Điều chế 3 chất đối chiếu acid ursolic, emodin, resveratrol

Tại Việt Nam, thuốc từ dược liệu đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường và chiếm một vị trí rất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh của nhân dân. Việc phát triển và nâng cao chất lượng thuốc từ dược liệu là một việc làm hết sức cần thiết. Để đảm bảo được chất lượng thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh của nhân dân, vấn đề tăng cường công tác quản lý chất lượng được đặt ra một cách cấp thiết. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm chất lượng thuốc từ dược liệu còn phụ thuộc nguồn nhập ngoại. Đây là vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu dược liệu trong nước phải làm thế nào để có thể chiết tách và tinh chế được đủ lượng chất chuẩn cần thiết phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc. Hiện nay, trong Dược điển Việt nam IV 3 có 76 chất đối chiếu (chỉ điểm), Dược điển Trung Quốc 2005 18 cũng có qui định 271 chất chuẩn và chất đối chiếu được dùng để định tính và định lượng cho các chuyên luận về dược liệu, chủ yếu dùng cho định lượng. Viện Dược liệu có nhiệm vụ kiểm tra chất lượng một số dược liệu trên thị trường, vì vậy luôn có nhu cầu nhiều về chất đối chiếu. Trước tình hình đó, chúng tôi đề xuất chiết tách một số hoạt chất có trong nhiều dược liệu hoặc có tần suất sử dụng lớn làm chất đối chiếu trong tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu (có trong danh mục chất đối chiếu Dược điển Việt nam IV hoặc Dược điển Trung Quốc 2005). Ba chất gồm có: Acid ursolic từ dược liệu lá hồng (Diospyros kaki, Ebenaceae), Emodin từ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, Polygonaceae), Resveratrol từ vỏ quả nho (Vitis spp., Vitaceae).

Điều chế 3 chất đối chiếu Acid ursolic, Emodin, Resveratrol

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tại Việt Nam, thuốc từ dược liệu đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường và chiếm một vị trí rất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh của nhân dân Việc phát triển và nâng cao chất lượng thuốc từ dược liệu là một việc làm hết sức cần thiết

Để đảm bảo được chất lượng thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh của nhân dân, vấn đề tăng cường công tác quản lý chất lượng được đặt ra một cách cấp thiết Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm chất lượng thuốc từ dược liệu còn phụ thuộc nguồn nhập ngoại Đây là vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu dược liệu trong nước phải làm thế nào để có thể chiết tách và tinh chế được đủ lượng chất chuẩn cần thiết phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc

Hiện nay, trong Dược điển Việt nam IV [3] có 76 chất đối chiếu (chỉ điểm), Dược điển Trung Quốc 2005 [18] cũng có qui định 271 chất chuẩn và chất đối chiếu được dùng để định tính và định lượng cho các chuyên luận về dược liệu, chủ yếu dùng cho định lượng Viện Dược liệu có nhiệm vụ kiểm tra chất lượng một số dược liệu trên thị trường, vì vậy luôn có nhu cầu nhiều về chất đối chiếu

Trước tình hình đó, chúng tôi đề xuất chiết tách một số hoạt chất có trong nhiều dược liệu hoặc có tần suất sử dụng lớn làm chất đối chiếu trong tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu (có trong danh mục chất đối chiếu Dược điển Việt nam

IV hoặc Dược điển Trung Quốc 2005) Ba chất gồm có:

- Acid ursolic từ dược liệu lá hồng (Diospyros kaki, Ebenaceae),

- Emodin từ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, Polygonaceae),

- Resveratrol từ vỏ quả nho (Vitis spp., Vitaceae).

Mục tiêu của đề tài:

Điều chế được 3 chất đối chiếu từ dược liệu có độ tinh khiết >90%: Acid ursolic, Emodin, Resveratrol; mỗi chất 100mg

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập 3 chất

- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được

- Xây dựng bộ dữ liệu về phổ và xác định cấu trúc của các chất phân lập được

Chuyên đề 1: Phân lập acid ursolic từ lá hồng

I Tổng quan

1.1 Đặc điểm thực vật của cây hồng (Diospyros kaki L.f.)

Cây hồng (Diospyros kaki L.f.) thuộc họ Thị (Ebenaceae) là một loại cây ăn quả

lâu năm Cây to, lá mọc so le, hình trứng hay trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có lông tơ Cụm hoa mọc ở kẽ lá; hoa đơn tính cùng gốc, màu vàng nhạt; hoa đực tụ họp thành xim 3 hoa, nhị 16, có khi hơn; hoa cái mọc đơn độc, đài có 5 răng, bầu 4 ô, thường có vách giả Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, nhẵn, phẳng hoặc có sống dọc, mang đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ; hạt dẹt, màu nâu vàng hoặc nâu đen Mùa hoa: tháng 3-7, mùa quả: tháng 8-10.[1][,2]

Cây có nguồn gốc á nhiệt đới đã được trồng lâu đời ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Ở nước ta hồng được trồng nhiều ở phía Bắc từ Hà Tĩnh trở ra, ở phía Nam hồng được trồng ở vùng Đà Lạt- Lâm Đồng nơi có độ cao từ 1000 - 1500 m so với mặt nước biển [2]

1.4 Acid ursolic

Về hóa học:

- Công thức phân tử: C30H48O3 ; KLPT: 456.68 g/mol; là bột kết tinh màu trắng, nhiệt độ nóng chảy từ 260-262 0C

- Acid ursolic được phân lập từ các loài Eriobotrya japonica Thunb (Tỳ bà diệp);

Ligustrum lucidum Ait (Nữ trinh tử), Zyzyphus spp (vỏ quả táo) và được bán dưới

dạng hàng hoá lớn dùng để sản xuất [5]

Về tác dụng sinh học:[4],[7], [8], [11]

- Tác dụng chống viêm

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

- Chống tăng đường huyết (đái tháo đường)

- Chống tăng mỡ máu

- Chống béo phì

Ngoài ra, acid ursolic được dùng nhiều trong mỹ phẩm với tác dụng bảo vệ da chống ung thư từ tia cực tím Ursolic acid đã được độc quyền sử dụng như kem đại lý trong dược phẩm, mỹ phẩm và các chế phẩm thực phẩm

Ở Việt Nam:

Acid ursolic có trong rất nhiều loài thực vật như và trong nhiều dược liệu như bạc

hà, bằng lăng nước, chè đắng, mã đề, hạ khô thảo, lá hồng, râu mèo, quả sơn thù, táo Trong danh mục chất đối chiếu của Dược điển Việt Nam IV (2009) và Dược điển Trung Quốc 2005, acid ursolic đều có mặt [3],[18]

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dung môi hóa chất và thiết bị

* Nguyên liệu dùng để nghiên cứu: Lá hồng (Diospyros kaki L.f.)

*Dung môi, hoá chất: Các dung môi công nghiệp như n-hexan, dicloromethan,

cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol đều được cất lại trước khi dùng

* Thiết bị sử dụng:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10 ATvp, detector diod array SPD-M10Avp Cột RP C18 (150mm x 4,6mm ID, 5µm)

- Máy đo phổ IR : 670-FTIR NICOLET- NEXUS (Viện hóa học)

- Máy đo phổ khối ESI-MS: AGILENT 1100 LC-MSD (Viện Hóa học)

- Máy cộng hưởng từ Bruker Avance AM500 FT-NMR (Viện Hóa học)

- Cân phân tích

- Máy đo điểm chảy

- Máy cất quay Buchi

- Tủ sấy chân không Binder

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất từ nguyên liệu thực vật

a Phương pháp chiết dung môi

Nguyên liệu mẫu thực vật được chiết với dung môi ở nhiệt độ phòng

b Phương pháp chiết hai pha lỏng

Phần chiết tổng được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký

a Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

b Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm và Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

c Phương pháp kết tinh lại

Các chất phân lập được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

2.2.3 Phương pháp xác định độ tinh khiết và nhận dạng cấu trúc

Phương pháp xác định độ tinh khiết: dựa vào kết quả định lượng, dựa vào điểm

chảy và kết quả đo phổ NMR, IR, MS

Nhận dạng cấu trúc bằng các phổ NMR, MS, UV, IR.

Cặn chiết MeOH được hòa bằng nước cất sau đó được chiết với dicloromethan Dịch chiết dicloromethan được gom lại và cô loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết đicloromethan (80g) được dùng để điều chế acid ursolic

3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

3.2.1 Phân tích sắc ký xác định điều kiện tiến hành sắc ký cột

Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck pha thường và pha đảo có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm

Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%

Phân tích xác định acid ursolic trong phần chiết dicloromethan từ lá hồng

Hệ dung môi phù hợp để triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết dicloromethan

là methanol-nước = 10:1, sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel pha đảo

3.2.2. Phân lập các hợp chất

Các chất được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thường trên chất hấp phụ

silica gel Hệ dung môi rửa giải là gradient hỗn hợp dung môi methanol-nước tỷ lệ

20/1, 10/1, 5/1, 1/1 (mỗi tỷ lệ 2 lít) Các dung dịch chạy cột được thu vào các bình hứng và thu được các phân đoạn I, II, III IV Từ phân đoạn III, tiến hành sắc ký cột silica gel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước là 9/1, 5/1, 1/1 được ba phân đoạn III-1, III-2, III-3 tương ứng Phân đoạn III-2 được phân tách tiếp trên cột silicagel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước là 4/1, hứng dung dịch rửa giải vào các ống nghiệm Kiểm tra các ống nghiệm bằng sắc ký lớp mỏng thấy ống từ 3-15 có cùng Rf Dồn các ống 3 đến 15, cho bay hơi dung môi thu được chất kết tinh có màu trắng với khối lượng 125

mg Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập acid ursolic thể hiện qua sơ đồ 1

Lá h ng (2 kg) ồ

+ MeOH (7 lít x 3 l n) ầ

D ch chi t MeOH ị ế

-MeOH Cao MeOH (170g)

Phân o n đ ạ

IV

Phân o n đ ạ III (8,5g)

Phân o n I đ ạ Phân o n đ ạ

II

S c ký c t pha ắ ộ đả o, methanol-n ướ c

1/1 5/1

9/1

Phân o n đ ạ III-2

Phân o n đ ạ III-1

Phân o n đ ạ III-3

S c ký c t pha ắ ộ đả o, methanol-n ướ c (4:1)

Ch t AU ấ 125mg

S ơ đồ1 Quy trình chi t xu t, phân l p acid ursolicế ấ ậ

III XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ THẨM ĐỊNH CÔNG THỨC CỦA ACID URSOLIC

Nhiệt độ nóng chảy

Acid ursolic tinh chế được làm khô trong bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết quả điểm chảy đo được là: 262-

266 0C

Sắc ký đồ sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký đã ghi trong mục 2.2.4

Kết quả định lượng acid ursolic trong sản phẩm tinh chế cho thấy acid ursolic đạt độ tinh sạch trên 90% được thể hiện trong hình :

Area

Spectrum at time 19.20 min.

nm

19.20 min

Lambda max : 195 250 289 306 295 Lambda min : 248 296 287 283 299

Hình 1,2 Sắc ký đồ HPLC và phổ UV của acid ursolic

Phổ UV (trong MeOH) λmax: 195, 250, 289, 295, 306 nm.

Phổ hồng ngoại (viên nén KBr): có các vân hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức phù

hợp với cấu trúc hóa học của acid ursolic, νmax (cm-1): 3424 (nhóm OH); 2926 (C-H của nhóm CH3); 1690 (nhóm C=O)

Phổ ESI-MS: m/z 455 [M-H]+ (negative) tương ứng với khối lượng phân tử là M =

456, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của acid ursolic C30H48O3

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Trên phổ 1H-NMR: Cho 1 tín hiệu proton olefin ở δH 5,14 (1H, m, H-12), 7 tín hiệu của 7 nhóm methyl (-CH3) đính vào vòng có độ dịch chuyển từ 1,01- 0,68 ppm, trong đó có 5 nhóm cho tín hiệu đơn và 2 nhóm cho tín hiệu kép Trên phổ còn xuất hiện 1 tín hiệu δH 3,07 (1H, dd, J=4,5;11Hz) gần liên kết OH Ngoài ra, còn có 18 proton có độ dịch chuyển từ 1,84-1,18 ppm (18H, m)

Trên phổ 13C-NMR cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon Có 1 tín hiệu có

δC 181,4 ppm của carbon nhóm carboxylic (-COOH), 1 tín hiệu của CH olefin δC ở 139,19 ppm (C-13) Có 1 cặp tín hiệu trùng nhau δC 24,08 ppm (C-11, C-27) Carbon của 7 nhóm methyl (-CH3) dịch chuyển trong vùng trường thấp ở δC từ 21,5-15,9 ppm

Các dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với các số liệu đã được công bố của acid ursolic Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [11] cho phép khẳng định hợp chất được phân lập chính là acid ursolic

Bảng 1: Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất AU và acid ursolic

Hình 3: Cấu trúc hóa học của acid ursolic

V KẾT LUẬN

- Đã xây dựng được quy trình chiết xuất và phân lập acid ursolic từ củ hà thủ ô

- Đã điều chế acid ursolic (125mg) có độ tinh khiết > 90%

- Đã có được dữ liệu về bộ phổ của acid ursolic

Chuyên đề 2: Phân lập emodin từ Hà thủ ô

I Tổng quan

1 1 Đặc điểm thực vật của cây Hà thủ ô (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae)

Dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm Thân mềm nhẵn, mọc xoắn vào nhau Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống của khoai lang Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình timm, đầu thuôn nhọn, dài 5-8cm, rộng 3-4cm, 3-5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài khoảng 2cm, phủ lông tơ,

bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc ngắn; hoa nhỏ nhiều, củ con, cùng với các đoạn rễ còn sót lại trong khi khai thác, đều có khả năng mọc thành cây mới [1],[2]

Trên thế giới, hà thủ ô đỏ có ở Trung Quốc, Bắc Lào, Nhật Bản, Ấn Độ Ở Việt Nam,

hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số tỉnh vùng núi cao (trên 1000m) phía bắc Cây mọc nhiều

ở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La Các tỉnh khác ít gặp hơn như Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái…[1]

1 2 Thành phần hóa học [1],[2]

Hà thủ ô đỏ chứa 1,7% antraglucosid trong đó có: crysophanol, emodin, rhein, 1,1% protid, 42,2% tinh bột, 3,1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% chất tan trong nước…

Thành phần hóa học của hà thủ ô đỏ thay đổi theo quá trình chế biến Theo y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ sống chứa 7,68% tanin, 0,259% dẫn chất antraquinon tự

do, 0,805% dẫn chất antraquinon toàn phần Sau khi chế biến, dược liệu chứa 3,82% tanin, 0,113% dầu chất antraquinon tự do, 0,25% dẫn chất antraquinon toàn phần Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, hà thủ ô đỏ chứa emodin, physcion, emodin 1,6 dimethyl ether, questin, citreorosein, questinol, 2 acetyl emodin, 2 methoxy-6-acetyl-7-methyl julone, tricin, 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucosid…Ngoài ra còn

có acid gallic, daucosterol, (+) catechin, (+) epicatechin…Chất phospholipid có 3,49% trong dược liệu thô và 1,82% trong dược liệu đã chế biến, hợp chất 2-3-5-4’tetrahydroxy stilbene-2-0-β-D-glucosid có trong thành phần của thuốc làm mọc tóc

1.3 Tác dụng sinh học

Hà thủ ô đỏ có tác dụng chống viêm trên các mô hình thực nghiệm, gây phù cấp tính và viêm mạn tính, gây rỉ dịch màng phổi bằng tinh dầu thông, gây viêm dị ứng và viêm đa khớp bằng BCG [1]

Hà thủ ô đỏ có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen, tác dụng kiểu progesteron nhẹ trên nội mạc tử cung, làm tăng trương lực cơ tử cung trong những thí nghiệm tử cung

cô lập và ở nguyên vị trí, tăng tiết sữa và chống viêm.[1]

Dịch chiết nước rễ hà thủ ô chưa chế làm giảm đáng kể nồng độ huyết thanh của các dấu hiệu gây men gan, chỉ số AST, ALT Ngoài ra, kết quả còn cho thấy có sự giảm đáng kể huyết thanh của yếu tố gây hoại tử dạng khối u, dấu hiệm viêm sưng trên chuột được điều trị bằng hà thủ ô đỏ.[15]

Dịch chiết với nước ấm của hà thủ ô chế thử nghiệm trên những chuột đã cắt bỏ tuyến thượng thận làm tăng tích lũy glycogen ở gan gấp 6 lần Hà thủ ô đỏ sống

không có tác dụng này.[1]

Cao cồn hà thủ ô đỏ còn có tác dụng dự phòng xơ vữa động mạch, gây thực

nghiệm theo cơ chế ngoại sinh trên chim cun cút Tác dụng làm giảm cholesterol và triglycerid huyết thanh, ức chế sự tăng lipid máu và làm chậm sự phát triển xơ mỡ động mạch.[1]

1.4 Emodin

Về hóa học: Công thức phân tử C15H10O5, Khối lượng phân tử: 270.24 g mol−1 Dạng bột kết tinh màu đỏ cam, nhiệt độ nóng chảy khoảng 255oC.

Emodin được tìm thấy trong các loài như là: cốt khí củ (Polygonum cuspidatum),

đại hoàng (Rheum palmatum ), hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora), tâm cúc ( Kalimeris indica ), muồng lá tù ( Senna obtusifolia), tai tượng lá to (Acalypha australis ) [1],[2],

[21]

Về tác dụng sinh học:

- Emodin có tác dụng làm giảm yếu tố gây bệnh tiểu đường typ 2 Là chất ức chế chọn lọc của các enzym 11β-HSD1 Trong nghiên cứu ở chuột béo phì, emodin hạn chế tác động của glucocorticoid, do đó có thể cải thiện được bệnh tiểu đường.[9]

- Emodin có tác dụng chống một số căn bệnh ung thư trong đó có cả ung thư tuyến tụy [16],[19], [14]

- Emodin cũng có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh, ngăn ngừa độc tính của các

glutamat [12]

Emodin cũng là một trong những chất chuẩn, chất đối chiếu được quy định trong Dược điển Việt Nam IV và Dược điển các nước khác

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dung môi hóa chất và thiết bị

* Nguyên liệu: Củ hà thủ ô đỏ

*Dung môi, hoá chất: Các dung môi công nghiệp như n-hexan, dicloromethan,

cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol được cất lại trước khi dùng

* Thiết bị sử dụng: phần 2.1 chuyên đề 1

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất từ nguyên liệu thực vật (như chuyên đề 1)

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký (như chuyên đề 1)

2.2.3 Phương pháp xác định độ tinh khiết và nhận dạng cấu trúc

Phương pháp xác định độ tinh khiết: dựa vào kết quả định lượng, dựa vào điểm

chảy và kết quả đo phổ NMR, IR, MS

Nhận dạng cấu trúc bằng các phổ NMR, MS, UV, IR.

Cặn chiết MeOH được hòa bằng nước cất sau đó được chiết lần lượt với hexan, ethylacetat và n-butanol Dịch chiết các phân đoạn được gom lại và cô loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết, cặn chiết ethyl acetat (50g) được dùng để điều chế emodin

n-3.3. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

3.2.1 Phân tích sắc ký xác định điều kiện tiến hành sắc ký cột

Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck pha thường và pha đảo có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm

Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%

Phân tích xác định emodin trong phần chiết ethyl acetat từ củ hà thủ ô

Hệ dung môi phù hợp để triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết ethyl acetat là n-hexan: ethyl acetat = 4:1, sử dụng bản mỏng silica gel pha thường

3.2.2 Phân lập các hợp chất

Các chất được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thường trên chất hấp phụ

silica gel Hệ dung môi rửa giải là gradient hỗn hợp dung môi n-hexan-ethyl acetat tỷ

lệ 20/1, 15/1, 10/1, 4/1, 2/1, 1/1, 0/1 (mỗi tỷ lệ 3 lít) Các dung dịch chạy cột được thu vào các bình hứng và thu được các phân đoạn I, II, III IV, V, VI, VII Từ phân đoạn

IV, tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với tỷ lệ n-hexan-ethyl acetat là 9/1,

4/1, 2/1, 1/1 được bốn phân đoạn IV-1, IV-2, IV-3, IV-4 tương ứng Phân đoạn IV-3

được phân tách tiếp trên cột silicagel pha thường với tỷ lệ n-hexan-ethyl acetat là 4/1,

hứng dung dịch rửa giải vào các ống nghiệm Kiểm tra các ống nghiệm bằng sắc ký lớp mỏng thấy ống từ 18-40 có cùng Rf Dồn các ống 18 đến 40, cho bay hơi dung môi thu được chất kết tinh có màu da cam với khối lượng 102 mg Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập emodin thể hiện qua sơ đồ 2