NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA ISOFLAVONOID TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.)

Đậu tương là cây trồng khá phổ biến trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Hạt đậu tương được sử dụng để chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhau như đậu phụ, bột đậu nành, sữa đậu nành, tào phớ, dầu đậu nành…Đây là những loại thức ăn được sử dụng thường xuyên của một số nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Ngoài giá trị dinh dưỡng cao do trong thành phần có rất nhiều loại acid amin trong đó có 8 acid amin cần thiết thì trong hạt đậu tương còn có chứa một số isoflavonoid là genistein, daidzein, glycitein và các dạng glycosid của chúng có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe.Các isoflavonoid trong hạt đậu tương là những chất có tác dụng chống oxy hóa mạnh. Bên cạnh đó chúng còn được xếp vào nhóm các phytoestrogen – nhóm chất lấy từ thực vật có tác dụng tương tự như hormone sinh dục 17β estradiol. Sự kết hợp 2 tính chất này của các isoflavonoid trong hạt đậu tương giúp cho chúng có được tác dụng tốt trong phòng ngừa một số bệnh như ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư ruột kết..; các bệnh về tim mạch như tăng lipid máu, vữa xơ động mạch; ngăn ngừa loãng xương… Các isoflavonoid này còn có tác dụng tốt giúp cải thiện một số hội chứng ở phụ nữ tiền mãn kinh như cơn bốc hỏa, chứng hay quên, mất tập trung…

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY

HÓA IN VITRO CỦA ISOFLAVONOID TỪ

HẠT ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.)

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

MỤC LỤCTrang phụ bìa

1.2.3 Tác dụng sinh học của isoflavonoid trong hạt đậu tương 14

2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong hạt đậu tương 21

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong hạt đậu tương 28

3.2.2 Chiết xuất isoflavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt 36

3.3 Xây dựng quy trình chiết xuất isoflavonoid và làm giàu

isoflavonoid từ hạt đậu tương

42

3.7.1 Về định tính các thành phần chính trong hạt đậu tương 53

EtOH Ethanol

HDL-Cholesterol High Density Lipoprotein

Cholesterol

Cholesterol tỉ trọng cao

LDL-Cholesterol Low Density Lipoprotein

Cholesterol

Cholesterol tỉ trọng thấp

phẩm làm từ Đậu tương

3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong hạt đậu tương 33

3.2 Hàm lượng cắn và hiệu suất chiết hồi lưu bằng 3 dung môi

MeOH, EtOH 90% và EtOAc

35

3.3 Kết quả định tính isoflavonoid, chất béo, acid amin và đường

của 3 dịch chiết EtOH 90%, MeOH và EtOActừ hạt đậu tương

36

3.4 Hàm lượng cắn và hiệu suất chiết bằng phương pháp ngấm kiệt

với dung môi EtOH

37

3.5 Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 3 dịch chiết EtOH

40%, 70% và 90%từ hạt đậu tương

38

3.6 Hàm lượng cắn của 3 dịch chiết EtOH 40%, 70% và 90% sau

khi loại chất béo, acid amin và đường

40

3.7 Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 3 dịch chiết EtOH

40%, 70% và 90%từ hạt đậu tương sau khi đã loại chất béo,

acid amin và đường

41

3.8 Giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ dịch chiết isoflavonoid 44

3.9 Kết quả hoạt độ chống oxy hóa của 4 dịch chiết EtOH 40%,

EtOH 70%, EtOH 70% đã làm giàu isoflavonoid và EtOH 90%

52

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.4 Cấu trúc hóa học của các isoflavonoid trong hạt đậu tương 13

1.5 Cấu trúc hóa học của Oestradiol, diethylstilbenstrol và 2

hormone thực vật genistein và daidzein

16

2.2 Sơ đồ chiết xuất Isoflavonoid từ hạt Đậu tương bằng

phương pháp chiết hồi lưu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đậu tương là cây trồng khá phổ biến trên thế giới, trong đó có ViệtNam Hạt đậu tương được sử dụng để chế biến thành nhiều loại thức ăn khácnhau như đậu phụ, bột đậu nành, sữa đậu nành, tào phớ, dầu đậu nành…Đây

là những loại thức ăn được sử dụng thường xuyên của một số nước châu Á,trong đó có Việt Nam Ngoài giá trị dinh dưỡng cao do trong thành phần córất nhiều loại acid amin trong đó có 8 acid amin cần thiết thì trong hạt đậu

tương còn có chứa một số isoflavonoid là genistein, daidzein, glycitein và cácdạng glycosid của chúng có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe.

Các isoflavonoid trong hạt đậu tương là những chất có tác dụng chốngoxy hóa mạnh Bên cạnh đó chúng còn được xếp vào nhóm các phytoestrogen– nhóm chất lấy từ thực vật có tác dụng tương tự như hormone sinh dục 17βestradiol Sự kết hợp 2 tính chất này của các isoflavonoid trong hạt đậu tươnggiúp cho chúng có được tác dụng tốt trong phòng ngừa một số bệnh như ungthư vú, ung thư buồng trứng, ung thư ruột kết ; các bệnh về tim mạch nhưtăng lipid máu, vữa xơ động mạch; ngăn ngừa loãng xương… Cácisoflavonoid này còn có tác dụng tốt giúp cải thiện một số hội chứng ở phụ nữtiền mãn kinh như cơn bốc hỏa, chứng hay quên, mất tập trung…

Lượng isoflavonoid có trong thực phẩm sử dụng hàng ngày thường làrất thấp Để phát huy được những tác dụng quý báu trên, isoflavonoid cầnđược bổ sung dưới dạng thuốc hay thực phẩm chức năng

Vì lí do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất,

phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của isoflavonoid từ hạt Đậu tương (Glycine max L.)” với 2 mục tiêu nghiên cứu như sau:

1- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và nhận dạng các isoflavonoid từhạt đậu tương

2- Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của isoflavonoid in vitro.

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Xét vềcấu trúc hóa học thì flavonoid có cấu trúc theo kiểu C6-C3-C6 tức là khung

cơ bản gồm 2 vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon [1]

Hình 1.1: Khung cấu trúc flavonoid

Trong đa số các trường hợp thì mạch carbon đóng vòng với vòng A vàtạo nên dị vòng có dị tố oxy C Dị vòng C có thể là:

Hình 1.2: Các dạng cấu trúc vòng C của flavonoid

Sự phân loại flavonoid dựa vào vị trí của các gốc aryl (vòng B) và cácmức độ oxy hóa của mạch 3 carbon Người ta chia ra: euflavonoid là cácflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3,neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4 Người ta còn phân biệt biflavonoid lànhững flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid,flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

Sự khác nhau giữa isoflavonoid và các flavonoid khác chính là bộkhung cơ bản: flavonoid có cấu trúc khung là 2-phenylchroman, trong khi đókhung cơ bản của isoflavonoid là 3-phenylchroman [1], [16]

o

3-Phenyl chroman

Hình 1.3: Cấu trúc 2-phenyl chroman và 3-phenyl chroman

Isoflavonoid là một phân nhóm đặc biệt và khá lớn của flavonoid,nhóm chất này có khung cấu trúc là 3-phenylchroman được sinh tổng hợp từdẫn chất 2-phenylchroman bằng phản ứng dịch chuyển 1,2-aryl Sự phân bốisoflavonoid trong hệ thực vật bậc cao là hạn chế nhưng sự đa dạng về cấutrúc của isoflavonoid lại rất lớn Sự đa dạng này không chỉ liên quan đếnkhung cấu trúc 3-phenylchroman mà còn liên quan đến mức độ oxy hóa củakhung cấu trúc này cũng như sự có mặt của dị vòng Phân loại nhómisoflavonoid cũng dựa trên hai tiêu chuẩn trên để phân loại Isoflavonoid đượcchia làm các nhóm nhỏ theo mức độ oxy hóa của dị vòng C, tạo thành cácnhóm isoflavone, isoflavanone, rotenoid, pterocarpan, isoflavan, isoflavanon,3-arylcoumarin, coumestan [23] Bảng 1.1 trình bày tóm tắt các phân nhómcủa isoflavonoid [1], [23]

có 130 cấu trúc mới được phát hiện.

số 4 Isoflavanol được tìm thấy ở một vài loài

như G glabla, G inflata

7

ISOFLAV-3-EN

O

Được tìm thấy ở các loài Glycyrrhiza như G.

glabla hay G inflata.

8

3-ARYLCOUMARIN

O O

3- arylcoumarin là một nhóm nhỏ củaisoflavonoid Đến năm 1985 mới chỉ pháthiện được 6 chất Đến nay có thêm 3 chấtmới được phát hiện Tất cả các chất này đềuđược tìm thấy từ rễ các loài thuộc chi

Glycyrrhiza.

O O

O

pterocarpan đã được oxi hóa hoàn toàn Các

loài thuộc chi Glycyrrhiza được xem như là

nguồn chính chứa coumestan Ngoài racoumestan còn có ở nhiều loài quen thuộc

như Glycine max, Phaseolus lunatus,

Pueraria lobata, Wedelia calendulacea, Eclipta alba.

là listein được phân lập từ loài Piscidia

erythrina Cho đến nay số chất trong phân

nhóm này đã tăng lên 13 chất

Pachyrhizus erosus.

α-METHYLDEOXYBENZOIN

(O

O )

Angolenin cùng với một vàimethyl ether và cadinyl ether đượcphân lập từ một vài loài

chất được phân lập Đến nay, nhómchất này đã tăng lên đáng kể,không chỉ có isoflavan dimer màcòn có isoflavonoid-isoflavonoid,isoflavonoid-stilben, isoflavonoid-phenylpropanoid liên kết với nhau

qua dây nối ether.

1.1.2 Tác dụng sinh học của isoflavonoid

sự hình thành và loại bỏ các gốc tự do khi chúng được sinh ra Bên cạnh đóthì trong các nguồn thức ăn cũng như thuốc đưa vào cũng có những chấtchống oxy hóa như vitamin E, β-caroten, flavonoid… cũng có tác dụng chốnglại sự hình thành của các gốc tự do Khi có sự mất cân bằng giữa quá trìnhsinh ra gốc tự do và quá trình loại bỏ gốc tự do thì các gốc tự do sinh ra sẽ gâytác hại đối với cơ thể Các gốc tự do phản ứng và làm biến đổi cấu trúc vàchức năng của một số thành phần của tế bào, chẳng hạn như lipid ở màng tếbào, lipoprotein, RNA, DNA, và là nguyên nhân tạo nên nhiều bệnh mãn tínhnhư ung thư, tim mạch, quá trình lão hóa, các bệnh về khớp, rối loạn thầnkinh…[28], [32]

Tác dụng chống oxy hóa của các isoflavonoid chủ yếu là các nhómhydroxyl phenol ở vòng B và vòng A, các nhóm này có khả năng nhườngH/electron Các isoflavonoid tác dụng chống oxy hóa theo hai cách: phản ứng

trao đổi H/electron với các gốc tự do nhờ các nhóm OH phenol trong phân tử

và thúc đẩy hoạt động của các enzyme chống oxy hóa nội sinh nhưglutathione peroxidase, superoxide dimutase, catalase Ngoài ra thì có một

số tài liệu còn đề cập đến khả năng chống oxy hóa của các isoflavone bằngcách tạo chelat với đồng và sắt, là những chất tham gia làm thúc đẩy phản ứngoxy hóa tạo ra các gốc tự do trong cơ thể [28]

1.1.2.2 Tác dụng trên hệ thống tim mạch

Các isoflavonoid ngăn cản quá trình oxy hóa LDL-Cholesterol, làmgiảm Cholesterol toàn phần trong đó làm giảm LDL-Cholesterol và làm tăngHDL-Cholesterol do vậy làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch Isoflavonoidnhư puerarin, daidzein lại có tác dụng hạ huyết áp, chống loạn nhịp tim Trêntuần hoàn não, chúng làm giảm trợ lực mạch máu vỏ não, tăng lưu lượng máuqua não [7], [16], [24], [28], [32]

1.1.2.3 Chống ung thư

Một số isoflavonoid (genistein) có khả năng ức chế sự phát triển củamột số dòng tế bào gây ung thư như dòng tế bào DU145 (gây ung thư tuyếntiền liệt), MCF-7 (gây ung thư vú), HL-60 (ung thư tủy sống), MOLT-4 (ungthư tế bào lympho) Có rất nhiều giả thuyết giải thích khả năng chống ung thưcủa các isoflavonoid Giả thuyết được nói đến nhiều nhất chính là khả năngchống oxy hóa, ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do của các isoflavonoid.Các gốc tự do tác động tới các DNA gây ra đột biến các DNA Sự tích tụ cácDNA bị đột biến dẫn đến sự phát triển bất thường của tế bào Như vậy, cácgốc tự do mang nhiều đặc trưng của chất gây ung thư Các isoflavonoid có tácdụng trực tiếp hay gián tiếp qua thúc đẩy hoạt động của các enzyme chống

oxy hóa nội sinh ngăn chặn sự hình thành và tác động của các gốc tự do nên

có khả năng ngăn ngừa ung thư [16], [22], [24], [28], [29], [32]

Ngoài ra còn có các giả thuyết khác giải thích khả năng chống ung thưcủa các isoflavonoid như ức chế sự hình thành mạch, ức chế tyrosine kinase,hay hoạt tính kháng oestrogen (oestrogen kích thích sự phát triển của một sốdòng tế bào ung thư, do một số isoflavonoid có khả năng gắn với thụ thểoestrogen nên cạnh tranh tác dụng với oestrogen, hạn chế sự phát triển của tếbào ung thư)

1.1.2.4 Hoạt tính Estrogen

Một số isoflavonoid, được gọi là các phytoestrogen, có tác dụng giốngnhư oestrogen, một hormone sinh dục nữ Phytoestrogen là những hợp chất tựnhiên có nguồn gốc từ thực vật, có khả năng gây ra tác dụng oestrogen hoặcđối kháng tác dụng oestrogen Các nhóm hợp chất thiên nhiên có tính chấtphytoestrogen gồm isoflavonoid, stilben, lignan và coumestan

Vào những năm 1940, lần đầu tiên người ta phát hiện ra rằng một vàihợp chất có nguồn gốc từ thực vật có thể gây ra tác dụng tương tự hoạt tínhoestrogen Những con cừu gặm cỏ trên cánh đồng mọc nhiều cây cỏ ba lá đỏ

(Trifolium uniflorum) gặp nhiều các vấn đề về sinh sản Những con non thì có

nhiều dấu hiệu phát dục sớm, những con cừu cái không thể mang thai hoặcnhững con đang mang thai lại thường bị sảy thai Về sau người ta tìm ra

nguyên nhân là do cây cỏ ba lá (Trifolium uniflorum) mọc với số lượng lớn

trên những cánh đồng cỏ này chứa một hàm lượng lớn các isoflavonoid làformononetin và biochanin A Đây cũng là những phytoestrogen đầu tiênđược phát hiện [29]

Trong những năm gần đây mối quan tâm của các nhà khoa học đối vớicác hormone thực vật đã tăng lên nhanh chóng khi các nhà khoa học thấy liệupháp điều trị thay thế hormone cho phụ nữ tuổi tiền mãn kinh không an toàn

và hiệu quả như mong muốn Sự phổ biến của các hormone thực vật trong chế

độ ăn uống và tác dụng sinh học của chúng đang rất được các nhà khoa họcquan tâm [30]

Nghiên cứu dịch tễ một số bệnh ung thư phụ thuộc oestrogen như ungthư vú, ung thư tử cung, cho thấy lượng phytoestrogen trong khẩu phần ăncủa người châu Á cao hơn trong khẩu phần ăn của người châu Âu và Mỹ cùngvới tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn người châu Âu và Mỹ Nhóm người châu Á di cưsang Mỹ có tỷ lệ bệnh cao hơn nhóm người sống tại chính nước họ [24], [28],[30], [32]

Theo nhiều kết quả nghiên cứu, một số isoflavonoid có cấu trúc hóahọc tương tự như các oestrogen nội sinh và gây ra tác dụng đối kháng hay chủvận với oestrogen Tác dụng đối kháng hay chủ vận này phụ thuộc vào nồng

độ của chúng hoặc các mô đích mà chúng tác dụng Trong các isoflavonoidthì genistein là chất có hoạt tính oestrogen mạnh nhất [16],[19],[28],[32]

Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc sử dụng các phytoestrogen,trong đó có các isoflavonoid với liều cao có tác dụng cải thiện rõ rệt các triệuchứng do thiếu hụt oestrogen ở các phụ nữ mãn kinh mà không gây ra các tácdụng phụ nghiêm trọng như liệu pháp thay thế hormone

1.1.2.5 Các tác dụng khác

Các isoflavonoid có tác dụng chống viêm giống như nhóm flavanon, arylcoumarin, dihydroflavonon, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, biflavon,

4-4-arylcoumarin, 4-arylchroman Tác dụng này được chứng minh bằng thựcnghiệm trên mô hình ức chế sinh tổng hợp prostagladin [17]

1.2 Tổng quan về cây đậu tương Glycine max (L.) Merr.

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Theo hệ thống phân loại mới của Takhtajan thì loài Glycine max (L.)

Merr Thuộc chi Glycine Willd., họ đậu Fabaceae (Papilionaceae), bộ Đậu (Fabales), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [10],[30].

Đậu tương là cây thảo đứng, sống hàng năm, cao từ 40 – 80cm Thâncành mảnh, có lông màu trắng Lá kép mọc so le, gồm 3 lá chét hình bầu dụchoặc trái xoan, gốc tròn, đầu nhọn, dài từ 3 – 12cm, rộng 2 – 8cm, lá chét bênlệch Hoa dầy, trắng hay tím, xếp thành chùm ở gốc Quả đậu, có lông mềmmàu vàng, mọc thõng xuống, dài 3 – 4cm, hơi thắt lại ở giữa các hạt Hạt 2, 3,

5 thận dài, màu trắng vàng Việt Nam phân biệt rõ ràng đậu nành hay đậutương (hạt màu vàng nhạt) với hạt đậu đen, đậu đỏ… nhưng trong các tài liệu

nước ngoài với tên khoa học Glycine soja hay Glycine max hay Soja hispida

người ta dùng chỉ nhiều loại đậu với màu vàng nhạt, màu nâu, màu đen [6],[13]

Từ lâu, Đậu tương đã được sử dụng làm thực phẩm, nhất là ở các nướcchâu Á Người ta cho rằng Đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc rồi sau đólan ra các nước Việt Nam, Malaysia, Nhật Bản, Triều Tiên Ở châu Âu mớibiết đến Đậu tương vào đầu thế kỷ 18 và việc trồng trọt bắt đầu thực hiện ởLiên Xô cũ nhưng ngược lại việc trồng Đậu tương phát triển nhanh chóng ởnhững nước châu Mỹ Những nước thuộc miền trung và đồng bằng sôngMissisipi đã trở thành những nước sản xuất Đậu tương với sản lượng lớn [13]

1.2.2 Thành phần hóa học của Glycine max (L.) Merr.

Toàn cây chứa nước 12%, glucid 16%, Protein 14-15%, muối khoáng6% và một số chất khác không có Nitơ [8]

Hạt Đậu tương (100g hạt) chứa [6], [8]:

- Ngoài ra, còn một số các chất khác như:

- Dẫn chất isoflavonoid: genistein, daidzein và glycitein

- Sắc tố anthoxyan trong các loại đậu tím, đen

- Vitamin: tan trong nước (B1, B2, PP), tan trong dầu (A, D, E, K, I)

- Các enzym: Amylase, Lipaseidin, Protease, Urease

Đậu tương và Sắn dây có hàm lượng isoflavonoid cao nhất trong cáccây họ Đậu Các loại đậu khác cũng như các chế phẩm có nguồn gốc từ Đậutương chỉ chứa rất ít các chất này Hình 1.4 trình bày cấu trúc hóa học của cácisoflavonoid đã được tìm thấy trong hạt Đậu tương [21]

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của các isoflavonoid trong hạt đậu tương

Ngoài những chất chủ yếu trên, các isoflavonoid trong đậu tương còn

tồn tại dưới dạng 6-O-acetyl và 6-O-malonyl glycosid Ngoài ra, còn có dạng

succinyl glycosid của daidzein, genistein và glycitein

Hàm lượng isoflavonoid trong một số cây họ Đậu và thực phẩm làm từĐậu tương được trình bày ở bảng 1.2 [29]

Bảng 1.2: Hàm lượng các isoflavonoid trong một số cây họ Đậu và

thực phẩm làm từ Đậu tương

toàn phần

1.2.3 Tác dụng sinh học của isoflavonoid trong hạt đậu tương

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)

Các isoflavonoid trong hạt đậu tương có tính oxy hóa mạnh, trong đómạnh nhất là genistein và cũng là chất được quan tâm và nghiên cứu nhiềunhất Hoạt tính chống oxy hóa của các isoflavonoid trong đậu tương là do cácnhóm OH phenol của vòng A và B có khả năng nhường H/electron cho cácgốc tự do Khả năng dập tắt các gốc tự do được thể hiện qua nghiên cứu khảnăng dập tắt chuỗi phản ứng tạo gốc tự do trên chuột khi chiếu tia cực tím Btrên thực nghiệm [28], [32]

Sự peroxy hóa lipid được tiến hành trên microsom tim và gan của chuộtcống trắng và dùng adriamycin là chất sinh ra các gốc tự do, kết quả cho thấydịch chiết đậu tương có tác dụng giảm sự peroxy hóa lipid [6]

Tác dụng chống oxy hóa của isoflavonoid chiết xuất từ đậu tương đượcnghiên cứu so sánh với α-tocopherol Kết quả cho thấy isoflavonoid có tácdụng mạnh hơn α-tocopherol từ 80 – 100 lần [6] Ngoài tác dụng dập tắt cácgốc tự do, Các isoflavonoid trong đậu tương còn có khả năng thúc đẩy hoạt

động của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như glutathione peroxidase,superoxide dismutase và glutathione reductase [17],[24],[28],[32].

Do có tác dụng chống oxy hóa mạnh nên các isoflavonoid đậu tươngcòn có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh (các tế bào thần kinh bị tổn thương vàchết do bị các tác nhân oxy hóa tấn công), do đó các isoflavone còn rất có lợicho những người bị các bệnh tổn thương tế bào thần kinh như bệnhParkinson, Alzheimer [28]

1.2.3.2 Tác dụng kiểu Estrogen

Các isoflavonoid có trong hạt đậu tương đều được xếp vào nhóm cácchất phytoestrogen Các nhà khoa học đã so sánh về mặt cấu trúc của 17β-estradiol, diethylstilbenstrol với genistein và daidzein thấy có sự tương đồng

về mặt cấu trúc Điều này có thể giải thích một phần tại sao genistein có thểgắn vào các thụ thể oestrogen Hình 1.5 trình bày sự tương đồng về cấu trúchóa học của hormon oestradiol và các dẫn chất stilben, isoflavonoid nhưdiethylstilbenstrol, genistein và daidzein

Người ta đã biết đến hai loại receptor của oestrogen là ERα và ERβ Mặc

dù cả hai loại receptor này có mặt trong cùng một tế bào nhưng nồng độ củachúng thay đổi theo từng loại mô và hiệu lực tác dụng của chúng cũng khácnhau Khi liên kết với ERα genistein có hoạt tính oestrogen bằng 1/1000 hoạttính của oestradiol, và khi gắn với ERβ thì giá trị này tăng lên là 1/3 Khả nănggắn kết của genistein với ERβ mạnh hơn 20 lần so với ERα Genistein gây rađáp ứng tương tự như oestradiol tại các tế bào vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt,màng trong tử cung, mạch máu và các mô xương [22],[29],[32]

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của oestradiol, diethylstilbenstrol và 2

hormone thực vật genistein và daidzein

Nghiên cứu trên những phụ nữ mãn kinh khi dùng các isoflavonoidtrong đậu tương thì thấy sau một thời gian, số lượng các globulin gắnhormone sinh dục trong máu tăng lên

Theo nhiều kết quả nghiên cứu, các isoflavonoid trong đậu tương nhưgenistein, daidzein và các chất chuyển hóa của chúng như coumestran,coumestrol có cấu trúc hóa học tương tự như các oestrogen nội sinh và gây ratác dụng đối kháng hay chủ vận với oestrogen Tác dụng đối kháng hay chủvận này phụ thuộc vào nồng độ của chúng hoặc các mô đích mà chúng tácdụng Trong các isoflavonoid thì genistein là chất có hoạt tính oestrogenmạnh nhất [11], [19]

Những phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh có sự thiếu hụt hormoneoestrogen nên thường gây ra một số hội chứng như rối loạn vận mạch tạo racác cơn bốc hỏa, một số bệnh về tim mạch, loãng xương… Để khắc phục cáchội chứng này, từ lâu người ta đã sử dụng liệu pháp thay thế hormoneoestrogen Liệu pháp này đã khắc phục được các hội chứng trên nhưng dogiới hạn điều trị hẹp nên dễ xảy ra khả năng quá liều, đồng thời phải sử dụngtrong thời gian dài nên dễ gặp một số tác dụng phụ nghiêm trọng như ung thư

vú, ung thư nội mạc tử cung, ung thư buồng trứng… Do vậy, trong nhữngnăm gần đây, các nhà khoa học đang có sự quan tâm lớn tới việc sử dụng liệupháp điều trị thay thế hormone bằng các phytoestrogen an toàn hơn

Trong liệu pháp điều trị thay thế hormone cho phụ nữ tuổi tiền mãnkinh, việc sử dụng các isoflavonoid đem lại những lợi ích rõ rệt Chúng ứcchế quá trình xốp xương, giảm tỷ lệ hay gặp các cơn bốc hỏa, mất ngủ, haycáu giận, hay quên và khó tập trung Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhữngngười có chế độ ăn chứa genistein và các phytoestrogen với nồng độ cao(100mg/ngày) sau thời gian nghiên cứu khoảng 10 tuần đã có những cải thiệnđáng kể về trí nhớ, khả năng nhận thức và khả năng phản xạ Đối với nhữngngười mà chế độ ăn không có hoặc có chứa phytoestrogen với nồng độ thấpthì không thấy những cải thiện này hoặc những cải thiện không thực sự rõ rệt [29]

1.2.3.3 Tác dụng trên hệ thống tim mạch

Các isoflavonoid trong hạt đậu tương có khả năng chống oxy hóamạnh Nó loại bỏ các gốc tự do và giảm sự peroxyd hóa lipid Ngăn cản quátrình oxy hóa LDL-Cholesterol, làm giảm Cholesterol toàn phần trong đó làmgiảm LDL-Cholesterol và làm tăng HDL-Cholesterol do vậy làm giảm nguy

cơ xơ cứng động mạch Genistein còn có khả năng ngăn chặn sự hình thànhcác cơn đau tim và đột quỵ khi hoạt động như một tác nhân chống lại việc

hình thành các cục máu đông Daidzein lại có tác dụng hạ huyết áp, chốngloạn nhịp tim Trên tuần hoàn não, có tác dụng làm giảm trợ lực mạch máu vỏnão, tăng lưu lượng máu qua não [16], [19], [28], [32].

1.2.3.4 Tác dụng chống ung thư

Isoflavonoid từ đậu tương có tác dụng hạn chế sự phát triển của nhiều

loại ung thư phụ thuộc hormone và không phụ thuộc hormone in vitro như tế

bào ung thư vú, tiền liệt tuyến, trực tràng và ruột kết Tác dụng này được giảithích là do sự điều chỉnh tác dụng oestrogen, hạn chế hoạt động của tyrosinekinase, DNA topoisomerase, hạn chế tổng hợp và giải phóng của TGFβ(Transforming Growth Factor beta), làm giảm sự biệt hóa và chu trình tế bàothông qua việc thay đổi sao chép gen

Oestrogen đóng vai trò là hormone đa chức năng trong cơ thể, trong đó

có chức năng kích thích sự phân bào của các tế bào trong hệ cơ quan sinh sản,xương, tim, não… Các tế bào ung thư phụ thuộc hormone oestrogen khi có sựkích thích của oestrogen thì sẽ phát triển rất nhanh Các isoflavonoid trong hạtđậu tương có tác dụng oestrogen yếu nên khi gắn vào các thụ thể oestrogen thìchỉ gây tác dụng oestrogen yếu và hạn chế sự gắn của oestrogen vào thụ thểnên gây ra tác dụng đối kháng oestrogen, làm hạn chế sự phát triển của các tếbào ung thư [16],[17],[24],[28],[29],[32]

Ngoài ra, một số nghiên cứu chỉ ra rằng genistein làm tăng độ nhạycảm của một số loại tế bào ung thư như tế bào ung thư vú, ung thư tử cung…với hóa trị liệu [21], [25], [31]

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Hạt Đậu tương thu hái tại huyện Phú Xuyên – Hà Nội

- Lựa chọn nguyên liệu:

+ Hạt có thể chất cứng, hình cầu hoặc hình xoan tròn, kích thước 2 – 5

mm, có màu vàng nhạt hoặc hơi xanh Hạt có rốn màu trắng nổi rõ

+ Chọn những hạt đậu tương tốt, màu vàng nhạt, không mốc mọt

- Xử lý nguyên liệu:

+ Loại bỏ tạp cơ học: vỏ quả, mảnh lá, các hạt bị sâu, mọt, lép không đạt tiêu chuẩn

+ Hạt được sấy khô (nhiệt độ < 60oC), xay vỡ, cho vào túi PE đóng kín,

để nơi khô ráo làm thực nghiệm

Hình 2.1: Quả đậu tương và hạt đậu tương nghiên cứu

2.1.2 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

Hóa chất sử dụng trong thực nghiệm là các hóa chất thí nghiệm thông thường:

- Methanol: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc

- Chloroform: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc

- Dicloromethan: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc

- Ethanol 96%: công ty Hóa chất Đức Giang - Việt Nam

- n -Hexan: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc

- Ethyl acetat: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc

Natri Hydroxyd, Amoni Hydroxyd: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông Trung Quốc

Silicagel sắc ký cột (Silicagel, Merck, d = 60 200 μm).m)

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn (Silicagel GF254 – Merck)

2.1.3 Dụng cụ

Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng ở bộ môn Dược liệu - Đại họcDược Hà Nội, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học - Học việnQuân y gồm có:

- Bình thủy tinh có nắp đậy,

- Cột sắc ký thủy tinh các loại,

- Máy cất quay BUCHI waterbath B480 (Đức)

- Máy ảnh Sony cybershoot DSC-W310

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong hạt đậu tương

Trong hạt đậu tương có nhiều thành phần khác nhau, do vậy chúng tôitiến hành định tính một số nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học [1], [2], [3]

- Tạo vết trong mờ trên giấy lọc

2.2.1.10 Định tính acid vô cơ

- Phản ứng với Na2CO3.

2.2.1.11 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Dùng bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck)

Thử khai triển với 3 hệ dung môi khác nhau

Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại (UV)

ở bước sóng λ = 254 và 365 nm Dùng thuốc thử hiện màu như hơ hơiamoniac, phun thuốc thử hiện màu như vanilin1% /H2SO4… và quan sát dướiánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại như trên [11], [25]

2.2.2 Chiết xuất

Chúng tôi tiến hành khảo sát chiết xuất với các dung môi có độ phâncực khác nhau là methanol, ethanol 90% và ethyl acetat bằng phương phápchiết hồi lưu và chiết ngấm kiệt

2.2.2.1 Chiết hồi lưu

Tiến hành chiết hồi lưu song song với 3 dung môi là MeOH, EtOH90% và EtOAc với cùng lượng dung môi, cùng khối lượng dược liệu, cùngthời gian và quy trình chiết xuất Sơ đồ quy trình chiết hồi lưu được trình bày

ở hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất isoflavonoid từ hạt Đậu tương bằng

phương pháp chiết hồi lưu

Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chânkhông ở nhiệt độ dưới 60oC Phần cắn được làm khô trong bình hút ẩm.Lượng cắn chiết xuất được tính bằng phương pháp cân, theo công thức dướiđây

Bột đậu tương

Chiết hồi lưu3h

Cất thu hồi DMDịch chiết

Cắn

Bã dược liệuDung môi

Kết quả tính theo công thức sau:

m X

- a là khối lượng dược liệu ban đầu (g)

- m là khối lượng cắn khô thu được (g)

- h là hàm ẩm dược liệu (%)

2.2.2.2 Chiết ngấm kiệt

Chúng tôi khảo sát chiết isoflavonoid từ hạt đậu tương bằng phươngpháp ngấm kiệt với dung môi ethanol Sơ đồ quy trình chiết xuất được trìnhbày ở hình 2.3

Hình 2.3: Sơ đồ chiết xuất isoflavonoid từ hạt Đậu tương bằng

phương pháp ngấm kiệt

Cách tiến hành: cân chính xác một lượng bột đậu tương, làm ẩm bằngethanol, để yên 30 phút Cho bột đậu tương đã làm ẩm vào bình chiết, thêmdung môi Rút dịch chiết sau 24h, tiến hành chiết 3 lần Gộp dịch chiết cất thu

Bột đậu tương

o = 25oC24h x 3 lần

Dịch chiết

Cất thu hồi DM

Cắn

Bã dược liệu

hồi dung môi Cắn được làm khô trong bình hút ẩm Lượng cắn thu được tínhtheo công thức như phần chiết xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu.

2.2.3 Phân lập và nhận dạng isoflavonoid

Chúng tôi tiến hành phân lập isoflavonoid bằng cách kết hợp cácphương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký chế hóa Nguyên tắc chungcủa các phương pháp này là dựa trên sự phân bố khác nhau trên pha rắn (phatĩnh) đã đặt hỗn hợp các chất cần tách khi cho pha lỏng (pha động ) chạy qua.Trong đó, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng chế hóa có pha tĩnh là các chấthấp phụ được trải thành lớp mỏng trên các phiến kính hoặc kim loại, còn sắc

ký cột thì pha tĩnh là các hạt hấp phụ được nhồi vào trong cột sắc ký

Phương pháp sắc ký cột

+ Sử dụng pha tĩnh là Silicagel 60 Merck

+ Để lựa chọn hệ dung môi rửa giải hợp lý, chúng tôi lựa chọn dung môitách qua quá trình tiến hành định tính dịch chiết isoflavonoid toàn phần bằngsắc ký lớp mỏng

Trong quá trình chạy sắc ký cột, các phân đoạn tách ra được tiến hànhthử độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng với các dung môi có độ phân cực khácnhau [4]

Sắc ký lớp mỏng chế hóa

Đối với các phân đoạn chưa tinh khiết, dịch chiết thu được sau khi chạysắc ký cột đem cô lấy cắn và tiến hành chạy sắc ký chế hóa để phân lập cácisoflavonoid tinh khiết

Nhận dạng isoflavonoid

Các isoflavonoid phân lập được đem nhận dạng dựa trên tính chất lýhóa, phân tích phổ khối [5].

2.2.4 Xác định hoạt độ chống oxy hóa trên in vitro

- Xác định hoạt độ chống oxy hóa theo phương pháp định lượng MDA [15]

- Nguyên tắc của phương pháp: tiến hành peroxy hóa acid béo chưa no

(Tween 80) ở một nhiệt độ nhất định Sau một khoảng thời gian, phản ứng tạo

ra MDA (Malonyl dialdehyd) MDA phản ứng với acid thiobarbituric tạo rahợp chất màu hồng Đo cường độ màu biết lượng MDA nhiều hay ít, mẫu thử

có chất chống oxy hóa thì lượng MDA thấp hơn so với mẫu đối chứng không

có chất chống oxi hóa

Hoạt độ chống oxy hóa biểu diễn bằng giá trị phần trăm (%) MDA bị

ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng

- Cách tiến hành

Trong những lọ màu nâu nút kín, cùng loại cho hỗn hợp phản ứng gồm:

- 2 ml Tween 80 1%

- 0,2 ml dung dịch FeSO4 10-3M

- 0,2 ml dung dịch acid ascorbic 10-2M

- 0,6 ml dịch chiết isoflavonoid (mẫu đối chứng thay bằng 0,6 mlnước cất)

Đậy nút kín, lắc kỹ, ủ nhiệt độ 40oC trong 48 giờ Lấy 2 ml hỗn hợp saukhi ủ, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid tricloracetic 30% Để yên 1 giờ Lytâm 5 phút với tốc độ 4200 vòng/phút Lấy 2 ml dịch trong sau ly tâm, thêm 2

ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25% Đun cách thủy 100oC trong 15 phút,

để nguội đến nhiệt độ phòng Đo màu của phức tạo thành ở bước sóng λ =

532 nm Tính lượng MDA với hệ số tắt mol ε = 1,56.105M-1cm-1

Nếu trong mẫu thử có chất chống oxi hóa thì lượng MDA tạo thànhphải ít hơn mẫu đối chứng, tức mật độ quang mẫu thử phải thấp hơn mẫuchứng Cường độ màu sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Lượng MDA trongmẫu thử giảm so với mẫu đối chứng sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trìnhperoxy hóa lipid (POL) của chất thử và gọi là hoạt tính chống oxy hóa(HTCO) của thuốc thử

- Công thức tính hoạt độ chống oxi hóa (Hđ %)

Hđ % = (Dc – Dt)/Dc x 100Dc: Mật độ đo quang của mẫu chứng

Dt: Mật độ đo quang của mẫu thử

- Giá trị thực (μm).):

µ = x ± tα

n s

N: số lần lặp lại thí nghiệm