Nghiên cứu các tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá hồi vân (oncorhynchus mykiss walbaum, 1792) giai đoạn cá giống nuôi tại lâm đồng và đề xuất biện pháp phòng trị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH THỊ THU THÙY NGHIÊN CỨU CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ HỒI VÂN Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792 GIAI ĐOẠN CÁ GIỐNG NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐINH THỊ THU THÙY

NGHIÊN CỨU CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT

TRÊN CÁ HỒI VÂN (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792)

GIAI ĐOẠN CÁ GIỐNG NUÔI TẠI LÂM ĐỒNG VÀ ĐỀ XUẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐINH THỊ THU THÙY

NGHIÊN CỨU CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT

TRÊN CÁ HỒI VÂN (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792)

GIAI ĐOẠN CÁ GIỐNG NUÔI TẠI LÂM ĐỒNG VÀ ĐỀ XUẤT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong bài luận văn này do chính bản thân tôi thực hiện dưới sự chỉ bảo tận tình, chu đáo của thầy hướng dẫn – TS Võ Thế Dũng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Viện Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa đào tạo sau Đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Xin gởi tới lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản 3 và các phòng ban liên quan lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian, trang thiết bị, cơ sở thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài để tôi có thể hoàn thành một cách tốt nhất

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự chỉ dẫn tận tình, chu đáo của thầy hướng dẫn TS Võ Thế Dũng và TS Phạm Quốc Hùng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn về phương pháp nghiên cứu và báo cáo khoa học

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu của các anh, chị phòng Công nghệ Sinh học Viện nghiên cứu NTTS 3, đặc biệt cảm ơn Ths Võ Thị Dung đã nhiệt tình hướng và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo đã truyền đạt những kiến thức chuyên môn cũng như xã hội quý báu

Cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè

đã luôn động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

đề tài tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó

Đinh Thị Thu Thùy

MỤC MỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC MỤC v

DANH MỤC KÝ HIỆU viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

1.1.Đặc điểm sinh học sinh sản của cá hồi vân 2

1.1.1.Hệ thống phân loại 2

1.1.2.Đặc điểm hình thái 2

1.1.3.Đặc điểm phân bố và sinh thái 3

1.1.4.Đặc điểm dinh dưỡng 4

1.1.5.Đặc điểm sinh trưởng 4

1.1.6.Đặc điểm sinh sản và vòng đời 5

1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh cá hồi vân trên thế giới 5

1.2.1.Bệnh do vi khuẩn gây ra 6

1.2.1.1.Bệnh nhọt (Furunculosis) 6

1.2.1.2.Bệnh nhiễm trùng máu ở cá hồi (Piscirickettsiosis) 7

1.2.1.3.Hội chứng cá hồi hương (rainbow trout fry syndrome - RTFS) 8

1.2.1.4.Bệnh Vibriosis 10

1.2.1.5.Bệnh vi khuẩn trên thận (Bacterial Kidney Disease – BKD) 10

1.2.2.Bệnh do nấm 11

1.2.3.Bệnh do ký sinh trùng 13

1.2.3.1.Bệnh đốm trắng (Ichthyophthiriasis) 13

1.2.3.2.Bệnh xoắn ở cá hồi do Myxosporea (Whirling disease -WD) 14

1.2.3.3.Bệnh do Gyrodactylus 15

1.2.3.4.Hội chứng mềm thịt ở cá hồi 16

1.3.Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá hồi vân ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2.Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp thu, vận chuyển và lưu giữ mẫu 20

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm 20

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu các tác nhân gây bệnh 21

2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng 21

2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 23

2.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm 26

2.2.4.Phương pháp mô bệnh học 28

2.2.5.Phương pháp cảm nhiễm ngược để xác định TNGB 29

2.2.6 Phương pháp thử nghiệm điều trị bệnh xuất huyết 30

2.2.6.1 Phương pháp nghiên cứu độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh 30

2.2.6.2.Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết bằng cho ăn kháng sinh 31

2.2.Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1.Mô tả dấu hiệu bệnh lý ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 33

3.2 Kết quả nghiên cứu các TNGB trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 34

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ký sinh trùng trên cá hồi vân giống 34

3.2.1.1 Thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống 34

3.2.1.2 Mức độ nhiễm ký sinh trùng trên cá hồi vân giống 37

3.2.2 Kết quả nghiên cứu vi khuẩn trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 39

3.2.2.1 Thành phần loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 39

3.2.2.2 Tần suất bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống 41

3.2.3 Kết quả nghiên cứu nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 42

3.2.3.1 Thành phần loài nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 42

3.2.3.2 Tần suất bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống 44

3.2.4 Kết quả mô bệnh học cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 45

3.3 Kết quả nghiên cứu cảm nhiễm ngược 46

3.4 Kết quả nghiên cứu phòng trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống 50

3.4.1 Kết quả thử kháng sinh đồ 50

3.4.2 Kết quả nghiên cứu trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống 54

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Đề xuất ý kiến 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC

Ký sinh trùng Rainbow trout fry syndrome (Hội chứng cá hồi hương)

Tỷ lệ cảm nhiễm Tác nhân gây bệnh Tần số bắt gặp

Vi khuẩn Whirling disease (Bệnh xoắn ở cá hồi do Myxosporea)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khả năng chịu độ mặn của cá hồi vân theo các giai đoạn phát triển 4

Bảng 2.1 Đặc điểm mẫu cá hồi vân giống được phân tích 20

Bảng 2.2 Dãy thử phản ứng sinh hóa của Test kit API – 20E 26

Bảng 3.1 Các dấu hiệu bệnh lý ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 33

Bảng 3.2 Thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống 34

Bảng 3.3 Tỷ lệ và cường độ nhiễm ký sinh trùng trên cá hồi vân giống 37

Bảng 3.4 Thành phần vi khuẩn được phân lập trên cá hồi vân giống xuất huyết 39

Bảng 3.5 Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống 41

Bảng 3.6 Thành phần loài nấm được phân lập trên cá hồi vân giống bị xuất huyết 42

Bảng 3.7 Tần số bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống 44

Bảng 3.8 Kết quả cảm nhiễm các chủng vi khuẩn lên cá hồi vân giống khoẻ 46

Bảng 3.9 Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A.hydrophila 48

Bảng 3.10 Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A salmonicida 49

Bảng 3.11 Tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với một số kháng sinh 50

Bảng 3.12 Tỷ lệ sống của cá sau 15 ngày sử dụng kháng sinh Ciprofloxacin 54

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cá hồi vân 2

Hình 1.2 Phân bố cá hồi vân trên thế giới 3

Hình 1.3 Vòng đời của cá hồi ngoài tự nhiên 5

Hình 1.4 Cá hồi Atlantic bị bệnh Furunculosis với “vết rộp” lớn trên thân 7

Hình 1.5 Cá hồi bị bệnh Piscirickettsiosi 8

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 19

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích ký sinh trùng 21

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu bệnh do vi khuẩn 24

Hình 2.4 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do nấm 27

Hình 2.5 Tiêm cảm nhiễm vi khuẩn vào cá khoẻ 30

Hình 3.1 Dấu hiệu bên ngoài của cá hồi vân giống bị xuất huyết 33

Hình 3.2 Giải phẫu cá hồi vân giống cho thấy nội tạng bị xuất huyết, cơ nhão 34

Hình 3.3 I multifiliis (hình a) và T nigra (hình b) ký sinh trên cá hồi vân giống 36

Hình 3.4 Ceratomyxa sp ký sinh trong mật cá hồi vân giống 36

Hình 3.5 Gyrodactylus teuchis ký sinh ở cá hồi vân giống 36

Hình 3.6 Areomonas hydrophila được phân lập từ cá hồi vân giống bị xuất huyết 40

Hình 3.7 Areomonas salmonicida từ cá hồi vân giống bị xuất huyết 41

Hình 3.8 Flavobacterium sp được phân lập từ cá hồi vân giống bị xuất huyết 41

Hình 3.9 Nấm Saprolegnia sp phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng 44

Hình 3.10 Nấm Achlya sp phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng 44

Hình 3.11 So sánh mô học cá hồi vân giống khoẻ mạnh và cá bị bệnh xuất huyết 46

Hình 3.12 Cá sau khi cảm nhiễm Aeromonas hydrophila và A salmonicida 50

Hình 3.13 Kết quả thử kháng sinh đồ 51

Hình 3.14 Tỷ lệ sống của cá hồi giống trong thí nghiệm trị bệnh xuất huyết 54

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) là một trong những loài cá

nước lạnh có giá trị kinh tế cao, đang được nuôi nhiều ở nước ta Gần đây, cá hồi vân tại Lâm Đồng đã xuất hiện một số bệnh như xuất huyết, lở loét, bệnh nấm,… ở cả cá thương phẩm và cá giống Vì vậy đề tài “Nghiên cứu các tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) giai đoạn cá giống nuôi tại

Lâm Đồng và đề xuất biện pháp phòng trị” là rất cần thiết tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng, trị bệnh và góp phần cho vụ nuôi thành công Mục tiêu của nghiên cứu này

là xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống và đề xuất biện pháp phòng trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống

Đối tượng nghiên cứu là các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng) trên cá hồi vân giống thu tại Trạm Nghiên cứu cá nước lạnh Tây Nguyên, Công ty TNHH Giang Ly và Công ty TNHH Thung Lũng Nắng Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 6/2014 đến hết 9/2015 tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III Trong nghiên cứu ký sinh trùng sử dụng phương pháp nghiên cứu toàn diện ký sinh trùng trên cá của Dolgiel Sử dụng một số tài liệu phân loại của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007), phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng đơn bào của Lom và Dykova (1992) Trong nghiên cứu vi khuẩn dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thủy sản của Frerichs (1993), Plumb và Bowser (1992), Bùi Quang Tề (1995)

và Đỗ Thị Hòa (2005), Võ Thế Dũng và ctv (2012) Định danh vi khuẩn bằng Test kit

API-20E và hệ thống phân loại vi khuẩn của Holt et al (1994), Frerichs và Miller

(1993) Nghiên cứu nấm theo tài liệu của Alexopoulos (1962), Bùi Quang Tề (1995, 1997), Đỗ Thị Hòa và ctv (2003, 2004), Võ Thế Dũng và ctv (2012) Phân loại nấm

bằng phương pháp của Ainsworth (1973), Frederick et al (1969), Booth (1971)

Kết quả định danh được bốn loài ký sinh trùng gồm Trichodina nigra, Ichthyophthirius multifiliis, Ceratomyxa sp và Gyrodactylus teuchis Thành phần loài

tương đối ít, tỷ lệ nhiễm cũng như cường độ nhiễm thấp Một số mẫu cá bị xuất huyết thậm chí còn không có kí sinh trùng ký sinh Điều này chứng tỏ ký sinh trùng không phải là tác nhân chính gây bệnh Kết quả nuôi cấy phân lập vi khuẩn định danh được

ba loài là Aeromonas hydrophila, A salmonicida và Flavobacterium sp Tỷ lệ bắt gặp

ở cá bệnh lần lượt là 61,90 %, 54,76 % và 2,38 % Cá khoẻ hầu như không có sự hiện

diện của vi khuẩn Đối với nấm phân lập được hai giống Saprolegnia và Achlya nhưng

tần số bắt gặp thấp (lần lượt là 7,14 % và 9,52 %) Chúng có thể là tác nhân cơ hội Trong thí nghiệm cảm nhiễm ngược, dùng hai chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp

cao là Aeromonas hydrophila và A salmonicida Mỗi chủng bố trí 3 thang nồng độ

102, 104, 106 cfu/ml bằng cách tiêm dưới da 0,1ml dịch khuẩn/con cá Đối chứng tiêm

nước muối sinh lý Nghiệm thức lặp lại 3 lần, mật độ thả 30 con cá giống/bể, tiến hành trong 7 ngày Kết quả cho thấy hai lô tiêm vi khuẩn cá có những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh xuất huyết như da sẫm màu, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi chậm chạp, xuất huyết trên thân, vây hoặc đường bên, nội tạng xuất huyết, lá lách đen thẫm, tích

dịch vàng trong xoang bụng Tỷ lệ chết tích luỹ khi tiêm A hydrophila và A salmonicida với các mức 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 8,9 %, 72,2 %, 100 % và 11,1 %, 71,1 %, 100 % Phân lập lại vi khuẩn ở cá bệnh thu được một dạng vi khuẩn

đặc thù đã đưa vào cảm nhiễm Trong khi lô đối chứng tỷ lệ sống 100 % Như vậy A

hydrophila và A salmonicida là hai tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá hồi vân giống

Lập kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy của Kirby Bauer Đường kính vòng vô khuẩn (mm) được đo và đánh giá theo tiêu chuẩn “The Clinical and Laboratory Standards Institute” của Anonymous (2002) Kết quả thử kháng sinh đồ

cho thấy hai loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A salmonicida đều nhạy cảm với

Ciprofloxacin (đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 30mm và 34mm), nhạy cảm vừa với Kanamycin (lần lượt là 22mm và 20mm), đề kháng với kháng sinh Ampicillin

và Streptomycin (lần lượt là 10mm, 11mm và 13mm, 12mm)

Trong thí nghiệm điều trị bệnh, cho cá bệnh ăn thức ăn trộn kháng sinh Ciprofloxacin ở 3 nồng độ khác nhau là 0,3 g/kg, 0,5 g/kg, 0,7 g/kg thức ăn Cho ăn liên tục 5 ngày, mỗi ngày 1 cữ kháng sinh, 2 cữ thức ăn thường Đối chứng không sử dụng kháng sinh Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mật độ thả 30 con cá giống/bể Theo dõi tình trạng sức khoẻ và tỷ lệ sống của cá, từ đó đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Sau 15 ngày thí nghiệm tỷ lệ sống cao nhất ở nghiệm thức cho cá ăn thức ăn trộn Ciprofloxacin nồng độ 0,5g/kg thức ăn (66,7 %) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê

so với nghiệm thức đối chứng (33,3 %) cũng như hai nghiệm thức 0,3g/kg thức ăn (50

%) và 0,5g/kg thức ăn (56,7 %)

Như vậy kết quả nghiên cứu cho thấy Aeromonas hydrophila và A salmonicida

là hai tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá hồi vân giống nuôi tại Lâm Đồng Sử dụng kháng sinh Ciprofloxacin với nồng độ 0,5 g/kg thức ăn, cho ăn 1 lần/ngày và liên tục 5 ngày có thể điều trị bệnh này hiệu quả Tuy nhiên phương pháp cho ăn kháng sinh chỉ

có hiệu quả khi cá chớm bệnh, còn khả năng bắt mồi Vì vậy cần tiến hành thử nghiệm các phương pháp điều trị bệnh khác như ngâm, tắm, tiêm, Và nghiên cứu vaccine phòng bệnh trên cá hồi nhằm thúc đẩy nghề nuôi phát triển ổn định và bền vững hơn

Từ khoá: Cá hồi vân, bệnh xuất huyết, kháng sinh, ký sinh trùng, vi khuẩn

MỞ ĐẦU

Cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) là một trong những loài cá nước

lạnh có giá trị kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Cá hồi vân lần đầu tiên được đưa vào Miền Bắc Việt Nam năm 2005 với mục đích đa dạng hóa đối tượng nuôi và phục vụ nhu cầu nội địa Đến nay cá hồi được nuôi thành công ở nhiều vùng nước lạnh như Lâm Đồng, Lào Cai, Lai Châu

Với những giá trị dinh dưỡng cao và giá trị kinh tế quan trọng mà cá hồi mang lại chắc chắn nghề nuôi cá hồi ở Việt Nam sẽ ngày càng phát triển mạnh Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là khi phát triển nghề nuôi thủy sản ở quy mô lớn, thường kèm theo bệnh dịch gây tổn thất không nhỏ cho nghề nuôi Gần đây, trong quá trình ương nuôi cá hồi vân tại Lâm đồng cũng bắt đầu xuất hiện một số bệnh gây chết cá rải rác như bệnh lở loét, bệnh nấm trên thân… ở cả cá thương phẩm và cá giống Vì vậy, nghiên cứu tìm hiểu

rõ tác nhân gây bệnh ở cá hồi vân, nhất là giai đoạn cá giống là rất cần thiết Việc làm này tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng, trị bệnh và góp phần cho vụ nuôi thành công Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, được sự đồng ý của Viện nuôi trồng Thủy sản

Trường Đại Học Nha Trang, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu các tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) giai đoạn cá

giống nuôi tại Lâm Đồng và đề xuất biện pháp phòng trị”

Mục tiêu của đề tài: Xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá hồi vân

giống và đề xuất biện pháp phòng trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống

Ý nghĩa khoa học của đề tài: Bổ sung thành phần các tác nhân sinh vật cảm nhiễm

trên cá hồi vân cũng như cá nước lạnh ở Việt Nam gồm: nấm, vi khuẩn và ký sinh trùng Làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng trị bệnh trên cá hồi vân

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Giúp người nuôi nhận biết được các dấu hiệu bệnh lý

của đàn cá giống khi bị cảm nhiễm các tác nhân trên Giúp người nuôi nhận biết được các dấu hiệu bệnh lý của đàn cá giống bị bệnh xuất huyết Đưa ra biện pháp phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giai đoạn cá

Do kinh nghiệm bản thân còn nhiều hạn chế, Luận văn sẽ không tránh khỏi sai sót Kính mong quý Thầy Cô chỉ dạy, các anh chị và bạn bè đồng nghiệp góp ý để chỉnh sửa Luận văn được tốt hơn

Tên tiếng Anh: Rainbow trout Tên tiếng Việt: Cá hồi vân

Đường bên liên tục, kéo dài, chạy giữa thân cá Vây lưng ở giữa thân, sau vây lưng

có một vây mỡ Xương trục và sọ cốt hoá không hoàn toàn Hàm trên dài hơn hàm dưới,

cả hai hàm đều có răng nhọn nhỏ, sắc và phân bố đều trên hai hàm

Cá hồi vân lớn nhất từng được khai thác có chiều dài 1,22 m, và nặng 16,3 kg [53]

Ở Nam Phi, cá thể có khối lượng lớn nhất được khai thác cho đến nay là 5,43 kg [108], trung bình cá chỉ nặng 1,5 kg [97]

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

Đặc điểm phân bố

Cá hồi vân là cá nước lạnh có nguồn gốc Bắc Mỹ, từ Alaska đến Mexico (Hình 1.2)

Nó là một loài cá nước ngọt đòi hỏi chất lượng môi trường sống cao, không bị ô nhiễm

Vì vậy nó thường được tìm thấy trong các dòng suối có dòng chảy mạnh và các hồ nước

mở hoặc đập [97] Tuy nhiên, một số quần thể di cư, dành phần lớn vòng đời của chúng ở biển và trở về nước ngọt chỉ để sinh sản [47]

Hình 1.2 Phân bố cá hồi vân trên thế giới Loài bản địa (màu xanh) và cá hồi nuôi

(màu đỏ) [53]

Hiện nay, cá hồi vân được nuôi thương phẩm ở hơn 64 nước trên tất cả các châu lục ngoại trừ châu Nam cực [47] Khi nuôi thương phẩm người ta thường cắt bỏ vây mỡ của chúng để phân biệt với cá tự nhiên khi lọt ra ngoài và đây cũng là một trong những biện pháp bảo vệ nguồn lợi tự nhiên

Đặc điểm sinh thái

Cá hồi vân có khoảng nhiệt chịu được từ 0 - 26°C Tuy nhiên, cá chỉ tăng trưởng và sinh sản ở nhiệt độ nước 9 - 14°C (FAO, 2012) và nhiệt độ sinh sản tối ưu là 10 - 13°C [98] Nhu cầu về hàm lượng oxy hoà tan trong nước khá cao, trung bình khoảng 300 mg/kg khối lượng cá/giờ Trong quá trình nuôi, cần phải duy trì hàm lượng oxy hoà tan cho cá hồi vân ở mức trên 7 mg/lít [51] pH thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của

cá dao động từ 6,4 - 8,4, thích hợp nhất trong khoảng 7,0 - 7,5 Tuy nhiên, cá trưởng

thành có thể chịu đựng được pH thấp dưới 5 Trong khi pH dưới 5,5 ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của phôi và cá bột pH cao cũng ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cá hồi vân do làm tăng độc tính của NH3 [44] Do cá hồi vân là loài cá di cư nên

có thể thích ứng tốt với cả môi trường nước ngọt và nước mặn Chúng thường di cư ra biển để sinh sống và tới khi thành thục, chúng di cư vào vùng nước ngọt để sinh sản Khả năng chịu đựng độ mặn của cá hồi vân tùy thuộc vào giai đoạn phát triển dao động từ 0 – 35‰ (Bảng 1.1) [24]

Bảng 1.1 Khả năng chịu độ mặn của cá hồi vân theo các giai đoạn phát triển Giai đoạn Cá bột – cá hương Cá giống 10 g Cá 20 g Cá > 200 g

1.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá hồi vân thuộc loài cá dữ, ngay từ khi mới nở, thức ăn tự nhiên của chúng thường

là các loài giáp xác nhỏ, động vật thân mềm, động vật phù du và cá Chúng có thể bắt được các loài cá cỡ nhỏ có chiều dài bằng 1/3 chiều dài cơ thể chúng Khi trưởng thành, thành phần thức ăn chủ yếu của cá hồi vân là cá con

Nhu cầu protein của cá khá cao và có sự thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển Nhu cầu protein ở cá hương là 45 - 50 %, cá giống và cá trưởng thành từ 42 - 48 % [54] Hàm lượng lipid trong thức ăn dưới 25 %, cá sẽ sử dụng được hết các thành phần axít béo không no Cá hồi là loài ăn thịt nên khả năng tiêu hoá glucid kém Thức ăn chứa hàm lượng glucid cao sẽ không được chuyển hoá thành glycogen Vì vậy, hàm lượng glucid trong thức ăn của cá hồi vân nên thấp hơn 25 % [15] Vitamin là thành phần vi lượng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng của cá hồi vân Thiếu B6 cá hồi vân bị rối loạn thần kinh Thiếu PP làm cá chậm lớn, nhạy cảm với ánh sáng, lở loét màng ruột Thiếu vitamine A cá dị hình nắp mang và xuất huyết mang Thiếu vitamin D cá sinh trưởng chậm, tăng tích lũy mỡ trong gan Vitamin C có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và

tỷ lệ sống của cá [54]

1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Tốc độ sinh trưởng của cá hồi vân ngoài tự nhiên có sự thay đổi rất lớn phụ thuộc vào nguồn thức ăn sẵn có và môi trường sống Ở những vùng suối thường nghèo dinh dưỡng, cá hồi vân chỉ đạt khối lượng 450g sau 4 năm tuổi Trong điều kiện nuôi từ cỡ

giống thả 30 g/con, cá có thể đạt khối lượng bình quân 250 – 300 g/con sau 8 tháng nuôi, 0,6 – 1,0 kg/con sau 2 năm nuôi

Kích thước thông thường đạt được của cá hồi vân có thể tới 59 cm và 2,7 kg/con Tuổi thọ trung bình của cá cũng tùy thuộc vào từng loài, ở vùng Bắc Mỹ, cá hồi vân thường sống 4 – 6 năm, cá biệt có thể tới 11 năm tổi [116]

1.1.6 Đặc điểm sinh sản và vòng đời

Cá hồi vân cái có khả năng sản xuất 2.000 trứng/kg cơ thể Vì vậy, tùy thuộc vào kích thước của cá thể, số lượng trứng có thể dao động từ 200 đến 12.000 trứng Mỗi trứng có đường kính 3-7 mm Sau khi đẻ tới lúc các trứng nở khoảng 4-7 tuần sau đó, các trứng không được bảo vệ [108]

Hình 1.3 Vòng đời của cá hồi ngoài tự nhiên [137]

Vào cuối mùa đông, đầu xuân, cá cái bắt đầu kiếm khu vực để sinh sản, những nơi

có chất đáy là đá sỏi, có nhiều oxy Cá cái đẻ trứng vào kẽ đá, cá đực phun tinh dịch vào

đó Ngoài tự nhiên, cá chỉ đẻ trứng một lần, vào mùa xuân (tháng 1 – tháng 5) Trong hệ thống nuôi nhân tạo, cá hồi vân không đẻ trứng Vì vậy, người ta phải thực hiện việc thụ tinh nhân tạo và ấp trứng trong khay có dòng nước chảy Các giai đoạn phát triển gồm: Trứng (egg) - Trứng có điểm mắt - Cá bột (alevins) - Cá hương (fry) - Cá trưởng thành (adults) [1]

Ở điều kiện 12 oC cá 2 tuổi trên 600 g đã có thể cho đẻ Hệ số thành thục đạt 20 %

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh cá hồi vân trên thế giới

Cũng như các loài cá khác, cá hồi có thể bị các bệnh do nấm, vi khuẩn, ký sinh trùng và vi rút gây ra Dịch bệnh xảy ra thường gây những tổn thất về kinh tế không nhỏ cho người nuôi Vì vậy, trên thế giới đã có không ít công trình nghiên cứu về bệnh trên cá hồi

1.2.1 Bệnh do vi khuẩn gây ra

Nuôi cá hồi vân với mật độ cao trong các trại sản xuất giống có thể dẫn đến sự bùng phát bệnh ký sinh trùng và các bệnh khác do vi khuẩn, nấm và virus nếu như thiết kế trại sản xuất giống và công tác quản lý không được duy trì tốt

Ở động vật thuỷ sản nói chung và ở cá hồi nói riêng các bệnh bao gồm bệnh do vi khuẩn, bệnh do virus, sinh vật đơn bào, bệnh nấm và bệnh do môi trường Trong số đó, bệnh do vi khuẩn là nguyên nhân gây ra các tổn thất nghiêm trọng ở các trại nuôi cá Ngày nay, hầu hết các các vi khuẩn gây bệnh phổ biến là vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên, vẫn có nhiều loại vi khuẩn Gram dương cũng là tác nhân gây bệnh

1.2.1.1 Bệnh nhọt (Furunculosis)

Bệnh do vi khuẩn thường bắt gặp trên cá hồi là bệnh Furunculosis (bệnh nhọt) Người ta cho rằng tất cả các loài cá hồi đều có thể bị bệnh Furunculosis [99]

Báo cáo đầu tiên xác nhận sự có mặt và mô tả bệnh nhọt là vào đầu năm 1894, tại

một ổ dịch của trại giống cá hồi nâu Salmo trutta ở Bavaria (Đức), với những dấu hiệu

bệnh lí đặc trưng như tổn thương và loét trên cơ thể cá bệnh Emmerich và Weibel (1894)

thực hiện việc phân lập và theo các tác giả này Aeromonas salmonicida là tác nhân chính

đã nhảy vọt lên 550, thiệt hại kinh tế ước tính hơn 100 triệu USD Tuy nhiên, người ta không thể tính toán được hết các tổn thất do bệnh này gây ra đối với cá hồi ngoài tự nhiên bởi theo thống kê của chính phủ Na Uy thì hàng năm số lượng cá hồi nuôi thất thoát do thiên tai, hoặc thiết bị lồng hư hỏng khoảng từ 0,5 – 2 triệu cá Có thể đây là một con đường lây lan bệnh ra ngoài [35]

Theo Hastings (1988), các con đường lây nhiễm thường là thông qua cá bị nhiễm và

do sự ô nhiễm nước Lý do là vì Aeromonas salmonicida có thể sống rất lâu trong nước

và chúng cũng được tìm thấy với nồng độ cao trong trầm tích dưới đáy ao [54]

Một khía cạnh quan trọng được chú ý là tỷ lệ tử vong tùy thuộc vào thông số môi trường, tuổi, mùa vụ và sức đề kháng của vật chủ Do đó, bệnh cũng có thể xảy ra ở cá con, cá bột, ở nhiệt độ thấp tới 2 °C – 4 °C [47] Inglis (1993) thông báo, ba cơ quan thường bị nhiễm trùng nhiều nhất là da, mang và ruột cá [64]

Hammel (1995) cho biết, chủng A salmonicida subsp salmonicida gây ra dạng

“nhọt điển hình” với biểu hiện nhiễm trùng máu trầm trọng, đi kèm với hiện tượng hoại

tử trên diện rộng, tỷ lệ tử vong cao cho cá hồi, tiêu biểu như ở Nova Scotia, Canada [55] Nhiễm trùng cấp tính thường xảy ra với cá giống và trưởng thành, cá có màu tối đen, xuất huyết tại gốc vây và miệng Nội tạng xuất huyết thấy rõ ở thành bụng, lá lách, gan Cá bơi lội thất thường, trở nên chậm chạp, và ngừng ăn Dạ dày cá bệnh ít có thức ăn mà đầy chất nhầy và máu [106]

Đầu năm 2005, bệnh đã giết chết 1,8 triệu cá hồi Đại Tây Dương tại một trại sản xuất giống cá hồi duy nhất trên đảo Vancouver Do đó, càng ngày càng có nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn về tác nhân gây bệnh Kirkan và ctv (2003) xác định được tính nhạy

cảm kháng sinh của A salmonicida phân lập từ cá hồi vân nuôi ở một trang trại tại Thổ

Năm 1989, bệnh nhiễm trùng máu ở cá hồi Coho (Oncorhynchus kisutch) nuôi

trong vùng ven biển Thái Bình Dương của Nam Mỹ gây thiệt hại dao động trong khoảng 30-90 % sản lượng ở cá hồi Năm 1990, Fryer và cộng sự đã tiến hành phân lập được

Piscirickettsia salmonis chủng LF-89 từ mẫu cá hồi bị bệnh nhiễm trùng máu Đến năm

1991, Garcés và cộng sự mới kết luận được P salmonis chính là tác nhân chính gây bệnh

này [49], [51]

Kể từ khi các báo cáo đầu tiên của bệnh Piscirickettsiosis vào đầu những năm 1990,

thì vi khuẩn P salmonis đã thường xuyên được phân lập trên các loài cá khác nhau ở

nước ngọt cũng như nước biển Bệnh đã gây ảnh hưởng đáng kể đến năng suất nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới [82]

Piscirickettsia salmonis là loài vi khuẩn di động Gram âm và là vi khuẩn nội bào

bắt buộc Ngoài thận và gan, não cũng được xem là mô đích tấn công của vi khuẩn này [50] Cá bị bệnh có biểu hiện lờ đờ, biếng ăn, sậm màu, thở khó khăn và bơi trên mặt nước Dấu hiệu đầu tiên là những vết thương màu trắng nhỏ và những vết loét cạn ở trên

da Biểu hiện đặc trưng nhất của tổn thương bên trong là sự hiện diện của những nốt có

vỏ bọc màu trắng ngả sang vàng, kích thước 2 cm, rải rác ở gan Hiện nay, một vaccin tiểu đơn vị tái tổ hợp đơn giá (monovalent recombinant subunit vaccine) được tạo ra có tính bảo hộ cao trên cá hồi Coho đã được thử nghiệm [82], [117]

Hình 1.5 Cá hồi bị bệnh Piscirickettsiosis [29]

1.2.1.3 Hội chứng cá hồi hương (rainbow trout fry syndrome - RTFS)

Dạng bệnh khác gặp khá phổ biến trên cá hồi là “hội chứng cá hồi hương” (rainbow

trout fry syndrome - RTFS), hay “vi khuẩn nước lạnh” (bacterial cold-water diseases – BCWD) Bệnh gây ảnh hưởng lớn đến các loài cá hồi Mặc dù bệnh xuất hiện ở vài loài

cá khác nhưng đặc biệt nhạy cảm đối với cá hồi vân Oncorhynchus mykiss và cá hồi bạc

Theo thống kê của Madsen và cộng sự (2005), BCWD có thể gây chết đến 90 % sản lượng cá hồi nuôi [80] Theo một công bố của Inger và cộng sự (2007), bệnh BCWD xảy

ra tại Đan Mạch vào năm 1998 ước tính rằng làm chết 88 triệu cá giống, thiệt hại tài chính 18 triệu Dkr (khoảng 2,5 triệu Euro), khoảng 50-60 % cá nhỏ chết, và 10 – 20 % đối với cá lớn hơn, cá thường bị loét phần đuôi và bị mù mắt [63]

Trong một báo cáo của Davis (1946) về hai trận dịch xảy ra ở cá hồi vân

(Oncorhynchus mykiss) tại trại giống quốc tế thuộc Leetown vào năm 1941 và 1945 Ông

đã mô tả các đặc điểm tổn thương ở cuống đuôi và gốc vây giống như là “bệnh thối vây” Mặc dù không thể phân lập tác nhân gây bệnh nhưng ông đã quan sát được một loài trực khuẩn dài và mỏng, tại các điểm thương tổn Năm 1948, bệnh lý tương tự cũng được

Borg ghi nhận trong quần thể cá hồi bạc Oncorhynchus kisutch thuộc vùng Tây Bắc Thái

Bình Dương

Bệnh thường xảy ra ở nhiệt độ thấp và cá có thể biểu hiện một loạt các dấu hiệu lâm sàng, bao gồm tổn thương tạo thành vết loét lớn trên cuống đuôi (khu vực đuôi) Do đó, bệnh này được gọi là “bệnh thối đuôi” hay “bệnh nhiệt độ thấp” [84]

Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp nuôi cá hồi vân ở thung lũng Hagerman của miền nam Idaho đã xảy ra nhiều dịch bệnh nghiêm trọng liên quan đến vi khuẩn này Trong khu vực này, dịch bệnh thường kết hợp với đồng nhiễm của cả hai loại

Flavobacterium psychrophilum và virus Parvovirus gây hoại tử cơ quan tạo máu

(infectious hematopoietic necrosis virus - IHNV)

Tất cả các loài cá hồi đều nhạy cảm với BCWD, nhưng cá hồi Salmon coho và cá

hồi vân phải chịu những tổn thất lớn nhất ở Tây Bắc Thái Bình Dương BCWD là một căn bệnh chủ yếu của cá con, tỷ lệ chết cao nhất ở cá bột và cá giống, mặc dù cá lớn cũng

có thể bị ảnh hưởng Cá còn sống sót sau khi bị bệnh có thể phát triển thành dị dạng cột sống [79], bơi xoắn ốc [67] Cá bị nhiễm nặng, một số lượng lớn vi khuẩn có thể được tìm thấy trong lách, gan, ruột, bóng hơi, tuyến tụy, và tim [46], [135] Một tỷ lệ nhỏ cá nhiễm bệnh sau khi hồi phục vẫn có thể biểu hiện tổn thương trên não sau, điều này giải thích cho việc một số cá bị bơi xoắn ốc sau khi mắc bệnh [67]

1.2.1.4 Bệnh Vibriosis

Bệnh Vibriosis là nhóm bệnh do Vibrio gây ra ở cá biển trong đó có cá hồi Tác

nhân gây bệnh gồm các vi khuẩn chủ yếu sau: Vibrio anguillarum, V ordalii, V salmonicida, V vulnificus

Vibriosis là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đối với cá hồi nuôi Bệnh này có mặt ở châu Mỹ, châu Âu và Viễn Đông Biểu hiện của bệnh bao gồm xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, vây bị ăn mòn Bệnh xảy ra ở nhiều mức nhiệt độ, nhưng thường diễn ra ở nhiệt độ trên 100C Bệnh lan truyền qua nước có cá nhiễm bệnh

Trong số các tác nhân thì Vibrio anguillarum được biết đến nhiều nhất, gây thiệt hại kinh tế lớn nhất Tác nhân V anguillarum lần đầu tiên được mô tả bởi Bergman vào năm

1909 khi phát hiện mẩn đỏ trên cá chình thuộc vùng biển Baltic Khi V anguillarum được phân lập trên mẫu cá hồi Oncorhynchus keta thì dịch bệnh đã tấn công gần 50 loài

cá nước ngọt và nước mặn trên khắp các nước quanh vùng đông bắc Thái Bình Dương cũng như theo dọc bờ biển Đại Tây Dương [19], [112], [133]

Theo Tanrikul (2007), Vibrio anguillarum gây tác hại đặc biệt nghiêm trọng cho cá

hồi vân ở Thổ Nhĩ Kỳ [119] Eguchi và cộng sự (2000) nhận xét vi khuẩn này không chỉ gây tử vong trên cá nuôi mà còn giết chết rất nhiều cá ngoài tự nhiên [40]

Tại Na Uy, Vibrio anguillarum được phân lập lần đầu tiên vào năm 1964 trên cá hồi

vân nuôi Kể từ đó, bệnh Vibriosis trở thành vấn đề trở ngại nghiêm trọng đối với nghề nuôi thủy sản ở đất nước này Bệnh này có thể sử dụng kháng sinh để điều trị, tuy nhiên, loại kháng sinh ít bị vi khuẩn kháng nhất được khuyến cáo sử dụng chỉ là Oxytetracycline [59]

1.2.1.5 Bệnh vi khuẩn trên thận (Bacterial Kidney Disease – BKD)

Một dạng bệnh do vi khuẩn Gram dương khó chữa trị ở cá hồi là bệnh vi khuẩn trên thận (Bacterial Kidney Disease – BKD) Tác nhân gây bệnh BKD là vi khuẩn

Renibacterium salmoninarum Đây là vi khuẩn Gram dương nhỏ, hình que Bệnh có thể

lây truyền theo trục ngang từ cá sang cá hoặc theo trục dọc từ cá lớn đến cá con của chúng thông qua trứng [85]

Theo mô tả của Bleding và Merrill (1935) cũng như Earp và cộng sự (1953), cá bị bệnh BKD thường có những tổn thương bên ngoài như lồi mắt, phồng rộp nhiều chỗ trên

da thậm chí tạo lỗ hổng trong cơ Tại các vết rộp này thường chứa chất dịch lỏng, màu

trắng hoặc hơi vàng, kèm theo xuất huyết Bên trong cơ thể, thận là nơi có biểu hiện rõ ràng nhất với các thương tổn như: sưng, mọc nhiều nốt sần màu trắng xám với các kích

cỡ khác nhau, quan sát trong lá lách, tim và gan thấy biểu hiện tương tự Ngoài ra, lá lách còn phồng to lên, gan nhợt nhạt, khoang bụng tích tụ dịch nhầy, biến đổi màu sắc, thậm chí hoại tử [23], [39]

Bệnh phát triển rất chậm, kéo dài và có tính chất âm ỉ, cá nhiễm bệnh có thể phải mất vài tháng mới có thể biểu hiện dấu hiệu bệnh lý Tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh

lý, dịch tễ học và phương pháp kiểm soát bệnh được Fryer và Sanders (1981) xem xét kỹ Bệnh xảy ra ở Bắc Mỹ, Nhật, Tây Âu và Chile Bệnh chỉ xảy ra ở những cá hồi trên một năm tuổi với các biểu hiện như mắt lồi, bụng chướng, xuất huyết gốc vây, có những hạt mủ trắng ở trên thận Những nốt mủ ngày càng lớn làm thận bị hoại tử Nhiệt độ nước, độ cứng của nước, mật độ nuôi, chế độ cho ăn và loài cá đều ảnh hưởng đến quá trình và mức độ nghiêm trọng của bệnh [33]

Tháng 11/2005 tại Seattle (Mỹ), hội thảo về bệnh BKD đã được tổ chức với sự đóng góp của các cơ quan nghiên cứu, ủy ban chuyên trách thủy sản các quốc gia trên thế giới Các nhà khoa học đều xem đây là một thách thức của nghề nuôi thủy sản ở thế kỉ 21 [87] Bởi vì đây là một trong những bệnh điều trị khó khăn nhất [134]

Việc điều trị bệnh BKD ở cá rất ít hiệu quả, điều trị kháng sinh chỉ có hiệu lực tạm thời Do đó, chìa khóa ngăn chặn được bệnh này chính là tổng hợp các phương pháp phòng bệnh, kiểm soát con đường lây truyền [42] Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Paterson và cộng sự (1981) cho thấy, gia tăng một vài khoáng chất như Fe, Cu, Mn, Co,

I, F, và bớt đi Ca trong khẩu phần ăn của cá sẽ giảm được tỷ lệ mắc bệnh BKD ở cá hồi Đại Tây Dương một tuổi Hiện nay đã có vaccin thương mại với thành phần là các tế bào

sống của vi khuẩn Arthrobacter davidanieli thể hiện sự bảo hộ kéo dài có ý nghĩa chống

lại bệnh BKD ở cá hồi

1.2.2 Bệnh do nấm

Các nghiên cứu về bệnh do nấm gây ra ở cá hồi đã sớm được thực hiện từ những

năm 40 của thế kỷ trước Những giống nấm phổ biến thường gây bệnh cho cá hồi vân bao

gồm Saprolegnia, Exophiala, Phialophora, Ichthyophonus, Derm oCystidium, Paecilomyces, Branchiomyces,…Trong số đó, Saprolegnia gây thiệt hại kinh tế đáng kể

đối với nghề nuôi cá hồi ở quy mô công nghiệp [99]

Một trong những dạng bệnh nấm chính ở cá hồi là Saprolegniasis gây ra bởi các loài

thuộc giống Saprolegnia Saprolegnia xâm nhập các mô biểu bì ở đầu hoặc vây cá và có

thể lây lan trên toàn bộ bề mặt của cơ thể Bằng mắt thường, chúng ta dễ dàng nhận thấy sợi nấm màu trắng giống như bông, tỏa tròn ra chung quanh

Saprolegnia có thể ký sinh trên cả cá và trứng [30] Khi ký sinh trên trứng chúng

sản sinh ra bào tử động, từ đó dễ dàng lây lan trên diện rộng Do đó, khi phát hiện thấy trứng nhiễm nấm, phải loại bỏ ngay Tại Na Uy, người ta quan sát thấy chúng phát triển thuận lợi vào mùa thu khi nhiệt độ nước nằm xung quanh 11-12ºC, trong mùa này lượng bào tử được sinh ra cao gấp 5 – 20 lần so với bình thường

Năm 1923 Coker là người đầu tiên mô tả nấm Saprolegnia parasitica ký sinh trên

cá giống ở một trại sản xuất giống Nhưng ông không mô tả cấu trúc bào tử Đến năm

1932 Kanouse đã mô tả các cấu trúc bào tử của S parasitica nhưng còn nghi ngờ liệu đó

có phải cũng là loài S parasitica mà Coker đã mô tả từ mười năm trước không Năm

1976 Neish quan sát thấy tất cả các chủng S parasitica được nuôi cấy có cấu trúc bào tử như loài S diclina một loài được mô tả bởi Humphrey năm 1893

Năm 2009, Mousavi và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và mô tả đặc điểm một số

loài nấm ký sinh ở cá hồi vân (O mykiss) nuôi tại Iran Kết quả cho thấy, cá bị nhiễm các loài nấm Saprolegnia parasitica, S mixta, S monilifera, Saprolegnia sp., Achlya sp., và Brevilegnia sp

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả năng chịu nhiệt của các loài thuộc giống

Saprolegnia là tương tự như của vật chủ mà chúng ký sinh Ví dụ Saprolegnia spp phân

lập từ cá hồi nước lạnh phát triển tốt hơn ở nhiệt độ thấp [98] Ngoài ra còn có các điều kiện khác làm cho trứng trong trại sản xuất giống dễ bị nhiễm trùng do nấm Ví dụ bào tử nấm có khả năng chống nhiệt, sấy khô, và thuốc khử trùng, vì vậy rất khó để loại trừ chúng ra khỏi nước nuôi trong trại sản xuất giống Thêm nữa, chất lượng nước không tốt, nước với lưu thông kém, oxy hòa tan thấp và hàm lượng amoniac cao, mật độ nuôi cao,

ức chế, và nhiệt độ giảm đều làm Saprolegnia phát triển

Langvad (1999) cho rằng bệnh do Saprolegnia rất bất thường Ở Na Uy bệnh đã xảy

ra vào mùa hè và mùa thu, khi nhiệt độ nước 11-12ºC Theo Langvad (1999), có bình thường là 50-200 bào tử /L, nhưng vào mùa xuân và mùa thu con số này tăng gấp

20 lần [45]

Từ năm 1933 người ta sử dụng Xanh malachite để trị bệnh do nấm gây ra mang lại hiệu quả cao trong diệt trừ nấm Nó đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở châu Âu và trên toàn thế giới trong nhiều Meyer and Jorgenson (1983) thử nghiệm điều trị trứng cá hồi vân bằng Xanh malachite và quan sát dị tật ở ấu trùng cao hơn 3-5 lần so với ấu trùng phát triển từ trứng không được điều trị [45]

Kitancharoen và cộng sự (1997) đưa ra cách trị nấm cho trứng hiệu quả là dùng Ô

xy già làm tăng tỷ lệ nở của trứng cá hồi

Năm 2004 Espeland và Hansen đã thử nghiệm điều trị trứng cá hồi nhiễm

Saprolegnia bằng Pyceze Các thành phần hoạt chất của Pyceze là bronopol (2 Bromo

-2- nitropropane -1 ,3- diol) Bronopol là một chất diệt khuẩn phổ rộng không có nguy hiểm độc hại nghiêm trọng đối với con người và cá Việc điều trị bệnh do nấm Saprolegnia bằng Pyceze hiện đang được coi là lựa chọn tốt nhất [45]

Cũng thuộc bộ Saprolegniales, Aphanomyces invadans là một trong những tác nhân

của hội chứng lở loét (Epizootic Ulcerative syndrome – EUS) ở nhiều loài cá nước ngọt như cá chép, rô phi, mè và cả cá hồi Mặc dầu bên trong cơ quan nội tạng không phát hiện thấy tổn thương, nhưng bên ngoài thì lở loét ở gốc vây, có khi ăn sâu đến xương, tới mức nấm có thể nhiễm cả vào gan, vảy bị rụng, cá bỏ ăn rồi chết Tỷ lệ tử vong lên tới 80

%, một con số đáng kể Tuy nhiên, EUS thường phát sinh do những thay đổi đột ngột của thời tiết và môi trường nuôi

1.2.3 Bệnh do ký sinh trùng

1.2.3.1 Bệnh đốm trắng (Ichthyophthiriasis)

Một số động vật đơn bào cũng là ký sinh trùng của cá hồi Robertson (1979) và

Urawa (1992) cho biết, cá giống của cá hồi rất mẫn cảm với Ichthyobodo necator và Ichthyophrhirius multifilis Theo FAO, khi cá hồi vân (Onchorhynchus mykiss) bị bệnh đốm trắng, thường tác nhân chính là Ichthyophthirius multifilis Cá bệnh xuất hiện từng

mảng bám trắng trên cơ thể, có thể bị hôn mê và thường tìm cách cọ xát vào thành bể để loại bỏ ký sinh trùng

Bệnh đốm trắng gây ra bởi ký sinh trùng Ichthyophthirius multifiliis ký sinh trên cả

cá nuôi lẫn cá tự nhiên, gây chết cho cả cá con lẫn cá thương phẩm Bệnh được báo cáo lần đầu tại trang trại nuôi cá ở Phần Lan vào năm 1970, và năm 1978 bệnh gây chết hơn

80.000 cá hồi giống Trong một số trường hợp, ký sinh trùng không gây tử vong, nhưng

nó vẫn làm suy giảm số lượng cá trong ở quần thể.Chúng tấn công vào da và mang [122]

Khi nghiên cứu mùa vụ của bệnh này tại ba trang trại cá hồi vân Onchorhynchus mykiss thuộc vùng đông bắc Thổ Nhĩ Kì, Ougut và ctv cho biết, Ichthyophthirius multifiliis có mặt và hoạt động khi nhiệt độ nước trên 140C, và tử vong xảy ra khi nhiệt

độ trên 180C [93] Tuy nhiên, thực tế, thời gian gần đây đã có những báo cáo về dịch bệnh đốm trắng tại vùng Bắc Mỹ và châu Âu, khi nhiệt độ nước cao hơn nhiều [123]

Dấu hiệu thường thấy khi nhiễm Ichthyophthirius multifiliis là sự hiện diện của

những đốm nhỏ màu trắng trên da hay mang Các tổn thương này trông giống như mụn nước nhỏ trên da cá Trước khi có sự xuất hiện của những đốm trắng, cá có triệu chứng bị kích ứng, yếu , ít ăn, và giảm hoạt động Nếu ký sinh trùng chỉ xuất hiện trên mang, đốm trắng ít xuất hiện nhưng cá sẽ chết với số lượng lớn, mang nhợt nhạt và sưng lên Do đó, đốm trắng không phải là dấu hiệu duy nhất để chẩn đoán bệnh [122]

Người ta đã sử dụng nhiều loại hóa chất để trị bệnh này, nhưng hiệu quả nhất vẫn là Xanh malachite và Formalin Tuy nhiên, Xanh malachite đã bị cấm [129]

1.2.3.2 Bệnh xoắn ở cá hồi do Myxosporea (Whirling disease -WD)

Bệnh xoắn ở cá hồi có tác nhân gây bệnh là Myxobolus cerebralis thuộc họ

Myxosporean gây ra Đây được cho là nguyên nhân của sự suy giảm quần thể cá hồi vân

ở một số bang của Mỹ như như Colorado và Montana Tỷ lệ chết do bệnh này ở cá hồi vân nuôi lồng rất cao 23 % (Colorado) và 50 % (Tasmania) [130]

Cá bị bệnh có dấu hiệu như bơi quay cuồng, biến dạng xương, đuôi màu đen sẫm, mắt lồi Theo thống kê của H Novick (1994) trên tạp chí “River Reporter”, 95 – 97 % cá hồi vân tự nhiên trên sông Colorado đã biến mất trong thời gian 1991 – 1993 Còn ở dòng sông Madison (Montana), mật độ cá giảm đến 90 % [126]

Thế nhưng, việc kiểm soát bệnh xoắn là một khó khăn lớn, do các bào tử có thể tồn tại trong bùn ướt, chịu lạnh ở 20°C ít nhất 3 tháng, và có thể hoạt động trở lại khi có điều

kiện môi trường thuận lợi Thực ra, Myxobolus cerebralis là loài đặc hữu ở các thủy vực Châu Âu, nơi nó phát triển như là một ký sinh tương đối lành tính trên cá hồi nâu (Salmo trutta) Sự nguy hại của nó tiềm ẩn hoàn toàn Đó chính là nguyên nhân vì sao cho đến

năm 1898, 5 năm sau khi cá hồi vân được di nhập đến Đức, bệnh xoắn mới được phát hiện [58]

Sau đó, cá hồi bị nhiễm bệnh từ nước Đức đã được chuyển tới Hoa Kỳ, Myxobolus cerebralis cũng vì thế lây nhiễm đến Bắc Mỹ Sự hiện diện của M cerebralis lần đầu tiên

được phát hiện tại Hoa Kỳ vào năm 1956 tại trại giống Springs Benner ở Pennsylvania,

và nhanh chóng có mặt ở 22 bang [20] Qua một đợt kiểm nghiệm, Allen and Bergersen (2002) cho biết 14/15 dòng sông Colorado đều dương tính với M cerebralis [18]

Như vậy, Myxobolus cerebralis trở thành một mối đe dọa lớn hơn nhiều so với nhận

định ban đầu Ngoài thiệt hại kinh tế, bệnh xoắn khiến con người lo ngại cho sức khỏe

khi ăn thịt cá hồi [18] Bởi vì vòng đời M cerebralis có giai đoạn chính từng được

Markiw và Wolf (1984) mô tả đầu tiên trong số 1350 loài kí sinh myxozoan Giai đoạn

bào tử Myxospore nhiễm vào giun ít tơ (T.tubifex), myxospores phát triển thành bào tử

hoạt động có 3 nhánh gai (bào tử triactinomyxon) Tiếp theo, bào tử này ra ngoài môi trường qua hậu môn giun ít tơ, trôi nổi trong nước cho đến khi tiếp xúc với cá Sau đó, chất bào tử (Sporoplasm) được đưa vào cơ thể cá qua da Bên trong cá, chất bào tử chia tách thành các tế bào khác nhau, di chuyển khắp cơ thể của cá Cuối cùng, các tế bào

sporoplasm đi dọc theo dây thần kinh và thông qua các mô sụn bắt đầu gây hại M cerebralis thông thường phải mất 7-9 tháng để hoàn thành vòng đời

Việc loại bỏ cá bị nhiễm bệnh, khử trùng các thiết bị dụng cụ, lót bạt ao đất và kiểm soát nguồn nước cấp sẽ giúp phòng bệnh xoắn Ngày nay, người ta đang đi theo một hướng mới hơn đó là kĩ thuật tạo ra các đàn giống hồi vân kháng bệnh Tuy nhiên, việc này chỉ có thể áp dụng với cá nuôi mà thôi [128]

sử dụng trong các dự án nuôi lớn tại Đan Mạch đều lấy từ Na Uy [31] Chúng còn lây lan sang cá hồi tự nhiên, và tàn phá một số quần thể cá hồi tự nhiên ở vùng này [110]

Gyrodactylus salaris có kích thước 0,5 – 1,0 mm, thường ký sinh trên vây và da

Phần sau cơ thể có đĩa bám gồm 2 móc lớn ở giữa, 14 – 16 móc nhỏ xung quanh Soleng

và Bakke (1997) đã thử nghiệm khả năng chịu đựng độ mặn của G salaris cho kết quả ở

7,5‰ toàn bộ ký sinh trùng bị chết sau 56 ngày Ở độ mặn cao hơn thời gian sống giảm

[109] Do đó G salaris được công nhận là ký sinh trùng nước ngọt [81]

Một vài loại hóa chất như formaldehyde, các hợp chất có chứa chlorine, iodine, nhôm sunfat hoặc nước muối có thể dùng để trị Gyrodactylus Nhưng hầu hết chúng gây độc cho cá Năm 1998, Tojo và Santamarina đã thử nghiệm diệt ký sinh trùng

Gyrodactylus trên cá hồi vân bằng 24 loại hoá dược khác nhau như Aminosidine,

Amprolium, Benznidazole, Bithionol, Chloroquine, Diethylcarbamazine, Flubendazole, Levamisole, Mebendazole, Metronodazole, Niclosamide, Nitroxynil, Oxybendazole, Parbendazole, Piperramide, Praziquantel, Ronidazole, Secnidazole, Tetramisole, Thiophanate, Toltrazuril, Trichlorfon, Triclabendazole và Nitroscanate Kết quả cho thấy chỉ có Triclabendazole và Nitroscanate có khả năng trị được ký sinh trùng này Triclabendazole có hiệu quả khi cho cá ăn với liều lượng 40 g/kg thức ăn, liên tục trong

10 ngày Nitroscanate tốt hơn với liều lượng chỉ 0,6 g/kg thức ăn và cho ăn trong 1 ngày

là trên 80 % [70]

Ký sinh trùng phổ biến thứ hai trong cá hồi nuôi là kudoa Ký sinh trùng này phá vỡ các sợi cơ cá, làm thịt cá mềm như thạch và vì thế làm giảm giá trị sản phẩm Cảm nhiễm kudoa đầu tiên được phát hiện khi giết mổ cá hồi trong các nhà máy chế biến Theo

Intrafish - một tờ báo công nghiệp, ký sinh trùng kudoa gây ảnh hưởng 20-50 % sản lượng cá hồi được sản xuất tại Columbia

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá hồi vân ở Việt Nam

Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh trên cá hồi, nhưng ở Việt Nam cho tới nay mới chỉ có một số lượng ít ỏi các công bố về bệnh trên loài cá này Tiến sĩ Võ Thế Dũng là người tiên phong trong nghiên cứu bệnh và các biện pháp phòng trị bệnh trên đối tượng nuôi mới mẻ nhưng có giá trị kinh tế cao này

Trần Thị Bạch Dương (2011) đã nghiên cứu bệnh lở loét trên cá hồi vân nuôi tại

Lâm Đồng phát hiện được 3 loài ký sinh trùng là Gyrodactylus sp., Trichodina sp., Ichthyophthilius multifiliis, 1 loài nấm bậc thấp Saprolegnia sp và 8 loài vi khuẩn thuộc

họ Enterobacteriaceae trong đó Aeromonas hydrophila là tác nhân chính gây bệnh lở loét

Sử dụng kháng sinh Erythromycin có độ nhạy tốt nhất cho hiệu quả điều trị bệnh lở loét cao nhất [7]

Võ Thế Dũng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tác nhân gây bệnh trên cá hồi là ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn Kết quả cho thấy, thành phần ký sinh trùng trên cá hồi nuôi

tại Lâm Đồng không nhiều chủ yếu gồm: Trichodina nigra, Ichthyophthilius multifiliis, Ceratomyxa sp., Chilodonella sp., Gyrodactylus sp và Neoergassilus sp Phân lập được

từ cá hồi bị lở loét trên thân và bị hư mang với các biểu hiện mang bị ăn mòn, có màu

vàng và dích lại với nhau được 4 giống nấm gồm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và Branchiomyces Phân lập vi khuẩn ở nhóm cá bị xuất huyết lở loét thu được 8 loài vi khuẩn loài vi khuẩn bao gồm Aeromonas hydrophila, Burkholderia cepacia, Edwardsiella tarda, Escgerichia vulneri, E hermanii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris và Stenophomonas maltophilia, trong đó, tần số bắt gặp của A hydrophila cao nhất và A hydrophila được xác định là tác nhân chính gây bệnh; Có 5 loài vi khuẩn phân lập đươc trên nhóm cá bị lở mang bao gồm Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp., Burkholderia cepacia, Vibrio sp trong đó, vi khuẩn F columnare được xác định là tác nhân chính gây bệnh Phân lập vi khuẩn ở nhóm cá bị mòn vây cụt đuôi được các loài vi khuẩn sau: Flavobacterium sp., Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp., B cepacia, Vibrio cholerae trong đó, Flavobacterium sp

được xác định là tác nhân chính gây bệnh [4]

Năm 2014, Võ Thế Dũng và cộng sự nghiên cứu một số ký sinh trùng gây bệnh ở cá hồi vân giai đoạn cá giống tại các trại cá Lâm Đồng cho thấy cá giống bị nhiễm 4 loài ký

sinh trùng gồm Trichodina nigra, Ichthyophthilius multifiliis, Gyrodactylus teuchis và Ceratomyxa sp Ba loài đầu là ngoại ký sinh, riêng Ceratomyxa sp ký sinh ở mật cá Kết

quả trị bệnh ký sinh trùng ngoại ký sinh cho các hồi vân giống có hiệu quả tốt nhất là dùng phương pháp ngâm cá trong nước muối với nồng độ muối 20‰ (20 kg muối/m3nước) trong 10 phút, 2 ngày thực hiện phương pháp này một lần và làm 3 lần liên tục [6]

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: các tác nhân gây bệnh trên cá hồi vân nuôi tại Lâm Đồng gồm: vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 đến hết 9/2015

Địa điểm nghiên cứu:

- Thu mẫu tại các khu vực nuôi cá hồi vân ở Lâm Đồng gồm: Trạm Nghiên cứu cá nước lạnh Tây Nguyên (thôn Klong Klanh), Công ty cổ phần Giang Ly và Công ty TNHH Thung Lũng Nắng

- Phân tích mẫu tại phòng sinh học thực nghiệm - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu, vận chuyển và lưu giữ mẫu

• Cách thu và vận chuyển mẫu

Thu mẫu: thu mẫu chọn lọc (thu những con có dấu hiệu xuất huyết, lở loét kết hợp thu mẫu khỏe để phân tích so sánh) trực tiếp từ các cơ sở ương – nuôi

Bảng 2.1 Đặc điểm mẫu cá hồi vân giống được phân tích

Cá khoẻ Cá bệnh xuất huyết

Chiều dài trung bình (mm) 115,3 ± 27,87 113,8 ± 24,51

Khối lượng trung bình (g) 18,1 ± 7,08 16,3 ± 6,68

Địa điểm thu mẫu Trạm Nghiên cứu cá nước lạnh Tây Nguyên; Công ty

TNHH Giang Ly; Công ty TNHH Thung Lũng Nắng Vận chuyển: vận chuyển sống về Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản III trong các bao nilong đựng nước sạch, có bơm ôxy, nhiệt độ nước được duy trì bằng đá lạnh ở mức 17-210C trong suốt quá trình vận chuyển

• Cách lưu giữ mẫu tại cơ sở nghiên cứu

Cá được lưu giữ trong bể composite, nhiệt độ nước được duy trì trong khoảng

19-210C trong phòng lạnh Trong quá trình lưu giữ, các bể được sục khí liên tục, cá được cho

ăn thức ăn công nghiệp, nước lưu giữ cá được bơm lọc liên tục để làm sạch

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm

Mẫu cá bệnh đem về được xử lý ngay: đo chiều dài, cân trọng lượng, quan sát bằng mắt thường các dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài như hình dạng, trạng thái, màu sắc, mùi, kiểm tra mắt, xoang miệng, mũi, hậu môn, vây, đuôi…

Nhớt ở thân, vây, các vết loét, mũi, miệng, mang, mắt được lấy bằng dao sạch đã vô trùng để kiểm tra ký sinh trùng

Sát trùng toàn bộ cơ thể cá bằng cồn 70 %, giải phẫu quan sát biểu hiện bệnh lý nội quan ở gan, thận, lách, dạ dày, bóng hơi, xoang bụng Sau đó, giải phẫu sâu vào trong phần cơ để kiểm tra xuất huyết Lấy mẫu bệnh phẩm gan, thận, vết loét giữ trong ống nghiệm vô trùng để phân lập vi khuẩn, nấm

Tất cả các dụng cụ giải phẫu, dụng cụ thu và giữ mẫu đều được tiệt trùng và sát trùng bằng cồn 70 %

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng

Sử dụng phương pháp nghiên cứu toàn diện KST trên cá của Dolgiel Mẫu cá sau khi thu được đo chiều dài (mm) và cân trọng lượng (g), sau đó kiểm tra nội và ngoại KST Những mẫu KST được cố định, làm tiêu bản, bảo quản và tiến hành phân loại

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích ký sinh trùng

• Các bước tiến hành thu mẫu ký sinh trùng

Quan sát bên ngoài cơ thể cá để phát hiện nhanh một số KST có kích thước lớn như: đỉa cá, giáp xác, Cạo nhớt da và dàn đều trên kính Đem quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10) để kiểm tra phát hiện KST

Dùng xilanh hút máu từ tim cá, dàn đều lên lam đem soi tươi hoặc làm tiêu bản nhuộm để quan sát dưới kính hiển vi

Cắt các vây, xương nắp mang và từng lá mang, bỏ vào các hộp lồng có chứa nước ngọt lọc sạch Quan sát KST dưới kính soi nổi Tách KST đưa lên lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10)

Mổ cá, quan sát cơ quan nội tạng tìm KST Tách túi mật, làm tiêu bản dịch mật rồi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi Kiểm tra KST ruột và dạ dày dưới kính soi nổi Tách KST đưa lên lam và đậy lamen, quan sát dưới kính hiển vi

Đối với gan, thận, não: đặt lên lam kính, dàn mỏng rồi quan sát dưới kính hiển vi

Chụp ảnh, vẽ, đo kích thước, đếm

Phân loại KST

Kiểm tra KST ngoại ký sinh Giải phẫu kiểm tra KST nội ký sinh

Quan sát KST dưới kính soi nổi, kính hiển

vi quang học, mô tả đặc điểm Mẫu cá nghiên cứu

• Phương pháp làm tiêu bản và phân loại các nhóm ký sinh trùng

Sán lá đơn chủ:

- Tách chúng ra khỏi ký chủ, cho vào hộp lồng chứa nước ngọt lọc sạch

- Nghiên cứu trùng sống: Đặt trùng lên lam kính, nhỏ nước cất lên sán rồi quan sát dưới kính hiển vi

- Làm tiêu bản cố định: (1) Tách sán, đưa lên lam kính, rửa sạch bằng nước cất (2) Tiến hành cố định và rút nước trong cơ thể sán bằng Glacial acetic acid lần lượt 1 giọt và 1-2 giọt (3) Gắn bằng bomcanada

- Phân loại: chủ yếu dựa vào các đặc điểm như hình dạng cơ thể, cấu tạo, kích thước của các cơ quan bám, cơ quan sinh dục

Động vật nguyên sinh:

Nghiên cứu trùng sống (tiêu bản tươi)

Cạo nhớt hoặc lấy dịch mật, dịch mắt hoặc ép gan, thận,

Xem dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X hoặc 40X

Nhuộm tiêu bản cố định: có 2 cách là nhuộm bằng Hematociline và nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO3) theo phương pháp Klein (Lom và Dykovas, 1992)

• Phương pháp nhuộm

- Nhuộm bằng Hematociline:

Làm trùng no nước: lấy mẫu lần lượt ngâm trong các thang cồn có nồng độ nhỏ dần:

700, 500, 300, 100, để khoảng 10 – 20 phút cho mỗi thang cồn

Cho mẫu vật vào dung dịch Feric sulfattamoni 2 – 4 %, thời gian ngâm trùng phụ thuộc vào từng KST

Dùng nước cất rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút

Cho vào dung dịch Hematociline khoảng 2 – 10giờđể trùng bắt màu

Rửa nước trong 30 phút – 1 giờ dưới vòi nước chảy nhẹ

Nếu quá đậm màu có thể làm nhạt bằng cách rửa qua dung dịch Feric sulfatamoni 2-4

%, thời gian khoảng 6-8 giờ Khi nào thấy nguyên sinh động vật bắt màu xanh tro hoặc màu xanh tím thì lấy trùng ra Rửa qua nước chảy nhẹ 1-2 giờ

Làm mất nước bằng cách cho qua các thang cồn có nồng độ cao dần: 10o, 30o, 50o,

79o, 90o, 100o, cồn xilen (tỷ lệ 1:1) Cuối cùng rửa qua xilen để làm trong sạch trùng

- Nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO 3 ):

Lấy lam có trùng xếp một lượt vào chậu thủy tinh (để mặt có trùng lên trên) dùng congtogut nhỏ AgNO3 2 % đều lên khắp mặt lam

Lấy mẫu ra rửa bằng nước sạch nhiều lần Tiếp tục ngâm mẫu trong nước ngập sâu 1- 1,5cm, đem phơi nắng khoảng 30- 60 phút tùy theo cường độ ánh sáng mặt trời

Rửa lại nước cất nhiều lần, dựng nghiêng cho khô

Quan sát dưới kính hiển vi, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada Balsam

Dán nhãn ghi rõ thông tin và bảo quản mẫu

- Phân loại động vật đơn bào: quan sát các tiêu bản (tươi hoặc cố định) dưới kính

hiển vi với độ phóng đại thích hợp Chụp hình, vẽ, đo, đếm các chỉ tiêu phân loại Đếm

số lượng mỗi loài trên từng thị trường hoặc trên cả lam kính

+ Phân loại Trichodina: dựa vào số lượng, hình dạng, kích thước răng, đường kính cơ

thể và vòng đồng tâm

+ Phân loại Ceratomyxa: dựa vào hình dạng và kích thước cơ thể (chiều dài, đường

kính và tỷ lệ giữa khoảng từ điểm giữa ra đến mút của cánh so với đường ngang thân); hình dạng và vị trí của cực nang

+ Phân loại Ichthyophthyrius: dựa vào hình dạng, kích thước cơ thể

- Phân loại sán lá đơn chủ: dựa vào hình dạng cơ thể; cấu tạo, hình dạng, kích thước của các cơ quan bám, cơ quan sinh dục

2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn

Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thủy sản của các tác giả sau: Frerichs (1993), Plumb & Bowser (1992), Bùi Quang Tề (1995) và Đỗ Thị Hòa (2005) Tham khảo phương pháp nghiên cứu của Võ Thế Dũng và ctv (2012)

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu bệnh do vi khuẩn

• Môi trường nuôi cấy, phân lập và hoá chất

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy TSA không có muối NaCl, NB

(Nutrient Broth); Môi trường dùng cho thử các phản ứng sinh hóa: Bộ kít API 20E; O/F

cơ bản để kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; Manitol di động khử khả năng di động

- Hóa chất: Dùng nhuộm Gram vi khuẩn gồm crystal, lugol, cồn acetol, fuchsin;

Các loại đĩa giấy kháng sinh dùng trong thử kháng sinh đồ; Nước muối sinh lý, cồn 700

• Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét) lấy từ cá bệnh, được rửa lại 2-3 lần bằng nước muối sinh lý 0,85 %, sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng và tán nhuyễn bằng đũa thủy tinh Dùng que cấy đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy lên đĩa thạch chứa môi trường TSA Cho đĩa thạch vào tủ ấm 20 – 22 0C và quan sát kết quả sau 24h, yêu cầu trên bề mặt đĩa thạch phải xuất hiện các khuẩn lạc rời nhau Dựa vào hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc làm cơ sở xác định loài nghiên cứu

- Nuôi cấy loài thuần:

Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ và chiếm ưu thế trên bề mặt các đĩa thạch phân lập để nuôi cấy thuần loài Dùng que cấy vô trùng để cấy loài thuần chuyển sang đĩa thạch khác,

Đặc điểm, hình

thái khuẩn lạc

Kết luận Định danh vi khuẩn

ứng sinh hóa

Mẫu cá

Thu mẫu bệnh phẩm (Gan, thận, lách, vết loét)

Nuôi cấy thuần Nuôi cấy phân lập

mục đích tạo số lượng lớn vi khuẩn để chuẩn bị cho việc thử các phản ứng sinh hóa làm

cơ sở cho việc định danh vi khuẩn hoặc chuyển sang lưu giữ trong trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng TSA có nút đậy tiệt trùng Không được dùng loài đã cấy chuyển quá 5 lần để hạn chế thoái hóa và giảm độc lực của loài vi khuẩn cần sử dụng

- Lưu giữ loài thuần: có 2 cách lưu giữ loài:

Môi trường lỏng: dùng Micropipet lấy khoảng 1ml dung dịch môi trường vào ống Ependord chứa môi trường NB (có chứa 20 % Glycerol) rồi dùng que cấy lấy 1 khúm nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần khuấy đều trong ống Để trong tủ ấm lắc trong khoảng 100 vòng/phút, sau 24 giờ đem lưu giữ trong tủ đông sâu -800C Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được đến 2 năm

Môi trường thạch nghiêng (TSA): dùng que cấy đầu tròn lấy 1 khúm khuẩn lạc từ đĩa thạch đã được cấy thuần ria đều trên mặt thạch nghiêng, để trong tủ ấm 24 giờ cho vi khuẩn mọc đều rồi đem lưu giữ trong tủ lạnh Bọc các ống nghiệm này trong giấy bạc và túi nhựa vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 5-70C để lưu giống định danh sau Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được trong vòng 6 tháng

- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn: theo phương pháp của Plumb &

Bowser (1983) (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992)

Nhuộm Gram theo các bước sau:

Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây

Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút

Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton để tẩy màu

Rửa nhanh nước và vẩy cho khô

Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản và để trong 1-2 phút

Rửa nước, để khô tự nhiên

Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản: Vi khuẩn có màu xanh tím: Gram dương (+); Vi khuẩn có màu đỏ hồng: Gram âm (-)

- Thử phản ứng sinh hóa để làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn:

Để định danh vi khuẩn còn phải thực hiện một chuỗi các phản ứng sinh hóa thông qua các bộ test kit: Test kit API-20E (Analitical Profile Index)

Test kit API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền đã khử nước Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên

Phân loại vi khuẩn dựa vào những đặc điểm sinh lý và kết quả thử phản ứng sinh hoá, Bảng tra kết quả API– 20E và hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey được giới thiệu bởi Holt và CS (1994), Frerichs và Millar (1993)

Bảng 2.2 Dãy thử phản ứng sinh hóa của Test kit API – 20E

1 OX: Cytocrome oxidase 12 GEL: Gelatinase

2 ONPG: Galactopyranosidase 13 GLU: Lên men/oxi hóa glucose

3 ADH: Argininedihydrolase 14 MAN: Lên men/oxi hóa manitole

4 LDC: Lysine decacboxylase 15 INO: Lên men/oxi hóa inositole

5 ODC: Ornithine decacboxylase 16 SOR: Lên men/oxi hóa Sorbitole

6 CIT: Citrate 17 RHA: Lên men/oxi hóa Rhaminose

7 H2S: H2S production 18 SAC: Lên men/oxi hóa Sucrose

9 TDA: Tryptophane deminase 20 AMY: Lên men/oxi hóa Amygdalin

10 IND: Indole production 21 ARA: Lên men/oxi hóa Arabinose

22 NO2: Sinh nitrite

11 VP Acetoin production (Voges

2.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm

Theo tài liệu của Alexopoulos (1962), Bùi Quang Tề (1995, 1997), Đỗ Thị Hòa và ctv (2003, 2004), Võ Thế Dũng và ctv (2012)

Hình 2.4 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do nấm

• Môi trường nuôi cấy nấm

- Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): 39g/1000 ml

- Môi trường nghèo dinh dưỡng APW: Sử dụng nước ao đã lọc thô bằng màng lọc, lọc lại qua giấy lọc thấm, đổ vào bình thủy tinh, pha nước cất Tỷ lệ nước ao và nước cất

là 1:2 Sau đó cho vào nồi hấp khử trùng 121 0C trong thời gian 20 phút

• Phương pháp nuôi cấy và phân loại nấm

Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra sự nhiễm nấm bằng phương pháp soi tươi dưới kính hiển vi

- Phương pháp nuôi cấy nấm thuần chủng một tế bào:

Thu mẫu bệnh phẩm Soi mẫu tươi

Nuôi cấy thuần bằng phương pháp một bào tử

Quan sát cách sinh sản bào tử

Phân loại Quan sát hình thái bào tử, túi bào tử

Nuôi cấy trên môi trường PDA 15-250C

Nuôi cấy trên môi trường nghèo dinh dưỡng/Slide culture