Nghiên cứu thu nhận lectin từ cây tỏi ta (allium sativum) và khảo sát khả năng ứng dụng làm thuốc bảo vệ cho rau cải

Ảnh hưởng của nồng độ muối NH42SO4 trong quá trình kết tủa dịch chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của lectin .... Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐỖ NGỌC BẢO

NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ CÂY TỎI TA

(Allium sativum) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LÀM THUỐC BẢO VỆ CHO RAU CẢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐỖ NGỌC BẢO

NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ CÂY TỎI TA

(Allium sativum) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LÀM THUỐC BẢO VỆ CHO RAU CẢI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy

cô hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang - Trường Đại học Nha Trang Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Khánh Hòa, ngày 18 tháng 12 năm 2015

Chữ ký Học viên

Đỗ Ngọc Bảo

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng (Trưởng

phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang)

và TS Nguyễn Văn Minh - Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang,

các anh chị phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ

Nha Trang, những người đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn

thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Trường Đại học Nha Trang, Viện

nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Trường

Đại học Nha Trang, Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã dạy dỗ và

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt

tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 18 tháng 12 năm 2015

Học viên

Đỗ Ngọc Bảo

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH VẼ x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - T NG QUAN 4

1.1 T ng quan về tỏi (Allium sativum ) 4

1.1.1 Tên gọi và lịch s 4

1.1.2 Phân loại và thành phần trong tỏi 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng của cây tỏi (Allium sativum) 5

1.1.4 Một số công dụng của tỏi 6

1.1.5 Tình hình sản xuất tỏi 7

1.2 T ng quan về lectin 8

1.2.1 Lịch s nghiên cứu lectin 8

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 10

1.2.3 Cấu tạo của lectin 11

1.2.4 Một số t nh chất lý h a và sinh học của lectin 12

1.2.5 Ứng dụng của lectin 17

1.3 T ng quan về sâu 18

1.3.1 Sâu xanh (Helicoverpa armigera) 18

1.3.2 Sâu tơ (Plutella xylostella) 19

1.3.3 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 19

1.3.4 Sâu cuốn lá (Cnaphalocrosis medinalis G) 20

1.4 Cây cải (Brassica juncea L.) 20

1.5 Tình hình nghiên cứu lectin từ cây tỏi 20

1.5.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ cây tỏi trên thế giới 20

1.5.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ cây tỏi ở Việt Nam 21

1.6 Tính chất hóa sinh của lectin từ tỏi 21

1.7 Hoạt tính kháng côn trùng của lectin từ tỏi và khả năng ứng dụng 23

1.8 Phương pháp thu nhận lectin 25

1.8.1 Các kĩ thuật chiết xuất lectin 25

1.8.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 26

Chương 2 - ĐỐI TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 28

2.1 Vật liệu, h a chất và thiết bị nghiên cứu 28

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.2 Phương pháp thu mẫu và x lý mẫu 28

2.1.3 H a chất 28

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Quy trình t ng quát dự kiến để chiết lectin tỏi 30

2.2.2 Xác định điều kiện chiết lectin 32

2.2.2.1 Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi đến hoạt độ t ng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR) của dịch chiết 32

2.2.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết 34

2.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết 35

2.2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết 36

2.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NH4)2SO4 trong quá trình kết tủa dịch chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của lectin 37

2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và cation h a trị 2 đến hoạt t nh ngưng kết hồng cầu và khả năng kháng khuẩn của lectin tỏi 38

2.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 38

2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 39

2.2.4.3 Ảnh hưởng của cation h a trị 2 tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 40

2.2.5 Ảnh hưởng của chế phẩm lectin tỏi đến khả năng hoạt động của sâu xanh, sâu tơ, sâu xanh da láng, sâu cuốn lá hại rau cải 41

2.3 Phương pháp phân t ch 43

2.3.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry 43

2.3.3 Tinh sạch dịch chiết lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 43

2.3.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin tỏi 44

2.3.5 Xác định khả năng liên kết carbohydrate của lectin tỏi 45

2.4 Phương pháp x lý số liệu 46

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHI N CỨU VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt độ lectin từ củ và lá tỏi 47

3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ dung môi 47

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết 49

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 50

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 52

3.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ của muối (NH4)2SO4 đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của lectin kết tủa từ dịch chiết 53

3.1.6 Quy trình công nghệ thu nhận lectin tỏi 55

3.2 Kết quả phân t ch lectin từ tỏi thu nhận bằng quy trình đề xuất 56

3.3 Tinh sạch dịch chiết lectin từ tỏi sau khi thẩm tách bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75 57

3.4 Đặc t nh h a lý và sinh học của lectin tỏi 58

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu (NKHC) của lectin tỏi 58

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 60

3.4.3 Ảnh hưởng của cation h a trị 2 đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 61 3.4.4 Khả năng ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin tỏi 62

3.4.5 Khả năng kháng khuẩn của lectin từ tỏi 64

3.4.6 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin tỏi 65

3.5 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm lectin từ cây tỏi diệt sâu xanh (Helicoverpa armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu cuốn lá (Cnaphalocrosis medinalis G) trong phòng th nghiệm 68

3.5.1 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu xanh ở các nồng độ khác nhau 68

3.5.2 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 69

3.5.3 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu xanh da láng ở các nồng độ khác nhau 70

3.5.4 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu cuốn lá ở các nồng độ khác nhau 71

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

đƣợc x lý Trypsin (minimum agglutination concentration)

SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại khoa học 4

Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng 100 g tỏi tươi 5

Bảng 1.3 Độc tính của một số lectin từ thực vật đến côn trùng có hại 14

Bảng 2.1 Các thiết bị ch nh được s dụng trong th nghiệm 29

Bảng 2.2 Các vi khuẩn được s dụng trong th nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin tỏi 45

Bảng 2.3 Một số loại đường và glycoprotein 46

Bảng 3.1 Kết quả tinh sạch lectin từ tỏi 56

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 61

Bảng 3.3 Khả năng gây ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin tỏi 62

Bảng 3.4 Kết quả th nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh của lectin từ tỏi 64

Bảng 3.5 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất c khả năng ức chế hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ tỏi 66

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Củ, cây tỏi (Allium sativum) 6

Hình 1.2 Tác dụng của lectin đối với hệ đường ruột côn trùng 16

Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của lectin từ tỏi 22

Hình 1.4 Cấu trúc của Man9GlcNAc2Asn 22

Hình 1.5 Lectin liên kết với chuỗi carbohydrate 23

Hình 1.6 (A) Vùng hóa mô của côn trùng bình thường và (B) vùng hóa mô của côn trùng cho ăn lectin từ tỏi đã bị sưng lên 24

Hình 1.7 Màng bao chất dinh dưỡng của côn trùng trước và sau khi ăn chế phẩm lectin tỏi 24

Hình 2.1 Quy trình dự kiến thu nhận lectin tỏi 30

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết lectin tỏi 33

Hình 2.3 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết lectin tỏi 34

Hình 2.4 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết lectin tỏi 35

Hình 2.5 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch chiết lectin tỏi 36

Hình 2.6 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối (NH4)2SO4 đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của dịch lectin 37

Hình 2.7 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 39

Hình 2.8 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 39

Hình 2.9 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cation h a trị 2 tới hoạt t nh ngưng kết hồng cầu của lectin tỏi 40

Hình 2.10 Sơ đồ th nghiệm ảnh hưởng nồng độ chế phẩm lectin từ cây tỏi đến số lượng sâu còn sống 42

Hình 2.11 Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin tỏi 44 Hình 3.1A Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của

Hình 3.1B Ảnh hưởng của nồng độ PBS đến đến hoạt độ t ng số và hoạt độ riêng của

dịch chiết 47

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến hoạt độ t ng số, hoạt độ riêng của dịch chiết 49

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ t ng số, hoạt độ riêng của dịch chiết 51

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số, hoạt độ riêng của dịch chiết 52

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NH4)2SO4 đến hoạt độ t ng số, hoạt độ riêng của dịch chiết 53

Hình 3.6 Quy trình tách chiết lectin từ tỏi 55

Hình 3.7 Sự biến đ i độ hấp thu (ƛ = 280nm) và hoạt độ NKHC (HU/ml) quá trình sắc ký lọc gel Sephadex G-75 của dịch chiết tỏi sau thẩm tách 57

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin tỏi 58

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin tỏi 60

Hình 3.10 Bố tr th nghiệm đánh giá hiệu lực chế phẩm trong phòng th nghiệm 68

Hình 3.11 Tỷ lệ sâu xanh còn sống ở các nồng độ khác nhau của chế phẩm lectin 68

Hình 3.12 Tỷ lệ sâu tơ còn sống ở các nồng độ khác nhau của chế phẩm lectin 69

Hình 3.13 Tỷ lệ sâu xanh da láng còn sống ở các nồng độ khác nhau của chế phẩm lectin 70 Hình 3.14 Tỷ lệ sâu cuốn lá còn sống ở các nồng độ khác nhau của chế phẩm lectin 71

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Để làm đa dạng phương thức bảo vệ rau cải (Brassica juncea L.) và hạn chế việc

s dụng thuốc bảo vệ thực vật c nguồn gốc h a học hiện nay, đồng thời tận dụng

nguồn nguyên liệu lá tỏi (Allium sativum) bỏ đi sau thu hoạch gây ô nhiễm môi trường

nên tác giả đã nghiên cứu tách chiết, thu nhận lectin từ cây tỏi ta và khảo sát khả năng ứng dụng làm thuốc bảo vệ cho rau cải

Mục đ ch của việc nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch lectin từ cây tỏi Đồng thời bước đầu được đánh giá tác động của dịch chiết lectin từ

cây tỏi đối với sâu xanh (Helicoverpa armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh

da láng (Spodoptera exigua) và sâu cuốn lá (Cnaphalocrosis medinalis G) hại rau cải

Một số phương pháp nghiên cứu được s dụng như: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm c điển: Cố định các yếu tố thay đ i một yếu tố là phương pháp được s dụng ch nh trong nghiên cứu Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu của Hori Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75

Kết quả nghiên cứu đã xác định được các điều kiện chiết thích hợp như: Loại dung môi, nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ chiết và nồng độ của muối amoni sunfate để kết tủa dịch chiết

Dịch chiết được tinh sạch bằng chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-75, để thu được phân đoạn có hoạt t nh ngưng kết hồng cầu cao nhất Đề tài cũng đã xác định được một số đặc tính hóa lý và sinh học của lectin tỏi như: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH; ảnh hưởng của cation hóa trị 2, khả năng ngưng kết với các loại hồng cầu khác nhau và khả năng kháng khuẩn của lectin tỏi

trong diệt sâu xanh, sâu tơ, sâu xanh da láng và sâu cuốn lá trong phòng thí nghiệm

Để nâng cao hơn nữa giá trị của nghiên cứu đề nghị tiếp tục khảo sát các yếu tố khác nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình chiết lectin từ tỏi Nâng cao khả năng phân tách và độ tinh sạch của lectin tỏi bằng một số phương pháp khác Nghiên cứu điều kiện bảo quản lectin tỏi sau khi tinh sạch Phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ tỏi trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp và một số lĩnh vực khác

Từ khóa: Tách chiết lectin tỏi, hoạt độ ngưng kết hồng cầu, tinh sạch lectin

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lectin (hemagglutinin) là những glycoprotein hoặc protein c khả năng làm ngưng kết hồng cầu (NKHC), khả năng liên kết với carbohydrate và không gây đáp ứng miễn dịch Theo Sharon và Lis [69] thì lectin giữ vai trò quan trọng như là một phân t nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào vì chúng c thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào Những đặc t nh này làm cho lectin trở thành một công

cụ hữu ch cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: Nghiên cứu miễn dịch học,

h a sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nh m máu, nghiên cứu tế bào ung thư…[74], [83] Đồng thời, lectin được phân bố rộng rãi ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật Lectin được thu nhận từ các nguồn khác nhau c cấu trúc, khối lượng phân t

và đặc t nh sinh học của chúng khác nhau

Từ khi được phát hiện vào năm 1888 tới nay, lịch s nghiên cứu lectin đã trải qua nhiều giai đoạn và vẫn đang tiếp tục phát triển mạnh mẽ Theo kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy, lectin thu nhận từ thực vật bậc cao n i chung và lectin từ cây một lá mầm n i riêng c nhiều hoạt t nh sinh học t ch cực trong các lĩnh vực khác nhau như

kháng lại virus HIV, kháng lại tế bào ung thư (lectin từ họ thủy tiên Amaryllidaceae)

[74], hoạt động kháng u và gây ra sự tự hủy diệt của tế bào ung thư ở người [82], nhận diện các protein c t nh điều hòa miễn dịch [20] và n định các kháng nguyên trong cơ

thể (lectin từ tỏi Allium sativum) [21] Bên cạnh đ , lectin tỏi còn c tác dụng kháng

sâu bệnh trên một số loài thực vật thông qua phương pháp chuyển gen [9] T nh chất này của lectin tỏi đã mở ra một hướng ứng dụng mới trong lĩnh vực bảo vệ thực vật nhằm thay thế cho các loại thuốc bảo vệ thực vật c nguồn gốc h a học Qua đ , giảm thiểu tác động độc hại của các h a chất lên sức khỏe của con người và môi trường sinh thái

Tuy nhiên, tình hình nghiên cứu về lectin và những ứng dụng của n ở Việt Nam chưa nhiều Các nghiên cứu mới chỉ tập trung ở một số đối tượng như m t, đậu đỏ, đậu

cô ve, chay, tằm [1], [2], [5] hay một số nghiên cứu về lectin rong biển [7], [32], [33]

Ở Việt Nam, tỏi được trồng khá rộng rãi và phân bố khắp mọi miền đất nước, nhưng trồng nhiều và tập trung nhất tại các tỉnh ph a Bắc và Duyên hải miền Trung

Theo Hiệp hội rau hoa quả Việt Nam, hàng năm t ng sản lượng tỏi xuất khẩu của

cả nước khoảng 2.000 tấn/năm, chủ yếu từ các vùng trồng tỏi n i tiếng là Lý Sơn - Quảng Ngãi, Ninh Hải - Ninh Thuận, Vạn Ninh và Ninh Hòa - Khánh Hòa, Hải Dương, Vĩnh Phúc và Bắc Ninh

Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, theo thống kê của Chi cục bảo vệ thực vật Khánh Hòa năm 2014 diện t ch trồng tỏi tại hai huyện trọng điểm trồng tỏi của tỉnh là Vạn Ninh và Ninh Hòa khoảng 300 ha, nhưng năm 2015 diện t ch trồng tỏi đã lên đến 500 ha Với sản lượng trung bình khoảng 7 đến 12 tấn/ha, thì sản lượng tỏi đã gần 5 ngàn tấn Do

đ đây là nguồn nguyên liệu phong phú dùng để tách chiết lectin

Tiếp nối những nghiên cứu đ , để làm rõ hơn về t nh chất, cũng như tác động sinh học của lectin từ đối tượng cây một lá mầm mà cụ thể là lectin từ cây tỏi trồng ở

Khánh Hòa, việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận lectin từ cây tỏi ta (Allium

sativum) và khảo sát khả năng ứng dụng làm thuốc bảo vệ cho rau cải ” là cần thiết

Thành công của đề tài sẽ g p phần khai thác nguồn tài nguyên lectin phong phú

từ nguồn thực vật của Việt Nam n i chung và cây một lá mầm n i riêng, nhằm đưa nguồn tài nguyên này vào ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch lectin từ cây tỏi

- Bước đầu đánh giá tác động của dịch chiết lectin từ cây tỏi đối với sâu hại rau cải

 Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ trong đến quá trình thu nhận lectin từ cây tỏi

- Nghiên cứu tinh sạch lectin thu nhận từ tỏi

- Đánh giá một số yếu tố h a lý đến hoạt t nh của lectin tỏi

- Nghiên cứu đánh giá bước đầu khả năng kháng sâu trên rau cải của dịch chiết lectin từ cây tỏi

 ngh a khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cho sinh viên và nhà nghiên cứu các dữ liệu khoa học về hoạt t nh và khả năng kháng sâu của lectin chiết xuất từ cây tỏi ta Đây là cơ sở khoa học quan trọng cho việc triển khai các nghiên cứu sâu hơn về hoạt

 ngh a thực ti n của đề tài

Thành công của đề tài sẽ g p phần nâng cao giá trị cho cây tỏi ta, g p phần nâng cao thu nhập cho người trồng tỏi Thành công trong việc s dụng dịch chiết lectin từ tỏi để kháng sâu trên cây cải sẽ mở ra một hướng mới trong phòng chống sâu bệnh trong nông nghiệp, nhằm hạn chế và hướng tới loại bỏ hoàn toàn việc s dụng thuốc trừ sâu h a học trong trồng trọt từ đ g p phần bảo vệ môi trường sinh thái và bảo vệ sức khỏe cho mọi người

Chư ng 1 - T NG QUAN

1.1 T ng quan về tỏi Allium sativum )

1.1.1 Tên gọi và lịch s

Tên Việt Nam: Tỏi

Tên gọi khác: Tỏi ta, hồ (vị thuốc), đại toán (vị thuốc)

Tên tiếng Anh: Garlic, (Leek-chỉ các loại tỏi khác)

Tên khoa học: Allium sativum

Cây tỏi ta (Allium sativum) có lịch s s dụng trên 7.000 năm và đã được s

dụng cho mục đ ch ẩm thực và làm thuốc Cây tỏi c nguồn gốc ở Trung Á và sau đ phát triển sang Trung Quốc, Cận Đông, khu vực Địa Trung Hải, Trung và Nam Âu, Ai Cập và Mexico…

Theo tài liệu tiếng Phạn cho thấy tỏi được s dụng làm thuốc khoảng 5.000 năm trước và n đã được s dụng t nhất 3.000 năm trong y học Trung Quốc Người Ai Cập, Babylon, Hy Lạp và La Mã s dụng tỏi cho các mục đ ch chữa bệnh [76]

Tỏi được s dụng làm gia vị thiết yếu ở khu vực Địa Trung Hải, cũng như một gia vị không thể thiếu ở Châu Á, Châu Phi, và Châu Âu Đồng thời tỏi là đối tượng phục vụ nghiên cứu đầy tiềm năng

1.1.2 Ph n loại và thành phần trong tỏi

b Thành phần trong tỏi

Tỏi c chứa 0,1% - 0,36% các hợp chất dầu dễ bay hơi quy định cho các t nh chất

histidine, arginine, aspartic, threonine, Serine, glutamine, proline, glycine, alanine, cysteine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tryptophan và phenylalanine Tỏi cũng chứa t nhất 33 hợp chất lưu huỳnh và các khoáng chất như: Germanium, canxi, đồng, sắt, kali, magiê, selen, kẽm, vitamin A, B1, C, chất xơ và nước được trình bày ở Bảng 1.2 dưới đây

Bảng 1.2 Gi trị dinh dư ng 100 g tỏi tư i [89]

Tỏi là loài cây thân thảo căn hành

Thân: Thân thật là chồi mọc đầu tiên (tép tỏi), thân khi sinh c hình trụ tròn vươn

cao, mang phát hoa Thân thật ph a dưới mang nhiều rễ phụ, bẹ lá và chồi (tép tỏi) hình thành thân giả, phần bẹ lá và chồi b thành khối tạo nên củ (giả) Củ tỏi c nhiều tép, từng tép tỏi cũng như cả củ tỏi đều c lớp vỏ mỏng bảo vệ

H nh 1.1 Củ c y tỏi Allium sativum)

Lá: Phần dưới là bẹ ôm sát chồi bên trong (tép tỏi) Phần phiến lá bên trên cứng,

gốc c một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép tỏi, các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi

b Đặc điểm sinh trưởng

Tỏi là loài thực vật sống lâu năm, phát triển tốt trong vùng ôn đới của bắc bán cầu Phần lớn các chồi cây trong các loài thuộc chi hành đều gia tăng bằng cách tạo ra các chồi nhỏ hay mầm cây xung quanh chồi già, cũng như bằng cách phát tán hạt

1.1.4 Một số công dụng của tỏi

a Tỏi được dùng làm rau gia vị

Củ tỏi là loại rau gia vị được s dụng rộng rãi trên toàn thế giới do hương vị cay nồng của n như là một chất kh mùi tanh và k ch th ch tiêu h a

Ở Châu Âu và Trung Đông lá và cụm hoa của cây tỏi đôi khi được dùng làm rau

để ăn sống hay xào nấu, c hương vị như hành, t cay nồng so với củ

b Tỏi được dùng làm thuốc

 Theo Đông y

Củ tỏi có vị cay, tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát khuẩn, sát trùng; chữa kh hư,

móc, giun kim, phòng trị cảm cúm

Tỏi giúp phục hồi alycin, một hợp chất tự nhiên trong cơ thể có tác dụng chống ung thư, giảm cholesterol, giảm huyết áp, có khả năng giết 60 loại nấm độc, đồng thời làm phát triển 20 loại vi khuẩn c ch đối với phụ nữ mãn kinh Mỗi ngày ăn 1-2 nhánh tỏi rất tốt cho sức khỏe [88]

 Các sản phẩm hóa học từ tỏi

Tinh dầu tỏi được điều chế thành thuốc bảo vệ thực vật để xua đu i ruồi đục quả, thuốc diệt tuyến trùng, thuốc diệt ve bét trên vật nuôi và thuốc trừ sâu ở một số nước [9]

1.1.5 T nh h nh sản uất tỏi

Cây tỏi được trồng trên toàn cầu, nhưng Trung Quốc là nhà sản xuất tỏi lớn nhất thế giới với khoảng 13,5 triệu tấn củ tỏi hàng năm, chiếm hơn 80% sản lượng tỏi thế giới Các nước trồng nhiều tỏi khác là Ấn Độ (4,1%), Hàn Quốc (2%), Ai Cập và Nga (1,6%) Tại Việt Nam, tỏi được trồng tại các tỉnh phía Bắc và Duyên hải miền Trung Theo Hiệp hội rau hoa quả Việt Nam, hàng năm t ng sản lượng tỏi xuất khẩu của cả nước khoảng 2.000 tấn/năm, chủ yếu từ các vùng trồng tỏi n i tiếng là Lý Sơn - Quảng Ngãi, Ninh Hải - Ninh Thuận, Khánh Hòa, Hải Dương, Vĩnh Phúc và Bắc Ninh

Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, theo thống kê của Chi cục bảo vệ thực vật Khánh Hòa năm 2014 diện tịch trồng tỏi tại hai huyện trọng điểm trồng tỏi của tỉnh là Vạn Ninh và Ninh Hòa khoảng 300 ha, nhưng năm 2015 diện t ch trồng tỏi đã lên đến 500 ha Với sản lượng trung bình khoảng 7 tấn đến 12 tấn/ha, thì sản lượng tỏi đã gần 5 ngàn tấn

1.2 T ng quan về lectin

1.2.1 Lịch s nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã c những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein c khả năng ngưng kết hồng cầu (NKHC) Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt c chứa thành phần gây độc này nhằm s dụng cho các mục

đ ch y tế

Lần đầu tiên nguyên lý gây độc của các hạt Aprus precatorius đã được Warden

và Waddel [80] giải th ch vào năm 1884 Sau đ Dixson [25] đã tìm ra được một dịch

lỏng c độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein vào

năm 1887 Những protein như vậy được gọi là hemagglutinins hay agglutinins thực vật, vì chúng được tìm thấy ở mẫu chiết thực vật Sau đ , chất hemagglutinin được

Stillmark [73] tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là

ricin, một độc tố mà sau đ được xác định là c bản chất protein

Vào cuối thế kỷ thứ 19, c nhiều bằng chứng cho thấy sự hiện diện của protein

c khả năng gây ngưng kết hồng cầu Protein này được gọi là hemagglutinins, hoặc phytoagglutinins, chúng đã được tìm thấy trong các chất chiết xuất từ thực vật

Kể từ đ quá trình nghiên cứu lectin được chia làm 3 giai đoạn ch nh:

 Giai đoạn đầu từ cuối thế kỷ XIX đến n a đầu thế kỷ XX:

Đây là giai đoạn mang t nh điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới

Đầu tiên là công trình nghiên cứu của Stillmark [73] vào năm 1888 tại trường đại học Tartu, Hellin, ông đã tách được một độc tố có nguồn gốc từ thực vật, đ là dịch

chiết từ hạt của cây Abrus precatororius, có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu

người và được đặt tên là abrin

Cũng trong giai đoạn này Landsteiner và cộng sự [45] đã chứng minh được khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu của các dịch chiết từ các thực vật và động vật khác nhau là khác nhau

Vào năm 1926 Sumner [75] đã phân lập được một protein từ đậu jack (Canavalia

ensiformis) và đặt tên nó là concanavalin A, đây được coi là một hemagglutinin tinh

khiết lần đầu tiên được phân lập

Cũng trong khoảng thời gian này Boyd [13] tại Đại học Boston đã phát hiện ra

(Vicia cracca) đặc hiệu với nhóm máu A, nhưng không đặc hiệu với hai nhóm máu B

và O, trong khi dịch chiết hemagglutinins từ măng tây (Lotus Tetragonolobus) đặc

hiệu với nhóm máu O

Như vậy trong giai đoạn đầu khi nghiên cứu về lectin, các nhà khoa học đã c thể tinh chế được một số hemagglutinins và xác định được t nh đặc hiệu của một số hemagglutinins đối với một số nh m máu Đây là t nh chất quan trọng của hemagglutinins, giúp xác định nhanh ch ng nh m máu trong lĩnh vực y tế

 Tiếp đến, trong những năm 1950 đến năm 1970:

Trong giai đoạn này lần đầu tiên vào năm 1954, thuật ngữ “lectin” đã được Boyd

và Shapleigh [13] s dụng để chỉ nh m các chất c khả năng ngưng kết đặc hiệu nh m máu

Trong giai đoạn này Joseph [37] đã phát hiện ra agglutinin lúa mì (Triticum spp)

c khả năng ưu tiên ngưng kết các tế bào ác t nh Bên cạnh đ agglutinins đậu tương

(Glycine max) cũng c khả năng ưu tiên ngưng kết các tế bào ác t nh được Sela và

cộng sự tìm ra [66]

C thể thấy thành công lớn nhất của giai đoạn này là phát hiện khả năng ưu tiên ngưng kết các tế bào ác t nh của một số agglutinins Điều này c thể giúp mở ra hướng nghiên cứu điều trị mới một số bệnh ác t nh đối với con người

Năm 1991, Balzarini [10] tìm ra lectin của một số loài thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ lan (Orchidaceae) giúp kìm hãm sự phát triển của virus HIV Kết quả nghiên cứu c thể mở ra một hướng điều trị mới đối với căn bệnh HIV mà lúc bấy giờ chưa c phương pháp chữa trị nào hiệu quả

Năm 1995, Peuman, Van Dame [56] đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến tính chất của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân t có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” Dựa vào cấu trúc phân t và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã chia lectin thành 3 loại:

Merolectin c khối lượng phân t nhỏ và c một trung tâm liên kết đường, không

c đặc t nh ngưng kết tế bào hồng cầu và không kết tủa các hợp chất liên kết đường Hololectin chứa t nhất hai trung tâm liên kết với đường, c khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu và gây kết tủa, do tương tác với nhiều hợp chất cộng đường Đ là các lectin đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu và thường được gọi là hemagglutinins

Chimerolectin là những phân t c t nhất một vị tr liên kết với đường và c một vùng chức năng sinh học khác (c thể là chức năng xúc tác sinh học), như protein kìm

hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) c trong hạt thầu dầu (Ricinus Communis L.) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.)

Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “lectin là glycoprotein hoặc protein không c nguồn gốc miễn dịch, c khả năng liên kết thuận nghịch, phi h a trị với carbohydrate mà không làm thay đ i cấu trúc của carbohydrate được liên kết” Lectin gắn kết với những tế bào c glycoprotein hoặc glycolipit bề mặt

Sự hiện diện của hai hay nhiều vị tr gắn kết đối với mỗi phân t lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được s dụng rất rộng rãi

để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau [56] Một trong những thành công hiện nay của các nhà khoa học là việc ứng dụng lectin vào sản xuất nông nghiệp, giúp cây trồng tăng khả năng kháng lại một số rầy, sâu bệnh như các nghiên cứu của Sadeghi và cộng sự [9], Bandyopadhyay và cộng sự [11], Clement và Venkatesh [20]… Thành công của các nghiên cứu này c thể mở ra

một hướng sản xuất mới đối với ngành nông nghiệp

1.2.2 Sự ph n bố của lectin trong sinh giới

Ở thực vật c hơn 1000 loài được phát hiện là c hoạt t nh lectin, tuy nhiên mới chỉ biết rõ 4-5% lectin ở những họ thực vật c hoa Đa số các lectin được nghiên cứu

rõ nhất đều thuộc họ đậu, chiếm 60% các lectin được nhiều người biết đến Lectin được phát hiện ở hầu hết các mô thực vật, nhưng sự phân bố của chúng trong các mô thay đ i theo các họ đã được nghiên cứu Chúng c nhiều ở hạt (họ đậu, họ đại k ch, hòa thảo), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ (họ bầu b , họ đậu) và ở chồi và lá (họ xương rồng và họ lan) [10]

Lectin động vật cũng đã được nghiên cứu ở một số đối tượng và chúng được phát

không xương sống c chủ yếu ở dịch hoặc dịch tiết, như huyết thanh cá, nọc rắn, tinh dịch, huyết tương Lectin ở động vật c xương số tồn tại ở dạng tự do hoặc protein cấu trúc màng ở dịch phôi, các cơ quan và mô ở cơ thể trưởng thành [71]

Lectin vi sinh vật đã được tìm thấy chủ yếu từ vi khuẩn nhưng chúng cũng được phát hiện thấy ở virus, nấm meo, nấm mốc, trùng roi, tảo lục Trong nhiều trường hợp lectin vi sinh vật gắn vào bề mặt vi khuẩn và chỉ c một vị tr nhận diện Lectin vi sinh vật giúp chúng gắn kết các tế bào lại với nhau nhưng lectin cô lập từ vi sinh vật lại không c hoạt t nh này, vì vậy chúng được gọi là các protein giống lectin Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự c mặt của lectin ở nhiều loài của

thực vật bậc thấp như ở một số loài nấm (Fungi), địa y (Lichenes) và rong (Algae)

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng ph biến, kết quả cho thấy c tới 60% các loài c chứa lectin [6] Các nghiên cứu

đối với họ dâu tằm (Moraceae), m t và một số loài cây khác như sake chi artocarpus (Artocarpus incia) và chay (Artocarpus tonkinensis) đều chứa lectin c hoạt t nh

ngưng kết hồng cầu rất cao [3]

1.2.3 Cấu tạo của lectin

 Khối lư ng ph n t của lectin

Đã c nhiều công bố về khối lượng phân t của lectin, dải khối lượng của chúng

từ vài kDa (lectin của rễ cây gai (Uricaceae): 8,5 kDa) đến vài trăm kDa (lectin của sam biển Châu Á (Tachypleus tridentatus): 700 kDa) Các nhà khoa học chưa tìm thấy

được mối liên hệ nào giữa khối lượng phân t lectin và hoạt t nh của ch nh n [38]

 Cấu tạo ph n t của lectin

Khi nghiên cứu trình tự acid amin trong phân t lectin, các nhà khoa học đã nhận thấy: Trình tự acid amin trong phân t lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến

h a Trên cơ sở của nhiều dẫn liệu khoa học về cấu trúc bậc nhất của các phân t lectin, Sharon và Lis [69] cho rằng: Các loài càng c quan hệ họ hàng càng gần gũi thì cấu trúc bậc nhất của phân t lectin càng giống nhau nhiều hơn C thể đây là một dấu hiệu để phân loại sinh vật ở mức độ phân t

Bất kỳ một dạng lectin nào dù c cấu trúc bậc I hay cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động, đ là trung tâm liên kết carbohydrate Ch nh trung tâm này quyết định hoạt t nh của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng

là các gốc acid amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động

của chúng là do một số gốc acid amin như tyrosin, serin, threonin, tryptophan… c khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên [15], [22]

Cơ chế hoạt động của lectin: “Các trung tâm hoạt động của các phân t lectin đều

c khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt

tế bào Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết d nh các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các thụ thể trên bề mặt tế bào cũng khác nhau Trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi n nằm trong một cấu trúc hoàn chỉnh của phân t Bất kỳ một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân t lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của

trung tâm này [38]

1.2.4 Một số tính chất l hóa và sinh học của lectin

 Khả năng ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin c khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nh m máu là rất t vì chúng đồng thời c thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: Thỏ, cừu, dê, gà, trâu hay ngựa… Theo Allen và Billantine [8], trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ c 90 loài chứa lectin đặc hiệu nh m máu, 710 loài chứa lectin không đặc hiệu nh m máu

Theo nghiên cứu của Sharon và Lis [69], lectin không chỉ gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn c khả năng ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: Tế bào giao t , tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi…

 Sự tương tác của lectin với các loại đường và dẫn xuất của n :

Vai trò n i bật nhất của lectin ở các sinh vật chính là chức năng nhận diện các gốc đường Vai trò này thể hiện trong chức năng của lectin trong miễn dịch tự nhiên,

cơ chế của sự tương tác giữa lectin với đường vẫn còn khá phức tạp [22] Nhưng 3 đặc

t nh này c ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu về lectin

Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đ thì c thể s dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào c mặt glycoprotein đ Một

số nhà khoa học đã s dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định

đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã s dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng s dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein c chức năng sinh học [90]

 Họat tính kháng côn trùng của lectin từ thực vật bậc cao:

Lectin từ củ khoai mỡ (Dioscorea batatas) cho thấy hoạt tính kìm hãm sự phát triển của ấu trùng sâu bướm (Helicoverpa armigera) do liên kết với màng bao chất dinh dưỡng [54] và diệt rệp vừng (Myzus persicaeca) hại trái đào [41] Lectin từ khoai môn (Arum maculatum) gây chết rệp (Lipaphis erysimi) và rệp muội đen (Aphis

craccivora) do liên kết với protein màng ruột côn trùng [48] Lectin từ hạt mãng cầu

(Annona coriacea) gây chết sâu non (Anagasta kuehniella) do làm thay đ i môi trường

màng ruột và phá vỡ cơ chế phục hồi enzyme tiêu hóa của côn trùng [21] Lectin từ lá

cây bông điển (Bauhinia monandra) làm chết mọt đậu (Zabrotes subfaciatus), mọt đậu

bò (Callosobruchus maculatus) và làm giảm trọng lượng của ấu trùng mọt hại đậu nành (A kuehniella) Lectin từ hoa giọt tuyết (Galanthus nivalis) đã làm giảm đáng kể rệp (Rhopalosiphum maidis) hại cây ngô [79] và ấu trùng rầy mềm (Adalia

bipunctata), bọ (Chrysoperla carnea) [29], diệt rầy xanh (Green leafhopper), rầy nâu

(Brown planthopper) và rầy lưng đen (Whitebacked planthopper) hại lúa [50] và diệt rệp (Aphis gossypii) gây hại cây bông vải [34] Lectin từ củ hành (onion) làm chết rệp (Lipaphis erysimi) gây hại cho cây mù tạc [31] Lectin từ tỏi tây (Allium porrum) diệt

giun ăn lá cây bông vải [62]

Bảng 1.3 Độc tính của một số lectin từ thực vật đến côn trùng có hại [78]

Đ c hiệu Mannose

Củ tỏi (Allium sativum) Rầy xám (Laodelpha striatellus), Rầy

nâu (Nilaparvata lugens)

Sâu xanh, sâu tơ, sâu xám, rầy mềm

Rệp vừng (Myzus persicae)

Bọ xít (Dysdercus cingulatus và D

koenigii)

Cây lúa Cây rau Cây đào, cây khoai tây, cây bông vải, cây mướp tây, cây ngô, cây cao lương

Lá tỏi (Allium sativum–

leaf)

Bọ xít (D cingulatus); Rệp muội(Lipaphis erysimi)

Sâu xanh, sâu tơ, sâu xám, rầy mềm

Cây bông vải, cây mướp tây, cây ngô, cây cải

Cây rau Cây khoai môn

(Colocasia esculenta)

mướp tây, cây ngô Cây môn trường sinh

(Differenbachia

sequina)

mướp tây, cây ngô

Cây hoa giọt tuyết

Cây cà chua Cây đậu đũa Câu khoai sọ

Cây lúa

Câu hoàng thủy tiên

Cây đậu ngựa

(Canavalia

ensiformis)

Rệp đậu (A pisum) Rệp muội bông (Aphis gossypii) Rệp (Aulacorthum solani) Rệp lupin (Macrosiphum albifrons) Rệp khoai tây (Macrosiphum

euphorbiae)

Rệp vừng (M persiacae) Bướm đêm (L oleracea) Rầy đục khoai sọ (T proserpina)

Câu đậu Cây bông vải, cây dưa hấu

Cây khoai tây Cây đậu Lupin Cây táo, cây đậu, cây bông cải xanh và cây

đu đủ Cây hạnh đào, cây khoai tây

Cây cà chua Cây khoai sọ

Cây thiết đậu (Lens

culinaris)

Cây đậu hòa lan

 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin

 Ảnh hưởng của pH:

Mỗi dạng lectin thường c pH th ch hợp với hoạt độ của n , đ là giá trị pH mà ở

đ hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái n định

 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường:

Hầu hết các lectin đều bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ Vì lectin c bản chất là protein hoặc glycoprotein, nên khi ở nhiệt độ cao, protein lectin bị biến t nh không thuận nghịch nên làm thay đ i cấu trúc của lectin, dẫn đến làm mất hoạt t nh sinh học của chúng

C mặt lectin: lectin liên kết với thụ thể côn trùng và ngăn chặn sự truyền bệnh cho cây trồng

Không có lectin: Virus liên kết với thụ thể côn trùng và truyền bệnh cho cây trồng

 Ảnh hưởng của một số nhân tố khác:

Enzyme c khả năng làm tăng hoạt độ lectin Trong nhiều th nghiệm, các hồng cầu được x lý bằng các enzyme như trypsin, chimotrypsin, papain… thì chúng dễ bị lectin làm ngưng kết Sở dĩ c hiện tượng này là vì khi hồng cầu x lý với enzyme thì

ch nh enzyme đã giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các

nh m carbohydrate của n , vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dễ dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên [20]

1.2.5 Ứng dụng của lectin

 Lectin trong huyết học:

S dụng lectin để phân loại nh m máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nh m máu bằng lectin cho kết quả nhanh, ch nh xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu Như nghiên cứu của Sudhir Kumar [74], phân lập hồng cầu người bởi lectin được chiết từ rong biển Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và c t nh đặc hiệu cao

 Lectin trong tế bào học:

Lectin được s dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và những biến đ i trên bề mặt tế bào trong quá trình biệt h a bệnh lý thông qua sự thay đ i thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào

 Lectin trong y học:

Lectin c tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực này, lectin được s dụng như một công

cụ chuẩn đoán c hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin được s dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác

để nâng cao giá trị chuẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển [69] Một số lectin c khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N-glycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein c mặt chủ yếu trên bề mặt của tế bào HIV, do đ c thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế khả năng mắc bệnh

Như vậy c thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để s dụng trong chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loại trao đ i chất, trong nghiên cứu sinh học và miễn dịch, làm mitogen trong nuối cấy tế bào với mục đ ch chữa bệnh, tăng năng suất trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [6]

 Lectin trong virus học [53]:

Lectin cũng đ ng vai trò quan trọng đối với quá trình gắn virus vào tế bào vật chủ, mở đầu cho quá trình tấn công tế bào vật chủ của virus Lectin được xem là một nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú, c khả năng kháng virus mạnh mẽ Không giống với phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin c khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủ của virus Thêm vào đ , những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, dải pH rộng, không c mùi và c khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ của virus

 Lectin trong bảo vệ thực vật và ngũ cốc [40], [65], [67]:

Lectin giúp bảo vệ thực vật kháng lại vi khuẩn gây bệnh và con mồi, đồng thời

ức chế quá trình tạo bào t nấm Như khi quan sát ở bọ cánh cứng cho thấy nếu cho chúng ăn thức ăn c lectin đậu đen thì ấu trùng của chúng bị chết

Lectin c khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ và côn trùng c hại cho cây - trồng vì chúng c khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết [9], [61], [68]

1.3 T ng quan về s u

C bốn loài sâu được s dụng trong nghiên cứu gồm sâu xanh (Helicoverpa

armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu

cuốn lá (Cnaphalocrosis medinalis G)

1.3.1 Sâu xanh (Helicoverpa armigera)

Sâu non mới nở màu xanh nạt c chấm đen to trên ngực, đầu đen, hoạt động mạnh và bò khắp nơi Tu i 1 bò như đo khúc, tu i lớn màu sắc sâu non biến động nhiều từ màu xanh lá cây, đến xanh đậm, sang màu nâu và màu nâu đen nhưng trên lưng luôn c 3 vệt dọc thân đậm mà trong đ c nhiều đường lượn s ng nhỏ, bên dưới

lỗ thở c vệt dọc màu vàng và bụng sâu non c màu sáng hơn lưng Cơ thể bao phủ nhiều u lông nhất là đốt bụng đầu tiên và đốt bụng cuối cùng trên lưng mỗi đốt c 2 u lông lớn Đầu sâu non màu vàng nâu c kèm theo những chấm nhỏ và mảnh cứng ngực trước màu đậm hơn

Vòng đời kéo dài đến 26 ngày [87]

1.3.2 S u t Plutella xylostella)

Sâu tơ chỉ gây hại các cây thuộc họ cải Sâu non ăn lá, khi mật số sâu tơ cao ăn tạo các lỗ thủng lá và làm xơ xác Sâu non c 4 tu i, đẫy sức dài 9 - 10 mm Sâu non màu xanh nhạt, hai đầu nhọn phân đốt rất rõ Tu i nhỏ màu trắng đến trắng sữa, đầu đen, sau khi nở chúng gặm lá chui vào trong ăn biểu bì của lá Nhộng màu vàng nhạt được bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá

Đặc điểm sinh học và sinh thái:

Sâu tơ phá hại bộ lá của cây, đặc biệt nghiêm trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non mới nở đục lá tạo thành rãnh, ở tu i lớn sâu tơ ăn toàn bộ biểu bì khiến lá bị thủng lỗ chỗ Mật độ cao sâu ăn hết thịt lá chỉ còn trơ lại gân lá làm giảm năng suất rõ rệt Trên bắp cải sâu non cũng ăn các bắp đang phát triển làm bắp biến dạng hoặc không thể cuốn bắp, tạo điều kiện cho bệnh thối nhũn phát triển Sâu tơ gây hại quanh năm, tuy nhiên hại nặng trong vụ đông xuân

Vòng đời sâu tơ thay đ i theo nhiệt độ, nhiệt độ thấp c thể kéo dài 50 ngày và

sâu tơ giảm rất rõ

Vòng đời kéo dài đến 26 ngày [85]

1.3.3 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)

Sâu xanh da láng là một loài sâu đa thực Sâu non ăn lá, lúc nhỏ chừa lại biểu bì, sâu tu i lớn ăn thủng lỗ trên lá, không hình dạng và mật độ sâu cao c thể làm ảnh hưởng đến năng suất Sâu non c màu xanh nhạt, da b ng láng trên lưng c năm sọc, 2 sọc ở mỗi bên hông rất to và đậm, sọc giữa lưng c màu đen xen kẽ màu trắng Nhộng màu nâu sẫm hay đỏ sẫm thường ở trong đất

Vòng đời kéo dài đến 40 ngày

Trưởng thành chủ yếu hoạt động vào ban đêm, nhất là những đêm c trăng Trứng được đẻ thành trên lá Sâu non mới nở sống tập trung quanh trứng, ăn chất xanh của lá để lại màng biểu bì Sâu tu i 3 bắt đầu phân tán ăn toàn bộ thịt lá chỉ chừa lại gân, sâu còn ăn cả ngọn, hoa và đục vào trái Sâu non c 6 tu i, sâu non ăn rất mạnh, cắn phá thành từng lỗ không hình dạng trên lá mật độ cao c thể làm các ruộng cây màu xơ xác Sâu non ban ngày ẩn trong tán lá hoặc dưới đất, phá hại mạnh vào ban đêm và những khi trời âm u, t nắng Sâu đẫy sức h a nhộng trong đất, lùm cỏ hoặc dưới lớp lá khô [88]

1.3.4 S u cuốn l (Cnaphalocrosis medinalis G)

Sâu non mới nở rất linh hoạt, bò khắp trên lá, thân, c thể chui vào lá nõn, mặt trong bẹ lá để ăn phần thịt lá Từ cuối tu i 2, sâu non bắt đầu nhả tơ kéo hai mép khoảng giữa lá dệt thành bao và nằm trong đ gây hại Sâu non c 5 tu i, sâu tu i 4-5

c khả năng nhả tơ, dệt gập lá theo chiều ngang

Vòng đời kéo dài đến 37 ngày [86]

1.4 C y cải (Brassica juncea L.)

Cải bẹ xanh c thân to, nhỏ khác nhau, lá c màu xanh đậm hoặc xanh nõn lá chuối Lá và thân cây c vị cay, đăng đắng thường dùng ph biến nhất là nấu canh, hay

để muối dưa (dưa cải) Thời gian thu hoạch cho cải bẹ xanh trong khoảng từ 40 – 45 ngày Thành phần dinh dưỡng trong cải bẹ xanh gồm c : vitamin A, B, C, K, axit nicotic, catoten, abumin…[84]

1.5 T nh h nh nghiên cứu lectin từ c y tỏi

1.5.1 T nh h nh nghiên cứu lectin từ c y tỏi trên thế giới

Lectin từ tỏi đã được các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Như nghiên cứu của Clement & Venkatesh [19] về lectin tỏi khi ăn vào

cơ thể tạo sự n định cao về miễn dịch Nhưng n i bật nhất về các công trình nghiên cứu lectin từ tỏi là khả năng ứng dụng vào lĩnh vực nông nghiệp Lectin tỏi đã c tác dụng giúp một số cây nông nghiệp và cây công nghiệp kháng lại một số rầy hay một số loài sâu gây hại như nghiên cứu của:

Nghiên cứu của Sadeghi và cộng sự [9] đã chứng minh được lectin từ tỏi có khả năng bảo vệ cây thuốc lá chống lại sâu ăn lá của lectin được chiết từ củ và lá cây tỏi Bên cạnh đ Bandyopadhyay và cộng sự [11] cũng đã nghiên cứu rõ về sự ảnh hưởng của lectin tỏi đối với hệ tiêu hóa của sâu bệnh

Hiện nay một trong những nghiên cứu về ứng dụng của lectin tỏi mang t nh đột phá đ là ứng dụng vào thực vật chuyển gen giúp cây vật chủ có khả năng kháng lại một số loài rệp như:

Nghiên cứu của Sampa Das và cộng sự [64] về khả năng tăng sức đề kháng bền

vững trong cây mù tạt Ấn Độ biến đ i gen Asal (Brassica juncea) chống lại rệp mù tạt (Erysimi Lipaphis) khi s dụng gen của asal từ lá tỏi

Hay nghiên cứu của Saha và cộng sự [63] về cây lúa biến đ i gen được cấy gen

từ asal lá tỏi giúp cây lúa kháng lại rầy nâu và rầy xanh

Bên cạnh đ Dutta và cộng sự [26] cũng đã chứng minh khả năng kháng lại côn trùng hại cây thuốc lá của lectin lá tỏi

Nghiên cứu của Sadeghi và cộng sự [9] về lectin tỏi dưới sự kiểm soát của chất hoạt h a vỏ cây Aus1 từ cây Arabidopsis thaliana bảo vệ cây thuốc lá chống lại rệp

vừng (Myzus nicotianae) Kết quả nghiên cứu cho thấy thực vật chuyển gen Asal có

ảnh hưởng đáng kể khả năng sinh sản của rệp trưởng thành, với mức giảm lên đến

40%

1.5.2 T nh h nh nghiên cứu lectin từ c y tỏi ở Việt Nam

Việc nghiên cứu lectin trong nước đã được triển khai từ hơn 30 năm nay Nhưng

nghiên cứu về lectin từ cây tỏi ta (Allium sativum) thì đến nay chưa c nhiều nghiên

cứu, mới có hai nghiên cứu về tách chiết lectin từ củ và lá tỏi của: Hoàng Thị Trang và

Nguyễn Thị Ngọc Trinh, sinh viên trường Đại học Nha Trang Bước đầu khảo sát ảnh

hưởng được ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết, thời gian chiết và nồng

 Đối với tách chiết lectin củ tỏi:

- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết PBS 0,02 M 0,85% NaCl là 1/7

- Thời gian chiết là 8 giờ

- Nồng độ muối (NH4)2SO4 dùng để kết tủa dịch chiết là 70%

 Đối với tách chiết lectin củ tỏi:

- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết PBS 0,02 M 0,85% NaCl là 1/6

- Thời gian chiết là 8 giờ

1.6 Tính chất hóa sinh của lectin từ tỏi

Lá, củ và rễ của cây tỏi đều chứa lectin nhưng với hàm lượng và hoạt tính sinh học khác nhau Cho đến nay đã c 2 lectin từ tỏi đã được tinh chế đ là ASAI và

ASAII - viết tắt của Allium sativum agglutinin, ASAI là một đồng phân không đồng

nhất bao gồm 2 nhóm nhỏ với khối lượng phân t mỗi nhóm là 11,5kDa và 12,5kDa [27] (Hình 1.3); và ASAII là một đồng phân đồng nhất bao gồm 2 nhóm nhỏ với khối lượng phân t của mỗi nhóm giống nhau là 12kDa [19], [26]

Hình 1.3 Cấu trúc tinh th của lectin từ tỏi [57]

Có 6 vị trí liên kết với đường giàu mannose trong 1 đồng phân E, F và G tương ứng với vị trí liên kết thứ nhất, thư hai và thứ ba trong monomer thứ nhất I, J và K tương ứng với 3 vị trí liên kết với đường giàu mannose trong monomer thứ hai Giữa hai monomer nối với nhau bằng cầu nối disulfide (gốc cystine)

Mỗi monomer trong đồng phân của lectin từ củ tỏi có ba vị trí liên kết với đường mannose ở những khu vực giống như lectin từ lá và rễ của tỏi [57] Lectin từ tỏi liên kết yếu với đường đơn mannose, nhưng trái lại liên kết mạnh với các glycoprotein dạng N-glycan giàu mannose Ái lực liên kết của lectin từ tỏi (ASA) với chuỗi oligosacchride giàu đường mannose được xắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau:

<< Man9-oligosaccharide Trong số các oligosacchride giàu đường mannose, lectin từ tỏi (ASA) liên kết mạnh nhất với oligosacchride Man9GlcNAc2Asn (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc của Man9 GlcNAc 2Asn [24]

Nhóm OH ở vị tr C2 trong đường đơn, phân biệt sự khác nhau giữa đường mannose so với đường galactose và glucose có khả năng liên kết hydrogen mạnh với

chứng minh rằng đường oligosaccharide giàu mannose liên kết với lectin từ tỏi với ái lực tăng khoảng 14.000 lần so với đường đơn mannose [24]

1.7 Hoạt tính kháng côn trùng của lectin từ tỏi và khả năng ứng dụng

Chuỗi đường oligosaccharide giàu mannose chiếm một tỉ lệ cao trên lớp vỏ của virus, vi khuẩn hoặc lớp màng glycoprotein trong hệ thống tiêu hóa của sâu hại, đây là các thụ thể (receptor) hấp dẫn để cho lectin từ tỏi tương tác dễ dàng (Hình 1.5)

Liên kết chủ yếu qua một mạng lưới liên kết hydrogen giữa nhóm OH - của carbohydrate trên bề mặt màng tế bào của ruột giữa côn trùng và nhóm NH - của protein-lectin

H nh 1.5 Lectin liên kết với chuỗi carbohydrate [57]

Lectin từ các bộ phân của cây tỏi đã được chứng minh làm giảm sự gây hại của

rầy nâu (Brown planthopper), rầy xanh (Green leafhopper) và rầy xanh lưng đen (Whitebacked planthopper) hại lúa [14], diệt giun (Spodoptera littoralis) ăn lá cây bông và rệp (Myzus nicotianae) hại cây thuốc lá [61], sâu xanh (Helicoverpa

armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xám (Agrotis ipsilon) và rầy mềm

(Brevicoryne brassacicae) hại rau xanh và hơn 300 mẫu cây trồng khác [68], rệp (Aphis craccivora) gây hại cây đậu xanh [17]

Tác dụng của lectin từ tỏi đối với côn trùng là làm giảm trọng lượng ấu trùng, tăng tỉ lệ chết, ức chế sự ăn, làm chậm thời gian phát triển, chậm sự trưởng thành và làm chậm khả năng sinh sản của côn trùng trên thế hệ thứ nhất và thứ hai [40], [65], [67] N i chung, cơ chế hoạt động chính của lectin kháng côn trùng là do lectin liên

kết với lớp glycoprotein, chủ yếu là enzyme aminopeptidase N (APN) và alkaline phosphatase (ALP), trên màng tế bào của phần ruột giữa côn trùng Từ đ phá vỡ cơ chế hoạt động của các enzyme này bao gồm làm cho hoạt tính của enzyme esterase trong côn trùng tăng lên, ngược lại hoạt tính của enzyme acid phosphatase, alkaline phosphatase và aminopeptidase N (APN) giảm xuống, kết quả là làm sưng tế bào biểu

mô, đ ng k n hoàn toàn khoang ruột, và làm suy yếu sự tiêu h a dinh dưỡng do ngăn chặn sự trao đ i chất, dẫn đến côn trùng chết [11],[48], [63], [77]

Hình 1.6 (A) Vùng hóa mô của côn trùng b nh thường và (B) vùng hóa mô của

côn trùng cho ăn lectin từ tỏi đã bị sưng lên [11]

Hình 1.7 Màng bao chất dinh dư ng của côn trùng trước và sau khi ăn chế phẩm

lectin tỏi [77]

Ảnh chụp từ k nh hiển vi điện t truyền qua (Transmission electron micrograph

TEM) cấu trúc của màng bao chất dinh dưỡng của côn trùng A, màng bao chất dinh

dưỡng của côn trùng bình thường B, Màng bao chất dinh dưỡng của côn trùng sau khi

ăn chế phẩm lectin tỏi Thanh chia độ tương ứng với 6 µm [77]

Bên cạnh đ lectin tỏi còn có khả năng điều biến miễn dịch, giúp tăng cường hệ miễn dịch của động vật [20] Vì vậy lectin tỏi là một trong những sự chọn lựa tốt trong

số các hợp chất từ thiên nhiên để làm thuốc trừ sâu sinh học trong tương lai [40]

1.8 Phư ng ph p thu nhận lectin

1.8.1 C c k thuật chiết xuất lectin

Lectin c bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật c thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo t nh chất của mỗi loại lectin người ta c thể s dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; CaCl20,1 M; dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl…

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung t nh ở nồng độ cao và c thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation h a trị 1,

những nồng độ muối trung t nh khác nhau Người ta s dụng phương pháp này trong các quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách

 Kết tủa ph n đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ c thể dễ hòa tan trong nước như axetone, polyetylenglycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng c thể bị kết tủa nhanh ch ng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất

dễ gây biến t nh protein, vì vậy việc s dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp

 Thẩm tích

Phương pháp thẩm t ch được tiến hành dựa trên nguyên lý s dụng màng bán thấm với đặc t nh cho qua những phần t nhỏ hòa tan và giữ lại những phần t lớn Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm t ch đặt trong môi trường c pH nhất định, các phân t nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ Thẩm t ch thường dùng để loại muối và những chất phân t nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm t ch

1.8.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký lọc gel

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào k ch thước phân

t Chất giá thường được s dụng là Sephadex Mỗi hạt Sephadex c bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp C nhiều loại Sephadex, trong đ mỗi loại c mức độ liên kết khác nhau tạo nên k ch thước của lỗ xốp khác nhau Ch nh mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất c

k ch thước phân t khác nhau Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100

Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân t của chất cần tách

 Sắc k trao đ i ion

Lectin c bản chất protein nên phân t của n mang điện t ch Tùy thuộc vào

pH của môi trường mà lectin mang điện t ch dương hoặc âm Lợi dụng t nh chất này người ta đã s dụng cột sắc ký trao đ i ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các

nh m chứa ion t ch điện dương như sephadex, xenluloza, trisacryl…được s dụng làm chất trao đ i anion Các chất nhựa gắn các nh m chức ion t ch điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được s dụng làm chất trao đ i cation Mỗi chất trao đ i ion đều c khả năng trao đ i một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đ i Người ta c thể s dụng hai loại chất trao đ i ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion h a và khả năng trao đ i ion của phân t lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

DEAE- Sắc ký ái lực

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân t khác gọi là chất kết hợp (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký Chất giá được s dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực

- Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách c ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất

đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định

- Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với cột: Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy

Từ những phân tích trên cho thấy, lectin thu nhận từ tỏi là một trong những chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt trong việc phòng ngừa và tiêu diệt sâu hại một số loại cây trồng Với sản lượng tỏi hàng năm lớn, đây là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc tách chiết lectin, từ đó làm tăng giá trị của cây tỏi và góp phần tăng thêm thu nhập cho người trồng tỏi

Qua phân tích cho thấy, phương pháp ngâm chiết là phương pháp được sử dụng rộng rãi với dung môi chiết là ethanol và đệm PBS Các loại dung môi này đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu chiết lectin từ các đối tượng khác nhau như đậu cô ve, các loại rong, hạt chay,… Do đó, trong nghiên cứu này tác giả tiến hành khảo sát quá trình chiết lectin từ tỏi trên hai đối tượng dung môi là ethanol và đệm PBS, để từ đó xác định loại dung môi chiết phù hợp

Chư ng 2 - ĐỐI TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu tỏi (Allium sativum) dùng để chiết lectin được thu mua ở xã Vạn

Hưng, huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa

Bốn loài sâu được s dụng trong nghiên cứu gồm sâu xanh (Helicoverpa

armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu

cuốn lá (Cnaphalocrosis medinalis G) là các lọai sâu cùng tu i 1, được cung cấp bởi

Chi cục Bảo vệ thực vật Khánh Hòa, Km 4, đường 23/10, xã Vĩnh Thạnh, TP.Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

Nguyên liệu lá cải (Brassica juncea (L.)) được cung cấp bởi Chi cục Bảo vệ thực

vật Khánh Hòa, được trồng theo Tiêu chuẩn VietGAP

Hồng cầu s dụng trong nghiên cứu là hồng cầu của thỏ, gà, ngựa và cừu được cung cấp từ viện Vaccine - Nha Trang

Các nh m máu A, B và O được mua từ bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa

Các chủng vi sinh vật gồm: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Candida Spp,

Clostridium perfringens, Enterobacter cloace, Escherichia Coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae được cung cấp từ bộ

sưu tập của phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang

2.1.3 Hóa chất2.1.2 Phư ng ph p thu mẫu và l mẫu

Tỏi được thu mua là tỏi nguyên cây, lá cây còn xanh, củ tỏi to, chắc, đồng đều không bị hư hỏng, biến dạng và được thu mua tại cùng một mảnh ruộng của một người dân cùng một thời điểm thu hoạch Ngay sau khi thu mua, tỏi được vận chuyển bằng

xe tải về phòng th nghiệm của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Tại đây, tỏi được loại bỏ rễ và cắt riêng từng bộ phận củ và lá

Củ tỏi được được r a sạch, b c vỏ, rồi tách tép tỏi, sau đ cho vào máy xay, xay

ở mức số 3 trong 5 phút, với lượng đủ dùng cho tất cả th nghiệm Củ tỏi sau x lý được cho vào túi PA và bảo quản ở - 22 C

Lá tỏi được cắt nhỏ, với k ch thước khoảng 3mm, rồi s dụng máy xay để xay