đó, trong điều kiện tối sẽ thích hợp cho quá trình hình thành rễ, quá trình này được điều khiển bởi hornmon nội sinh IAA Khi nghiên cứu về yếu tố

nhiệt độ, hầu hết các tác giả đều cho rằng, nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy in vitro

trong khoảng 20 - 270C tùy thuộc vào loài ( Read and Preece, 2003)

Nhân sâm là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng rộng rãi như một vị

thuốc bổ, một dược phẩm quý giá Furuya et al (1973) đã nuôi cấy mô callus

nhân sâm để thu nhận hợp chất saponins và sapogenins Các nghiên cứu trên cây nhân sâm chủ yếu tập trung vào nhân sinh khối nhằm phục vụ cho công nghiệp

dược Năm 1994, Choi nghiên cứu nhân nhanh in vitro nhân sâm thành công trên quy mô công nghiệp Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) là một loài sâm đặc

hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973, không chỉ là loài sâm quý của

Việt Nam mà còn trên thế giới Nhân giống vô tính in vitro trên đối tượng sâm Ngọc Linh đã được thực hiện và hành công bởi Nhut et al (2010) Sau đó, Nhut

et al (2012) đã nghiên cứu thành công quy trình tạo phôi từ thân rễ của cây sâm

Ngọc Linh Vũ Thị Hiền và cs (2014) đã thành công trong việc cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ lá và cuống lá

Đinh lăng là một loài thực vật chứa nhiều saponin, có tác dụng tích cực

chống oxy hóa, chống stress Sau 3 năm nghiên cứu (2008 - 2011), Salwa et al (2014) đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro từ đoạn thân non

mang mầm ngủ Tại Việt Nam, Phạm Thị Tố Liên và cs (2007) đã tạo thành

công phôi vô tính thông qua cảm ứng callus từ mô lá non in vitro cây đinh lăng Reddy et al (1998) đã nhân giống in vitro thành công cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre), một cây thuốc quý cho bệnh nhân tiểu đường, với hệ số

nhân trên môi trường MS+ 5 mg/l BA+ 0,2 mg/l α-NAA đạt 7 lần Sau đó,

Komalavalli and Rao (2000); Arunakumara et al (2013) cũng đã nhân giống thành công dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho hệ số nhân

giống cao, cây giữ nguyên đặc tính so với cây mẹ

Chow et al (1982) đã nghiên cứu thành công nhân loài lan kim tuyến

Anoectochilus formosannus từ hạt với môi trường nhân nhanh chồi là môi trường

½ MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l

α-NAA Tsay et al (2002) đã sử dụng các mắt đốt thân lấy từ cây lan kim tuyến

Anoectochilus formosanus Hayata 2 năm tuổi làm vật liệu nhân nhanh in vitro trên

môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-NAA + 2% than

hoạt tính Tại Việt Nam, Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) đã xây dựng thành

công quy trình nhân giống in vitro cây lan kim tuyến Anoectochilus setaceus

Blume từ mắt đốt ngang thân cho hệ số nhân chồi cao (6,55 chồi/mẫu) và chất

lượng cây tốt Trương Thị Bích Phượng và cs (2013), nghiên cứu nhân nhanh in

vitro cây lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl từ đỉnh sinh trưởng

và đoạn thân mang mắt ngủ với hệ số nhân chồi đạt 4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 1,0 mg/l Kinetin+ 0,3 mg/l α-NAA

Trên chi Hibiscus, Samanthi et al (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của

BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Hibiscus cannabinus từ vật liệu là

chồi non cùng được cắt ra từ hạt nảy mầm 10 ngày tuổi Kết quả cho thấy hệ số nhân chồi đạt cao nhất (11 lần) trên môi trường MS có bổ sung 8,8 µM BA

Đã có rất nhiều nghiên cứu nhân nhanh in vitro các loài lan thuộc có giá trị dược liệu cao thuộc chi Dendrobium như lan Phi Điệp vàng - Dendrobium

chrysanthum (Subarna et al., 2010); lan Dendrobium wangliangii (Dake et al.,

2013), lan Thạch hộc - Dendrobium nobile Lindl (Vũ Ngọc Lan và cs., 2013); lan Hoàng thảo long nhãn – Dendrobium fimbriatum Hook (Nguyễn Thị Sơn và

cs., 2012)…

Một đối tượng khác là cây ba kích (Morinda officinalis How) cũng được tái

sinh thành công với vật liệu ban đầu là đoạn thân mang chồi nách trên môi trường thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + 1 mg/l BA với tỷ lệ chồi tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy là 96,6% Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 3,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân là 10,13 lần (Hoàng Thị Thế và cs., 2013)

2.4.3 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm

Nhiều công trình nhân giống vô tính cây Đan sâm với mục đích tạo ra

giống chất lượng cao đã được công bố Cai et al (1991) tiến hành nhân nhanh

cây Đan sâm từ vật liệu mô lá Tỷ lệ mô lá tái sinh tạo chồi đạt cao nhất trên môi trường MS + 0,5 – 1,0 mg/l BA Môi trường cảm ứng ra rễ tốt nhất cho chồi Đan sâm là ½ MS + 0,2 – 1,0 mg/l IBA

Theo nghiên cứu của Zhao et al (2003), đoạn thân non cây Đan sâm là vật

liệu thích hợp để cảm ứng tạo callus trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l 2,4D Để tái sinh và nhân nhanh chồi, callus được chuyển sang môi trường

MS + 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA Bổ sung IBA ở nồng độ 0,5 mg/l vào môi

trường ½ MS cho hiệu quả ra rễ cao hơn so với khi bổ sung IAA hoặc α-NAA

Feng et al (2004) sử dụng đoạn thân non, lá và cuống lá làm vật liệu nhân

nhanh cây Đan sâm thông qua con đường hoạt hóa chồi nách và tạo chồi bất định 100% đoạn thân mang mắt ngủ cảm ứng tạo chồi trên môi trường MS + 1,0 mg/l BA và hệ số nhân chồi đạt 15 lần khi chuyển chồi sang môi trường nhân nhanh MS + 1,0 mg/l BA + 0,01 mg/l α-NAA Trên môi trường MS + 0,5 (hoặc 2,0) mg/l BA, 100% lá và cuống lá cảm ứng tạo chồi bất định; hệ số nhân chồi đạt 24 lần trên môi trường MS 1,0 mg/l BA Môi trường cảm ứng chồi Đan sâm ra rễ tốt nhất là ½ MS 0,1 mg/l IBA Để thu được tỷ lệ cây sống 100% khi

trồng trên giá thể đất, cây Đan sâm in vitro được trồng trong hệ thống thủy canh

vài ngày trước khi chuyển ra trồng trên đất

Xu and Sun (2008) khảo sát khả năng nhân nhanh in vitro cây Đan sâm từ

ba loại vật liệu là đoạn thân, cuống lá và lá của cây in vitro gieo từ hạt 1 tháng

tuổi và nhận thấy lá là nguồn vật liệu tốt nhất để cảm ứng tạo chồi bất định Trên môi trường MS + 1,0 mg/l BA, 80% mô lá cảm ứng tạo chồi Môi trường MS + 1,0 mg/l cũng là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi với hệ số nhân đạt 25

chồi/mẫu Để ra rễ cho chồi in vitro, các chồi được chuyển sang môi trường MS

+ 0,1 mg/l IBA + 10 g/l sucrose với tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 95%

Tại Việt Nam, trước nghiên cứu này, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu

liên quan đến nhân nhanh in vitro cây Đan sâm được thực hiện bởi Tạ Như Thục

Anh và cs (2014) Tạ Như Thục Anh và cs (2014) đã khảo sát ảnh hưởng của

các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân in vitro cây Đan sâm sử dụng

vật liệu là chồi mầm từ củ giống Nghiên cứu đã chỉ ra các chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh

và kích thích ra rễ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro

2.5 TẠO VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP

Sự hình thành rễ tơ nhờ chuyển các gen cảm ứng tạo rễ tơ của vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật là một trong những con đường rất

thuận lợi nhằm làm tăng sinh khối rễ lớn, phục vụ sản xuất và thu nhận các hợp chất tự nhiên với số lượng lớn

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes, một loại vi khuẩn đất gram âm, với tế bào vật chủ Rễ