Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật vào quá trình lên men ca cao

Phần lớn các loài khác có mặt trong quá trình lên men ít có tác dụng tới quá trình hình thành chất lượng hoặc thậm chí không có hoặc có tác dụng không tốt tới quá trình hình thành chất l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

TRẦN NHẬT THANH

NGHI N CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT VÀO QUÁ

TR NH N EN CA CAO

UẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

1 ỜI CA ĐOAN

Tôi xin cam kết đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nêu trong luận văn

“ là trung thực và

chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nha Trang, ngày 05 tháng 10 năm 2015

Tác giả luận văn

Trần Nhật Thanh

2 ỜI CẢ ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

 Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn và Cô TS Mai Thị Tuyết Nga, Cô Nguyễn Thị Thanh Hải đã hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện

4 ỤC ỤC

1 LỜI CAM ĐOAN iii

2 LỜI CẢM ƠN iv

4 MỤC LỤC v

5 DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT viii

6 DANH MỤC BẢNG ix

7 DANH MỤC HÌNH x

8 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

9 LỜI MỞ ĐẦU xiii

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tìm hiểu về ca cao 1

1.1.1 Nguồn gốc 1

1.1.2 Đặc điểm hình thái 1

1.1.3 Phân loại và tác dụng của ca cao .3

1.1.3.1 Phân loại 3

1.1.3.2 Tác dụng của ca cao 3

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ca cao 4

1.2 Tổng quan về lên men ca cao 5

1.2.1 Ủ đống (fermentation in heap) 5

1.2.2 Ủ trong thúng (fermentation in basket) 6

1.2.3 Ủ thùng (fermentation in box) 7

1.3 Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao .8

1.3.1 Nấm men 11

1.3.2 Vi khuẩn Acetic 11

1.3.3 Vi khuẩn Lactic 12

1.3.3.1 Khái quát chung về vi khuẩn lactic 13

1.3.3.2 Các chủng lactic lên men đồng hình 13

1.3.3.3 Các chủng lactic lên men dị hình 14

1.4 Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao 15

1.4.1 Cấu tạo hạt ca cao 15

1.4.2 Biến đổi sinh hóa 16

1.4.3 Biến đổi về nhiệt độ 18

1.4.4 Biến đổi pH của khối lên men 18

1.4.5 Biến đổi màu sắc hạt 19

1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về lên men ca cao 20

1.5.1 Những nghiên cứu trong nước 20

1.5.2 Những nghiên cứu ngoài nước 21

2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 24

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp trong quy trình sản xuất chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic 25

2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng bột đậu nành 25

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng đường glucose 26

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định pH 27

2.2.2.4 Bố thí nghiệm tối ưu hóa các thông số trong quy trình sản xuất chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 28

2.2.2.5 Tạo chế phẩm vi khuẩn lactic: 29

2.2.3 Bố trí thí nghiệm bổ sung chế phẩm vi sinh vật trong lên men ca cao 29 2.2.3.1 Kiểm tra thành phần hóa học nguyên liệu: 29

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định thời điểm bổ sung chủng tốt nhất: 30

2.2.3.3 Tiến hành kiểm tra pH, số lượng các chủng vi sinh trong quá trình lên men ca cao 31 2.2.4 Các phương pháp phân tích và xử lý số liệu 32

3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic 33

3.1.1 Các thông số thích hợp trong quy trình sản xuất chế phẩm lactic 33

3.1.1.1 Hàm lượng bột đậu nành 33

3.1.1.2 Hàm lượng đường 34

3.1.1.3 Độ pH 35

3.1.1.4 Kết quả tối ưu hóa chế phẩm vi sinh 35

3.1.2 Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm lactic 42

3.1.2.1 Sơ đồ quy trình 42

3.1.2.2 Thuyết minh quy trình 42

3.2 Kết quả bổ sung chế phẩm vi khuẩn vào quá trình lên men ca cao 43

3.2.1 Hạt ca cao lên men hoàn toàn 44

3.2.2 Hạt ca cao lên men không hoàn toàn 44

3.2.2.1 Lên men 1 phần 45

3.2.2.2 Dưới mức lên men 46

3.2.3 Sự biến đổi pH của 16 mẫu nghiên cứu có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 47 3.2.3.1 Nhóm 1 (mẫu 1-5) 47

3.2.3.2 Nhóm 2 (mẫu 6-10) 48

3.2.3.3 Nhóm 3 (mẫu 11-15) 49

3.2.4 Sự biến đổi của vi sinh vật trong 16 mẫu nghiên cứu bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 52

3.2.5 Đề xuất quy trình và tiến hành lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic quy mô phòng thí nghiệm 57

4 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 60

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

6 PHỤ LỤC - 1 -

6 DANH ỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số vi sinh vật chính được phân lập từ quá trình lên men hạt ca cao 9 Bảng 2.1 Bảng bổ sung chế phẩm trong thời gian lên men theo tỉ lệ % so với lượng mẫu 31 Bảng 3.1 Quy đổi biến mã và biến thực 35 Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa 36 Bảng 3.3 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc 2 của hàm mục tiêu số lượng khuẩn lạc 37 Bảng 3.4 Thông số đánh giá tính phù hợp và sự tương quan mô hình 37 Bảng 3.5 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi quy 40

7 DANH ỤC H NH

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao 3

Hình 1.2 Lên men thành đống 6

Hình 1.3 Lên men trong thúng 7

Hình 1.4 Lên men ca cao bằng thùng 8

Hình 1.5 : Cấu tạo hạt ca cao 16

Hình 1.6 Biến đổi sinh hóa và quá trình khuếch tán trong cơm nhầy và trong hạt với quá trình lên men ca cao 16

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát 24

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm xác định hàm lượng bột đậu nành 25

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm xác định hàm lượng đường 27

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm xác định pH 28

Hình 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu nành đến mật độ vi khuẩn lactic 33

Hình 3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến mật độ vi khuẩn lactic 34

Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH đến mật độ vi khuẩn lactic 35

Hình 3.4 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu nành và đường đến số lượng khuẩn lạc 38

Hình 3.5 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu nành và pH đến số lượng khuẩn lạc 39

Hình 3.6 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường và pH đến số lượng khuẩn lạc 39

Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng tìm thông số tối ưu hóa 40

Hình 3.8 Tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn của 16 mẫu lên men có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 44

Hình 3.9 Tỷ lệ hạt lên men một phần của 16 mẫu lên men có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 45

Hình 3.10 Tỷ lệ hạt dưới mức lên men của 16 mẫu lên men có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 46

Hình 3.11 Sự biến đổi pH của nhóm 1 trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 47

Hình 3.12 Sự biến đổi pH của nhóm 2 trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 48

Hình 3.13 Sự biến đổi pH của nhóm 3 trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 49

Hình 3.14 Sự biến đổi của nấm men trong khối hạt trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 52

Hình 3.15 Sự biến đổi của vi khuẩn acetic trong khối hạt trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 53

Hình 3.16 Sự biến đổi của vi khuẩn lactic trong khối hạt trong quá trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic 55

Hình 3.17 Quy trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic quy mô phòng thí nghiệm 57

8 TRÍCH YẾU UẬN VĂN

 Ca cao được du nhập vào Việt Nam từ rất sớm nhưng đến nay kỹ thuật sơ chế còn thấp, phương pháp lên men còn thủ công … nên hiệu quả thu được và chất lượng hạt ca cao thành phẩm còn thấp Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn và TS Mai Thị Tuyết Nga, tôi đề xuất được thực hiện đề

 Xây dựng quy trình bổ sung chế phẩm lactic lên men ca cao với tỉ lệ là 6% (tính theo khối lượng của khối ca cao lên men) ở ngày đầu, sau đó tiếp tục bổ sung 2% chế phẩm vào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 4

 Do thời gian ngắn nên chỉ mới nghiên cứu được chế phẩm vi sinh bằng vi khuẩn lactic, cần nghiên cứu thêm bổ sung bằng các loại vi sinh vật khác như acetic, nấm men…

 Diện tích mẫu nhỏ trong PTN Nên nghiên cứu trong lượng mẫu lớn để đảm bảo điều kiện lên men đạt hiệu quả cao

 Do thiết bị bảo quản không đáp ứng (máy đông khô, thiết bị hút chân không bị hỏng …) nên chế phẩm chỉ bảo quản được thời gian ngắn Cần đi sâu nghiên cứu quy trình bảo quản chế phẩm vi sinh

 Nghiên cứu sâu quy trình bổ sung chế phẩm vi sinh để tỷ lệ lên men hoàn toàn đạt hiệu suất cao

Từ khóa: ca cao, vi khuẩn lacic, lên men, chế phẩm

9 ỜI Ở ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

 Ca cao du nhập vào nước ta từ rất lâu Nó được trồng phổ biến ở các tỉnh ở Tây Nguyên và Nam Bộ với sản lượng rất cao Năm 2009 tổng diện tích ca cao của Việt nam là 9.683 ha: 1.315 ha trồng thuần (1.100cây/ha) và 8.368 ha trồng xen (600 cây/ha), nhiều nhất là ở các tỉnh Bến Tre, Dak Lak, Bình Phước. Đến năm 2013, diện

tích ca cao cả nước đạt 22.110,3 ha, trong đó vùng có diện tính trồng lớn nhất là Đồng bằng sông Cửu Long và Tây Nguyên Diện tích ca cao cho thu hoạch khoảng 11.055

ha, chiếm 50% tổng diện tích, sản lượng hạt ca cao khô lên men năm 2013 là 6.765 tấn

 Có 3 giống ca cao chính là Criollo, Forastero và Trinitario Criollo là giống cho hương vị đặc biệt, hạt ca cao Criollo thường được dùng để pha trộn vào các loại ca

cao khác khi chế biến, hoặc để dùng làm nguyên liệu để sản xuất ra những loại

chocolate đặc biệt Tuy nhiên Criollo thường hay bị bệnh tật tấn công Forastero cho

năng suất cao nên được trồng rộng rãi Ngày nay 80% ca cao trên thế giới được trồng

là ca cao Forastero Trinitario là giống tương đối mới được cấy gh p giữa Criollo và Forastero, nó có mùi thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng c ng như khả năng chống chịu sâu bệnh của Forastero Tuy nhiên do nó là giống mới nên sản lượng trên

thị trường thế giới còn ít

 Tuy có từ khá lâu ở nước ta nhưng do kỹ thuật sơ chế còn thấp, phương pháp lên men còn thủ công … nên hiệu quả thu được và chất lượng hạt ca cao thành phẩm còn thấp Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Anh

Tuấn và TS Mai Thị Tuyết Nga, tôi đề xuất được thực hiện đề tài: “ ”

 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật

 Nghiên cứu thử nghiệm bổ sung chế phẩm vi sinh vật trong quá trình lên men

ca cao quy mô phòng thí nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

 Cung cấp dữ liệu khoa học về quá trình lên men hạt ca cao có bổ sung chế phẩm vi sinh

 Góp phần làm tăng hiệu quả cho quá trình lên men ca cao, ổn định chất lƣợng sản phẩm

Chi: Theobroma L - Theobroma

Loài: Theobroma cacao L – Cacao

(National Plant Database, 2004)

 Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng ca cao:

o Nam Mỹ: Brazil, Ecuador

o Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria

o Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam

 Ca cao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được người Maya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt Từ “ca cao” từ tiếng Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này Ca cao xuất hiện lần đầu tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605 [26]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

 Cây ca cao là loại cây rừng có nguồn gốc từ Châu Mỹ Nó là loại cây đa niên, chịu mát nhưng thích hợp với khí hậu nhiệt đới, các nước trồng nhiều như: Bờ Biển Ngà, Ghana, Nigeria, Ecuador, Brazil, Malaysia, Philippines, đây là những quốc gia nằm gần vùng xích đạo

 Rễ ca cao có dạng trụ, dài khoảng 1,5 – 2 m Trên suốt chiều dài của rễ trụ có nhiều rễ ngang phân nhánh và rất nhiều rễ con tập trung chủ yếu dưới cổ rễ khoảng 20

cm

 Thân: Ca cao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao từ 10 – 20 m nếu mọc tự nhiên Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây ca cao khoảng 5 – 7 m, đường kính khoảng 10 – 18 cm Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4 – 5 tầng cành

 Lá: Lá ca cao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống Màu sắc lá thay đổi tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm Trong quá trình trưởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thể nằm ngang Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng Khí khổng chỉ có mặt ở dưới phiến lá Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào và chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh Lá tồn tại được từ 4 – 5 tháng, sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng

 Hoa: Hoa ca cao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành Hằng năm, hoa xuất hiện trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa Hoa có cuống dài 1 – 3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài Hoa nở từ 3 giờ chiều đến 9 giờ sáng hôm sau

 Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào giống

 Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ tím,… Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển qua màu da cam

 Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơi dài, nhọn hoặc hình trứng Thường quả có chiều dài 7 – 30 cm, rộng 7 – 9 cm

 Hạt: Hạt ca cao không có nhân, mập, dài 2 – 3 cm: và có cùi nhớt màu trắng, có

vị hơi chua bao bên ngoài Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấy hạt ở bên trong Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối với giống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men Kích thước hạt có thể thay đổi tùy theo giống và mùa vụ Mỗi quả ca cao có từ 30 – 40 hạt được bao quanh bằng lớp nhầy Lớp nhầy này có vị hơi ngọt và đó chính là cơ chất cho quá trình lên men [25]

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao

[33][35][38] 1.1.3 Phân loại và tác dụng của ca cao

1.1.3.1 P â ạ

Ca cao được phân làm 3 loại:

 Criollo: Hạt có chất lượng rất cao do có hương ca cao đặc trưng, cây phát triển

 Giải khát, chữa bệnh: chữa bệnh đường ruột, điều hòa huyết áp, kích thích tiêu hóa, tăng cường hoạt động của chức năng tuần hoàn, trợ tim (do chứa theobromin, chất này c ng thường chứa trong những hợp chất chữa bệnh tim)

 Kích thích hưng phấn nhẹ nhàng do chứa hàm lượng cafein thấp

 Cung cấp năng lượng, các vitamin, khoáng chất…

 Bơ ca cao c ng được sử dụng trong sản xuất thuốc lá, xà phòng, mỹ phẩm,

….[20]

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ca cao

 Ca cao được trồng ở 50 quốc gia trên thế giới với diện tích khoảng 5 triệu ha, tuy nhiên mức cung lại phụ thuộc vào 3 quốc gia chính là Bờ Biển Ngà, Indonexia và Ghana, trong đó Bờ Biển Ngà là nước sản xuất ca cao nhiều nhất thế giới, chiếm 40% sản lượng toàn cầu, Indonexia chiếm 12 % sản lượng, Ghana chiếm 21 % [12]

 Sản lượng ca cao trên thế giới niên vụ 2003/04 lên tới 3,5 triệu tấn tăng so với niên vụ 2002/03 là 13,8 %

 Tây Phi sản xuất ca cao chiếm 72,4 % sản lượng ca cao thế giới Từ những năm

1970 đến nay sản lượng ca cao ở Đông Nam Á tăng nhanh và hiện chiếm 17 % Tại Đông Nam Á ca cao được trồng ở một số nước như: Indonexia, Philippin, Malaysia, Việt Nam, Papua New Guinea, India, Srilanca và cho sản lượng khoảng 500 000 tấn

 Tiêu thụ ca cao trên thế giới ngày càng tăng với tốc độ 2 – 3 % mỗi năm và ca cao chủ yếu dùng để sản xuất socola Ước tính tiêu thụ ca cao trên thế giới năm 2004/05 tăng lên 3,23 triệu tấn và tăng thêm 3 triệu tấn năm 2008

 Trong thế kỷ 20, tiêu thụ ca cao tăng nhanh do kết quả trực tiếp của việc gia tăng nhu cầu socola Nhu cầu socola tăng do nhiều yếu tố như tăng thu nhập, tăng dân

số, giá bán lẻ giảm, sản phẩm làm từ ca cao phong phú, kỹ thuật tiếp thị hiện đại,

 Các nước Tây Âu, Bắc Mỹ là thị trường tiêu thụ lớn nhất thế giới, chiếm 70 % sản lượng ca cao thế giới, riêng các nước Liên minh Châu Âu (EU) tiêu dùng khoảng một nửa sản lượng ca cao hằng năm trên thế giới (Bỉ là nước tiêu thụ ca cao nhiều nhất, trung bình cứ 5 kg/người) [30], [32]

 Cây ca cao ở Việt Nam được khôi phục và phát triển từ khi có sự hỗ trợ của dự

án quốc tế Success alliance, từ vài chục ha năm 2000 tăng lên 7320 ha năm 2006 và

đạt hơn 11 400 ha vào cuối năm 2007 Nhiều mô hình trồng ca cao đạt năng suất từ 1,5 tấn đến hơn 2 tấn hạt khô/ ha

 Hiện nay, tổng lượng ca cao khô của Việt Nam mỗi năm khoảng 4.000 tấn Theo kế hoạch phát triển ca cao của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm

2015 diện tích trồng đạt 33.500 ha, sản lượng hạt khô lên men 25.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu 60 - 70 triệu USD/năm [39]

 Các công ty nước ngoài đang có xu hướng đến Việt Nam thu mua ca cao Doanh nghiệp trong nước c ng mạnh dạn đầu tư hàng triệu USD, xây dựng nhà máy chế biến ca cao Chưa bao giờ hạt ca cao được kì vọng như vậy

 Năm 2005, công ty TNHH Cargill Việt Nam, doanh nghiệp 100% vốn của Mỹ

ở Đồng Nai, đã chi ra cả tỷ đồng để lập trạm thu mua ca cao ở Bến Tre, sau đó mở tiếp trạm thu mua ở Đăk Lăk, những địa phương có diện tích trồng ca cao lớn [31]

 Năm 2006, Công ty TNHH Thuận Kiều ở Bình Dương đã đầu tư xây dựng một nhà máy chế biến ca cao đầu tiên của Việt Nam tại Bến Tre

 Đối với thị trường tiêu thụ trong nước, công nghiệp chế biến ca cao ở nước ta đang phát triển, như các nhà máy chế biến bánh kẹo ở Quãng Ngãi và TP HCM c ng phải nhập nguyên liệu bột và bơ ca cao, trong nước sản xuất còn quá ít không đủ cung cấp cho thị trường nội địa Hàng năm, các nhà máy chế biến bánh kẹo, thức uống của Việt Nam phải nhập khoảng 1000 tấn ca cao bột và một số ít bơ ca cao tương đương khoảng 2700 tấn hạt ca cao khô

1.2 Tổng quan về lên men ca cao

1.2.1 Ủ đống (fermentation in heap)

 Hạt ca cao được đổ thành đống hình nón trên lớp lá chuối được xếp tròn trên mặt đất Bên dưới một lớp lá chuối kê các cành cây để tạo độ thoáng và giúp dịch nhầy chảy ra dễ dàng Các lá chuối sẽ được cuộn lên để bao kín khối hạt nhằm giữ hơi nóng trong suốt quá trình ủ Đống hạt có thể từ 25 – 2500 kg hạt tươi Hai hoặc ba ngày sau khi ủ phải được đảo trộn đều và giữ kín bằng lá chuối cho đến khi quy trình hoàn tất Tuỳ theo nhiệt không khí (tuỳ mùa) mà thời gian ủ k o dài 4 đến 7 ngày

 Ủ đống là phương pháp phổ biến được nông hộ nhỏ tại Ghana, nhiều nước sản xuất hạt ca cao tại Châu Phi và khu vực Amazon của Brazil thực hiện Thời gian ủ đống khoảng 4 đến 7 ngày

 Ủ đống có ưu điểm: dụng cụ đơn giản, phù hợp với nhiều khối lượng khác nhau [32]

Hình 1.2 ên men thành đống

[35] 1.2.2 Ủ trong thúng (fermentation in basket)

 Lót lá chuối xung quanh thúng tre, đổ đầy hạt và đậy thúng lại bằng lá chuối Hai ngày sau khi ủ trộn đều hạt bằng cách đổ từ thúng này sang thúng khác

 Kích thước thúng tuỳ theo khối lượng hạt để có thể chứa từ 10 – 150 kg hạt ca cao tươi

 Sau khi ủ độ 5 – 7 ngày, nếu ủ đúng cách và đúng mức thì các hạt ca cao đều

có màu nâu sậm Ngược lại nếu ủ không đúng cách thì các hạt bên phía ngoài có màu nâu, phía trong hơi trắng và giữa đống ủ các hạt trắng hơn Có thể hạt còn có màu đen, nấm mốc phát triển và hạt xuất hiện mùi amoniac khi thời gian ủ quá mức

 Đối với giống Forastero Trinitario thường ủ khoảng 3 – 7 ngày, còn giống Criollo chỉ cần 2 – 3 ngày là được [32]

Hình 1.3 Lên men trong thúng

[35] 1.2.3 Ủ thùng (fermentation in box)

 Ca cao được chứa trong thùng gỗ có đục lỗ ở đáy Kích thước chiều dài và chiều rộng của thùng có thể thay đổi tùy theo lượng hạt nhưng chiều cao khối hạt không nên vượt quá 50 cm Khối lượng từ 50 – 1000 kg

 Đảo trộn hạt sau hai ngày ủ Thời gian ủ từ 5 – 7 ngày

 Thùng được kê cao 20 – 30 cm cho thoáng nước và nước trong thùng ủ thoát ra được Phải giữ nhiệt độ trong thùng ủ khoảng 500C và cứ hai ngày một lần đảo trộn khối hạt cho đều Nếu có nhiều thùng thì việc trộn đống ủ thường dễ dàng hơn: sau khi

ủ hai ngày trong thùng thứ nhất, sang hạt qua thùng thứ hai (vừa sang vừa chú ý trộn đều hạt) Hai ngày sau sang qua thùng thứ ba ủ tiếp trong hai ngày nữa Trong hai ngày này cần bắt đầu chú ý xem hạt đã ủ đúng mức chưa tức là hạt đã đạt màu nâu sẫm

ở ngoài và tím đậm bên trong [28]

 Trong khi ủ cần lưu ý, đối với giống Forastero và Trinitario thường ủ khoảng 3 – 7 ngày, còn giống Criollo chỉ cần ủ 2 – 3 là được

Hình 1.4 Lên men ca cao bằng thùng

[38] 1.3 Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao

 Một số nghiên cứu trên thế giới đã xác định hệ vi sinh vật rất đa dạng tham gia

vào quá trình lên men bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Betabacterium, Streptobacterium, Str p ,…), vi khuẩn acetic (Acetobacterraner, A ascendens,

A suboxydans, A xylinodes, A orleanense, Gluconobacter oxydans,…), vi khuẩn Bacillus (B subtilis, B circulans, B licheniformis,…) và nấm mốc (Aspergillus, Mucor, P ,R z p ,…) Mỗi nhóm vi sinh vật đều có một vai trò rất quan

trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men c ng như chất lượng hạt thành phẩm

Do đó, các công trình nghiên cứu tuyển chọn và ứng dụng hệ vi sinh vật chức năng để điều khiển quá trình lên men c ng được quan tâm thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới [16], [ 17]

 Theo Ardhana và Fleet (2003) có khoảng 124 loài vi sinh vật hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao bao gồm các loài: nấm men (yeasts), vi khuẩn (bacteria), nấm mốc (mould) Tuy nhiên mật độ và số lượng vi sinh vật ban đầu của mỗi vùng, mỗi quốc gia là khác nhau, do đó quá trình lên men của các vùng c ng khác nhau Phải chăng đây là một trong những nguyên nhân và biện pháp điều khiển để tạo ra các loại hạt ca cao có chất lượng đặc biệt và từ đó tạo ra các sản phẩm chocolate có nguồn gốc

và xuất xứ (chocolate đặc sản)[13]

 Trong quá trình lên men mật độ vi sinh vật c ng biến thiên theo thời gian lên men: số tế bào vi sinh vật hiếu khí tăng lên từ 6,1 x 106

CFU/g đến cực đại 4,2 x 107CFU/g chất khô sau 48 h lên men Nấm men phát triển tới cực đại trong 24 h đầu của

lên men ở mật độ 6,1 x 107

CFU/g Vi khuẩn sản sinh acid lactic và acid acetic phát triển sau 48 h là 7,3 x 107

CFU/g và 1,5 x 108 CFU/g chất khô [8]

 Nhiều nghiên cứu cho rằng trong rất nhiều loài vi sinh vật đó thì chỉ có một số loài chính hoạt động mạnh và ảnh hưởng nhiều tới quá trình lên men và chất lượng hạt sau lên men (xem bảng 1.1) Phần lớn các loài khác có mặt trong quá trình lên men ít

có tác dụng tới quá trình hình thành chất lượng hoặc thậm chí không có hoặc có tác dụng không tốt tới quá trình hình thành chất lượng của hạt cacao thành phẩm [3].Các loài phụ này thường bị ức chế trong quá trình lên men cacao nhưng trong điều kiện thuận lợi (nhiệt độ thấp, hàm lượng etanol không cao, hàm lượng acid ít ) thì chúng

sẽ phát triển và làm hỏng quá trình lên men hạt

Bảng 1.1 ột số vi sinh vật chính được phân lập từ quá trình lên men hạt ca cao

Lactobacillus mali

Lactobacillus collinoides

Lactobacillus fermentum

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus collinoides

Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus fructivorans

Lactobacillus gasseri

Leuconostoc

messenteroides

Leuconostoc paramesenteroides

Acetobacter ascendens

Acetobacter xylinum

Gluconobater oxydans

Acetobacter rancens

Acetobacter lovaniensis

Acetobacter xylinum

Gluconobater oxydans

Sacharomycopsi

s spp

Schizosacharom yces spp

Torulopsis spp

Candida spp

Debaryomyces spp

Hanseniaspora spp

Sacharomyces cerevisiea

Sacharomyces chevalieri

Sacharomyces spp

Schizosascharomyces malidevorans

tế bào nấm men lúc đầu là 104

- 105 CFU/g, và sau 24-36 h lên men chúng phát triển đến số lượng cực đại là 107

- 108 CFU/g, sau đó số lượng bị giảm nhưng vẫn duy trì cho đến khi quá trình lên men kết thúc [4]

 Ethanol là sản phẩm của nấm men, ngoài ra nó còn sinh ra các sản phẩm khác như acid acetic, acid malic, và acid succinic, chúng tạo nên một hệ đệm trong cơm nhầy ca cao C ng như rượu, các acid b o và các este acid b o, chúng góp phần tạo nên hương vị, các hợp chất tiền sinh hương của ca cao [7] Bên cạnh đó, hoạt động của nấm men là nguyên nhân làm giảm độ nhớt và làm thoát nước của khối ca cao lên men

do chúng tiết ra các enzyme pectin làm phá vỡ cấu trúc cơm nhầy Khoảng trống được tạo thành giữa các hạt do cơm của khối hạt bị lên men tạo điều kiện cho không khí xâm nhập vào bên trong, thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic

1.3.2 Vi khuẩn Acetic

 Lên men ca cao là quá trình lên men hiếu khí k o dài từ lúc mới bắt đầu lên men cho đến khi kết thúc, đó là điều kiện tối ưu nhất cho vi khuẩn acetic hoạt động Theo nghiên cứu cho thấy vi khuẩn acetic hoạt động trong khoảng từ 24 – 112 h của quá trình lên men Khi một lượng lớn cơm nhầy được chuyển hóa và lượng nước mất

đi c ng lớn, không khí bên trong khối hạt tăng lên, và khi nhiệt độ tăng trên 37°C, vi khuẩn acetic chịu nhiệt phát triển với số lượng ban đầu từ 3 – 5 tăng lên tối đa là 5 – 8

lg (CFU/g) ca cao lên men [15] Từ 24 h trở đi vi khuẩn acetic phát triển với một số lượng lớn và sau 36 – 48 h lên men, số lượng của chúng đạt lg (CFU/g) = 7,7 - 7,8, ở những giai đoạn sau số lượng của chúng giảm

 Ở vùng Trinidad, người ta thấy vi khuẩn sinh acid acetic chiếm khoảng 80-90% tổng số vi sinh vật sau 2 ngày lên men ca cao Theo báo cáo của Carret và cộng sự (1979) vi khuẩn acetic là một trong những vi sinh vật đặc biệt quan trọng trong việc lưu thông khí bên trong khối lên men, chúng có vai trò oxy hóa ethanol do nấm men sản xuất ra để tạo thành acid acetic

 Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng đối với chất lượng hạt ca cao sau lên men

Nó chuyển hóa đường và acid hữu cơ tạo thành các aldehyde, ceton và các sản phẩm

dễ bay hơi khác, nó tạo ra hương thơm đặc trưng cho hạt sau lên men [3] Tuy nhiên

nó c ng có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của hạt

 Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (36 – 48 h) số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt 106

-108 CFU/g, sau đó giảm dần [15]

 Vi khuẩn lactic lên men một loạt các loại đường (chủ yếu là glucose và fructose) và chuyển hóa một số acid hữu cơ (như acid citric, acid malic) tạo thành sản phẩm chính, sản phẩm cuối cùng là acid lactic Quá trình chuyển đổi này phụ thuộc vào chủng loại vi khuẩn lactic Hầu hết vi khuẩn lactic thường sử dụng glucose như là nguồn năng lượng, nhưng c ng có một số loài thuộc chủng vi khuẩn lactic sử dụng fructose như là một nguồn thay thế điện tử bên ngoài và chuyển chúng thành mannitol [1].Tỷ lệ tương đối của tất cả các sản phẩm khi kết thúc quá trình lên men sẽ thay đổi thành phần cơm nhầy của khối lên men và do đó nó có thể ảnh hưởng đến sự hoạt động của các vi sinh vật tiếp theo Vì vậy khi nhiệt độ khối hạt bắt đầu giảm có thể kết thúc quá trình lên men

1.3.3.1 Khái quát chung ề k ẩ

 Tế bào của chúng hình cầu (hoặc hình hơi oval) và hình que Đường kính của các dạng cầu khuẩn từ 0,5 ÷ 1,5 µm Cầu khuẩn đứng riêng lẻ, cặp đôi hoặc chuỗi

(Streptococcus) có chiều dài khác nhau Kích thước dạng hình que từ 1 ÷ 8 µm Các tế bào trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi

 Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động và không sinh bào tử, Gram dương (+), kị khí tùy tiện, trực khuẩn lactic nhạy cảm với oxy hơn cầu khuẩn lactic

 Vi khuẩn lactic có thể lên men được monose và disaccharide Một số chủng không lên men được saccharose, maltose hoặc lactose Tinh bột và các polysaccaride khác các vi khuẩn lactic không lên men được Một số chủng dị hình sử dụng được pentose và acid

 Phần lớn vi khuẩn lactic, đặc biệt là chủng trực khuẩn lên men đồng hình, có nhu cầu lớn về tập hợp các acid amin hoặc các nitơ hữu cơ có cấu tạo phức tạp Hầu hết vi khuẩn lactic đều có nhu cầu các vitamin (B1, B2, B6, PP, acid pantotenic và acid folic)

 Vi khuẩn lactic có hoạt tính protelytic, chúng có thể thủy phân protein thành peptide và các acid amin, chủng trực khuẩn có hoạt tính cao hơn những loài khác

 Các tế bào vi khuẩn lactic dễ chuyển sang dạng khô h o, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loại sống trong môi trường 10 ÷ 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn chịu được nồng độ muối cao (7 ÷ 10%)

 Một số vi khuẩn có khả năng tạo màng nhầy, là các polysaccharide (polymer sinh học), một số khác sinh bacteriocin – chất có họat tính kháng sinh, chất đại diện và được dùng trong bảo quản là nisin

 Đa số các vi khuẩn lactic thuộc dạng ưa ấm nhiệt độ sinh trưởng tối thích là

25 ÷ 35 oC, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 ÷ 45 oC, nhóm lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (≤ 5 oC) Khi gia nhiệt tới 60 ÷ 80 oC thì chết trong 10 ÷ 30 phút Loài trực khuẩn có thể phát triển ở pH 3,8 ÷ 4, pH tối thích cho sự phát triển của trực khuẩn lên men là 5,5 ÷ 6 [19]

1.3.3.2 C ủ đồ

 Streptococcus lactic: hình cầu, kết đôi hoặc chuỗi ngắn, ưa ấm, nhiệt độ thích

hợp cho sinh trưởng là 30 ÷ 35 oC, làm đông tụ sữa sau 10 ÷ 12 h Trong môi trường

tích tụ được 1% acid lactic Nhiệt độ tối thiểu là 10 oC, tối đa là 40 ÷ 45 oC Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin Chủng này được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm sữa chua, bơ chua, phomat

 Str cremoris: hình cầu, kết thành chuỗi dài, ưa ấm và tạo thành ít acid Khoảng

nhiệt độ sinh trưởng là 10 oC đến 36 ÷ 38 oC, thích hợp là 25 oC Một số chủng sinh bateriocin ở dạng diplococcin

 Str thermophilus: chuỗi hình cầu dài, phát triển mạnh ở nhiệt độ 40 ÷ 45 oC,

tích tụ trong môi trường khoảng 1% acid, được sử dụng cùng với Lactobacillus trong

chế biến sữa chua và phomat

 Lactobacillus bungaricus: hình que lớn (đôi khi ở dạng hạt), thường kết chuỗi

dài, không lên men saccharose Vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển

là 40 ÷ 45 oC, nhiệt độ tối thích là 15 ÷ 20 oC, tạo nhiều acid, tích tụ trong sữa tới 2,5 ÷ 3,5% acid lactic, được dùng trong sản xuất sữa chua Địa Trung Hải, Cumic

 L casein: thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn khác nhau, tích tụ tới 1,5%

acid, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 30 ÷ 35 oC Trực khuẩn này dùng trong sản xuất phomat

 L acidophilus: vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ tối thiểu là 20 oC, nhiệt độ thích hợp

30 ÷ 40 oC Trong sữa, trực khuẩn này tích tụ tới 2,2% acid Có khả năng sinh bacteriocin ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột Một số chủng sinh màng nhầy, dùng để sản xuất các sản phẩm sữa acidophin

 L delbrueckii: trực khuẩn ưa nhiệt, đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi dài,

ngắn Không lên men lactose Nhiệt độ thích hợp 40 ÷ 45 oC, tối thiểu là 20 o

C, trong

cơ chất tích tụ được 2,5% acid, được sử dụng sản xuất acid lactic và sản xuất bánh mì

 L plantarum: trực khuẩn nhỏ thường kết đôi hoặc kết thành chuỗi, nhiệt độ tối

thích là 30 oC, tích tụ được 1,3% acid Dùng cho muối chua rau quả, ủ chua thức ăn xanh cho gia súc [19]

1.3.3.3 C ủ ị

 Lactobacillus brevis tìm thấy chủ yếu trong muối dưa chua bắp cải, rau cải, dưa

chuột Lên men được saccharose và tích tụ được 1,2% acid lactic, ngoài sinh ra acid nó còn tạo thành acid acetic, rượu etylic, CO2 tạo cho sản phẩm có mùi hương dễ chịu

 Lactobacillus fermentum là chủng vi khuẩn đươc phân lập từ các thực phẩm lên

men Việt Nam Nó là vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ và có thể lên men các đường riboza, galactoza, glucoza, fructoza,

maltoza, saccaroza, lactoza Lactobacillus fermentum là vi khuẩn có lợi cho sức khỏe

con người và động vật Chúng có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột non, kháng các vi sinh vật gây bệnh, kháng vi nấm và ức chế các tế bào ung thư Ngoài

ra Lactobacillus fermentum còn có khả năng phân giải Demorphin, Gluten Exorphin C,

và -Casomorphin-7 là các peptide gây kích thích hệ thần kinh, là ba trong số các chất gây bệnh tự kỷ ở trẻ em [10] [6]

 L diacetilacte, Str Citrovonus, sản phẩm tạo ra của các loại này ngoài acid

lactic, CO2, còn có các chất tạo mùi như este, diacetyl, làm cải thiện hương vị của sản phẩm Nhiệt độ thích hợp phát triển là 25 ÷ 30 oC Chúng có khả năng lên men được muối của acid citric [19]

1.4 Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao

1.4.1 Cấu tạo hạt ca cao

Hạt gồm có 2 phần cơ bản: vỏ lụa bao quanh bên ngoài, hai lá mầm và phôi nhỏ

ở bên trong hạt Lá mầm là nơi chứa chất dinh dưỡng của hạt Vỏ lụa không bị các phân tử có khối lượng lớn ngấm qua (acid citric, polyphenol, alkaloid) Tuy nhiên các phân tử nhỏ rất dễ bay hơi: ethanol, acid acetic Chúng có thể ngấm vào bên trong một cách dễ dàng

Lá mầm được tạo nên từ các thành phần cơ bản như các tế bào chứa lipid, protein, tinh bột và các tế bào chứa polyphenol có màu tía, với dạng như mô mềm huyết tương tạo thành một mạng lưới giữa hai loại tế bào

Hình 1.5 : Cấu tạo hạt ca cao

[2] 1.4.2 Biến đổi sinh hóa

 Lên men là khâu quan trọng nhất trong ngành trồng và chế biến ca cao, nhằm thủy phân phần cơm bao bọc xung quanh hạt ca cao và làm chết mầm hạt [17] hoặc diệt chất phôi nha để hạt không còn nẩy mầm được nữa [28] Do đó lên men ca cao giúp khởi đầu những phản ứng sinh hóa xảy ra bên trong tử diệp hay nội nh , góp phần làm giảm vị đắng, chát và tạo các tiền chất của hương thơm ca cao [16]

Hình 1.6 Biến đổi sinh hóa và quá trình khuếch tán trong cơm nhầy và trong hạt với quá trình

lên men ca cao

[11]

 Biến đổi sinh hóa xảy ra trong lên men thường xảy ra theo 2 quá trình:

o Quá trình thứ nhất bao gồm sự phân giải yếm khí các chất nhầy chứa đường, bột của cơm nhầy xung quanh hạt Theo Schwan, R.F (1998) cơm nhầy chứa

14 % đường, 1,5 % pectin và pH thấp 3,5 nhờ có mặt của acid citric là môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men, dưới tác động của nấm men các chất đường của cơm hạt thành rượu C2H5OH và phóng thích CO2 Sau đó tế bào của cơm hạt tan

vỡ, nước thoát hết làm môi trường trở nên thông thoáng hơn, vi khuẩn Acetobacter tác

động và phát triển mạnh, oxi hóa C2H5OH thành CH3COOH làm tăng nhiệt độ của khối ca cao Đến ngày thứ 3, giữa vi khuẩn acetic và nấm men đã có sự cân bằng rõ rệt, vi khuẩn lactic chỉ hoạt động trong thời gian rất ngắn Dưới tác động của sự lên men ấy, nhiệt độ tăng và lệ thuộc vào kích thước khối ca cao ủ

o Quá trình thứ hai là sự lên men bên trong bao gồm một loạt phản ứng phức tạp, các tử diệp co rút lại từ áo hạt và biến đổi màu sắc, bên cạnh đó nhiệt độ tăng làm chết phôi hạt và từ đó bắt đầu các phản ứng lên men phôi nh Nhiệt độ từ 440

C -

470C đạt trong phạm vi 48 h được coi là tốt Rohan cho biết nhiệt độ tăng ở lớp trên của khối ca cao hơn là ở lớp giữa và hiệu số càng cao khi khối ủ càng lớn [28] Quá trình này diễn ra có mãnh liệt hay không phụ thuộc vào hàm lượng acid acetic và acid lactic trong quá trình lên men lớp cơm nhầy Khi các acid này thấm vào nội nh sẽ gây

ra hiện tượng phá vỡ thành tế bào Trong nội nh của hạt ca cao có 2 loại tế bào chính

là tế bào chứa các sắc tố polyphenol (tế bào màu tím) và tế bào chứa bơ ca cao protein

và các enzyme (tế bào trắng), khi thành các tế bào này bị phá vỡ thì các hợp chất bên trong có điều kiện tiếp xúc với nhau, dưới tác dụng của enzyme thủy phân như invertase, glycosidases, protease thì các phản ứng sinh hóa xảy ra, sản phẩm của phản ứng này là các đường khử (đường đơn), aminoacid, peptide, acid b o tự do, polyphenol, sterol Các chất này lại chính là nguyên liệu để tạo nên hương vị đặc trưng của chocolate thông qua các phản ứng Maillar, phản ứng oxy hóa, quá trình caramen hóa khi tiến hành rang ở nhiệt độ 115 - 1450C [4]

 Cùng với quá trình dịch chuyển acid vào trong hạt thì c ng có quá trình khuếch tán các chất bên trong hạt ra bên ngoài như cafein, theobromine để làm giảm vị đắng của hạt, các polyphenol để làm giảm vị chát của hạt

 Các acid dịch chuyển vào bên trong hạt để tạo nên các phản ứng sinh hóa, các phản ứng thay đổi màu sắc, hương vị chocolate của hạt, nhưng một khía cạnh khác cần phải quan tâm đó là sau khi lên men vẫn còn một lượng lớn acid còn lưu lại trong hạt

và tạo vị chua cho sản phẩm Các acid này một phần sẽ mất đi trong quá trình phơi sấy

do bay hơi (chủ yếu là acid acetic), do dịch chuyển theo hơi ẩm (chủ yếu là acid lactic)

 Hàm lượng polyphenol và alkaloid có trong hạt ca cao tươi phụ thuộc vào mùa

vụ Trong quá trình lên men epicatechin và theobromine khuếch tán ra khỏi lá mầm vì vậy hàm lượng của chúng giảm, polyphenol bị oxy hóa và ngưng tụ Lượng polyphenol còn lại sẽ tạo vị se đắng cho chocolate thành phẩm [4]

 Các hợp chất methylxanthines caffeine, theobromine, polyphenolic, proanthocyanidins và flavan-3-ols (epicatechin và catechin), tạo vị đắng và vị chát cho hạt ca cao Tuy nhiên, trong quá trình lên men vị đắng và vị chát bị giảm đáng kể do

có sự khuếch tán các alkaloid (giảm 30%) và polyphenol (giảm 20%) ra môi trường bên ngoài [4]

 Trong quá trình bảo quản, protein bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme endoprotease aspartic và carboxypeptidase trong điều kiện pH và nhiệt độ tối thích khác nhau hình thành các oligopeptide ưa nước và các gốc acid amin kị nước tự do Đường sacarose bị thủy phân tạo thành glucose và fructose do hoạt động của enzyme invertase trong lá mầm [4]

1.4.3 Biến đổi về nhiệt độ

 Trong nghiên cứu của Michael (2001), nhiệt độ khối lên men tăng từ 25o

C lên

50oC trong quá trình lên men, sự gia tăng hơn 20oC của khối lên men có tác động vô cùng lớn đến hoạt động của enzyme Nếu nhiệt độ tăng thấp thì hoạt động của enzyme giảm, dẫn đến các hợp chất sinh hương hình thành ít, chúng làm cho hương vị chocolate sau này kém [17]

 Theo nghiên cứu của Nielsen và cộng sự (2007), nhiệt độ của khối lên men tăng

từ 28oC (bắt đầu lên men) đến 46 - 48oC ở giai đoạn giữa và cuối quá trình lên men Nhiệt của khối lên men tăng do trong quá trình chuyển hóa các chất có sinh nhiệt lượng Đối với các khối lên men cần tiến hành đảo trộn trước 48 h để tạo điều kiện cho quá trình chuyển hóa đường và acid acetic [4]

1.4.4 Biến đổi pH của khối lên men

 Lúc bắt đầu lên men pH của khối lên men là 3,7 - 3,9, ở cuối quá trình lên men

pH tăng lên 4,8 - 4,9, trong khi pH của hạt giảm từ 6,3 - 6,5 xuống 5,0 - 5,1 pH thay

đổi là do vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic sinh ra các acid hữu cơ ngấm vào bên trong hạt [1]

 Nếu pH lá mầm có hàm lượng acid cao quá sớm (pH < 4,5), nó sẽ làm giảm các hợp chất tiền sinh hương và cho hàm lượng acid bên trong hạt ca cao sau lên men cao [1]

 Như thế nếu hàm lượng acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men thấp, pH của

lá mầm không phù hợp với hoạt động tối thích của enzyme, nó làm ảnh hưởng đến hương vị cuối cùng của hạt ca cao Tuy nhiên nếu hàm lượng acid quá cao chúng sẽ ảnh hưởng đến hương vị của chocolate [17]

1.4.5 Biến đổi màu sắc hạt

 Biến đổi sinh hóa xảy ra bên trong lá mầm trong suốt quá trình lên men hạt ca cao là nguyên nhân làm thay đổi cấu trúc polyphenol Anthocyanin, polyphenol là những hợp chất tạo màu tía (đỏ và lam) cho hạt ca cao trước khi lên men Trong quá trình lên men, chúng bị thủy phân tạo thành anthocyanidin, galactose và arabinose [7]

 Các polyphenol oxidase chuyển hóa các polyphenol (chủ yếu là epicatechin và anthocyanidin tự do) thành các quinon Polyphenol và quinon tạo hợp chất với các polyphenol khác, với protein và các peptid làm giảm vị chát và làm biến đổi màu của hạt sau lên men thành màu nâu [4]

 Cơ chế để chuyển từ màu tía sang màu nâu phụ thuộc vào mức độ của quá trình lên men Kết quả cắt hạt là cơ sở để đánh giá mức độ lên men Phân tích kết quả cắt hạt, hạt ca cao có 50 % hoặc hơn 50 % có màu tía thì được xếp vào nhóm dưới mức lên men Những hạt này có vị chát (se đầu lưỡi) và vị đắng rất cao, bên cạnh đó các hợp chất tạo hương thơm cho hạt rất thấp Do vậy những hạt này không được dùng để sản xuất chocolate [7]

 Bên cạnh những biến đổi về màu sắc hạt trong quá trình lên men thì các hợp chất tiền sinh hương c ng được tạo thành trong quá trình này và quá trình sấy khô [17] Do đó, cần phải có sự cân bằng giữa thời gian của quá trình lên men, yếu tố môi trường bên ngoài, và hoạt động của vi sinh vật, hoạt động của enzyme lên lá mầm của hạt Hơn nữa, sự không đồng nhất giữa lên men khối lớn và khối nhỏ, sự khác nhau về

số lượng vi sinh và hàm lượng đường có trong quá trình lên men có thể tạo nên các hợp chất tiền sinh hương nhất định trong hạt ca cao Điều này có thể tạo nên một sự

khác biệt lớn đối với hương vị chocolate hình thành kiểm soát quá trình lên men là có thể kiểm soát được hương vị của chocolate [17]

 Chất lượng hạt ca cao sau lên men có thể được kiểm tra bằng cách cắt kiểm tra

sự thay đổi màu sắc của lá mầm trong suốt quá trình lên men [4]

1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về lên men ca cao

1.5.1 Những nghiên cứu trong nước

 Phan Thanh Bình và cộng sự (2010), Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên - nghiên cứu “Bước đầu sử dụng chế phẩm Ultrazyme AFPL có chứa enzyme pectinase vào quá trình lên men hạt ca cao” nhằm mục đích nhằm làm giảm hàm lượng cơm nhầy, tăng nhanh quá trình lên men hiếu khí, làm giảm lượng acid lactic và từ đó giảm độ chua trong hạt Kết quả cho thấy liều lượng sử dụng chế phẩm enzyme Ultrazyme AFPL tốt nhất là 80 ppm/khối lượng hạt tươi, thời điểm bổ sung enzyme tốt nhất và thuận lợi nhất là khi bắt đầu quá trình lên men [18]

 Nghiên cứu của Vương Thanh Tùng và Hà Thanh Toàn (2006) đã tiến hành khảo sát chất lượng hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên, những biến đổi sinh hoá và một số các vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men Kết quả cho thấy hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên c ng có chất lượng chấp nhận được nhưng không đồng đều giữa các lớp trong khối ủ, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết Đây là một chuỗi các quá trình lên men của các nhóm vi sinh vật nối tiếp nhau Đầu tiên là sự phát triển của nấm men, tiếp theo là vi khuẩn, cuối cùng là sự phát triển của một số nấm sợi trên bề mặt của khối ủ Chất lượng hạt ca cao sau lên men tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ lên men ở 40 0C, độ ẩm nguyên liệu là 82% và thời gian lên men trong 7 ngày [29]

 Nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm, Trần Xuân Ngạch, Lê Thị Liên Thanh (2003) Trường Đại Học Kỹ Thuật, Đại Học Đà N ng về “Nghiên cứu phân lập và định tên một số nòi nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao” cho thấy dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, sinh lý của khuẩn lạc và tế bào nấm men rồi So sánh với khóa phân loại nấm men, dự đoán tên của 4 loài nấm men phân

lập được như sau Hansenia spora uvarum, Galactomyces reessii, Candida sorboxylosa, Candida fructus [23]

 Nghiên cứu của Phan Thanh Bình, Nguyễn Văn Thường, Nguyễn Duy Thịnh (2008) về “Đánh giá một số yếu tố trong quá trình lên men ảnh hưởng đến chất lượng

hạt ca cao khô” có một số yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lên men ca cao được kiểm tra bao gồm nhiệt độ, thời gian lên men, mức độ thông khí và thời gian lưu quả Kết quả cho thấy: trong thử nghiệm lần 1, nhiệt độ và thời gian lên men có ảnh hưởng đến chất lượng hạt ca cao, việc xử lý ở nhiệt độ 50 0C trong 6 ngày lên men Kết quả tỷ lệ hạt nâu thu được là 71,7%, pH = 5,62, độ acid chung (TA) 0,75ml, NaOH 0,1N/g, mùi

vị bình thường Thử nghiệm lần 2 cho thấy thời gian lưu quả và đảo hạt có ảnh hưởng đến chất lượng của hạt ca cao Phương pháp xử lý lưu quả 9 ngày và đảo hạt 2 lần trong quá trình lên men tốt hơn các phương pháp khác với tỷ lệ hạt nâu: 79,7%, hạt mốc: 1%, pH = 5,41, TA = 0,63ml NaOH 0,1 N/g, mùi vị tốt hơn thử nghiệm 1 Khuyến nghị phương pháp lên men là 9 ngày lưu quả, nhiệt độ môi trường 500

C, 6 ngày lên men, đảo hạt 2 lần trong 6 ngày [18]

1.5.2 Những nghiên cứu ngoài nước

 Rosane Freitas Schwan (1998) với “Quá trình lên men ca cao với dịch cocktail

có lượng vi sinh vật xác định ” Lên men trong những thùng gỗ theo bốn phác đồ thử nghiệm: hạt lên men tự nhiên với vi khuẩn, hạt được vô trùng, và loại hạt tiêm một loại cocktail có chứa vi sinh vật ở nồng độ thích hợp vào thời điểm ban đầu hoặc bổ sung theo từng giai đoạn thích hợp Các loại cocktail được sử dụng bao gồm nấm men

Saccharomyces cerevisiae var.chevalieri, hai loài vi khuẩn lactic Lactobacillus lactis

và Lactobacillus plantarum, và hai loài vi khuẩn axetic Acetobacter acetic và Gluconobacter oxydans subsp.suboxydans Các thông số đo gồm số lượng tế bào, hàm

lượng đường, ethanol, acid acetic, và thành phần acid lactic (bao gồm các axit hữu cơ khác), pH, và nhiệt độ Một thử nghiệm cắt để kiểm tra chất lượng hạt và phân tích cảm quan của sô cô la được làm từ những hạt đó được thực hiện Quá trình lên men tự nhiên tuân theo chính xác các điều kiện trong thùng 800 kg ở các trang trại Thời gian lên men gần giống như quá trình lên men tự nhiên Quá trình lên men với các chủng theo từng giai đoạn[16]

 Các công trình nghiên cứu trước đây về vi sinh vật cho rằng chủng cocktail phải bao gồm một hoặc nhiều đại diện của ba nhóm: nấm men, vi khuẩn lactic và các vi khuẩn acetic Các loài nấm men phải có khả năng lên men cao và chứa các enzyme

pecti-nolytic Nấm men S cerevisiae var chevalieri được chọn kể từ khi loài S cerevisiae là nấm men chiếm ưu thế và giống này đặc biệt sản xuất pectinaza, có thể

lên men tất cả các loại đường ở pH 3,5 đến 4,2, sinh ethanol khởi đầu của quá trình lên

men tự nhiên Vài thí nghiệm sơ bộ đã được thực hiện để xác định liều lượng chủng tạo ra ethanol tương tự quá trình lên men bình thường (hộp A), và chủng ban đầu có chứa 1010

tế bào / g gồm L lactis và L plantarum,đại diện của các vi khuẩn lactic Nó

có thể lên men một số lượng lớn các loại đường được tìm thấy trong cây và chịu được

nồng độ acid (pH = 3.5) Liều lượng Lactobacillus được sử dụng 10 7 tế bào / g chất khô, tương đương với thời gian 24 h trong quá trình lên men tự nhiên.Các vi khuẩn

acetic được sử dụng A aceti và G oxydans subsp suboxydans được tìm thấy trong tất

cả các quá trình lên men ca cao trước đó, hiện diện khi ethanol 6,0%, mà không đặc trưng khi phân lập và có thể chịu đựng nhiệt độ 45°C ở độ pH 3,5 Còn vi khuẩn acetic được sử dụng 10 8

tế bào / g chất khô, tương đương với 48 giờ lên men tự nhiên

 Theo nghiên cứu của Aran H-Kittikun, Soawaluck Jitbunjerdkul và Niyom Kam1angdee Trường Đại học Hoàng tử Songkla (1995) về “Vai trò của VSV trong quá trình lên men ca cao ” với thí nghiệm lên men hạt ca cao loại bỏ chất nhầy sử dụng

3 nhóm vi khuẩn: nấm men, vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Dùng hạt ca cao ở miền Nam Thái Lan Môi trường được dùng là thạch PDA và DSM Pha loãng đến 10 CFU/

ml trước khi cho và dịch ca cao Lên men 50 kg hạt trong thùng gỗ thời gian là 4 ngày Kết quả nấm men phát triển mạnh trong giai đoạn đầu tạo alcohol, este glycerol Vi khuẩn lactic đạt tối đa sau 1 ngày lên men.Vi khuẩn acetic đạt tối đa sau 3 ngày lên men Nó phát triển trong diều kiện hiếu khí khi chất khô bị phân hủy tạo acid dễ bay hơi, giảm độ pH dịch lên men Cả 3 thí nghiệm cho thấy pH chất khô tăng từ 4,10 đến 4,50 - 4,75 trong khi trung tâm giảm độ pH từ 6,3 xuống còn 5,30 - 5,75 Hàm lượng acid tổng số, acid lacticvà axit dễ bay hơi gia tăng trong quá trình lên men Hàm lượng saccarose ở hạt từ 0,58% xuống 0,24% và chất khô từ 12,2% giảm 0,75% Rõ ràng có

sự chuyển hóa hoàn toàn đường ở lớp chất khô, còn phần hạt thì giảm nhẹ [9]

 Theo Ardhana và Fleet (2003) có khoảng 124 loài hiện diện trong quá trình lên men ca cao Tùy số lượng vi sinh vật từng vùng, từng quốc gia khác nhau nên quá trình lên men c ng khác nhau.Số tế bào hiếu khí tăng từ 6,1 x 106

CFU đến tối đa 4,2

x 107 CFU/ g chất khô sau lên men 48h Đối với nấm men max 6,1 x 107 CFU/ g sau

24 h Vi khuẩn lactic và acetic là 7,3 x 107 và 1.5 x 108 CFU /g chất khô trong 48 h

[13]

 Theo Dzogbefiaa, Buamaha và Oldhama (1999) với “Kiểm soát sự lên men ca

cao (ca cao L Theobroma) bằng cách sử dụng nấm men: dùng chế phẩm enzym và liên

kết lý hóa thay đổi trong ủ ca cao” Có thể thúc đẩy quá trình ủ ca cao bằng cách dùng một số chủng nấm men làm chủng khởi động cho quá trình lên men [5]

 Miller và cộng sự (2006) khi nghiên cứu về “ Sự hoạt động của các chất chống oxi hóa và hàm lượng polyphenol, procyanidin trong sản phẩm có chứa ca cao & socola ở Mỹ” đã tiến hành khảo sát về các loại thực phẩm thương mại s n có tại Mỹ có chứa ca cao và sô-cô-la để xác định chất chống oxy hóa và polyphenol, procyanidin bao gồm: ca cao tự nhiên, sô cô la nướng không đường, sô-cô-la đen, khoai tây chiên nướng hơi ngọt, sô-cô-la sữa, và sô-cô-la xirô Mẫu tổng hợp được đặc trưng bằng cách sử dụng bốn phương pháp khác nhau: khả năng hấp thu gốc tự do oxy (ORAC), hàm lượng vitamin C tương đương lượng chất chống oxy hóa (VCEAC), polyphenol

và procyanidin Kết quả có sự tương quan tuyến tính giữa ca cao rắn không b o (NFCS) và ORAC (R2 = 0,9849), polyphenol (R2 = 0,9793), và procyanidin (R2 = 0,946) Khảo sát c ng cho thấy rằng, bất kể loại sản phẩm nào, NFCS là yếu tố chính góp phần vào mức độ chất chống oxy hóa ca cao [14]

2 CHƯƠNG 2: VẬT IỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

 Quả và hạt ca cao (Theobroma) mua từ các tỉnh miền Tây Chọn quả chín,

không dập nát, hư hỏng

 Chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus fermentum: được phân lập từ ca cao lên

men theo quy trình của Th.s Võ Thị Mỹ Lộc (2012)

 Bột đậu nành: Chọn hạt đậu nành không bị mốc, hư hỏng sau đó tiến hành rang xay

 Đường Glucose tinh khiết đạt chất lượng thực phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát

Chủng

Nuôi tăng sinh

Tạo chế phẩm VSV (1 chủng)

Lên men

Làm khô Hạt ca cao

Kiểm tra chất lượng hạt

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp trong quy trình sản xuất

chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic

 Chọn thời gian nhân giống là 48h, nhiệt độ nhân giống cố định là 38 ± 2o

C, các thông số cần nghiên cứu là:

 Tiến hành: Chủng lactic Lactobacillus fermentum sau khi phân lập tiến hành

nhân giống cấp 1 tăng sinh khối Sau đó, lấy 10% (w/w) vi khuẩn lactic bổ sung vào môi trường vỏ ca cao (vỏ thịt) đã thanh trùng chứa bột đậu nành (bố trí thí nghiệm với bước nhảy Δ ح = 0,2 %), 11% glucose Sau đó tiến hành nhân giống (cấp 2) ở pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ 38 ± 2o

C trong 48 h Xác định mật độ vi khuẩn lactic,

so sánh, chọn hàm lượng bột đậu nành có khả năng nhân lượng vi khuẩn lactic lớn nhất

2.2.2.2 Bố í í ệ x đị ượ đườ glucose

 Mục đích: chọn hàm lượng thích hợp để đảm bảo lượng vi khuẩn lactic trong nhân giống

 Tiến hành: Chủng lactic Lactobacillus fermentum sau khi phân lập tiến hành

nhân giống cấp 1 tăng sinh khối Sau đó, lấy 10% (w/w) vi khuẩn lactic bổ sung vào môi trường vỏ ca cao (vỏ thịt) đã thanh trùng chứa 1,2% bột đậu nành, glucose (bố trí thí nghiệm với bước nhảy Δ ح = 2 %) Sau đó tiến hành nhân giống (cấp 2) ở pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ 38 ± 2o

C trong 48 h Xác định mật độ vi khuẩn lactic,

so sánh, chọn hàm lượng đường có khả năng nhân lượng vi khuẩn lactic lớn nhất