CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM VI SINH VẬT

PP Sinh học phân tử ttỨng dụng trong  bệnh nhiễm VSV tt:... PP Sinh học phân tử ttỨng dụng trong  bệnh nhiễm VSV tt:... PP Sinh học phân tử ttỨng dụng trong  bệnh nhiễm VSV tt: 2.

PGS TS Cao Minh Nga

BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP HCM

- một số khác: không có triệu chứng điển hình

VD: viêm gan virus A, B, C, D, E và G, …

 Xét nghiệm chẩn đoán () đóng vai trò quan trọng:   (+) từng bệnh lý cụ thể

là tiêu chuẩn vàng:  nhiều bệnh nhiễm VSV

I Mở đầu (tt)

 Các phương pháp (pp)  bệnh nhiễm VSV chính:

- pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy

- pp miễn dịch học: phản ứng kháng nguyên – kháng thể

- pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu

 Các pp   (sinh hĩa, huyết học, giải phẫu bệnh, … )

 Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh

 , theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV

II Phương pháp Vi sinh học

 Quan sát trực tiếp:

1 Soi tươi

2 Nhuộm

 Nuơi cấy vi vi khuẩn (VK):

1 Nuơi cấy - Phân lập VK

II PP Vi sinh học (tt)

 Quan sát trực tiếp:

1 Soi tươi: phát hiện VSV cịn sống, di động

VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira

2 Nhuộm: nhiều pp

- nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram của VK

II PP Vi sinh học (tt)

 Quan sát trực tiếp:

1 Soi tươi

2 Nhuộm: - nhuộm Gram

- Nhuộm kháng acid - Nhuộm bạc:

M tuberculosis trên phết nhuộm Legionella_Silver_Stain

II PP Vi sinh học (tt)

 Quan sát trực tiếp

 Nuơi cấy vi khuẩn:

1 Nuơi cấy  phân lập VK: trên các mơi trường thích hợp

Mơi trường BA - S aureus Mơi trường EMB - E coli

II PP Vi sinh học (tt)

 Quan sát trực tiếp

 Nuơi cấy vi khuẩn:

II PP Vi sinh học (tt)

2.2 Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng

4 2 1 0,5 0,25 0,12 0

10 4 cfu

mg/ml

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml

(Minimum inhibitory concentration - MIC)

II PP Vi sinh học (tt)

 Quan sát trực tiếp

 Nuơi cấy vi khuẩn

 Nuơi cấy virus:

 Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử

II Phương pháp Miễn dịch học

II PP Miễn dịch học (tt)

- đo lường các nhân tố  tham gia / hệ thống MD

VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể

Kháng nguyên

• Điểm quyết định KN (epitope):

phần trên phân tử KN cĩ khả

năng liên kết đặc hiệu vào phần

liên kết với KN trên phân tử KT

Tương tác KN - KT

Hiện tượng vùng

II PP Miễn dịch học (tt)

 Phân loại:

A Phản ứng dựa trên sự tạo thành “hạt”:

1 Kết tủa (precipitation reaction): KN hịa tan

2 Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình

B Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT:

1 Kết hợp bổ thể (complement binding reaction)

2 Trung hịa (neutralization reaction)

C Phản ứng MD đánh dấu:

1 MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction)

2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

3 MD phĩng xạ (radio immmuno assay - RIA)

Các phản ứng MD có độ nhạy khác nhau

Loại phản ứng MD Ngưỡng phát hiện (mg/ml)

Kết tủa / môi trường lỏng

II PP Miễn dịch học (tt)

 Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng:

A Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction):

II PP Miễn dịch học (tt)

A Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction)

Tạo mạng

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

(thụ động)

Ngưng kết hồng cầu thụ động

KN hoặc hapten KT / mẫu

gắn trên giá khoác

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

(thụ động) - 2

 Ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược

KT / giá khoác KN / mẫu

Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

(Hemagglutination Inhibition - HI)

II PP Miễn dịch học (tt)

B Phản ứng MD đánh dấu:

1 MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF)

VD:  RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …

* Đếm tế bào dịng chảy (flow cytometry):

đếm & phân loại TB

2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

VD:  HBV, HCV, HIV, Rubella, …

1 PƯ MD huyønh quang : nguyeân lyù

Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng

(thuốc nhuộm fluorescein)

Virus sởi tạo hợp bào từ các tế bào Vero bị nhiễm Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết

(thuốc nhuộm rhodamin)

2 Phản ứng ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )

* Mục đích:

định lượng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học

* Nguyên lý cơ bản:

KT/pha rắn + KN/mẫu + KT E + Subtrate

KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng KT E + Subtrate

 màu: So màu (mắt / máy đo OD)

* Kỹ thuật thực hiện: - "Cạnh tranh”

- "Không cạnh tranh"

b ELISA theo phương pháp “sandwich”

c ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA

(IgM antibody capture-ELISA)

Máy đo quang

II PP Miễn dịch học (tt)

 Nhận định kết quả:

1 Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN & KT):

Mỗi phản ứng cĩ ngưỡng phát hiện  nhau

 nên định lượng

2 Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý

VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200 (200 đơn vị/ml huyết thanh)  (+) khi  400 đ.v/ml

II PP Miễn dịch học (tt)

 Nhận định kết quả (tt):

3 Kết quả (+) tính giả:

 thường dùng nhiều phản ứng cùng lúc

4 Đáp ứng KT: cĩ thay đổi về lớp Ig

- IgM: xuất hiện trước

- IgG: xuất hiện sau, thay thế nhanh chĩng cho IgM

5 Tiến triển của hiệu giá KT trong HTh BN:

“huyết thanh kép”

Schematic diagram representing the course of acute rubella infection from the time of initiation

of the infection by droplet spray

III Phương pháp Sinh học phân tử

(khuếch đại đoạn gen đặc hiệu)

 Mở đầu:

- 1985: Kary Mullis California, USA

- 1993: giải Nobel Hóa học

 Ứng dụng kỹ thuật SHPT

trong chẩn đốn bệnh nhiễm VSV

III PP Sinh học phân tử (tt)

 Mở đầu: Các kỹ thuật SHPT thơng dụng:

1 PCR (Polymerase Chain Reaction)

III PP Sinh học phân tử (tt)

 Mở đầu (tt):

Ứng dụng kỹ thuật SHPT:

1 Chẩn đĩan & nghiên cứu vi sinh học (VSH)

2 Chẩn đĩan & nghiên cứu di truyền học

3 Nghiên cứu & ứng dụng cơng nghệ sinh học

4 Giải trình tự bộ gen người & động vật

III PP Sinh học phân tử (tt)

 Mở đầu

 Ứng dụng trong chẩn đốn () bệnh nhiễm VSV:

1 Phát hiện & định lượng VSV gây bệnh

2 Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh

3 Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh

4 Xác định kiểu gen của VSV gây bệnh

5 Xác định kiểu gen của ký chủ

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

1.1 Phát hiện VSV gây bệnh (tt)

 VSV cho KQ chậm / nuơi cấy: M tuberculosis

 VSV khĩ nuơi cấy vì cĩ rất ít / BP, đã  KS

- Lao thất bại nuơi cấy,

- Viêm màng não mủ, lậu đã  KS

Phát hiện sản phẩm PCR/  lao

• Điện di trên gel agarose (1,5%)

• Nhuộm bằng ethidium bromide (10mg%)

• Đo bằng thang DNA (DNA ladder)

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

Real-Time PCR

Là 1 kỹ thuật PCR sử dụng chất huỳnh quang để

phát hiện & định lượng

1 hoặc nhiều trình tự DNA đích trong phản ứng PCR

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

2 Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh

 Gen mã hĩa cho độc tố LT của E coli

 Gen mã hĩa cho độc tố SEA, SEB của S aureus

(pp Multiplex PCR)

 Gen mã hĩa cho độc tố CT của V cholerae

 …

III PP Sinh học phân tử (tt)

Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

3 Xác định kiểu gen (genotype) của VSV gây bệnh

 Định typ dựa trên trình tự nucleic acid:

Sự khác biệt >10% : loại (type) mới

với probe 1

Reverse Dot-Blot xác định genotype HPV

Nguyên tắc phương pháp lai Reverse Dot blot

(Lai phân tử)

Reverse Dot-Blot xác định genotype HPV

Từ sơ đồ các typ trên màng lai trong hộp RDB đã biết

=> Đọc kết quả: định genotype HPV

Ví dụ:

Chứng +: Dương tính

Mẫu đồng nhiễm type 6, 11, 81, 16, 18, 33, 58, 66, 68

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

4 Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh

 Lao: PCR phát hiện đột biến (ĐB)

- kháng rifamicin / gen rpoB

- kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G)

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

4 Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh (tt)

 HIV: phát hiện các ĐB kháng thuốc khác nhau

 …

pp: Real-Time PCR, PCR-RFLP, Sequencing

III PP Sinh học phân tử (tt)Ứng dụng trong  bệnh nhiễm VSV (tt):

5 Xác định kiểu gen của ký chủ

VD: Đối với bệnh nhân viêm gan C  phát hiện điểm đa

hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism)

nằm gần gen IL28B trên nhiễm sắc thể 19 của người

- Kiểu gen đáp ứng thuốc kém: dị hợp tử

V Kết luận

 Cĩ nhiều pp chẩn đốn xác định bệnh nhiễm VSV

 Cần chọn lựa pp chẩn đốn phù hợp với:

- tình trạng bệnh lý

- mục đích chẩn đốn

- điều kiện trang thiết bị, tay nghề của nhân viên

- tình hình và nhu cầu thực tiễn

 Nâng cao hiệu quả: chẩn đốn & điều trị bệnh,

kiểm sốt dịch bệnh