Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ eucheuma denticulatum

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng dụng của lectin từ rong b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu thu nhận Lectin từ rong đỏ Eucheuma

denticulatum” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu là hoàn toàn trung

thực do chính tác giả thu thập và phân tích, các nội dung trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Khánh Hòa, ngày … tháng … năm 2015

Tác giả luận văn

Ngô Đức Duy

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các cán bộ làm việc tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày … tháng… năm 2015

Tác giả luận văn

Ngô Đức Duy

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT 4

1.1 Tổng quan về rong biển 4

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 4

1.1.2 Phân loại rong biển 5

1.1.3 Giới thiệu chung về rong đỏ Eucheuma denticulatum 6

1.2 Tổng quan về lectin 13

1.2.1 Khái niệm về lectin 8

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu lectin 9

1.2.3 Phân bố của lectin trong sinh giới 10

1.2.4 Tính chất của lectin 12

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của lectin 14

1.2.6 Ứng dụng của lectin 15

1.3 Lectin nguồn gốc từ rong biển 17

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài 17

1.3.2 Cấu tạo lectin nguồn gốc từ rong biển 21

1.4 Thu nhận lectin từ rong biển 25

1.4.1 Các kỹ thuật chiết tách lectin 25

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 28

2.1.1 Nguyên vật liệu 28

2.1.2 Hóa chất 28

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 29

2.2.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 31

2.2.3 Quy trình tổng quát dự kiến chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 32

2.2.4 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 34

2.2.5 Khảo sát các tác nhân tủa và nồng độ thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ thuật của rong đỏ E denticulatum 39

2.2.6 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 41

2.2.7 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin từ rong đỏ E denticulatum bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE 43

2.2.8 Phương pháp khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin 47

2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49

3.1 Nghiên cứu các điều kiện để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 49

3.1.1 Tỷ lệ dung môi chiết 49

3.1.2 Loại dung môi chiết 51

3.1.3 Nồng độ ethanol chiết 53

3.1.4 Thời gian chiết 54

3.1.5 Nhiệt độ chiết 56

3.2 Tinh chế lectin 58

3.2.1 Khảo sát các tác nhân kết tủa để thu chế phẩm lectin kỹ thuật 58

3.2.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephadex G -75 62

3.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE 63

3.2.4 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ E denticulatum 65

3.3 Kết quả xác định đặc tính lý, hóa và sinh học của lectin từ rong đỏ E denticulatum 67

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin 67

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin 68

3.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin 70

3.3.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin 70

3.3.5 Khả năng ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin từ rong đỏ E denticulatum 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CPKT : Chế phẩm kỹ thuật

DC : Dịch chiết DCT : Dịch chiết thô HĐR : Hoạt độ riêng HĐTS : Hoạt độ tổng số NKHC : Ngưng kết hồng cầu

OD : Độ hấp thu quang học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng 16

Bảng 1.2 Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở một số loài rong thuộc chi Eucheuma và Kappaphycus 23

Bảng 2.3 Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và glycoprotein 47

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 49

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 51

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HĐTS và HĐR của lectin 53

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 56

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin 59

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết/ethanol đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin 60

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin 60

Bảng 3.10 Trọng lượng phân tử protein từ rong đỏ E denticulatum 64

Bảng 3.11 Kết quả tinh sạch các lectin từ rong đỏ E denticulatum 65

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E denticulatum 70

Bảng 3.15 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E denticulatum 71

Bảng 3.16 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết từ rong đỏ E denticulatum 73

Bảng 2.1 Giá trị OD750nm tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) A Bảng 2.2 Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn A Bảng 3.9 Kết quả đo OD280nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc lọc gel trên cột nhựa Sephadex-75 B

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E

denticulatum B

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E denticulatum C

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Rong đỏ Eucheuma denticulatum 8

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của phân tử lectin .13

Hình 1.3 Nguyên tắc của kỹ thuật tinh chế bằng sắc ký lọc gel 26

Hình 2.1 Hình ảnh hiện tượng ngưng kết hồng cầu 30

Hình 2.2 Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry 32

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tổng quát chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 33

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 35

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình khảo sát loại dung môi 36

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình khảo sát nồng độ dung môi chiết 37

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thời gian chiết 38

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình khảo sát nhiệt độ chiết 39

Hình 2.9 Sơ đồ nghiên cứu kết tủa dịch chiết bằng ethanol 40

Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu kết tủa dịch chiết bằng (NH4)2SO4 bão hòa 40

Hình 2.11 Hệ thống cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 43

Hình 2.12 Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn 46

Hình 2.13 Hệ thống chạy điện di 47

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS của lectin 49

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐR của lectin 50

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết đến HĐTS của lectin 51

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết đến HĐR của lectin 52

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HĐTS của lectin 53

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HĐR của lectin 54

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS của lectin 55

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐR của lectin 55

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến HĐTS của lectin 57 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến HĐR của lectin 57 Hình 3.11 Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS và hiệu suất thu hồi của CPKT từ

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

1 Giới thiệu

Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với glycoprotein, thuộc nhóm protein rất bền nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II

Xuất phát từ tiềm năng rất lớn của lectin từ rong biển nên tác giải đã chọn đề tài

“Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum” làm luận văn tốt

nghiệp cao học của mình

2 Mục tiêu và đối tượng của đề tài

- Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu các điều kiện thu nhận, tinh sạch và đánh

giá các đặc tính của lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum

- Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Echeuma denticulatum nuôi trồng tại vùng

biển Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa

3 Phương pháp nghiên cứu

- Xác định khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin

- Xác định protein lectin hòa tan theo phương pháp Lowry

- Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75

- Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin từ rong đỏ E

denticulatum bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE

- Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 16.0

4 Các kết quả nghiên cứu chính

4.1 Xác định điều kiện để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum

Đã xác định được điều kiện thích hợp để thu nhận lectin từ rong E

denticulatum với loại dung môi chiết là ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/8

(w/v), thời gian chiết là 4 giờ và nhiệt độ chiết là 4oC

4.2 Tinh sạch lectin

- Đã xác định được tác nhân tủa thích hợp để thu được chế phẩm lectin kỹ thuật từ

rong E denticulatum đó là dung dịch ethanol với tỷ lệ dịch chiết/ethanol là 1/4 (v/v)

5 Kết luận và khuyến nghị

5.1 Kết luận

a) Điều kiện chiết thích hợp lectin từ rong E denticulatum là: ethanol 20%, tỷ

lệ nguyên liệu/dung môi 1/8 (w/v), thời gian 4 giờ và nhiệt độ 4oC

b) Điều kiện thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ E denticulatum: thu tủa bằng

dung dịch ethanol với tỷ lệ dịch chiết/ethanol là 1/4 (v/v), nhiệt độ 0oC và thời gian 4 giờ

c) Tinh sạch lectin bằng cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 xác định được bốn

phân đoạn có hoạt độ NKHC cao là 13, 14, 15 và 16

d) Khối lượng phân tử của lectin từ rong E denticulatum khoảng 29 kDa

e) Một số tính chất đặc trưng của lectin từ rong E denticulatum như sau:

• Lectin này khá bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20oC đến 50oC

• Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH từ 3 đến 10

• Không bị mất hoạt tính khi có mặt của các ion kim loại như: Ca2+, Mg2+ và EDTA với nồng độ 50 mM

• Lectin không có khả năng ngưng kết các loại hồng cầu của ngựa, gà và người Tuy nhiên, lectin này có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của thỏ và cừu

• Lectin không có khả năng liên kết với tất cả các loại đường trong thí nghiệm mà chỉ liên kết được với 8/10 loại glycoprotein ở các nồng độ khác nhau

5.2 Khuyến nghị

a) Nghiên cứu thêm các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch lectin

b) Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm lectin sau khi tinh sạch

c) Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ E denticulatum trong

các lĩnh vực y học, nông nghiệp và một số lĩnh vực khác

Từ khóa: E denticulatum, lectin, hoạt độ ngưng kết hồng cầu

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Lectin giữ vai trò quan trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào, vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào Những đặc tính này làm cho lectin trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu

tế bào ung thư [30]

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [11] Các nghiên cứu về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so với lectin từ thực vật bậc cao Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật) và thuộc nhóm protein rất bền nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [31] Với những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, với hơn 1.000 loài rong biển đã được tìm thấy Trong đó, đã xác định được 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [22] Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin

Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011 cho thấy hơn 90% dịch chiết từ rong được khảo sát có sự hiện diện lectin Chúng có khả năng làm ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm Trong đó, dịch chiết từ rong

Eucheuma denticulatum thuộc dòng rong đỏ cho hoạt tính ngưng kết hồng cầu mạnh

nhất với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [21, 23] Đồng thời, loài rong này cũng đã

và đang được trồng phổ biến ở các vùng biển khác nhau thuộc tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên tác giả đã chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum” làm luận văn tốt nghiệp cao học của mình

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện thu nhận lectin

- Nghiên cứu điều kiện tinh sạch lectin

- Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

a Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Echeuma denticulatum nuôi trồng ở vùng

biển Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa

b Phạm vi nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tại số 2, Hùng Vương, TP Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Thời gian nghiên cứu là từ tháng 12/2013 đến tháng 12/2014

4 Đóng góp của luận văn

- Về mặt lý luận:

Luận văn sẽ đóng góp một phần vào việc hệ thống hóa cơ sở lý luận về sự thu

nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum Mặt khác, luận văn còn là tài liệu dùng

để tham khảo cho sinh viên, học viên, nhà nghiên cứu sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này ở nước ta

- Về mặt thực tiễn:

Đề tài "Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum” không

chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, nhằm khai thác một hợp chất có hoạt tính sinh học mới từ rong biển để sử dụng làm thuốc thử chẩn đoán một số vi khuẩn gây bệnh cho người, mà còn góp phần nâng cao giá trị kinh tế

5 Cấu trúc luận văn

Ngoài phần mở đầu, luận văn còn bao gồm 4 chương sau đây:

Chương 1 Cơ sở lý thuyết Chương này sẽ giới thiệu về rong biển, phân loại rong biển Trình bày khái niệm về lectin cũng như tính chất, sự phân bổ và ứng dụng của lectin Trình bày tóm tắt những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương này sẽ trình bày về vật liệu trong nghiên cứu, phương pháp và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Chương 3 Kết quả nghiên cứu Trong chương này tác giả sẽ trình bày các kết quả nghiên cứu chính được thực hiện của đề tài

Chương 4 Kết luận và khuyến nghị Chương này sẽ tóm tắt kết quả nghiên cứu chính, đưa ra những khuyến nghị liên quan đến đề tài nghiên cứu cũng như gợi mở hướng nghiên cứu tiếp theo trong tương lai

CHƯƠNG 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan về rong biển

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển Chúng mọc trên các rạn san hô, vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển khác [3]

Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là Algae, Marine plant hay Seaweed Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước Chúng có thể là đơn bào, đa bào sống thành quần thể Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt Sản lượng hàng năm của các đại dương cung cấp cho Trái đất khoảng 200 tỉ tấn rong Nhiều kết quả nghiên cứu khoa học chỉ ra rằng trên 90% carbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó có 20% do rong biển tổng hợp nên Vì vậy, rong biển đóng một vai trò khá quan trọng trong hệ sinh thái của trái đất Không những thế rong biển còn là một nguồn thực phẩm tiềm năng cho nhân loại trong tương lai

Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn,… Rong đỏ và rong nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống Đối với rong lục thì loại tảo Chlorella được xếp vào loại tảo kỳ diệu, có tốc độ sinh khối rất nhanh, đang được nghiên cứu phục vụ con người

Rong biển hấp thụ một lượng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ lục địa ra, rong

có nhiều tính chất không giống thực vật sống trên cạn Một số yếu tố sinh thái đối với động vật sống trên cạn là rất quan trọng, song đối với rong biển lại không quan trọng như độ ẩm không khí, lượng mưa Nhưng các yếu tố sinh thái biển có ảnh hưởng đến đời sống rong biển như: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, pH, muối dinh dưỡng, khí hòa tan, sóng, gió, hải lưu…

Rong biển rất giàu chất dinh dưỡng Ngoài thành phần đạm, rong biển còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng và vitamin Trong đó, nổi bật là iốt, yếu tố

vi lượng tối cần thiết cho tuyến giáp, canxi với hàm lượng cao hơn trong sữa, vitamin

A cao gấp 10 lần trong bơ, vitamin B2 gấp 7 lần trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả Ngoài ra, các hợp chất protein và polysaccharide từ rong biển còn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, y dược, nông nghiệp và công nghệ sinh học [3] Nhiều tác dụng quý của rong biển chưa được khám phá Một khi những tác dụng mới của rong biển được khám phá thì lĩnh vực áp dụng của chúng cũng sẽ được mở rộng

Theo tờ báo Telegraph dẫn một cuộc nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng các loài rong biển cũng chứa nhiều thành phần hoạt chất sinh học giúp giảm lượng cholesterol,

hạ huyết áp, tăng cường sự ngon miệng và thậm chí nó còn có khả năng loại bỏ những gốc phân tử tự do là tác nhân chính gây ung thư Trong khi đó, kết quả báo cáo được đăng tải trên chuyên san Hiệp hội Nghiên cứu Ung thư Mỹ vào tháng 3/2011 cho biết một số hợp chất từ rong biển có thể ngăn chặn sự tăng trưởng của các tế bào ung thư dẫn đến ung thư hạch bạch huyết

Ở Việt Nam, việc sử dụng rong biển tuy chưa phổ biến như các nước phát triển nhưng những tác dụng rất tốt của chúng đang dần được quan tâm nghiên cứu và sử dụng nhiều như một liệu pháp an toàn cho sức khỏe Trong những năm gần đây, nhiều tác dụng quý của một số loại rong biển thu hái từ tự nhiên cũng như nuôi trồng được

đã góp phần đáng kể vào việc gia tăng nhận thức của con người đối với rong biển như một nguồn thực phẩm quý giá từ biển Mối quan tâm của người Việt Nam đối với rong biển ngày càng gia tăng Trong tương lai không xa, rong biển sẽ chiếm một phần đáng

kể trong khẩu phần ăn của người Việt

Ở nước ta có khoảng hơn 1.000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các

tỉnh phía Nam và phía Bắc Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún (Enteromorpha) [22] Thực tế

cho thấy, Việt Nam có điều kiện rất thuận lợi để rong biển phát triển và có thể còn nhiều loài rong quý hiếm ở Việt Nam chưa được khám phá

1.1.2 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia làm 9 ngành sau đây [3]:

- Ngành rong lục (Chlorophyta)

- Ngành rong nâu (Phaeophyta)

- Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

- Ngành rong trần (Englenophyta)

- Ngành rong giáp (Pyrophyta)

- Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)

- Ngành rong kim (Chrysophyta)

- Ngành rong vàng (Xantophyta)

- Ngành rong lam (Cynophyta)

Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục, rong nâu và rong đỏ Trong

đó rong đỏ được sử dụng phổ biến nhất với khối lượng lớn để phục vụ con người Một số loài có hàm lượng cao về Agar, Carrageenan, Alginat được sử dụng để chế biến keo rong

Thành phần hóa học của rong đỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, thời gian sinh trưởng và điều kiện sống như cường độ bức xạ, thành phần hóa học của môi trường Trong đó, nước chiếm từ 77% đến 91%, hàm lượng protein của rong đỏ Việt Nam dao động trong giới hạn 5% đến 22% tính theo trọng lượng rong khô (theo Viện nghiên cứu biển Nha Trang) Thành phần chủ yếu của chất khoáng trong rong đỏ là: Canxi, Kali, Lưu huỳnh và hàng loạt các nguyên tố khác, chiếm khoảng 20% trọng lượng khô Ngoài ra, rong đỏ còn chứa các sắc tố như: diệp lục tố, sắc tố đỏ, sắc tố vàng, sắc tố xanh lam Nhìn chung, sắc tố của rong đỏ kém bền hơn sắc tố trong rong nâu [3]

1.1.3 Giới thiệu chung về rong đỏ Eucheuma denticulatum

Rong đỏ Eucheuma denticulatum (Hình 1.1) là một trong các loại rong biển

kinh tế và là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất iota carrageenan Loại rong này tồn tại trong tự nhiên ở Philippines, vùng nhiệt đới Châu Á và khu vực Tây Thái Bình Dương Tuy nhiên, loài rong này được trồng ở quy mô thương mại để chiết suất

carrageenan Những loại rong này thường được biết với tên phổ biến là Eucheuma

spinosum khi nuôi trồng và có thể tìm thấy ở nhiều màu sắc khác nhau như: màu nâu,

xanh và đỏ

Trồng rong Eucheuma bắt đầu từ Phillipines vào đầu những năm 1970 và đã

được giới thiệu đến nhiều địa phương khác với nhiều kết quả khác nhau Có nhiều

phương pháp nuôi trồng rong E denticulatum Một trong những phương pháp phổ biến

nhất đó là treo các sợi rong trên các sợi dây và cho chìm trong nước biển Sau 6 tuần phát triển, rong được thu hoạch và làm khô

Trong những năm gần đây, ngành nuôi trồng rong biển ở Việt Nam đã có những bước phát triển đáng kể Nhiều loại rong quý, có giá trị dinh dưỡng và dược học đã được nhân giống và nuôi trồng thành công ở Việt Nam Một số loại rong tương đối phổ biến ở Việt Nam như rong nâu, rong đỏ, rong lục Gần đây, chúng ta đã di giống

và nuôi trồng thành công rong nho, một trong những đối tượng rong biển tiềm năng

Rong E denticulatum cũng được chú ý trong thời gian gần đây do loại rong này có

chứa nhiều hợp chất quý và có những hoạt tính sinh học đặc biệt Mặc dù loại rong này chưa được trồng phố biến như một số loại rong khác, nhưng nó cũng được xác định là một trong những đối tượng nuôi trồng tiềm năng Những khám phá về các giá trị quý

của rong E denticulatum sẽ góp phần thúc đẩy ngành nuôi trồng loại rong này phát

triển trong thời gian tới

Khánh Hòa là một trong những tỉnh của Việt Nam có bờ biển dài và diện tích mặt biển lớn Điều kiện thiên nhiên rất thuận lợi để các loài rong biển phát triển, trong

đó có loại rong E denticulatum Mặc dù chưa có số liệu thống kê chính thức về chủng

loại và sản lượng nuôi trồng các loại rong ở Khánh Hòa trong những năm qua, tuy nhiên triển vọng của ngành nuôi trồng rong biển ở Khánh Hòa là rất lớn

Những nghiên cứu khoa học được công bố gần đây cho thấy rằng rong E

denticulatum là một trong những loại rong ăn được có giá trị dinh dưỡng cao bởi vì

chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quý như protein, lipid, carbohydrate, khoáng Bên cạnh đó, loại rong này cũng đã được chứng minh là chứa nhiều hợp chất hoạt tính quý

như polyphenol, flavoinoid….Hoạt tính sinh học của rong E denticulatum cũng đã được ghi nhận, theo kết quả nghiên cứu được công bố gần đây thì rong E

denticulatum có hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống vi sinh vật, hoạt tính chống

lại một số enzyme gây bệnh tiểu đường (antidiabetic) Đây là những tính chất rất quý

mà rong E denticulatum có được [13] Điều này cũng góp phần thúc đẩy sự quan tâm

đặc biệt của những nhà nghiên cứu về rong biển nhằm khám phá những tính chất mới,

Thông tin về phân loại rong Eucheuma denticulatum như sau:

Loài Eucheuma denticulatum

Hình 1.1 Rong đỏ Eucheuma denticulatum

1.2 Tổng quan về lectin

1.2.1 Khái niệm về lectin

Goldstein và cộng sự (1980) đã định nghĩa lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu [18] Khái niệm này cũng có những điểm tương đồng với định nghĩa của Houston và Dooley năm 1983 Theo nhóm

tác giả này thì lectin là protein tương tác đặc hiệu với đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu Tiếp theo, Peuman và Van Dame vào năm

1995 đã đưa ra một khái niệm mới về lectin Theo các tác giả này, lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, các tác giả này đã chia lectin thành 3 loại, bao gồm: merolectin, hololectin và chimerolectin [21]

Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết với đường Do đó, không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp chất liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan

(Orchidaceae) Trong khi đó, hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với

đường Nhờ vậy, nó có khả năng gây ngưng kết tế bào và gây tủa do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợp đường Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng

và thường được gọi là hemmagglutinin Nhóm cuối cùng là chimerolectin, đây là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học) Thuộc về loại này là protein

kìm hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu dầu (Ricinus communis L.) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.)

Cùng với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cách thiết thực

và có hiệu quả hơn Hiện nay, các nhà khoa học đã hiểu biết khá nhiều về bản chất của lectin Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau:

Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipid bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau [44]

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuy

nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của

các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein

Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật [25]

Có thể chia quá trình nghiên cứu lectin thành 3 giai đoạn chính:

+ Giai đoạn đầu (từ cuối thế kỷ XIX đến nữa đầu thế kỷ XX): đây là giai đoạn mang tính điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới Ngoài công trình nghiên cứu của Stillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, Hellin cũng đã tách được

một độc tố khác có nguồn gốc từ thực vật, đó là dịch chiết từ hạt của cây Abrus

precatororius, nó có khả năng làm ngưng kết tế bào hồng cầu người và được đặt tên là

abrin Trong suốt những năm sau đó, các hợp chất có tính chất đặc biệt làm ngưng kết

tế bào hồng cầu người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người

+ Giai đoạn 2 (những năm 1950 đến năm 1970): Trong hai thập kỷ này, bên cạnh các công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinh giới, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấu trúc và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách

sử dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người

- Từ năm 1970 đến nay: Giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy nhanh Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy và ở

cơ thể người [33]

1.2.3 Phân bố của lectin trong sinh giới

1.2.3.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt Allen và Brillantine năm 1969 đã tiến hành điều tra 2.663 loài thực vật Kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu

(Fabaceae) chiếm trên 600 loài Bên cạnh các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa

lectin thì một số thực vật khác như: họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [6]

Ở Việt Nam, đã có một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến Nguyễn Thị Thịnh và cộng sự năm 1983 công bố có tới 60% các

loài chứa lectin Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như: Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có

hoạt tính NKHC rất cao [2]

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của

lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp Ví dụ như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y

(Lichenes) và Rong (Algae) Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển được công bố bởi Boyd và cộng sự năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ Từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau đã được ghi nhận như: ở Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc và Việt Nam [42]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [5]

Lectin từ rong biển chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam Trong vài năm trở lại đây, lectin từ rong biển ở Việt Nam đang được quan tâm nghiên cứu trở lại Tuy nhiên, chỉ một số rất ít các nghiên cứu được thực hiện và thông tin về lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế

1.2.3.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong

giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus

polyphemus) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật

thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra Ở Việt Nam, khi khảo sát

30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang thuộc tỉnh Khánh Hòa, đã phát hiện có 10 loài chứa lectin [5]

Trong khi đó, ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều

tra cơ bản Một số loài thuộc lớp cá xương (Osteichthye), lớp lưỡng cư (Amphibia), lớp bò sát (Reptila), lớp chim (Aves) và lớp thú (Mammalia) cũng có chứa lectin Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata)

hay trứng cá vược (Perca piuviatitis) Một kết quả nghiên cứu khá thú vị là ở mô

người như: mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như: tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [8]

1.2.3.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện bởi Hirst và cộng sự năm 1942 Đặng Thị Thu và cộng sự vào năm 2009 đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết

tế bào hồng cầu gà Sau này, một số công trình khoa học của Bruoly, Stone và Bruet cũng đã công bố về sự hiện diện của lectin ở một số loài virus khác [35]

Nghiên cứu của Ofek năm 1987 cho thấy trên bề mặt của vi khuẩn E Coli có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như: galactoza và dẫn xuất amin của nó Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác [32]

1.2.4 Tính chất của lectin

1.2.4.1 Tính tan và kết tủa

Lectin có khả năng hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Khả năng hòa tan của lectin phụ thuộc vào loại dung môi, dạng tồn tại của nó, nguồn gốc của lectin cũng như khối lượng phân tử của chúng Lectin có bản chất là protein nên chúng có thể được kết tủa bởi một số tác nhân hóa học như: ethanol, acetone, một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium sunphate Khả năng kết tủa của lectin cũng phụ thuộc vào loại dung môi, nồng độ dung môi và bản chất của lectin Đây là một trong những đặc tính quan trọng của lectin, giúp quá trình thu nhận lectin từ nguyên liệu Trong công nghệ tách chiết và tinh sạch lectin, quá trình kết tủa đóng một vai trò quan trọng giúp tinh sạch sơ bộ được lectin trước khi thực hiện các quá trình tinh sạch tiếp theo

Hình 1.2 trình bày cấu trúc không gian của lectin Có thể thấy rằng lectin là tồn tại ở dạng glycoprotein được chia thành hai vùng khác biệt đó là vùng N và vùng C Trong đó có ba vị trí có thể liên kết với đường đó là ,  và  Những vị trí này đóng một vai trò quan trọng trong việc mang lại những hoạt tính quý của lectin

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của phân tử lectin

1.2.4.2 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó

Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được tách chiết

từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường đơn như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với các glycoprotein dạng N-glycan

hay O-glycan như: porcine stomach mucin, lactotransferrin, asialofetuin [28]

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức tạp Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử dụng lectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc của glycoprotein màng tế bào đó Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học [22]

1.2.4.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít, vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa Theo tác giả Allen và Billantine năm 1969, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu

[6] Lectin từ rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi đó lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu nhóm A đã xử lý

papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác của người như: O, B hay AB [34] Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon, lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi [39]

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của lectin

1.2.5.1 Ảnh hưởng của pH

Các nghiên cứu về điểm đẳng điện của lectin cho thấy tại điểm đẳng điện (pI) hoạt độ lectin là bé nhất Tại đó, lectin dễ bị kết tủa Ở giá trị pH ngoài điểm đẳng điện, lectin ở trạng thái phân ly tích điện, dễ hòa tan và có hoạt độ Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định Khi pH thuộc vùng axit và kiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển có khoảng pH thích hợp rất rộng, hầu hết pH từ 5 đến 9, đặc biệt có

một số loại rong như: Boodlea composite, Dictyosphaeria versluysii hay Valonia

fastigiata không bị giảm hoạt độ trong khoảng pH từ 3 đến 9 [22]

1.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng Ở nhiệt độ cao, protein lectin bị biến tính không thuận nghịch Hiện tượng sốc nhiệt cũng có thể làm mất hoạt độ lectin Nhiệt độ tối thích là nhiệt độ tại đó lectin thể hiện hoạt tính mạnh nhất Mỗi lectin có nhiệt độ tối thích khác nhau phụ thuộc vào bản chất và nguồn gốc của lectin Đặc tính quan quan trọng này đã dẫn

đến những yêu cầu nghiêm ngặt trong kỹ thuật tách chiết và tinh sạch lectin trong các nghiên cứu về cấu trúc cũng như nghiên cứu ứng dụng

So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ rong biển khá ổn định với mức nhiệt độ khá cao Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt

tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong Pterocladiella capillacea cho thấy hoạt độ

của nó vẫn giữ ổn định ở 60oC trong 30 phút, 50% hoạt độ chỉ bị mất đi sau 30 phút ở mức nhiệt 70oC và mất hoàn toàn hoạt tính ở 80oC sau 10 phút [41] Thí nghiệm này cũng có kết quả tương đồng với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển [15]

1.2.5.3 Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, các hồng cầu được xử lý bằng các enzyme như: trypsin, chimotrypsin, papain,… thì chúng dễ bị lectin làm ngưng kết Như khi xử lý hồng cầu nhóm máu O bằng papain thì hoạt độ

của lectin từ dòng rong xanh Ulva lactuca tăng lên 7 - 8 lần [28] Sở dĩ có hiện tượng

này là vì khi hồng cầu xử lý với enzyme thì chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó Vì vậy, lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên

Cho đến nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu đầy đủ về sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin Mặc dù theo kết quả nghiên cứu của Benevides và Fabio năm 1998 thì hoạt tính ngưng kết hồng cầu của

lectin từ 2 loài rong đỏ Enantiocladia duperreyi và Vidalia obtusiloba phụ thuộc vào

sự có mặt của các cation hóa trị II như: Ca2+ và Mn2+ [10, 15] Tuy nhiên, theo một số dẫn liệu khoa học của Hori và Keiji năm 1990; Leite và cộng sự năm 2005 cho thấy hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại [19, 28]

1.2.6 Ứng dụng của lectin

Lectin có nhiều ứng dụng khác nhau trong thực tiễn của đời sống Các ứng dụng

đó có thể được tóm tắt như sau:

1.2.6.1 Lectin trong huyết học

Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và cho đến nay ứng dụng này vẫn còn được áp dụng một cách rộng rãi Phương pháp xác định nhóm

máu bằng lectin cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao

Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng

trong nhiều năm nay Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu

B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu nhóm máu A đã xử lý

papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB [34]

1.2.6.2 Lectin trong tế bào học

Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thông qua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào

Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một

công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn là

Glu-NAc

1.2.6.3 Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc

Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột

và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết

Bảng 1.1 Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng Liên kết đặc hiệu

Gracilaria

cornea (rong đỏ)

Boophilus microplus

Làm côn trùng chậm phát triển, giảm trọng lượng trứng và lượng trứng nở thành con…

Fetuin, porcine stomach mucin

Gracilaria ornate

(rong đỏ)

Callosobruchus maculatus

Làm côn trùng chậm phát triển…

Fetuin, porcine stomach mucin

(Nguồn: Tổng hợp từ tài liệu tham khảo của tác giả)

1.2.6.4 Lectin trong y học

Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực Lectin được sử dụng như một công cụ chẩn đoán có hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển

Dịch chiết lectin từ rong Eucheuma serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi khuẩn này gây bệnh ở cá [29] Lectin từ một số loài rong nâu như: Fucus vesiculosus,

Dictyopteris membranacea và Fucus serrate có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự

phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như: Candida guilliermondi

Lectin từ một số loài rong đỏ như: Eucheuma serra và Griffithsia sp có khả

năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N-glycan ở nồng độ rất thấp Đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của màng tế bào HIV Do

đó, nó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả năng mắc bệnh

Như vậy có thể thấy rằng lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học

và miễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng

suất trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [5]

1.2.6.5 Lectin trong virus học

Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phong

phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ Chẳng hạn như: Grifftithsin (GRFT) của Mori

và cộng sự năm 2005, Oscillatoria agardhii (OAA) của Sato và cộng sự năm 2007 và

Eucheuma serra (ESA-2) do Sato và cộng sự năm 2015 thực hiện [38]

Những lectin này đã cho thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những virus khác Không giống như phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin có khả năng liên kết với glycoprotein trên bề mặt của lớp vỏ virus, qua đó

ức chế ngăn chặn virus xâm nhập vào tế bào vật chủ Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, bền với phạm vi rộng của pH, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ của virus Vì vậy, lectin từ rong biển đang

là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai

1.3 Lectin nguồn gốc từ rong biển

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài 1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khác với lectin từ thực vật bậc cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Chỉ có một số ít nghiên cứu được thực hiện bởi

Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Khánh Hòa Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu tại Viện này đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 ngành gồm: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy hầu hết các loài rong biển sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như: thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B, O của người Một

số tính chất hóa sinh như: liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [22]

Nhóm tác giả Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2009 đã nghiên cứ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi trồng đến hoạt tính đông tụ máu của lectin chiết từ rong

Kappaphycus alvarezii Kết quả chỉ ra rằng các yếu tố môi trường gồm: nhiệt độ, độ

muối, pH, chất dinh dưỡng và cường độ ánh sáng đóng một vai trò quan trọng quyết

định hàm lượng và hoạt tính của lectin từ loại rong Kappaphycus alvarezii Để nhận được một dịch chiết lectin từ rong Kappaphycus alvarezii có hàm lượng và hoạt tính

cao, các điều kiện nuôi trồng như sau: chất dinh dưỡng NH4Cl, KH2PO4 hoặc dạng KNO3 + KH2PO4, pH = 8,1 - 8,3, độ muối 33 - 34‰, nhiệt độ 28 ± 0,5oC và cường độ

ánh sáng 10.000 - 15.000 lux Với những kết quả đạt được, rong Kappaphycus

alvarezii đã quy hoạch trồng ở một số ao, đầm ở các tỉnh phía Nam Hàm lượng lectin

của ba giống rong Kappaphycus alvarezii có thể đạt giá trị cao hoặc thấp tùy thuộc vào

những giai đoạn phát triển khác nhau trong năm [21]

Trong một nghiên cứu khác được thực hiện năm 2009, Lê Đình Hùng và Kanji

Hori đã tinh sạch và bước đầu đặc trưng hóa lectin từ loại rong đỏ Kappaphycus

alvarezii bằng kỹ thuật lọc gel và sắc ký trao đổi ion Kết quả đã tách được ba loại

lectin từ phần chiết 80% ethanol, gồm: KAA-1, KAA-2 và KAA-3 với hàm lượng tương ứng là 42,2; 31,8 và 30,2 µg/g rong tươi Những lectin này có khối lượng phân

tử trung bình 28 kDa KAA-1 và KAA-2 là những protein không có phần carbohydrate

và hầu như chứa chuỗi gồm 20 axit amin và chỉ khác nhau điểm đẳng điện Hoạt tính hemagglutination của các lectin này bị ức chế mạnh bởi glycoprotein mang N-glycan cao như: porcine thyroglobulin và mannan của nấm men Hoạt tính của ba lectin tách chiết được không bị ảnh hưởng bởi EDTA, ổn định trong phạm vi pH từ 3 đến 10 và không thay đổi hoạt tính ở 50oC trong 30 phút [21]

Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu tách lecitn từ loại rong đỏ

có giá trị kinh tế là Kappaphycus striatum trồng tại Vịnh Cam Ranh, Khánh Hòa Kết

quả cho thấy lectin từ loại rong này có tính chất tương tự nhau đối với hoạt tính ngưng kết máu, đặc tính liên kết carbohydrate và có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa Hoạt tính ngưng kết máu bị ức chế mạnh bởi glycoprotein và không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của EDTA hoặc các cation hóa trị II Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng lectin tách chiết từ loại rong trên ổn định trong khoảng pH từ 3 đến 10 và không thay đổi hoạt tính ở 60oC trong 30 phút [23]

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km Từ năm 1993 - 1998 với khoảng 1.000 mẫu được dự đoán, Huỳnh Quang Năng

và cộng sự đã xác định được 639 mẫu bao gồm 151 mẫu rong xanh, 269 mẫu rong đỏ,

143 mẫu rong nâu và 76 mẫu rong lam [21] Thêm vào đó, rong đỏ thuộc chi Eucheuma

và Kappaphycus đã và đang được nuôi trồng rộng rãi ở nước ta từ năm 1993 Cho đến nay diện tích nuôi trồng và sản lượng rong Kappaphucus alvarezii, K striatumn và Eucheuma

denticulatumin ở nước ta đã không ngừng tăng lên với diện tích nuôi trồng hơn 700 hecta

và sản lượng khoảng 2.000 tấn rong khô Các rong này đóng góp không chỉ như là nguồn carrageenan mà còn là nguồn nguyên liệu để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học giá trị cho sử dụng trong hóa sinh và y sinh Trong kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt nam, Lê Đình Hùng và cộng sự đã phát hiện hoạt tính ngưng kết hồng cầu

mạnh của các dịch chiết từ rong đỏ K alvarezii, K striatum và Eucheuma denticulatum

Để góp phần cung cấp lectin, sự thay đổi theo mùa trong hàm lượng lectin của rong K

alvarezii được nuôi trồng cũng đã được khảo sát xuyên suốt năm Thêm vào đó, các lectin

từ K alvarezii cũng đã được tinh chế để đánh giá các tính chất hóa sinh và hàm lượng của chúng Các kết quả cho thấy rằng rong đỏ carrageenophyte đang được nuôi trồng ở nước

ta sẽ là nguồn nguyên liệu hứa hẹn để nghiên cứu và sản xuất lectin phục vụ cho hóa sinh

và y sinh [21]

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự [11] Những tác giả này đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu ở người Kể từ đó, có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong

rong biển Hori vào năm 1988 đã khảo sát hoạt tính NKHC của 31 loài rong biển trên hồng cầu người và động vật Kết quả cho thấy hoạt tính NKHC đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế bào rong biển Hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [20] Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ, rong nâu và rong lục Trong đó, hoạt tính NKHC từ rong

đỏ là phổ biến nhất [22, 16]

Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn, từ Nam Mỹ, Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực Hơn nữa, không chỉ dừng lại ở việc khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng

đã được chú tâm đến [17, 9] Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc cao [22] Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ

yếu là ở một số dòng rong đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B triquetrum, Solieria

filiformis, Pterocladiella capillacea Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã

được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H japonica và Vidalia obtusiloba [15, 40]

Các nghiên cứu về đặc tính của lectin từ rong biển đã cho thấy rằng lectin từ rong biển có thể là một nhóm lectin mới, bởi vì nhiều lectin đã có một số đặc điểm chung như khối lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monome, bền nhiệt và hoạt tính không phụ thuộc vào cation hóa trị II, và không có ái lực với các đường đơn nhưng có

ái lực mạnh với các glycoprotein, đặc biệt là các glycoprotein trên bề mặt tế bào hoặc trên lớp vỏ của virus [19, 21] So với lectin từ thực vật trên cạn, chỉ có một ít công bố

về hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển như hoạt tính dính kết tế bào khối u

FM3A của chuột, hoạt tính kháng vi khuẩn streptococci in vitro, hoạt tính phân bào trong cả hai lympho bào người và chuột của các lectin từ Carpopeltis flabellata,

Solieria robusta, Eucheuma amakusaensis và E cottonii [26] hoặc lectin hypnin A từ

rong đỏ Hypnea japonica đã nhận biết đặc hiệu lõi fucose (α1-6) mà nó là chất chỉ thị quan trọng để nhận biết ung thư gan và tụy, lectin GRFT từ Griffithsia sp là chất ức chế mạnh cho sự nhân đôi của virus HIV, lectin ESA-2 từ Eucheuma serra có đặc tính

nghiêm ngặt cho N-glycan dạng high-mannose và đã cho thấy hoạt tính kháng HIV mạnh và các hoạt tính sinh học khác như phân bào [37] và kháng các chất gây ung thư

[43], các lectin từ rong đỏ Bryothamnion triquetrum (BTL) và Bryothamnion

seaforthii (BSL) đã được dùng để phân biệt sự biến đổi của tế bào ung thư ruột kết

tràng của người, lectin KAA-2 từ Kappaphycus alvarezii đã cho xem hoạt tính ức chế

mạnh sự lây nhiễm của các dòng virus cúm (H1N1 và H3N2) với nồng độ nanomol, và

lectin BCA từ rong lục Boodlea coacta cũng đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng lại

virus HIV và virus cúm H1N1 với nồng độ nanomol Thêm vào đó, lectin từ các vi tảo

(microalgae) như CV-N từ Nostoc ellipsosporum, SVN từ Scytonema varium, MVL từ

Microcystis viridis, và OAA từ Oscillatoria agardhii cũng đã cho thấy hoạt tính mạnh

kháng virus HIV và các virus khác [37] Tuy nhiên, hầu hết các lectin từ vi tảo kháng virus đã được thông báo cho đến ngày hôm nay đều được nhận từ các mẫu tảo không được nuôi trồng và các vi tảo độc chứa microcystin, mà nó sẽ làm giới hạn việc sử dụng chúng Cho đến nay, chỉ có 11 trình tự acid amino đầy đủ của lectin từ rong biển

đã được công bố bao gồm 6 trình tự từ rong đỏ Bryothamnion triquetrum [12], Hypnea

japonica, H cervicornis và H Musciformis, Griffithsia sp, Eucheuma serra, và 5 trình

tự từ rong lục Enteromorpha prolifera, Ulva pertusa, Boodlea coacta, Bryopsis

plumosa và Codium barbatum [24]

Những kết quả nghiên cứu của nước ngoài về lectin nguồn gốc từ rong biển cho thấy rằng lectin từ rong biển, mà đặc biệt là rong đỏ, là nguồn nguyên liệu hữu ích để

sử dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinh trong giai đoạn sắp tới [22]

Từ những kết quả tổng quan nghiên cứu lectin từ rong biển trong và ngoài nước

có thể đi đến một số kết luận như sau:

Nghiên cứu lectin từ rong biển chưa được công bố nhiều, đặc biệt nghiên cứu

lectin từ loài Eucheuma denticulatum, một đối tượng quan trọng và đầy tiềm năng để

nuôi trồng ở quy mô công nghiệp Vì vậy, hướng nghiên cứu lectin từ loại rong này có

ý nghĩa rất thiết thực

1.3.2 Cấu tạo lectin nguồn gốc từ rong biển

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion

hóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry), khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau

Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ nhất là lectin của

Hypnea japonica, thuộc dòng rong đỏ, với khối lượng phân tử khoảng 4,2 kDa Trong khi

đó, lectin có khối lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong đỏ, Ptilota plumose, gồm

một chuỗi polypeptide khoảng với khối lượng phân tử khoảng 170 kDa [34]

Năm 1986 Rogers đã tinh chế được lectin từ rong lục Codium fragile và đã xác

định khối lượng phân tử của nó là 60 kDa Lectin này có cấu tạo gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng là 15 kDa tạo nên [34] Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến 3,9 Bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE, năm

2011 Jong Won Han và cộng sự đã xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa

là 11,5 kDa Lectin này ở dạng đơn phân [24]

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin

và kết quả cũng cho thấy khối lượng phân tử của chúng dao động trong khoảng khá rộng Tuy nhiên, so với khối lượng phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như: lectin từ

hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L.) là 108 kDa hay lectin từ động vật như: Sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus) có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối

lượng phân tử của lectin từ rong biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45 kDa Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử lectin và hoạt tính sinh học của chính

nó Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa của loài hay cá thể đó [5]

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tự axit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy rằng trình tự axit amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa Khi

nghiên cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E

serra, E amakusaensis và E cottonii đã chỉ ra rằng trình tự của 20 axit amin đầu N

của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các gốc Glx, Asx, Gly và Ser [26, 27]

Bảng 1.2 Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở

một số loài rong thuộc chi Eucheuma và Kappaphycus

(kDa)

Trình tự sắp xếp các axit amin (20 axit amin đầu N)

(Nguồn: Tổng hợp từ tài liệu tham khảo của tác giả)

Trên cơ sở của nhiều dẫn liệu khoa học về cấu trúc bậc nhất của các phân tử

lectin, Lis và Sharon năm 1986 chỉ ra rằng các loài có quan hệ họ hàng càng gần gũi

thì cấu trúc bậc nhất của phân tử lectin càng giống nhau Có thể đây là một dấu hiệu để phân loại sinh vật ở mức độ phân tử [30]

Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biển được cấu tạo từ một mạch polypeptide Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạch polypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau Ví dụ như lectin từ rong đỏ

Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là

59,6 và 15,2 kDa [15] Trong khi đó, lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo

tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15 kDa [34]

Hori và cộng sự năm 2000 đã nghiên cứu cấu trúc bậc 1 của 2 đồng phân lectin

là hypnin A-1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy chúng có cấu tạo

đơn phân chỉ do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành Trình tự axit amin của 2 lectin này chỉ khác nhau ở 3 vị trí là 19, 31 và 52 Sự khác nhau của các gốc axit amin này không ảnh hưởng đến sự giống nhau về hoạt tính ngưng kết hồng cầu cũng như khả năng liên kết với một số glycoprotein của 2 loại lectin này Mặt khác, ngoài glycoprotein, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng còn bị ức chế bởi protein phospholipase A-2 Điều này cho phép nhận định rằng lectin hypnins không chỉ chứa vị trí liên kết với carbohydrate mà còn chứa vị trí liên kết với protein Với trọng lượng phân tử chỉ xấp xỉ 9,1 kDa cùng với 2 cầu nối disulfide Đây được xem là

2 yếu tố chính làm tăng khả năng chịu nhiệt của 2 lectin này Không những vậy, khi alkyl hóa hoặc cắt đứt cầu disulfide thì hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng cũng

bị mất đi Từ đó có thể đưa ra giả định rằng trung tâm hoạt động của 2 lectin này có chứa cầu nối disulfide [15]

Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc 1 hoặc cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động Đó là trung tâm liên kết carbohydrate Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc axit amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như: tyrozine, xerine, treonine, tryptophan,… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên Các dạng lectin khác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động khác nhau Cho đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp và vẫn đang thu hút

sự quan tâm của các nhà nghiên cứu [19, 12]

Về cơ chế hoạt động của lectin từ rong biển nói riêng và sinh vật tự nhiên nói chung, các nhà khoa học đều thống nhất rằng các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào cũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một chỉnh thể thống nhất Bất kỳ một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một

số tác nhân lý hóa của môi trường [5]

1.4 Thu nhận lectin từ rong biển

1.4.1 Các kỹ thuật chiết tách lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein nên dễ tan trong nước Vì vậy, việc chiết tách lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện

dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết khác nhau như: dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%, dung dịch muối CaCl2 0,1M, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl,…

1.4.1.1 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị I, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2SO4, Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ muối bão hòa khác nhau Người ta sử dụng phương pháp kết tủa bằng muối trung tính trong các quy trình chiết tách lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách

1.4.1.2 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như: acetone, polyetylenglycol, ethanol,… làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất

dễ gây biến tính protein Vì vậy, việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp

1.4.1.3 Thẩm tích

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phân tử lớn hơn kích thước màng (kDa) Thẩm tích thường dùng để loại muối và những phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần làm sạch Trong quá trình tinh sạch lectin, thẩm tích là một trong những công đoạn quan trọng giúp loại bỏ những tạp chất không phải lectin trong dịch chiết thô để tạo điều kiện thuận lợi cho những công đoạn tinh chế tiếp theo Tuy nhiên, để thực hiện quá trình thẩm tích hiệu quả cần phải nghiên cứu xác lập được điều kiện tối ưu để thực hiện quá trình thẩm tích đạt hiệu quả

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

1.4.2.1 Sắc ký lọc gel

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử Nhựa thường được sử dụng là Sephadex với kích thước hạt khác nhau phụ thuộc vào bản chất lectin cần tinh chế Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thước phân tử khác nhau

Nguyên lý chung của kỹ tinh sạch các chất bằng sắc ký lọc gel đó là dựa vào khối lượng phân tử, kích thước của các hạt khác nhau khi đi qua cột sắc ký có chứa các hạt gel sẽ được tách ra ở những thời gian khác nhau khi đi qua cột Các chất có khối lượng phân tử và kích thước lớn thường ra khỏi cột trước, các chất có kích thước và khối lượng phân tử nhỏ hơn sẽ đi ra cột sau Dựa vào đặc điểm này để thu được các phân đoạn có chứa các chất khác nhau

Sephadex G-75 và Sephadex G-100 thường được sử dụng trong tinh chế các chất có hoạt tính sinh học, trong đó có lectin Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách

Hình 1.3 Nguyên tắc của kỹ thuật tinh chế bằng sắc ký lọc gel

1.4.2.2 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất là protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào

pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như: DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl,… được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl,… được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

1.4.2.3 Sắc ký ái lực

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel,… Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: Việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực

đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định

- Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với

cột Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Giai đoạn 3: Rửa giải lectin ra khỏi cột Cần phải dùng một dung dịch giải

hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy, gradient nồng độ,