Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển việt nam và hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ KIM THUYỀN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ 15 LOÀI HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT SINH HỌ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ KIM THUYỀN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ 15 LOÀI HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM

VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT

SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ KIM THUYỀN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ 15 LOÀI HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM

VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT

SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung thực hiện của luận văn này là kết quả nghiên cứu của bản thân, không sao chép kết quả nghiên cứu của người khác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn nếu có bất kỳ sự gian dối nào

Khánh Hòa, Ngày 21 tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Võ Thị Kim Thuyền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của các quý Thầy Cô, bạn bè và người thân Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu, các phòng ban chức năng, quý Thầy Cô giáo đã giảng dạy, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trường

Quý Thầy Cô Trung tâm Thí nghiệm Thực hành đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS.Huỳnh Nguyễn Duy Bảo đã hướng dẫn tận tình và chu đáo trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành báo cáo Luận văn

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Khánh Hòa, ngày 21 tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Võ Thị Kim Thuyền

MỤC LỤC

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng ix

Danh mục hình x

Trích yếu luận văn xiii

Mở đầu 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về hải miên 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của hải miên 3

1.1.2 Hình thức sinh sản của hải miên 3

1.1.3 Môi trường sống của h miên 4

1.1.4 Ứng dụng của hải miên 4

1.1.5 Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới và Việt Nam 5

1.2 Một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có trong hải miên 8

1.2.1 Nhóm hợp chất phenol 8

1.2.2 Nhóm hợp chất sterol 8

1.2.3 Nhóm hợp chất flavonoid 9

1.2.4 Nhóm hợp chất saponin 9

1.2.5 Nhóm hợp chất polypeptide 9

1.2.6 Nhóm hợp chất glycoside 10

1.3 Phương pháp chiết tách các hợp chất 10

1.3.1 Cơ sở lý thuyết phương pháp chiết 10

1.3.2 Một số phương pháp hỗ trợ chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học 11

1.4 Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa 13

1.4.1 Quá trình oxy hóa 13

1.4.2 Chất chống oxy hóa 14

1.4.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến… 15

1.5 Phương pháp xác định protein 18

1.5.1 Phương pháp định lượng protein 18

1.5.2 Một số phương pháp kết tủa tách phân đoạn protein 20

1.5.3 Một số kỹ thuật phân tích protein 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 29

2.1.1 Nguyên liệu 29

2.1.2 Hóa chất 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 30

2.2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát 15 loài hải miên và sàng lọc loài hải miên tiềm năng để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 31

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết thích hợp để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong hải miên 32

2.2.4 Thí nghiệm tinh chế sơ bộ dịch chiết từ hải miên có hoạt tính chống oxy hóa………40

2.3 Phương pháp phân tích 45

2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng 45

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu thực nghiệm 46

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và phân tích nhận diện các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên 47

3.1.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên 47

3.1.2 Phân tích nhận diện các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết 15 loài hải miên Error! Bookmark not defined 3.2 Xác định điều kiện chiết thích hợp để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong hải miên (Ircinia mutans) 51

3.2.1 Xác định loại dung môi chiết thích hợp có hỗ trợ siêu âm và không siêu âm để thu được dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 51

3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để thu được dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao 57

3.2.3 Xác định thời gian chiết thích hợp để thu được dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao 59

3.2.4 Xác định nhiệt độ chiết thích hợp để thu được dịch chiết hải miên có hoạt

tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao 61

3.2.5 Xác định số lần chiết thích hợp để thu được dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao 63

3.2.6 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên 65

3.3 Tinh chế sơ bộ dịch chiết từ hải miên có hoạt tính chống oxy hóa 70

3.3.1 Tách phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên bằng muối ammonium sulfate……… 71

3.3.2 Tinh sạch protein từ dịch chiết hải miên để thu được protein có hoạt tính chống oxy hóa cao 76

3.3.3 Phân tích protein trong dịch chiết hải miên bằng sắc ký cột trao đổi ion 78

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 82

4.1 Kết luận 82

4.2 Đề xuất ý kiến 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các thành phần hợp chất chống oxy hóa được nhận diện trong dịch chiết

15 loài hải miên Error! Bookmark not defined

Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm được chọn để khảo sát mẫu ban đầu 66

Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm leo dốc hàm mục tiêu IC50 DPPH 67

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm leo dốc hàm mục tiêu IC50 tổng khử 69

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm leo dốc của hàm chập YL 69

Bảng 3.6 Hoạt tính chống oxy hóa trong 1g protein của các phân đoạn tách bằng muối ammonium sulfate 74

Bảng 3.7 Hoạt tính chống oxy hóa trong 1g protein của phân đoạn protein 80% tách bằng muối ammonium sulfate trước và sau khi tinh sạch 77

Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxy hóa trong 1g protein tại các đỉnh 80

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo cơ thể hải miên 3

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH 15

Hình 1.3 Phản ứng Biure 19

Hình 1.4 Phản ứng lowry 19

Hình 1.5 Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối 21

Hình 1.6 Sơ đồ điện di SDS – Page 24

Hình 1.7 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2 – DE 25

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát 15 loài hải miên và sàng lọc loài hải miên tiềm năng để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 31

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi chiết thích hợp có hỗ trợ siêu âm để thu được dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 32

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để thu được dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 34

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp để thu được dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 35

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp để thu được dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 36

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết thích hợp để thu được dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 38

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết để thu được dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất 39

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên 40

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tinh sạch protein từ dịch chiết hải miên 42

Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích protein trong dịch chiết hải miên bằng sắc ký trao đổi ion Hình 3.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam 47 Hình 3.2 Tổng năng lực khử của dịch chiết 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam 49

Hình 3.3 Hoạt tính khử hydrogen peroxide của dịch chiết 15 loài hải miên ở vùng

biển Việt Nam 50

Hình 3.4 Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau 52

Hình 3.5 Năng lực khử của dịch chiết hải miên được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau 53

Hình 3.6 Hàm lượng protein của dịch chiết hải miên được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ siêu âm và không hỗ trợ siêu âm 54

Hình 3.7 Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử với hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết hải miên 56

Hình 3.8 Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử với hàm lượng protein không hỗ trợ siêu âm của dịch chiết hải miên 57

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên 58

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng protein 59

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên 60

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng protein 61

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên 62

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng protein 63

Hình 3.15 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên 64

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng protein 65

Hình 3.17 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu IC50 DPPH 67

Hình 3.18 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu IC50 tổng khử 68

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ và thời gian đến giá trị IC50 hàm chập tuyến tính….68 Hình 3.20 Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn protein với nồng độ ammonium sulfate bão hòa từ 20% đến 80% 0

Hình 3.21 Tổng năng lực khử của các phân đoạn protein với nồng độ ammonium sulfate bão hòa từ 20% đến 80% 72

Hình 3.22 Hàm lượng protein của các phân đoạn protein với nồng độ ammonium

sulfate bão hòa từ 20% đến 80% 73 Hình 3.23 Kết quả xác định thành phần khối lượng protein trong các phân đoạn bằng

phương pháp SDS – PAGE 75 Hình 3.24 Hoạt tính chống oxy hóa của phân đoạn protein 80% tách bằng muối

ammonium sulfate trước và sau khi tinh sạch 76 Hình 3.25 Kết quả xác định thành phần khối lượng protein của phân đoạn trước và sau

khi tinh sạch bằng phương pháp SDS – PAGE 77 Hình 3.26 Phân tích protein trong dịch chiết hải miên bằng sắc ký cột trao đổi ion 78 Hình 3.27 Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hải miên ở các phân đoạn được

phân tách bằng sắc ký cột trao đổi ion 79 Hình 3.28 Kết quả xác định thành phần khối lượng protein trong các phân đoạn tách

sắc ký trao đổi ion bằng phương pháp SDS – PAGE 81

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Chủ đề nghiên cứu của luận án là khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam và hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên

Mục tiêu đạt được là khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam Hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên.Tinh chế sơ bộ protein có hoạt tính chống oxy hóa từ hải miên

Các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm được sử dụng để nghiên cứu gồm các phương pháp xác định: hàm lượng protein, hoạt tính khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử, khử hydrogen peroxide, điện di SDS – PAGE Áp dụng các phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả đảm bảo yêu cầu khách quan về độ chính xác cho phép với sự hỗ trợ của phần mềm thống kê R phiên bản 3.2.1,

Statgraphics XV, Microsoft Excel 2010 và SPSS 16.0

Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên cho thấy tất cả các loài hải miên được khảo sát đều có khả năng chống oxy hóa, loài

Diacarnus laevis và loài Ircinia mutans được xác định có hoạt tính chống oxy hóa cao

nhất Loài hải miên Ircinia mutans được chọn để tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy

trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa Điều kiện thích hợp nhất cho quá

trình chiết tách dịch chiết hải miên (Ircinia mutans): Dung môi chiết nước cất; Chiết

dung môi/nguyên liệu 7/1 ml/g

Kết quả đạt được sau khi tinh chế sơ bộ protein có hoạt tính chống oxy hóa trong hải miên: Tách phân đoạn protein trong dịch chiết hải miên bằng muối ammonium sulfate bão hòa từ 20% – 80%, kết quả cho thấy phân đoạn 50% và 60% có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao nhất; Tinh sạch protein của phân đoạn 80% nồng độ muối ammonium sulfate bão hòa, kết cho thấy khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein của phân đoạn tổng 80% cao hơn rất nhiều mẫu tổng 80% tinh sạch; Tách protein trong dịch chiết hải miên bằng sắc ký cột trao đổi ion, kết quả thu được 3 đỉnh tương ứng với 3 pic trong đó 2 pic ở giai đoạn đầu và 1 pic thu được ở

giai đoạn rửa giải Khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein ở đỉnh 1 là cao nhất tiếp đến là đỉnh 2 và thấp nhất là đỉnh 3

Khối lượng phân tử của protein trong dịch chiết hải miên Ircinia mutans

khoảng 23 - 78 kDa

Từ khóa: hải miên; hoạt tính chống oxy hóa; Ircinia mutans

MỞ ĐẦU

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người

ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất [36] Hải miên được xếp đầu danh sách đối với việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng trong dược phẩm do sự đa dạng trong các cấu trúc hóa học của chất chuyển hóa có trong hải miên Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây phát hiện ra những hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải miên như chất chống oxy hóa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV [66]

Gulcin và cộng sự (2002) đã nghiên cứu phân tích bốn loài hải miên

Smenospongia, Callyspongia, Niphates, và Stylissa được thu thập từ Biển Đỏ ở bờ

biển Ai Cập, chiết xuất từ các loài hải miên này đã chỉ ra tác dụng ức chế đa dạng về chỉ số oxy hóa và các enzym thủy phân carbohydrate với tỷ lệ ức chế phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế [27] Theo Longeon và cộng sự (2011) đã phân tích được một

số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên, chẳng hạn như các dẫn xuất của indol, alkaloid thơm, polyketides thơm, và các hợp chất phenolic cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh hơn so với vitamin E và acid ascorbic [15], [51] Trong những năm gần đây có một số các hợp chất thiên nhiên mới trong hải miên được dùng để đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I-III để điều trị các bệnh ung thư khác nhau theo Mayer và cộng sự (2010) [53] Một chương trình hợp tác đã được khởi xướng vào năm 1990 giữa một phòng thí nghiệm hóa học sản phẩm tự nhiên (Đại học California Santa Cruz và một phòng thí nghiệm thử nghiệm phương pháp điều trị của Bệnh viện Henry Ford ở Detroit) tập trung vào việc phát hiện và phát triển các loại thuốc chống ung thư được chiết xuất từ hải miên [50]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hoạt chất sinh học từ hải miên vẫn còn khá mới

mẻ và chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu cụ thể về hải miên Trong khi đó, Việt Nam có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài hải miên cùng với các động vật ký sinh sinh sống và phát triển Các sản phẩm từ hải miên đã được nghiên cứu là có tính năng phòng bệnh, bao gồm cả kháng khuẩn, chống oxy hóa, hạ huyết áp, thuốc chống đông máu, chống ung thư, kháng viêm, làm lành vết thương và điều hòa miễn dịch, và các hiệu ứng thuốc khác [7] Trong khi đó, các nghiên cứu, đánh giá cũng như ứng dụng các hoạt tính sinh học của hải miên ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa tận dụng

được hết nguồn tài nguyên biển vô cùng quý giá Để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên quý giá này, việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất sinh học từ hải miên là

rất cần thiết và đó là lý do tôi chọn đề tài “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch

chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam và hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên”

Mục tiêu nghiên cứu

Việt Nam

Ý nghĩa khoa học

hóa của dịch chiết từ hải miên ở vùng biển Việt Nam

oxy hóa của hải miên ở vùng biển Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

oxy hóa cao, ứng dụng vào trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ thực

phẩm…

chống oxy hóa cao ở vùng biển Việt Nam

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về hải miên

1.1.1 Đặc điểm sinh học của hải miên

Hải miên là động vật đa bào thấp, cấu tạo cơ thể không tương đồng với các nhóm động vật đa bào khác như cơ thể chưa có kiểu đối xứng ổn định, chưa có lỗ miệng, chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất [22] Phần lớn hải miên sống ở biển, chỉ có khoảng 150 loài sống ở nước ngọt Màu sắc, hình dáng và kích thước của cơ thể khác nhau tùy theo loài, từ vài milimet tới vài mét Thân lỗ là nhóm sống bám tuy cũng quan sát thấy vài loài có thể di chuyển chỗ vài mm sau mỗi ngày, có thể do vận động của tế bào chất hoặc tế bào amip, hải miên ăn bằng cách lọc Hầu hết hải miên ăn các hạt hữu cơ nổi

và sinh vật phù du nhỏ mà chúng lọc được từ các dòng nước chảy qua cơ thể của

thành cơ thể vào khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài [8]

Hình 1.1 Cấu tạo cơ thể hải miên [71]

1.1.2 Hình thức sinh sản của hải miên

Hải miên sinh sản theo hai hình thức vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính bằng cách mọc chồi hoặc tạo mầm chồi, đó là những múm nhỏ mọc trên thành cơ thể Mầm

là khối tế bào amip được một lớp vỏ kép cách nhiệt bọc ngoài Sinh sản hữu tính với phần lớn thân lỗ lưỡng tính Tế bào sinh dục do tế bào amip hoặc tế bào cổ áo tạo

thành, chúng ở tầng keo và nằm dưới các phòng roi, tinh trùng chín lọt vào phòng roi theo dòng nước thoát ra ngoài, rồi tới thụ tinh noãn của một cá thể khác Thân lỗ có khả năng tái sinh cao Từ một mảnh cơ thể tách rời hoặc từ một đám tế bào sau khi nghiền nát hoặc sàn qua lưới vẫn có thể phát triển thành một cơ thể toàn vẹn [8]

1.1.3 Môi trường sống của hải miên

Hải miên sống trong một loạt các môi trường sống đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới [17] Hầu hết chúng sống trong vùng nước yên tĩnh bởi vì sóng hoặc các dòng nước sẽ khuấy động lớp trầm tích làm chặn các lỗ hút nước gây khó khăn cho chúng ăn và hô hấp [47] Phần lớn hải miên được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, một số loài hải miên gắn vào trầm tích mềm Hải miên ở vùng biển ôn đới dồi dào nhưng ít đa dạng hơn hải miên ở vùng biển nhiệt đới, có thể vì nguồn thức

ăn của hải miên ở vùng biển nhiệt đới có nhiều loại và phong phú hơn [31]

Ở Việt Nam, đã biết hơn 160 loài hải miên và phân bố nhiều ở vùng biển phía nam nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc và Côn Đảo

1.1.4 Ứng dụng của hải miên

Phần lớn hải miên được ứng dụng trong y học Hải miên đã được sử dụng với hơn 5.300 sản phẩm khác nhau và mỗi năm có hàng trăm hợp chất mới được phát hiện Hầu hết các hợp chất chứa hoạt tính sinh học từ hải miên có thể được phân loại như kháng viêm, chống khối u, ức chế miễn dịch hoặc kháng virus, chống sốt rét, thuốc kháng sinh [28] Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên với sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên Các chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên với nhiều chất chuyển hóa có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào, chống viêm và hoạt tính kháng virus Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành công nghiệp dược phẩm để tạo ra các loại thuốc mới [6]

Ngoài ra còn có một số ứng dụng khác của hải miên như ngày nay nhu cầu sử

dụng hải miên làm “bông tắm” ngày càng tăng “Bông tắm” từ hải miên có thể được định nghĩa là bất kì loài hải miên nào sở hữu sợi chỉ spongin đó là các sợi đàn hồi làm

từ collagen Chất lượng của miếng hải miên dựa trên chất lượng của bộ xương xốp Các sợi mềm, bền và đàn hồi tốt sẽ có mức giá cao Bông tắm hiện đang được sản xuất

miếng xốp/năm được bán tại địa phương cho người dân và du khách

cứu môi trường của Pohnpei [56], [26]

Ngoài ra hải miên còn được sản xuất thành các hợp chất chống hà Một lớp cuối cùng của hợp chất bioactivem từ hải miên được sử dụng làm sơn chống hà Chúng không liên quan đến việc phát triển các loại thuốc mới, nhưng có thể thay thế thân thiện với môi trường Sơn chống hà tự nhiên từ phân tử hải miên gần đây đã được xem xét và có thể cung cấp cho hoạt động chống gỉ ít độc hại hơn và cụ thể hơn [30]

Từ các nghiên cứu ứng dụng trên, nhất là các ứng dụng trong ngành dược phẩm thì việc nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong hải miên ở vùng biển Việt Nam là hướng đi đầy triển vọng góp phần đẩy mạnh việc nghiên cứu chuyên sâu về hải miên cũng như ứng dụng vào các ngành dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm

1.1.5 Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay hải miên đang là đối tượng được quan tâm trong lĩnh vực tìm kiếm những nguồn dược liệu có nguồn gốc từ tự nhiên và đã thu được các kết quả tốt trong việc tìm ra các hợp chất chống ung thư và một số bệnh khác Một số nơi như ở New Zealand đã tiến hành nuôi trồng một số hải miên có giá trị phục vụ cho mục đích thương mại cũng như cho việc nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học [11]

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới

Trên thế giới, hải miên đã được biết đến và nghiên cứu từ khá lâu nhưng các công trình nghiên cứu mang tính chiều sâu thì chỉ mới xuất hiện trong vòng 20 năm trở lại

trong quá trình tiến hóa và chúng phải khắc phục hiện tượng pha loãng của nước biển trong quá trình lọc nước vì vậy các hợp chất thường rất mạnh để có hiệu quả trong môi trường biển [61] Từ đó, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hoạt tính sinh học có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn trong hải miên, cũng như nghiên cứu ứng dụng vào trong y học để nâng cao sức khỏe của con người Một số nghiên cứu

có liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn trong hải miên:

Halliwell (1994), Chairman (2012) đã nghiên cứu một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C [22], [35]

Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất

từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với

hydroxytoluene butylated (BHT) [49]

Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao [64]

Liu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các alkaloid

chiết từ hải miên thuộc chi Iotrochota đến từ vùng biển phía nam Trung Quốc Đối

tượng nguyên cứu là alkaloid purpurone được phân lập từ các miếng hải miên

Iotrochota sp Kết quả khảo sát cho thấy alkaloid purpurone là một chất chống gốc tự

do mạnh [72]

Reddy và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa, chống

viêm và chống nấm của loài hải miên Subergargoria suberosa Kết quả cho thấy acid

subergargoric 1 có tác dụng chống oxy hóa và viêm cao nhất và cũng cho thấy hợp chất 7 có hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm cao hơn hợp chất 2 Những kết quả này gợi ý rằng acid subergorgic cũng như các dẫn xuất của nó tương tự hợp chất 2 và hợp chất 7 có tiềm năng lớn như một chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng chống oxy hóa và chống viêm [62]

Nghiên cứu của Sepcic (2010) về các hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất

từ hải miên nhiệt đới Trong nghiên cứu này họ đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc 66 chiết xuất được chiết từ 35 loài hải miên từ biển Caribbean (Curaçao) và từ tám loài từ Great Barrier Reef (Đảo Lizard) Dịch chiết xuất đã được chuẩn bị trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước và đã được thử nghiệm cho tán huyết, hemagglutinating, kháng khuẩn và các hoạt động chống acetylcholinesterase (AChE), cũng như khả năng của chúng để ức chế hoặc kích hoạt protein phosphatase tế bào 1 Họ kết luận rằng hầu như tất cả các chất chiết xuất từ hải miên trong nghiên cứu này cho thấy chúng có ít nhất là một hoạt tính, nhưng chỉ có vài loài đại diện đầy tiềm năng cho các nghiên cứu

về thành phần hoạt tính của chúng Hầu hết các thành phần này là các hợp chất hữu cơ

mà hoạt tính không bị phá hủy bởi nhiệt [65]

Orhan và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu các chất chiết xuất từ hải miên của nhiều loài khác nhau trên biển Địa trung hải thuộc địa phận Thổ Nhĩ Kỳ Kết quả các chất chiết xuất hải miên cho thấy tính kháng khuẩn đáng chú ý, hoạt động chống AChE và gốc tự do DPPH hiệu quả [59]

Các nghiên cứu trên cho thấy các hợp chất trong hải miên đều có hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất trong hải miên phụ thuộc vào loài, đặc điểm môi trường sống, các phương pháp và kỹ thuật tách chiết,…Bên cạnh đó các nghiên cứu cũng cho thấy các tiềm năng ứng dụng của hải miên là vô

cùng lớn

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu hải miên tại Việt Nam

Ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu chuyên sâu về hải miên, cả về khu hệ sinh thái hải miên cũng như thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong hải miên Một số công trình nghiên cứu như:

Báo cáo của Lindgren (1897, 1898) công bố khoảng 20 loài hải miên tại khu vực quần đảo Malaysia và vùng biển Đông [50]

Năm 2002 các chuyên gia hoạt động trong dự án hợp tác Việt Nam - Italia về bảo tồn đa dạng sinh học dải ven biển Việt Nam khi nghiên cứu tại khu vực vịnh Hạ Long (Quảng Ninh) và khu đầm phá Tam Giang - Cầu Hai (Thừa Thiên Huế) đã phát hiện 161 loài hải miên thuộc 41 họ [21]

Nguyễn Xuân Cường và các cộng sự (2007) đã nguyên cứu và phân lập các

thành phần hóa học của loài hải miên Xestospongia testudinaria thu thập tại Việt nam

Trong nguyên cứu này họ đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất là:

thymidine, thymine, batilo và chimyl alcohol [7]

Việt nam có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài hải miên cùng với các động vật kí sinh sinh sống và phát triển thế nhưng chúng ta vẫn chưa tận dụng được hết nguồn tài nguyên biển vô cùng quý giá này Vì thế việc nghiên cứu về các loài hải miên ở vùng biển Việt Nam là vô cùng cần thiết, góp phần thúc đẩy việc khai thác, ứng dụng hải miên vào trong đời sống thực tiễn

1.2 Một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có trong hải miên

Trong số các nguồn hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ tự nhiên, hải miên được xếp vào hạng có chứa hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C [22] Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt

chất sinh học chiết xuất từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn

đáng kể so với hydroxytoluene butylated (BHT) Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao [35], [49], [64]

1.2.1 Nhóm các hợp chất phenol

Các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vòng thơm Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có (do nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no) Trong cấu trúc của chúng, vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên tử hydro ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao Một số polyphenol thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin [6] Polyphenol là những hợp chất phân cực nên thường dùng các dung môi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi nguyên liệu, các dung môi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol, methanol, … Trong đó, dung môi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do tính an toàn, có khả năng hòa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ [9]

1.2.2 Nhóm hợp chất sterol

Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran Các sterol là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng,…không tan trong nước Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi nguyên liệu Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ

thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten, leucithin (đối với sterol thực vật) Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Thực hiện sắc ký (cột, lớp mỏng, giấy, ) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol [45]

1.2.3 Nhóm hợp chất flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự

do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform [23]

1.2.4 Nhóm hợp chất saponin

Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, galactose, pentose, metyl pentose, .) và phần sapogenin (aglycol) Phần sapogenin có thể là seroid hay triterpenoid Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh Thường các steroid saponin thì tả truyền còn triterpenoid saponin thì hữu truyền Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung môi phân cực để chiết xuất saponin [43]

1.2.5 Nhóm hợp chất polypeptide

Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới 10.000

Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn [27]

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống oxy hóa

in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide,

hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide Nước và các dung môi phân cực hòa tan tốt polypeptide nên chúng được sử dụng để chiết xuất peptide [27], [67], [69]

1.2.6 Nhóm hợp chất glycoside

Glycoside là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, ramnose, digitoxose, xymarose, ) và phần aglycol (steroid, sterol, acid mật, hormon, ) Tùy theo đặc điểm cấu tạo của aglycol mà glycoside có hoạt tính sinh học khác nhau Hoạt tính chống oxy hóa của glycoside khác nhau phụ thuộc vào độ hòa tan và sự oxy hóa aglycon chứa monosaccharide hoặc disaccharide ở vị trí C3 Glycoside là hợp chất phân cực nên hòa tan được trong các dung môi phân cực như nước cất, methanol, ethanol, Vì vậy, để chiết xuất glycoside thường sử dụng các dung môi phân cực

[20]

1.3 Phương pháp chiết tách các hợp chất

1.3.1 Cơ sở lý thuyết phương pháp chiết

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các

mô Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết [11] Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:

Sự hòa tan của chất tan vào dung môi

Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi

Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất

Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa tùy yêu cầu, điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp

Các phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt Trong phương pháp ngâm, nguyên liệu được ngâm trong dung môi ở một thời gian nhất định để các chất tan trong nguyên liệu hòa tan vào dung môi Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào, quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi nguyên liệu Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối nguyên liệu theo một chiều xác định với tốc độ nhất định Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong nguyên liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối nguyên liệu Như vậy, ngấm kiệt là một quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối nguyên liệu Dung môi mới tiếp xúc với nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết tốt hơn Tùy theo từng loại họat chất mà chọn dung môi chiết thích hợp Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải sử dụng các dung môi phân cực Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực [2], [11]

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với

sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất

1.3.2 Một số phương pháp hỗ trợ chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học 1.3.2.1 Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)

Trong quá trình chiết xuất, sóng siêu âm được áp dụng để tăng hiệu quả chiết nhờ tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường khả năng tiếp xúc giữa dung môi với các chất tan có trong nguyên liệu, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan Sóng siêu âm thường được sử dụng trong chiết xuất

có tần số từ 20 KHz đến 100MHz [58]

Ưu điểm của phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm là rút ngắn đáng

kế thời gian chiết, có thể áp dụng được cho hầu hết các loại dung môi có độ phân cực khác nhau, lượng dung môi sử dụng ít, chi phí thấp và giảm ô nhiễm môi trường Phương pháp này không áp dụng được đối với những hợp chất dễ bị phân hủy hoặc có hoạt tính không ổn định dưới tác dụng của sóng siêu âm

Trong nghiên cứu hoặc chuấn bị mẫu phân tích thường chiết xuất với thế tích nhỏ nên có thế nhúng bình chiết vào một bế siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát

ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa nguyên liệu và dung môi Trong quá trình chiết với sự hỗ trợ của siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên Trong một số trường hợp có thể kết hợp gia nhiệt để tăng cường quá trình chiết xuất

1.3.2.2 Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction)

Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng được Ganzler và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1986, nó được áp dụng để chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Nhiều nghiên cứu sau đó đã áp dụng kỹ thuật này để chiết xuất các hợp chất từ hạt giống, thức ăn, Kết quả cho thấy chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng hiệu quả hơn so vói các phương pháp cổ điển như Soxhlet hoặc ngâm chiết Trong những năm gần đây, kỹ thuật này được phát triến và ứng dụng rộng rãi để chiết tách các hợp chất tự nhiên từ các mẫu sinh học [32]

Vi sóng là sóng điện từ có tần số từ 300 MHz đến 300 GHz Khi chiếu bức xạ điện từ vi sóng vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường, cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất Trong chiết xuất, khi chiếu bức xạ điện từ vi sóng vào hỗn hợp chiết (nguyên liệu có chứa hoạt chất sinh học và dung môi phân cực), các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào nguyên liệu, giải phóng các chất tan trực tiếp vào dung môi chiết, chuyển quá trình chiết thành quá trình hòa tan đơn giản Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết có nhiều tạp chất hơn

Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ chiết xuất hoạt chất sinh học ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho các phương pháp chiết xuất truyền thống, rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài phút đến vài chục phút Hiện nay, chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng đã được áp dụng ở quy mô lớn Nhược điểm chính của phương pháp này

là dịch chiết có chứa nhiều tạp chất hơn nên cần phải có phương pháp tách loại tạp chất

1.3.2.3 Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao (Pressurised liquid extraction)

Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao là một trong những kỹ thuật chiết hiện đại được áp dụng trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Nguyên lý của phương pháp này dựa vào đặc điểm là khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất và dung môi tăng Trong chiết xuất dưới áp suất cao, dung môi chiết được đưa đến nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn Ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi nên chiết xuất đạt hiệu quả hơn Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 - 200°C và áp suất có thể lên đến 150 bar tùy theo loại dung môi và hợp chất cần chiết [42], [54]

Một biến thể của chiết xuất bằng chất lóng dưới áp suất cao cũng được áp dụng trong chiết xuất hoạt chất sinh học là chiết xuất bằng nước nóng dưới áp suất cao (pressurized hot water extraction) Do điểm tới hạn của nước khá cao nên phương pháp này được thường thực hiện ở áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 - 200°C Trong điều kiện này, độ phân cực của nước bị thay đổi rất nhiều nên có thể chiết được các chất kém phân cực [42], [44]

Các phương pháp hỗ trợ chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học trên ngày càng được sử dụng rộng rãi trong chiết tách các hợp chất nhằm nâng cao hiệu quả chiết tách, rút ngắn thời gian, giảm lượng dung môi sử dụng cũng như ô nhiễm môi trường

Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp hỗ trợ chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học nhưng chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm được sử dụng rộng rãi vì đây

là phương pháp rút ngắn đáng kế thời gian chiết, có thể áp dụng được cho hầu hết các loại dung môi có độ phân cực khác nhau, lượng dung môi sử dụng ít, chi phí thấp, giảm ô nhiễm môi trường và dễ áp dụng

1.4 Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa

1.4.1 Quá trình oxy hóa

Quá trình oxy hóa là một loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy

tế bào sinh vật khi có mặt của oxy Gốc tự do là bất cứ phân tử hóa chất nào chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử Gốc tự do điện

tích luôn không cân bằng, có xu thế lấy điện tử từ phân tử khác và tạo ra góc tự do mới gây ra sự rối loạn chức năng của tế bào Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn sẵn sàng thực hiện oxy hoá, nhận điện tử của chất mà nó tiếp xúc (để ghép đôi với điện tử độc thân của nó) và làm chất bị nó oxy hoá bị huỷ hoại nặng nề Những gốc như superoxide, hydroxyl, peroxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được coi là gốc tự do [12], [15]

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH., O2.–, NO.,…) như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc

tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch…Do đó, để tránh

sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như các VTM (A, C, E,…), polyphenols, flavonoids, anthocyanins, carotenoids,…[40]

1.4.2 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng [66] Chất chống oxy hóa chia làm hai loại là chất chống oxy hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp

Chất chống oxy hóa được coi là tự nhiên nếu nó được tách chiết từ nguyên liệu

tự nhiên hay được chuyển hóa bằng con đường sinh học như sử dụng tế bào của chính

nó hoặc sử dụng enzyme Một số chất chống oxy hóa được thu nhận từ tự nhiên như retinoids (vitamine A), tocopherols (vitamine E), ascorbic acid (vitamine C), polyphenols, carotenoids, manganese, zinc, selenium [37] Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa thu nhận từ quá trình thủy phân protein động thực vật bằng enzyme cũng được coi là chất chống oxy hóa tự nhiên

Chất chống oxy hóa tổng hợp là các chất chống oxy hóa được tạo thành bằng con đường hóa học Một số chất chống oxy hóa tổng hợp được sử dụng rộng rãi như butylated hydrotolene (BHT), butylated hydroanisole (BHA), propyl gallate (PG), ethoxyquin, nordihydroguai acetic acid (NDGA), 2,4,5-trihydroybutyrophenone

(THBP), octyl gallate (OG), tertiary butyl hydroquinone (TBQH, tertiary butyl hydroquinone (TBQH) [37]

Các nghiên cứu về chất chống oxy hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp cho thấy các chất chống oxy hóa tự nhiên đa dạng hơn, tạo ra nhiều tác động tích cực đến chất lượng cảm quan khi bổ sung vào thực phẩm và dễ dàng được chấp nhận bởi người tiêu dùng và các cơ quan y tế Tuy nhiên, so với các chất chống oxy hóa tổng hợp thì các chất chống oxy hóa tự nhiên trong thành phần còn có nhiều chất khác

và hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn [44]

Các thăm dò xu thế tiêu dùng trên thế giới về các chất chống oxy hóa cho thấy, hiện nay người tiêu dùng ngày càng có xu hướng sử dụng các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên vì giá trị dinh dưỡng và tính an toàn của nó [44] Do đó, nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm, đầu tư vào việc nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các chất chống oxy hóa tự nhiên trong các lĩnh vực như thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm

1.4.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ

biến

1.4.3.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa vì nó đơn giản, nhanh chóng và ổn định Khả năng khử gốc tự do DPPH của chất chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên được phân tích dựa vào phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [29]

Nguyên tắc của phương pháp:

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH [68]

l,l - diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt

chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl (DPPH- H) do trung hòa gốc DPPH bằng cách cho đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết họp với một nguyên tử hydro của chất chống chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử Hoạt tính quét gốc tự do của chất chống oxy hóa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

1.4.3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử

Tổng năng lực khử của chất chóng oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu (1986) [60]

Nguyên tắc:

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chất Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính oxy hóa) sẽ khử potassium ferricyanid

1.4.3.3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ

Lipid/FeCl/H 2 0 2

Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Hải miên dựa

Bảo và cộng sự (2013) [4]

Nguyên tắc:

do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (MetMb) và

ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ son giảm đi Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ son để phân tích hoạt tính của chất chống oxy hóa

Myoglobin sử dụng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa trong hệ phản ứng

lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm

1.4.3.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide

Khả năng khử hydroperoxide của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Nabavi và cộng sự (2008) [57]

Khả năng khử hydroperoxide của chất chống oxy hóa có thể là do nó cho điện

tử khi tham gia phản ứng oxy hóa Vì vậy khả năng khử hydroperoxide cũng biểu hiện

tham gia vào phản ứng Fenton tạo ra các gốc hydeoxyl kích hoạt cho quá trình oxy hóa lipid sẽ gây độc tế bào

1 4.3.5 Phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC)

Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hỗn hợp lipid của chất chống oxy hóa Trong khảo nghiệm này, hydroperoxide sinh ra bởi acid oleic thêm vào hỗn hợp phản ứng bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ kèm trong thời gian thử nghiệm được đo gián tiếp, sắt (II) clorua và ammonium thiocyanate phản ứng với nhau để tạo ra ferric thiocyanate (màu đỏ) nhờ hydroperoxide Hỗn họp thí nghiệm gồm có: 0,1 ml mẫu chất chống oxy hóa, 1 ml acid oleic 200 mg/ml, 5 ml đệm

phosphat 0,04 M; 5 ml ethanol 75%, 2 ml nước cất và giữ ở 45°C, trong bóng tói Hỗn

hợp này cũng được chuẩn bị thêm phản ứng không có acid oleic để làm đối chứng Sau khi mẫu có màu đỏ, độ hấp thụ được đo ngay lập tức ở bước sóng 500nm Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ [44]

Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa nhưng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khử hydroperoxide được sử dụng rộng rãi vì đây là các phương pháp đơn giản, có độ tin cậy cao, ít tốn kém và dễ áp dụng

1.5 Phương pháp xác định protein

1.5.1 Phương pháp định lượng protein

Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein được sử dụng, tùy thuộc vào mục đích cũng như điều kiện nghiên cứu có thể áp dụng phương pháp định lượng protein phù hợp Một số phương pháp được áp dụng phổ biến như: định lượng protein bằng phương pháp so màu, dùng Bicinchoninic acid (BCA) hay quang phổ

1.5.1.1 Định lượng protein theo phương pháp Biuret

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa protein và Cu2+ trong môi trường

kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm [71]

Hình 1.3 Phản ứng Biure [69]

Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết peptid trong chuỗi polypeptide Phương pháp này được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn 20 – 2,000 µg/ml

1.5.1.2 Định lượng protein bằng phương pháp Lowry ( Buiret cải tiến)

Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp

Lowry và cộng sự (1951) với một vài hiệu chỉnh nhỏ [52]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin Phương

pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuân protein để từ đó định lượng hàm

lượng protein Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein

Hình 1.4 Phản ứng lowry [70]

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein, thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 – 2,000 mg protein

1.5.1.3 Định lượng protein theo phương pháp Bradford

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh Coomassie (

Coomassie Brilliant Blue G – 250) và cả khả năng hấp thụ bước sóng 595nm Trong môi trường Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với nhóm kị nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Dựa vào đường chuẩn protein suy ra hàm lượng protein trong mẫu [19]

Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein nhưng định lượng protein theo phương pháp lowry được sử dụng phổ biến do độ chính xác cao, xác định nồng độ protein trong khoảng rộng, hóa chất ít tốn kém và dễ áp dụng

1.5.2 Một số phương pháp kết tủa tách phân đoạn protein

Các phương pháp tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan của protein cần chiết tách Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết tách các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết Muốn thu nhận được các protein nguyên thể (protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó) cần sử dụng

các phương pháp khác nhau

Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để tách phân đoạn các phân tử protein có hoạt tính sinh học Có nhiều phương pháp kết tủa khác nhau như: kết tủa bằng muối, kết tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc kết tủa ở pH đẳng điện (pI) của protein

1.5.2.1 Phương pháp kết tủa protein bằng muối

Kết tủa protein bằng muối là phương pháp được áp dụng phổ biến để tách phân đoạn các protein có hoạt tính sinh học Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out)

Tính tan của protein tăng nhẹ ở nồng độ muối thấp (salting in) được giải thích đầu tiên bởi Debye và Huckel (1923) Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính

của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, nhờ đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi Debye và Huckel cho rằng tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch [24]

Ở nồng độ muối cao tính tan của protein giảm mạnh (salting out), hiện tượng này được Kirkwood giải thích rằng sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự kết tủa

Độ hòa tan protein ở nồng độ muối cao tuân theo công thức sau của Cohn:

log S = B - KI Trong đó:

S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)

trong dung dịch)

I: cường độ ion của muối

Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối như ở Hình 1.5

Hình 1.5 Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối [76]

Khi muốn tách protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp để tách được protein mục tiêu Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ

thuộc vào nhiệt độ và độ pH Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp kết tủa giảm xuống

Hiệu quả kết tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate

1.5.2.2 Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ

Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi:

Trong đó

S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ

D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào

R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối

Công thức trên cho thấy khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein Kết quả

là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, ngoại trừ một số dung môicó thể được sử dụng ở nồng độ cao như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO)

và ethanol [16]

1.5.2.3 Phương pháp kết tủa protein ở điểm đẳng điện

Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ kết tủa của protein cũng thay đổi Ở

pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amin bị proton hóa (thu nhận proton) Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carboxyl trong phân tử protein bị mất đi

điện Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường Khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường [16]

1.5.2.4 Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại

Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại dựa vào sự gắn kết của ion kim

loại với một phần của phân tử protein Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm

có chứa lưu huỳnh [41]

Trong số các phương pháp kết tủa protein, phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sutfate có nhiều ưu điểm cho phép tách phân đoạn các protein từ dịch chiết rất hiệu quả Vì vậy, nghiên cứu đã áp dụng phương pháp kết tủa bằng ammonium sutfate để tách phân đoạn các protein có trong dịch chiết hải miên nhằm sàng lọc hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao từ hải miên

1.5.3 Một số kỹ thuật phân tích protein

Đây là công cụ truyền thống nhưng được ứng dụng rộng rãi và có nhiều vai trò quan trọng trong nghiên cứu protein Thứ nhất chúng làm cho các mẫu phức tạp trở nên đơn giản hơn bằng cách phân tách hỗn hợp mẫu thành các protein riêng lẻ hoặc các nhóm nhỏ Thứ hai, chúng cho phép phân biệt sự khác nhau về mức độ biểu hiện của protein và so sánh giữa các mẫu Có nhiều phương pháp phân tách khác nhau tùy thuộc vào mục đích và nhu cầu sử dụng

1.5.3.1 Điện di SDS-PAGE

Phân tích protein bằng phương pháp điện di SDS-PAG, phương pháp được thực

hiện theo LaemLi [48] Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không đổi Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau

Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau

sẽ di chuyển về điện cực trái dấu Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích được loại trừ

Hình 1.6 Sơ đồ điện di SDS – Page [77]

Khi protein được chạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein-SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thước phân tử Khi đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác nhau Gel thường được sử dụng với nồng độ từ 5%-15% và có thể được chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng (Hình 1.6) [48]

1.5.3.2 Điện di 2-DE (Two-dimensional electrophoresis)

Ngày nay, kỹ thuật điện di 2 chiều (two-dimensional electrophoresis, 2DE) ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một phương pháp truyền thống hay được sử dụng nhất Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải gradient

pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (5000 protein, và có thể phát hiện vệt protein với lượng <1ng) có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [48]

Hình 1.7 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2 – DE [77]

nhau Theo chiều thứ nhất: các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bởi nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric focusing) trên một thanh strip có giải gradient pH xác định (ví dụ dải pH 3-10) Chiều thứ hai: các phân

tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di PAGE) (Hình 6) Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i) chiều thứ nhất theo điện tích và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử

SDS-1.5.3.3 Kỹ thuật ESI-MS/MS (ElectroSpray Ionization )

ESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi

Cơ chế hoạt động của nguồn ESI khá đơn giản Dưới áp lực dòng liên tục, đường kính cột bé và hiệu điện thế cao (2500V), peptid sẽ được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu kim phun Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám sương mù (đám mây khí ion), dễ bay hơi, các giọt này chứa peptid và các thành phần dung môi khác Quá trình bay hơi được thực hiện bởi nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ (curtain gas) làm cho mẫu dễ bay hơi Kết quả là chỉ còn peptid tích điện và bay vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ liên tục MS/MS Hệ nanoLC-MS/MS có thể phân tách hỗn hợp protein phức tạp với hàng ngàn protein được nhận dạng [68]

1.6 IC 50 và cách xác định

1.6.1 Định nghĩa

1.6.2 Cách xác định IC 50

đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ)

chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết

Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha t ĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định

1.7.2 Phân loại

Người ta phân loại các phương pháp sắc kí dựa vào cơ chế hoạt động sắc kí: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion… và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phương pháp thể hiện sắc kí Ví dụ:

- Phương pháp sắc kí lỏng rắn trên cột, phương pháp sắc kí phân bố khí lỏng trên cột