Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ rể cây mật nhân (e longifolia) và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

- Chiết xuất bằng phương pháp chưng ninh... Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu,10 trang... Thành phần hóa học Mật nhân có chứa nhiều thành phần có hoạt tính s

ĐẠ ỌC ĐÀ NẴN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ƯƠN N ẠN

Phản biện 1: ĐẶNG MINH NH T

Phản biện 2: GS.TSKH L ĂN ÀN

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn thạc sĩ

kỹ thuật họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 29 tháng 11 năm

2014

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

MỞ Đ U

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, nhu cầu tiêu dùng đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm thực phẩm cũng như dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên.Mật nhân được biết đến là loại thực vật chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với tác dụng trị bệnh, tăng cường sức khỏe, do đó có thể sử dụng chiết xuất từ loại thảo dược này để làm thực phẩm chức năng – điều này thõa mãn nhu cầu tiêu dùng hiện đại Hầu hết các bộ phận của cây mật nhân đều được tác dụng trị bệnh Các chiết xuất từ mật nhân đã được y học cổ truyền sử dụng để điều trị bệnh sốt rét, làm thuốc tăng trưởng hoocmon sinh dục và làm thuốc hạ nhiệt Rễ mật nhân được cho là thành phần có giá trị nhất, được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như đau nhức, sốt dai dẳng, sốt rét, suy dương, kiết lỵ, sưng tuyến và có thể dùng làm thuốc tăng cường sức khỏe Chiết xuất từ rễ cây mật nhân được dùng để khôi phục lại năng lượng cơ thể và sinh khí, tăng cường lưu thông máu đồng thời có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con Ngoài

ra, chiết xuất từ rễ mật nhân cũng được báo cáo rằng có chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u, chống ký sinh trùng, có khả năng gây độc tế bào đối với dòng tế bào gây ung thư ở người như ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại tràng và chống loét, Một hoạt tính rất nổi bật của loại cây này đó là hoạt tính tăng nội tiết tố testosterone ở nam giới; đã có rất nhiều nghiên cứu báo cáo về hoạt tính sinh học này trên chuột cũng như trên cơ thể người Vì vậy, việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng từ rễ cây mật nhân để

có thể bổ sung vào thực phẩm, tạo ra sản phẩm mới vừa đảm bảo giá trị dinh dưỡng vừa có tác dụng ngăn ngừa bệnh tật mang lại sức khỏe cho con người là cần thiết

Hiện nay trên thế giới, công nghệ chiết xuất và ứng dụng các chiết xuất từ mật nhân đã được sử dụng rộng rãi trong cả dược phẩm

và thực phẩm Riêng ở nước ta, mật nhân mới chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa có nhiều công trình công bố về vấn đề khai thác và ứng dụng của nó Với những tác dụng to lớn của loại thảo dược quý này, đồng thời nhằm đa dạng hóa sản phẩm và nâng cao giá trị sử dụng của rễ cây mật nhân chúng tôi đã quyết định

chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia) và ứng ḍng trong cnng ngḥ tḥc ph̉m”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của rễ cây mật nhân

- Khảo sát chọn dung môi và các điều kiện chiết tốt nhất

- Nghiên cứu làm giảm vị đắng dịch chiết nước mật nhân

3 Phạm vi nghiên cứu

Rễ cây mật nhân được thu nhận từ huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế Phạm vi nghiên cứu: chiết xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ rễ cây mật nhân và định danh thành phần hoá học trong dịch chiết thu được và ứng dụng vào công nghệ thực phẩm

4 hương pháp nghiên cứu

Phương pháp hóa lý

- Xác định độ ẩm

- Xác định tro toàn phần

- Xác định thành phần một số kim loại

- Xác định thành phần hóa học của dịch chiết: phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS

- Chiết xuất bằng phương pháp chưng ninh

Phương pháp hóa sinh

- Xác định hàm lượng đường tổng số và hàm lượng tinh bột

- Xác định hàm lượng protein

- Xác định hàm lượng lipid

Phương pháp thử hoạt tính sinh học của dịch chiết

- Hoạt tính chống oxi hóa: phương pháp DPPH

- Hoạt tính kháng khuẩn : phương pháp đục lỗ

Phương pháp cảm quan

Phương pháp thống kê và xử lý số lịu

5 nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý ngh̃a khoa học

- Đóng góp vào kho tài liệu thông tin khoa học về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cây mật nhân và dịch chiết của nó

- Đóng góp về các thông số công nghệ của quá trình chiết bằng các phương pháp phân tích khoa học và hiện đại

5.2 Ý ngh̃a tḥc tiễn

- Tối ưu hóa điều kiện chiết ở quy mô phòng thí nghiệm; từ đó góp phần ứng dụng đối với quy mô sản xuất

- Tạo ra sản phẩm mới có giá trị kinh tế, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, tăng hiệu quả sử dụng đối với cây mật nhân

- Góp phần đối với vấn đề nghiên cứu dược liệu ở Việt Nam

6 Cấu trúc của luận văn

Luận văn gồm 140 trang, ngoài phần mở đầu, kết luận, tài liệu tham khảo và các phụ lục còn có các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu, 23 trang

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu,10 trang Chương 3: Kết quả và thảo luận, 37 trang

C ƯƠN 1 TỔNG QUAN À L 1.1 TỔNG QUAN VỀ C N N

1.1.1 Đặc điểm thực vậtvà phân bố

Cây mật nhân (còn được gọi với tên bá bệnh, bách bệnh, mật

nhơn, hậu phác nam) tên khoa học Eurycoma longifolia (Tongkat Ali); là một loại thực vật có hoa thuộc họ Simaroubaceae (họ thanh

thất) có nguồn gốc từ Đông Nam Á – đặc biệt tìm thấy nhiều ở Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam, Lào

1.1.2 Thành phần hóa học

Mật nhân có chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học, mỗi bộ phận của cây chứa thành phần khác nhau như eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, và pasakbumin-B

mà trong đó các hợp chất của quassinoid, alkaloidlà những thành

phần chiếm chủ yếu

Quassinoid

Alkaloid

1.1.3 oạt tính sinh học của rễ cây mật nhân

a.Hoạt tính chống sốt rét, gây độc tế bào và hoạt tính chống ung thư

b.Chống ḅnh tiểu đường

c Hoạt tính kích thích tình ḍc

d Hoạt tính kháng khủn

1.2 CƠ Ở Ề C X Ấ ƯỢC L

1.2.1 Khái niệm

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

a Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược lịu

b Những yếu tố thuộc về dung mni

c Những yếu tố thuộc về kỹ thuật

1.2.3 Các phương pháp chiết xuất

a Phương pháp chiết xuất gián đoạn

b Phương pháp chiết xuất bán liên ṭc

c Phương pháp chiết xuất liên ṭc

d Một số kỹ thuật chiết hịn đại

1.3 ÌN ÌN N N C N À N À NƯỚC

C ƯƠN 2

Đ ƯỢN À ƯƠN N N C 2.1 Đ ƯỢN N N C

2.1.1 Nguyên liệu

Rễ cây mật nhânđược thu nhận từ huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế đem về phòng thí nghiệm để xử lý như sau: rửa sạch, phơi khô tự nhiên, xay nhỏ thành bột, cho vào túi ghép mí để bảo quản

2.1.2 hiết b ụng cụ và hoá chất trong quá trình nghiên cứu

a hiết bị và ḍng c̣ sử ḍng trong quá trình nghiên cứu

b Hoá chất sử ḍng trong quá trình nghiên cứu

2.2.1 Xác đ nh một số thành phần hoá học của rễ cây mật nhân

a Phương pháp xác định độ ̉m

b.Xác định hàm lượng chất béo

c ác định hàm lượng prot in

d ác định hàm lượng đường t ng số, hàm lượng tinh bột

e ác định hàm lượng xenlulozathô

f ác định hàm lượng tro t ng số

g ác định hàm lượng một số kim loại n ng

2.2.2.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng ninh bột rễ mật nhân

a hảo sát ḷa chọn dung mni chiết

Khảo sát với 4 dung môi: nước, cồn tuyệt đối, etyl axetat và hexan

n-b hảo sát ảnh hư ng t ḷ dung mni nguyên lịu đến hịu suất chiết

Khảo sát 6 tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1, 60/1

c hảo sát ảnh hư ng của thời gian chiết đến hịu suất chiết

Khảo sát 6 thời gian chiết từ 30, 0, 0, 120, 1 0 và 240 phút

d hảo sát ảnh hư ng của nhịt độ chiết đến hịu suất chiết

Khảo sát với các nhiệt độ chiết 00C, 700C, 800C, 900C, 1000C

2.2.3 Khảo sát thành phần hoá học của ch chiết nư c mật nhân b ng phương pháp s c k l ng gh p khối ph LC MS 2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá b ng phương pháp DPPH

2.2.5 hương pháp vi sinh

a hảo sát hoạt tính kháng khủn b ng phương phápkhuếch tán trên l thạch

b Phương pháp xác định t ng vi sinh vật hiếu khí

c Phương pháp xác định t ng số nấm m n, nấm mốc

2.2.6 hương pháp cảm quan

a Phép thử so hàng mức độ ưu tiên

b Phép thử thị hiếu chấp nhận

2.2.7 hương pháp x l số liệu

Rễ cây mật nhân

Làm sạch

Phơi khô tự nhiên

Nghiền

thành

bột

Khảo sát thành phần hoá

học của rễ cây mật nhân

Khảo sát lựa chọn dung môi

chiết Nước Cồn Ethyl axetat n-hexan Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ

600C 700C 800C 900C

1/50 1/60

0 phút

0 phút

120 phút

1 0 phút

240 phút

từ rễ cây mật nhân

Định danh thành phần hoá học của dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân bằng phương pháp LC/MS

Thăm dò giảm vị đắng của dịch chiết nước mật nhân

Khảo sát

ảnh hưởng

của các yếu

tố đến hiệu

suất chiết

Chưng ninh

C ƯƠN 3

K T QUẢ VÀ THẢO LU N 3.1 X C Đ NH MỘT S ÀN N Ó ỌC N

C N N

Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học của rễ cây mật nhân

Bảng 3.2 Một số kim loại có trong rễ cây mật nhân

Đối với quá trình chiết xuất, chất béo và protein là thành phần không có lợi, gây cản trở cho quá trình chiết Trong rễ cây mật nhân, hàm lượng lipit và protein tương đối thấp (lipit chiếm 3,2 % KL

mẫu, protein 203,2 mg/kg), thuận lợi cho việc chiết xuất các thành phần có hoạt tính sinh học

Hàm lượng của các kim loại nặng phổ biến như Pb, As, Cd,

Hg thấp hơn nhiều so với hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép có trong thực phẩm theo Bộ Y Tế Vì vậy có thể sử dụng rễ mật nhân làm nguyên liệu trong thực phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khỏe con người

3.2 N N C L C ỌN N Ô C

Độ phân cực của dung môi khác nhau thì khả năng hòa tan các cấu tử chiết là khác nhau Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 4 dung môi có độ phân cực tương đối khác nhau để khảo sát là: nước, cồn 0, ethyl axetat và n-hexan

Hình 3.1 Hiệu suất chiết theo từng loại dung môi

Qua đồ thị ta nhận thấy hiệu suất chiết tăng dần theo thứ tự hexan, ethyl acetate, ethanol, rồi đến nước.Dung môi được chọn là dung môi phải hòa tan tốt các chất cần chiết Nguyên tắc dựa vào độ phân cực của dung môi, dung môi càng phân cực thì càng có khả năng hòa tan tốt các hợp chất phân cực, dung môi không phân cực thì có khả năng hòa tan tốt các hợp chất không phân cực Với 4 dung môi khảo sát thì độ phân cực được xếp theo chiều giảm dần như sau:

nước > cồn > etyl axetat > n-hexan Kết quả thí nghiệm cho thấy chiều giảm hiệu suất chiết của các dung môi cũng chính là chiều giảm độ phân cực.Có thể giải thích kết quả của hiệu suất chiết như sau: trong thành phần rễ cây mật nhân, theo tác giả Rajeev Bhat và cộng sự (2010) thì thành phần chủ yếu là các quassionoid và alkaloid Trong đó, các alkaloid là những hợp chất có tính chất phân cực mạnh, còn các quassioid là những dẫn xuất của triterpend – là những hợp chất phân cực vừa Do đó, những thành phần này có thể hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như nước và cồn, tan tương đối ít trong dung môi etyl axetat, và tan rất ít trong dung môi n-hexan.Mặc khác, nước

là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn khi bổ sung vào thực phẩm, lại không gây mùi vị khó chịu đối với thực phẩm nên chúng tôi chọn dung môi chiết là nước để thực hiện cho những nghiên cứu

tiếp theo

3.3 N N C C C ẢN ƯỞN Đ N Ấ C N N Ô NƯỚC

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ung môi nguyên liệu

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn/lỏng đến hiệu suất chiết

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ rắn/lỏng, chúng tôi nhận thấykhi thay đổi tỷ lệ từ 1/10 đến 1/50 thì hiệu suất chiết thu được của quá trình chiết tăng lên đáng kể Tiếp tục giảm tỷ lệ

rắn/lỏng đến 1/60 thì hiệu suất chiết giảm xuống Như vậy, với tỷ lệ rắn/lỏng khác nhau thì cho hiệu suất chiết khác nhau Khi tỷ lệ này giảmxuống, tức làcùng với một lượng nguyên liệu nhưng dung môi nhiều hơn do đó bề mặt tiếp xúc của các hạt bột nguyên liệu tăng lên nên khả năng hòa tan các chất chiết tăng theo.Khi tỷ lệ rắn/lỏng lớn, lượng dung môi không đủ để hoà tan hết các cấu tử chiết có trong nguyên liệu, do đó hiệu suất thấp Khi đạt được mức chiết cao nhất nếu tiếp tục tăng lượng dung môi (giảm tỷ lệ rắn/lỏng) thì khả năng hòa tan các chất chiết sẽ không tăng lên Mặc khác, khi tăng thể tích dung môi lên còn làm tăng khả năng hòa tan một số tạp chất khác có trong nguyên liệu và gây lãng phí.Vậy tỷ lệ rắn/lỏng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ chiết 00C, thời gian chiết là 1 0 phút là 1/50 (g/ml)

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết

Trong chiết xuất thường xảy ra một số quá trình: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích Do đó thời gian chiết phải thích hợp để cho quá trình chiết có thể lấy triệt để các cấu tử cần thiết ra khỏi nguyên liệu

Hình 3.3 Ảnh hưởng của th̀i gian chiết đến hiệu suất chiết

Kết quả cho thấy rằng, khi tăng thời gian chiết thì hiệu suất chiết tăng lên và đạt cực đại ở 0 phút Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi

trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn Do đó, ở thời gian 30 phút, một phần các hoạt chất được hòa tan nhưng do thời gian không đủ dài để hòa tan hết các hoạt chất có trong nguyên liệu Khi tăng thời gian lên 0 phút là thời gian vừa đủ để các cấu tử chiết cần thiết hòa tan triệt để vào dung môi nên hiệu suất tăng lên Do nước là một dung môi có khả năng hòa tan được rất nhiều chất khác nhau; mặc khác, trong thành phần rễ cây mật nhân có chứa , 3% tinh bột và một số chất có tính keo; vì vậy khi kéo dài thời gian chiết lên lượng tinh bột này sẽ bị hồ hoá dưới tác dụng của nhiệt trong thời gian dài Lúc này, độ nhớt của dịch chiết sẽ tăng lên nên gây cản trở cho việc khuếch tán các cấu tử cần chiết từ trong tế bào nguyên liệu

ra dung môi Do đó, hiệu suất chiết khi thời gian tăng lên thì lại giảm

đi Đồng thời, khi kéo dài thời gian chiết, một số cấu tử có trong dịch chiết sẽ bị phân hủy dưới tác động của nhiệt độ sinh ra những hợp chất khác nhau lẫn trong dịch chiết Vậy, thời gian chưng ninh thích hợp ở điều kiện nhiệt độ 00C, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20 (g/ml) là 0 phút

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

Yếu tố nhiệt độ cũng là yếu tố thường có ảnh hưởng nhiều đến quá trình chiết xuất

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết