Đánh giá vai trò của vi khuẩn vibrio với hiện tượng ngao meretrix sp chết hàng loạt tại một số tỉnh phía bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG --- NGUYỄN THN HUYỀN ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN Vibrio VỚI HIỆN TƯỢNG NGAO Meretrix sp CHẾT HÀNG LOẠT TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -

NGUYỄN THN HUYỀN

ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN Vibrio

VỚI HIỆN TƯỢNG NGAO Meretrix sp CHẾT HÀNG LOẠT

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA– 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -

NGUYỄN THN HUYỀN

ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN Vibrio

VỚI HIỆN TƯỢNG NGAO Meretrix sp CHẾT HÀNG LOẠT TẠI

MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Huyền

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng ban trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài

Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của TS Ngô Anh Tuấn - Trường Đại học Nha Trang và TS Bùi Quang Tề - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 những người định hướng và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành tốt đề tài Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ths Bùi Ngọc Thanh cùng các anh chị Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 - Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong trường Đại học Nha Trang, trong suốt hai năm học tại trường, tôi đã nhận được sự dạy

dỗ, dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo trong trường

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp những người đã góp ý chân thành, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, các anh chị em đã luôn cổ vũ, động viên con trong những lúc khó khăn nhất giúp con có thêm nghị lực để có được ngày hôm nay

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2015

Nguyễn Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại vi khuNn Vibrio 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Đặc tính phân bố và nuôi cấy 5

1.1.4 Đặc tính sinh hóa 5

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 7

1.2.1 Bệnh do vi khuNn Vibrio gây ra trên thế giới 7

1.2.2 Vai trò của nhiệt độ và độ mặn 9

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

1.3.1 Hiện trạng nghề nuôi ngao ở nước ta Error! Bookmark not defined 1.3.2 Tình hình dịch bệnh trên ngao do vi khuNn Vibrio sp tại Việt N am 12

1.3.3 Tình hình dịch bệnh trên ngao do ký sinh trùng Perkinsus tại Việt N am 13

1.3.4 N hiệt độ, độ mặn 14

CHƯƠN G 2: PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CỨU 16

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 16

2.2 N ội dung nghiên cứu 16

2.3 Vật liệu nghiên cứu 16

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.3.2 Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu 16

2.3.3 Môi trường, hóa chất phục vụ nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 18

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuNn 18

2.4.3 Phương pháp đếm mật độ vi khuNn 23

2.4.4 Phương pháp gây nhiễm các chủng vi khuNn Vibrio sp ………Error! Bookmark not defined.23 2.4.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 29

CHƯƠN G 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập vi khuNn trên ngao 30

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuNn trên ngao tại 4 tỉnh……… 30

3.1.2 Kết quả phân lập vi khuNn trên ngao khỏe và ngao bệnh tại các tỉnh… 34

3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuNn phân lập được………… 36

3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuNn V parahaemolyticus ……….37

3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuNn V parahaemolyticus ………… 38

3.2.3 Kết quả kiểm tra độc lực của các vi khuNn - điều kiện đa nhân tố ……… 39

CHƯƠN G 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……… 43

4.1 Kết luận 43

4.2 Đề xuất 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

: Đối chứng : Động vật thủy sản : Giờ

: N ước oxy già : Miligam/ lít : Mililít : Muối N atri : N atri hiđroxit : N ghiệm thức : Động vật thân mềm hai vỏ : N uôi trồng thủy sản : Phosphate buffered saline : N hiệt độ

: Tế bào/ lít : Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar : Tryptic Soy Agar

: Phần trăm : Phần nghìn : Độ C

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của một số loài Vibrio spp là tác nhân gây bệnh ở động

vật thuỷ sản 6

Bảng 1.2 Tỷ lệ cảm nhiễm vi khuNn trên một số động vật thân mềm hai vỏ … ……13

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuNn trên ngao nuôi 30

Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ nhiễm vi khuNn trên ngao nuôi tại N am Định 34

Bảng 3.3: Thành phần và tỷ lệ nhiễm vi khuNn trên ngao nuôi tại Hải Phòng 35

Bảng 3.4: Thành phần và tỷ lệ nhiễm vi khuNn trên ngao nuôi tại Thái Bình 35

Bảng 3.5: Thành phần và tỷ lệ nhiễm vi khuNn trên ngao nuôi tại Thanh Hóa 36

Bảng 3.6: Khả năng gây chết ngao của vi khuNn Vibrio parahaemolyticus trongđiều kiện đơn nhân tố (%) 37

Bảng 3.7: Khả năng gây chết ngao của vi khuNn V alginolyticus trong điều kiện đơn nhân tố (%) 39

Bảng 3.8: Khả năng gây chết ngao của hai loại vi khuNn V alginolyticus và V parahaemolyticus ở điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰ 410

Bảng 3.9: Khả năng gây chết ngao của hai loại vi khuNn V alginolyticus và V parahaemolyticus ở điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰ 401

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuNn V parahaemolyticus 4

Hình 1.2 Vi khuNn V vulnificus 4

Hình 1.3 Vi khuNn V harveyi 4

Hình 1.4 Vi khuNn V alginolyticus 5

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 18

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập vi khuNn trên ngao 22

Hình 2.3 N ghêu M lyrata 22

Hình 2.4 Phân lập vi khuNn Vibrio trên ngao 23

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của vi khuNn lên ngaoError! Bookmark not defined.5 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm vi khuNn cho ngao trong điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰ 27

Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm vi khuNn cho ngao trong điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰ 28

Hình 3.1 Hình thái khuNn lạc vi khuNn Vibrio parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc TCBS và môi trường thạch máu 32

Hình 3.2 Kết quả thử kít API 20E định danh vi khuNn Vibrio parahaemolyticus

Error! Bookmark not defined.2 Hình 3.3 Kết quả phản ứng sinh hóa của V parahaemolyticus trên môi trường O/F 33

Hình 3.4 Hình dạng vi khuNn Vibrio parahaemolyticus (nhuộm gram) 33

Hình 3.5 Kết quả phản ứng sinh hóa của V alginolyticus trên môi trường O/F 33

Hình 3.6 Kết quả phản ứng sinh hóa của V alginolyticus trên kít API 20E 34

Hình 3.7.Hình thái khuNn lạc vi khuNn V alginolyticus khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc TCBS và hình dạng vi khuNn V alginolyticus (nhuộm gram) 34

Hình 3.8 Khả năng gây chết ngao của vi khuNn Vibrio parahaemolyticus trong điều kiện đơn nhân tố………38

Hình 3.9 Khả năng gây chết ngao của vi khuNn V.alginolyticus trong điều kiện đơn nhân tố……….39

Hình 3.10 Khả năng gây chết ngao của hai loại vi khuNn V alginolyticus và V parahaemolyticus ở điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰ 420 Hình 3.11 Khả năng gây chết ngao của hai loại vi khuNn V alginolyticus và V.parahaemolyticus ở điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰

402

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (N TTS) đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh

tế đất nước nói chung

Bên cạch sự phát triển của nghề nuôi tôm, cá nước ngọt và nghề nuôi cá biển thì nghề nuôi động vật thân mềm hai vỏ (ĐVTMHV) cũng dần khẳng định được vai trò to lớn của mình trong đó ngao là một trong những đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ được nuôi chủ lực ở hầu hết các tỉnh ven biển Bắc bộ và khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long với diện tích nuôi và sản lượng ngày càng tăng do có những điều kiện thuận lợi như: Diện tích bãi triều rộng, điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển nuôi ngao và người dân đã có kinh nghiệm nuôi ngao, bước đầu đã chủ động sản xuất được con giống đáp ứng yêu cầu nuôi của một số địa phương

Tuy nhiên trong những năm gần đây hiện tượng ngao thương phNm chết hàng loạt tại nhiều tỉnh đã xảy ra gây ra tổn thất nghiệm trọng N hận thấy tình hình ngao chết hàng loạt đang đe dọa lớn đến sinh kế của hàng triệu người dân các tỉnh ven biển

Bộ N ông nghiệp và Phát triển N ông thôn đã giao Viện nghiên cứu N uôi trồng thủy sản

1 thực hiện đề tài ―N ghiên cứu các biện pháp kỹ thuật và quản lý nhằm góp phần

ổn định nghề nuôi nghêu thương phNm ở Việt N am trong 3 năm từ 2012 -2014 Do đó trong khuôn khổ đề tài chúng tôi sẽ làm rõ một số nội dung nghiên cứunhằm xác định được hiện trạng dịch bệnh và tác nhân gây chết ngao hàng loạt tại một số tỉnh miền Bắc Việt N am

Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định vai trò của vi khuNn Vibrio spp trong hiện tượng ngao Meretrix sp chết hàng loạt tại một số tỉnh phía Bắc Việt N am

Phương pháp nghiên cứu của đề tài như sau:

+Phương pháp phân lập và giám định vi khuNn dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh

vi khuNn ở động vật thuỷ sản của Frerichs và Millar (1983, 1993) và Whitman (2004)

+ Phương pháp xác định mật độ vi khuNn: bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng OD600nm

+Thí nghiệm bố trí với 3 thí nghiệm bao gồm:

Thí nghiệm 1: gây nhiễm vi khuNn đơn nhân tố;

Thí nghiệm 2: gây nhiễm vi khuNn đa nhân tố ở nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰; Thí nghiệm 3: gây nhiễm vi khuNn đa nhân tố ở nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰ Với phương pháp nghiên cứu trên chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:

+ Phân lập và giám định vi khuNn : Xác định được 14 chủng vi khuNn Vibrio hiện diện trên mẫu ngao có hiện tượng chết hàng loạt đó là: vi khuNn V parahaemolyticus, V vulnificus, V alginolyticus, V tubiashii, V splendidus, V tapetis, V harveyi, V fisherii, V icthyoenterii, V ordalii, Vibrio sp, V fluvialis, V logei, V agarivorans Trong đó các chủng vi khuNn V parahaemolyticus và V alginolyticus chiếm tỷ lệ cao

nhất lần lượt là 16,3% và 12,5% Các chủng vi khuNn còn lại chiếm tỷ lệ nhiễm thấp từ 0,2-7,2%

+ Kết quả gây nhiễm ở điều kiện đơn nhân tố với tác nhân vi khuNn là V parahaemolyticus và V alginolyticus; nhiệt độ và độ mặn thích hợpngao bắt đầu chết

ở ngày thứ 4 và ngày thứ 10 nhưng với tỷ lệ chết không cao ở nồng độ vi khuNn cao

108 cfu/ml, ở nồng độ vi khuNn 106 cfu/ml và 104 cfu/ml ngao không chết

+ Kết quả gây nhiễm ở điều kiện gây nhiễm đa nhân tố với tác nhân vi khuNn là V parahaemolyticus và V alginolyticus; nhiệt độ 35°C và 33°C, độ mặn 35‰ và 33‰

ngao bắt đầu chết ở ngày thứ 3 và thứ 6 với tỷ lệ chết từ 80-100%;ngao chết 100% ở

ngày thứ 8 với tác nhân vi khuNn là V parahaemolyticus và V alginolyticus ở nhiệt độ 35°C, độ mặn 35‰ và chết 100% ở ngày thứ 14 với tác nhân V alginolyticus ở nhiệt

độ 33°C, độ mặn 33‰

Kết luận: Qua phân tích kết quả gây cảm nhiễm nhân tạo ở điều kiện đơn và đa nhân

tố, chúng tôi đã xác định vi khuNn Vibrio có ít vai trò với hiện tượng ngao chết hàng

loạt tại một số tỉnh phía Bắc Việt N am Với những nghiên cứu trên chúng tôi thấy rằng ngoài yếu tố tác nhân vi khuNn thì yếu tố môi trường (nhiệt độ và độ mặn cao) đóng vai trò không nhỏ đến hiện tượng ngao chết hàng loạt

Kiến nghị:

- N gao chết cần phải được thu gom chuyển ra những khu vực xa bãi nuôi để tránh hiện tượng lây lan và gây ô nhiễm môi trường Đối với ngao kích cỡ thương phNm có thể thu hoạch được cần tiến hành thu hoạch nhằm hạn chế thiệt hại

- Đối với ngao kích cỡ nhỏ chưa thu hoạch được cần san thưa và chủ động di rời tới những bãi nuôi dự phòng được cho là có điều kiện thuận lợn hơn cho sự sinh trưởng

và phát triển của ngao

Từ khóa: Vibrio sp, V parahaemolyticus, V alginolyticus, ngao Meretrix sp

Bên cạch sự phát triển của nghề nuôi cá nước ngọt, nghề nuôi cá biển thì nghề nuôi động vật thân mềm hai vỏ (ĐVTMHV) cũng dần khẳng định được vai trò to lớn của mình trong đó ngao là một trong những đối tượng động vật thân mềm được nuôi chủ lực ở hầu hết các tỉnh ven biển Bắc bộ và khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long với diện tích nuôi và sản lượng ngày càng tăng do có những điều kiện thuận lợi như: Diện tích bãi triều rộng, điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển nuôi ngao và người dân đã

có kinh nghiệm nuôi ngao, bước đầu đã chủ động sản xuất được con giống đáp ứng

yêu cầu nuôi của một số địa phương Hiện tại có 3 loài ngao thuộc giống Meretrix đang được nuôi phổ biến là nghêu Bến Tre M lyrata, ngao dầu M meretrix, ngao vân

M lusoria

Tuy nhiên, trong những năm gần đây hiện tượng ngao thương phNm chết hàng loạt tại nhiều tỉnh đã xảy ra gây lên tổn thất nghiệm trọng Theo báo cáo của Chi cục Thủy sản Tiền Giang năm 2012, diện tích ngao chết trong toàn tỉnh từ năm 2010 đến nay là 1.195,8 ha, ước tính thiệt hại khoảng 220,318 tỷ đồng Tại tỉnh Bến Tre, tổng diện tích ngao chết trên toàn tỉnh năm 2011 khoảng 1.560 ha, ước tính thiệt hại trên

400 tỷ đồng (Chi cục N uôi trồng Thủy sản Bến Tre, 2011)

Theo báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh Thái Bình, trong tháng 4 năm 2012, trong tổng diện tích nuôi ngao trên địa bàn xã N am Thịnh khoảng 640 ha xuất hiện ngao chết

N ăm 2013 bệnh trên ngao đã xuất hiện ở 6 tỉnh với tổng diện tích bị bệnh là 1.560,69 ha bao gồm: Hải Phòng (102 ha), Thanh Hóa (155 ha), N ghệ An (2,5 ha), Tiền Giang (1.121,19 ha), Trà Vinh (60 ha) và Bạc Liêu (120 ha)

Vi khuNn Vibrio sp là tác nhân phân bố rộng khắp, hầu như chúng đều xuất hiện

trong các môi trường nuôi nước mặn lợ, gây bệnh phổ biến ở động vật thân mềm Các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới (Li Guo và ctv, 2008; Yue Xin và ctv, 2010; Yue Xin, 2011) đã cho thấy vi khuNn này có khả năng gây chết hàng loạt ngao nuôi Theo báo cáo của Chi cục Thú y Hải Phòng trong năm 2013, trong 222 mẫu thu được

từ đợt ngao chết hàng loạt tại Cát Hải, Hải Phòng có 162 mẫu phân lập được vi khuNn

V alginolyticus, V splendidus và V parahaemolyticus

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá vai trò của vi khuẩn Vibrio với hiện tượng ngao Meretrix sp chết hàng loạt tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” nhằm xác định được hiện trạng dịch bệnh và tác nhân gây chết ngao hàng loạt

tại một số tỉnh phía Bắc Việt N am từ đó có cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng trị

bệnh hợp lý trên ngao Meretrix sp nhằm giảm thiểu rủi ro cho người nuôi

Mục tiêu

Xác định vai trò của vi khuNn Vibrio sp trong hiện tượng ngao Meretrix sp chết

hàng loạt tại một số tỉnh phía Bắc Việt N am

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài sẽ xác định được các chủng vi khuNn nhiễm phổ biến trên ngao nuôi tại

Việt N am

Đề tài sẽ xác định được vi khuNn Vibrio sp có phải là tác nhân chính trong hiện tượng ngao Meretrix sp chết hàng loạt tại một số tỉnh phía Bắc Việt N am

Ý nghĩa thực tế của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để những người nuôi ngao có được các biện pháp quản lý để hạn chế hiện tượng ngao nuôi bị chết hàng loạt

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm phân loại vi khuẩn Vibrio

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae bao gồm hơn 100 loài và được phân vào 14

nhánh Vi khuNn tồn tại trong môi trường nước như ở cửa biển, nước ven biển và bùn Một lượng lớn các loài thuộc giống này sống cộng sinh hoặc gây bệnh ở các loài thủy sản biển như cá, giáp xác, động vật thân mềm Trong thập kỷ gần đây, 50 loài mới

trong giống Vibrio đã được phát hiện dựa trên những kỹ thuật sinh học phân tử mới

trong việc phân loại vi khuNn Bên cạnh đó, các nghiên cứu về môi trường cũng góp

phần làm tăng hiểu biết về họ Vibrionaceae.Vibrio crassostreae, V breoganii, V celticus là một số trong các loài mới được mô tả như một phần của hệ vi sinh vật của

nhuyễn thể Một vài trong số chúng gây chết ở các loài nhuyễn thể khác nhau Ở

nhuyễn thể hai mảnh vỏ, bên cạnh các loài Vibrio đã được biết rõ như V alginolyticus,

V harveyi, V mytili, V parahaemolyticus, V pectenicida, hay V vulnificus, hiện nay

19 loài mới đã được phát hiện trong giống Vibrio (Jesús L Romalde và cộng sự, 2014)

Hình 1.1.Vi khuẩn V parahaemolyticus

Nguồn: www.khoahoc.com.vn

Hình 1.2.Vi khuẩn V vulnificus

Nguồn: www.golbamboo.com

Hình 1.3.Vi khuẩn V harveyi

Nguồn: University of Wisconsin

Hình 1.4.Vi khuẩn V alginolyticus

Nguồn: wwwsoc.nii.ac.jp

1.1.3 Đặc tính phân bố và nuôi cấy

N goài tự nhiên vi khuNn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường nước biển,

vùng nước lợ ven biển, có thể tìm thấy chúng trong các tầng nước, vùi trong trầm tích

đáy hoặc bám trên bề mặt của các sinh vật sống trong vùng nước đó Vibrio là vi

khuNn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 20-30°C (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

Trong môi trường nuôi cấy tất cả các loài thuộc giống Vibrio đều cần N aCl để

phát triển, nồng độ muối cho phép trong môi trường nuôi cấy thường là 1 - 2 %

TCBS là môi trường chọn lọc của các loài Vibrio, sau 18 - 24h nuôi cấy hình

thành khuNn lạc với kích thước khoảng 2 - 5mm, có màu vàng (nếu lên men đường

sucrose) như V cholerae, V alginolyticus, V harveyi, V fluvialis hoặc xanh (nếu không lên men đường sucrose) như V parahaemolyticus, V vulnificus

1.1.4 Đặc tính sinh hóa

Các loài vi khuNn thuộc giống Vibrio đều yếm khí tuỳ tiện, hầu hết là oxy hoá và

lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với

Vibriostat (0/129) (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của một số loài Vibrio spp là tác nhân

gây bệnh ở động vật thuỷ sản Đặc điểm sinh hóa 1 2 3 4 5 6

Đặc điểm sinh hóa 1 2 3 4 5 6

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.2.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên thế giới

Guillard (1959) lần đầu tiên đã thông báo những bằng chứng về khả năng gây

chết ấu trùng ngao Mercenaria mercenaria (70%) của Vibrio sp Trong nghiên cứu

được thực hiện bởi Tubiash và ctv (1965) đã quan sát thấy một lượng lớn vi khuNn xuất hiện ở viền xung quanh của ấu trùng, và ngày càng dày lên và gây chết sau 8 giờ

do hoại tử tuyến Đây là nghiên cứu đầu tiên mô tả khái niệm hoại tử do trực khuNn gây ra cho nhiều loài động vật thân mềm Triệu chứng điển hình của hoại tử do trực

khuNn là sự kéo dài của miệng, giảm di chuyển hay di chuyển bất thường theo vòng

tròn xuất hiện sau 4-5 giờ phơi nhiễm với Vibrio sp Các loài V alginolyticus, V tubiashii và V anguillarum đã được xác định là tác nhân chính của bệnh hoại tử do

trực khuNn (Tubias và ctv, 1970; Tubias và Otto, 1986)

Elston và Leibovitz (1980) đã mô tả 3 nhóm bệnh sinh ở ấu trùng động vật thân

mềm nói chung gây ra bởi Vibrio spp được gọi là nhóm bệnh sinh I, II và III N hóm

bệnh sinh I gây bệnh ở tất cả các giai đoạn của ấu trùng, ấu trùng trở lên ít vận động do

sự xâm nhiễm vào màng áo và các khoang nội tạng N hóm bệnh sinh II tác động vào giai đoạn đầu của ấu trùng gây ra sự cản trở hoạt động bơi bình thường Ấu trùng biểu hiện hao mòn trước khi vi khuNn xâm nhập vào các cơ quan tiêu hóa N hóm bệnh sinh III tác động vào giai đoạn sau và như ở nhóm bệnh sinh I ấu trùng trở lên ít vận động Tuy nhiên, ở nhóm bệnh sinh III vi khuNn gây teo các cơ quan nội tạng và bệnh tích ở

các cơ quan tiêu hóa Các đặc điểm khác của bệnh do Vibrio sp ở ấu trùng là sự xuất

hiện của hiện tượng xuất hiện các “đốm” ở đáy bể do ấu trùng yếu đọng lại (Di Salvo

và ctv, 1978) Tất cả các nghiên cứu đã cho thấy các dấu hiệu điển hình gây ra bởi vi

khuNn Vibrio sp ở ấu trùng động vật thân mềm và vẫn được sử dụng để xác định và mô

tả các vi khuNn Vibrio sp có độc lực

N ăm 1988, bệnh vòng nhẫn nâu xuất hiện và làm chết rất nhiều ngao Manila nuôi dọc ven bờ Atlantic (Pháp), bao gồm các vùng ven vịnh Marennes–Oléron và năm

1989 xuất hiện tại vịnh Arcachon (Robert và Deltreil, 1990) Bệnh gây ra những tổn

thất kinh tế lớn cho nghề nuôi ngao Manila (R philippinarum) ở nhiều vùng bờ biển

Châu Âu như: Pháp, Ý, Tây Ban N ha, Bồ Đào N ha, Anh, Ireland và Thụy Điển (Paillard và Maes, 1990; Figueras và ctv, 1996; Allam và ctv, 2000; Drummond và ctv, 2007; Paillard và ctv, 2009) Khi ngao bị bệnh, ở phía trong 2 mảnh vỏ của ngao xuất hiện một lớp lắng đọng màu nâu (Paillard và ctv, 1989) và đó cũng là lý do mà bệnh được đặt tên là bệnh vòng nhẫn nâu Bệnh được chia thành 7 giai đoạn phát triển

và dấu hiệu của bệnh có thể quan sát dễ dàng bằng mắt thường khi bệnh ở giai đoạn 2 hoặc cao hơn Ở giai đoạn đầu xuất hiện các đốm nhỏ, sau đó lan rộng ra xung quanh

vỏ ngao Tác nhân gây bệnh được xác định là do vi khuNn loài Vibrio tapetis gây ra

(Allam và ctv, 2002; Paillard và Maes, 1990) Yếu tố môi trường (nhiệt độ và độ mặn) đóng một vai trò hết sức quan trọng trong sự phát triển của bệnh BRD, bệnh có xu

hướng phát triển hơn vào mùa Xuân và mùa Đông khi nhiệt độ tăng trưởng tối ưu cho

V tapetis là 15ºC (Paillard và ctv., 1990) Reid và ctv (2003) đã triển khai một số

nghiên cứu thực nghiệm và chỉ ra rằng ngao Manila nuôi ở độ mặn 20‰ tỷ lệ nhiễm

bệnh cao hơn so với nuôi ở độ mặn 40‰ N gao R philippinarum mẫn cảm với V tapetis hơn ở các loài ngao khác (R decussatus và M mercenaria) (Allam và ctv,

2001; 2006)

Tại Trung Quốc, vi khuNn Vibrio parahaemolyticus đã được phân lập từ ngao dầu Meretrix meretrix với tỷ lệ nhiễm tương ứng trên ngao bệnh và ngao khỏe là 80%

và 15% Khi gây nhiễm thực nghiệm tác giả đã xác định V parahaemolyticus chính là

tác nhân gây chết hàng loạt loài ngao này nuôi (Li Guo và ctv, 2008) Trong một

nghiên cứu khác V parahaemolyticus cũng được xác định đã gây ra hiện tượng chết hàng loạt trên ngao M meretrix ở tỉnh Jiangsu tháng 7 năm 2007, cơ chế gây chết của

chủng vi khuNn này được cho là do gen độc lực toxR và tlh (Yue Xin và ctv., 2010)

N ghiên cứu gây nhiễm thực nghiệm sau này tác giả nhận thấy rằng V parahaemolyticus đã gây chết hàng loạt ngao M meretrix với biểu hiện biến đổi mô

bệnh học xảy ra ở tụy, mang và màng áo (Yue Xin, 2011)

1.2.2 Vai trò của nhiệt độ và độ mặn

Giống như hầu hết các loài động vật thủy sinh khác, ngao là loài động vật máu lạnh nên hầu hết các hoạt động sống đều chịu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Davis và Calabrese (1964) cho rằng ngao Meretrix mercenaria giai đoạn đỉnh vỏ thẳng

không phát triển ở nhiệt độ 10°C do quá trình tiêu hóa bị ngừng trệ Tăng trưởng tích cực trong khoảng nhiệt độ từ 18 - 30°C Theo Curtis và Roger (1990), ngao nhỏ có khả năng thích ứng với điều kiện môi trường có nhiệt độ dao động trong phạm vi hẹp hơn ngao trưởng thành Ấu trùng (larvae) tồn tại ở nhiệt độ từ 12,5 – 33°C, tối ưu từ 22,5 – 25°C ở điều kiện độ mặn bằng 22,5‰ N gao trưởng thành có thể tồn tại ở điều kiện nhiệt độ từ -6°C – 45,2°C, tối ưu từ 21 – 31°C Theo nghiên cứu của Weber và ctv (2010), ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của ngao nói chung là 16 - 27ºC

N gao sẽ ngừng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 8ºC và trên 31ºC N gao sẽ đóng vỏ nếu nhiệt độ dưới 3ºC và tỷ lệ trao đổi nước giảm mạnh nếu nhiệt độ trên 27ºC và dừng trao đổi nước ở nhiệt độ 32ºC Tuy nhiên, việc xác định chính xác nhiệt độ gây chết

cho ngao là rất khó khăn bởi vì nó phụ thuộc nhiều đến thời gian phơi bãi ở nhiệt độ

đó (Weber và ctv, 2010)

N hững ảnh hưởng của độ mặn và nhiệt độ đối với ngao rất khó để giải thích vì sự tương tác giữa hai yếu tố này.Theo báo cáo của Woodburn (1961, 1962), độ mặn nước

biển gần (35-36 ‰) tốt nhất cho loài ngao M campechiensis phát triển và độ mặn tối

thiểu cho ngao nuôi là 20‰ Các thực nghiệm xác định độ mặn tối thiểu không gây

chết cho ngao M mercenaria trưởng thành là 12,5‰ (Castagna và Chanley, 1973) Phạm vi độ mặn tối ưu cho ngao M campechiensis trưởng thành từ 24 - 35‰ và 20 – 30‰ đối với ngao M mercenaria Độ mặn tối ưu cho ngao sinh trưởng và phát triển từ

22 – 35‰ (Mulholland, 1984).Độ mặn chịu ảnh hưởng của thủy triều, lượng mưa, dòng chảy ngao phát triển tốt với giá trị độ mặn từ 20 – 30‰ N gao bắt đầu chết ở vùng biển với độ mặn lớn hơn 40‰ (Clams and Water Quality, 2006) Theo Shirley và ctv (2007), ngao và hầu hết các loài động vật thân mềm sống ở biển cho phép độ mặn trong máu của chúng thay đổi theo độ mặn của môi trường bên ngoài, nhưng chúng vẫn cần phải giữ cho nồng độ của các ion bên trong tế bào ổn định, để duy trì sự hoạt động của các enzyme Khi độ mặn của môi trường giảm, độ mặn của máu sẽ thấp hơn của các tế bào sẽ dẫn đến các tế bào bị sưng tấy và nước sẽ pha loãng các ion trong tế bào, làm gián đoạn hoạt động của các enzyme chuyển hóa N gược lại, khi độ mặn của môi trường tăng lên, độ mặn của máu sẽ lớn hơn của các tế bào, các tế bào sẽ co lại, các ion trong tế bào trở nên đậm đặc hơn và chức năng enzyme sẽ bị phá vỡ

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.3.1 Hiện trạng nghề nuôi ngao ở nước ta

Tại Việt N am có khoảng 40 loài ngao thuộc 7 giống, phân bố dọc bờ biển từ Bắc vào N am (N guyễn Chính, 1996; Trương Quốc Phú, 1999) Ở miền Bắc có phân bố tự

nhiên các loài như ngao dầu Meretrix meretrix, ngao mật Meretrix lusoria, ngao lụa Paphiaundulata và ở miền N am phổ biến nhất là loài ngao Bến tre M lyrata (Trung

tâm khuyến ngư quốc gia, 2006) Có 3 loài ngao được nuôi tại Việt N am bao gồm

nghêu Bến Tre M lyrata, ngao dầu M meretrix, ngao vân M lusoria

Hiện nay phần lớn các địa phương đều nuôi nghêu Bến Tre (M lyrata) N ghêu

Bến Tre là một trong những đối tượng thuỷ sản có giá trị cao ở Việt N am Ở phía

N am, vùng thực tế khai thác và phân bố tự nhiên của ngao khoảng 12.000 ha kéo dài dọc theo vùng ven biển từ huyện Cần Giờ (thành phố Hồ Chí Minh) tới Cà Mau, tập trung nhất là vùng ven biển thuộc tỉnh Tiền Giang, Bến Tre và Trà Vinh N ăm 1998, các nông dân thuộc tỉnh N am Định đã thử nghiệm chuyển nghêu giống từ Bến Tre ra nuôi ở những vùng bãi triều của địa phương Kết quả cho thấy nghêu Bến Tre thích nghi một cách nhanh chóng với điều kiện môi trường của tỉnh Trong năm 2005, sản lượng loài nghêu Bến Tre đã đóng góp 90% tổng sản lượng ngao của tỉnh N am Định Thành công của việc di chuyển này tạo nên sự mở rộng vùng nuôi đối tượng nghêu Bến Tre ra các tỉnh miền Bắc như: QuảngN inh, Hải Phòng, Thái Bình, Thanh Hoá,

N ghệ An, Hà Tĩnh và trở thành đối tượng nuôi chính ở các tỉnh này (Chu Chí Thiết, 2008; Bộ Thủy sản và N gân hàng thế giới, 2006)

N ăm 2010, diện tích nuôi ngao của các tỉnh ven biển đã đạt hơn 15.000 ha với sản lượng hơn 85.000 tấn Trong đó xuất khNu được 19.000 tấn với giá trị xuất khNu là

40 triệu USD.Kế hoạch năm 2011, sản lượng ngao trên toàn quốc là 123.500 tấn Mặc dầu hàng năm, ngao nuôi chiếm một vai trò lớn trong nền kinh tế quốc dân, nhưng cho tới nay người nuôi vẫn chưa có qui trình kỹ thuật nuôi ngao thống nhất

Hiện nay, ở nước ta người dân chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của bản thân để nuôi ngao, mỗi hộ nuôi đều có những kinh nghiệm khác nhau và do đó kỹ thuật nuôi bao gồm cỡ giống, mật độ và mùa vụ thả cũng khác nhau Mật độ nuôi thường gặp ở các hộ nuôi là từ 120-150 con/m2, cá biệt có những nơi thả tới hơn 300 con/m2 N ăng suất trung bình chỉ đạt 5 tấn/ha và năng suất cao nhất đạt 26 tấn/ha (Vụ nuôi trồng thủy sản, 2011)

Theo kết quả điều tra gần đây nhất, Thái Bình là địa phương có diện tích và sản lượng ngao nuôi lớn nhất miền Bắc và Bắc Trung Bộ (1.984ha, 30.130 tấn), tiếp theo

là các tỉnh N am Định (1.708ha, 20.015 tấn), Thanh Hóa (960ha, 7.700 tấn), Quảng

N inh (1.271ha, 5.123 tấn) Hà Tĩnh có diện tích nuôi và sản lượng thấp nhất trong các tỉnh điều tra (200ha, 2800 tấn) (Bùi Đắc Thuyết và Trần Văn Dũng, 2013) Các tỉnh miền N am theo thống kê năm 2013, địa phương có diện tích nuôi ngao nhiều nhất là Bến Tre (3.600 ha), tuy nhiên tổng sản lượng ngao chỉ đạt 3.848 tấn, tỉnh Tiền Giang với diện tích 1.179,9 ha (Tổng cục Thủy sản, 2013)

1.3.2 Tình hình dịch bệnh trên ngao do vi khuẩn Vibrio sp tại Việt Nam

Theo báo cáo của Cục Thú y: N ăm 2010, hiện tượng ngao chết hàng loạt đã xảy

ra tại các tỉnh Tiền Giang, Thái Bình và Bến Tre Trong đó tỉnh Tiền Giang tổng thiệt hại ước tính khoảng 3.144,2 tấn, Thái Bình: 30 ha ngao chết, Bến Tre tổng diện tích thiệt hại 672 ha nghêu nuôi

N ăm 2011 diện tích nuôi nghêu bị thiệt hại lớn đặc biệt tại 3 tỉnh (Tiền Giang, Bến Tre và Cà Mau) là 1.969 ha (chiếm trên 50 % diện tích thả nuôi) ngoài ra một số tỉnh như Hồ Chí Minh, Bạc Liêu cũng xuất hiện

N ăm 2012 bệnh trên ngao cũng xuất hiện tại Thái Bình và Thành phố Hồ Chí Minh Theo báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh Thái Bình, trong tháng 4 năm 2012, trong tổng diện tích nuôi ngao trên địa bàn xã N am Thịnh khoảng 800 ha có khoảng 80% diện tích xuất hiện ngao chết trong đó diện tích có tỷ lệ ngao chết từ 80-95% là 20 ha, diện tích ngao chết 30-50% chiếm khoảng 20 ha, còn lại là diện tích có hiện tượng ngao chết rải rác (10-20%)

Đến tháng 6 năm 2012, trên địa bàn thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh đã xảy ra hiện tượng ngao nuôi bị chết trên diện tích 75 ha ngao nuôi từ 10-

11 tháng tuổi

Đặc biệt năm 2013 bệnh trên ngao đã xuất hiện ở 6 tỉnh với tổng diện tích bị bệnh là 1.560,69 ha bao gồm: Hải Phòng (102 ha), Thanh Hóa (155 ha), N ghệ An (2,5 ha), Tiền Giang (1.121,19 ha), Trà Vinh (60 ha) và Bạc Liêu (120 ha)

Một vài nghiên cứu gần đây đã phân lập được nhiều loài vi khuNn trên ngao nuôi

Vi khuNn V alginolyticus và V vulnificus là 2 trong số 7 loài có tỷ lệ nhiễm dao động trong khoảng 26.67-40.75% được phân lập từ M lyrata trong đợt dịch chết hàng loạt xảy ra tại Hải Phòng năm 2010 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm đã xác định V alginolyticus là một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt ngao xảy ra năm

2010 (N guyễn Thị Hiền và Trần Thị N guyệt Minh, 2012) N ghiên cứu trên các mẫu thu được qua các đợt dịch chết hàng loạt ở các tỉnh thành khác nhau trong cả nước, đã

ghi nhận hàng loạt các loài vi khuNn khác nhau trong đó chủ yếu là nhóm vibrio như V parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V tubiashii và V tapetis Kết quả

hàng loạt tại Việt N am trong giai đoạn nghiên cứu 2012-2013 (Bùi N gọc Thanh và

ctv., 2014)

Theo N gô Thị N gọc Thủy và ctv (2011), đã phân lập đước 8 loài Vibrio (V

parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V anguilarum, V haveyi, V damsela, V fluvilis biovar 2 và V cholerae) trong động vật thân mềm; trong đó loài

V.alginolyticus và V vulfinicus với tỷ lệ nhiễm khá cao trên nghêu (54,99 % và

46,72%) Tỷ lệ cảm nhiễm hai loài vi khuNn này cao hơn trên các mẫu thu được tại các

tỉnh miền N am (V alginolyticus 70,7% và V.vulfinicus 87,8%) Trong khi vi khuNn V

alginolyticus xuất hiện nhiều hơn tại thời điểm có nghêu chết trên bãi nuôi; vi khuNn

V vulfinicus lại có tỷ lệ cảm nhiễm cao hơn trên bãi nghêu khỏe

Tỷ lệ cảm nhiễm vi khuNn trên hàu, nghêu, tu hài, trai ngọc - Theo N gô Thị N gọc

Bình Dương

Hầu cửa sông Nghêu

Tu hài

Trai ngọc

Theo N gô Thị Thu Thảo (2008) đã phát hiện ký sinh trùng Perkinsus sp trên

nghêu lụa (Paphia undulata) ở vùng biển Kiên Giang Và Bà Rịa – Vũng Tàu N ăm

2007, Perkinsus olseni cũng đã phát hiện trên trai tai tượng (Tridacna croea) của Việt

N am xuất khNu sang Mỹ để làm cảnh (Sheppard và Phillips, 2008) N guyễn Văn Hảo

và ctv (2008) lần đầu tiên phát hiện M.lyrata nuôi tại Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh nhiễm Perkinsus sp với tỷ lệ và cường độ nhiễm cao N goài ra, tu hài nuôi tại Vịnh Hạ Long và Cam Ranh cũng được phát hiện có nhiễm Perkinsus sp không được xác định

là tác nhân gây bệnh cho đối tượng động vật thân mềm này (Phan Thị Vân và ctv, 2014)

1.3.4 Nhiệt đô, độ mặn

Một số tài liệu nghiên cứu trong nước cho rằng ngao có thể sống được ở vùng trung, hạ triều đến nơi có độ sâu 5 - 10m, bãi nuôi thường là bãi triều, các eo vịnh có sóng nhỏ, nơi có nguồn nước ngọt nhất định chảy vào Đáy là cát bùn (trong đó cát chiếm 70 - 80%), độ mặn 15 – 25‰, thời gian phơi bãi (bãi nuôi ngao bị cạn không có nước, do thủy triều xuống thấp) không quá 4 – 5 giờ/ngày N ếu nhiệt độ và độ mặn biến đổi đột ngột ngao sẽ chết hàng loạt N gao sống ở tầng đáy, khi gặp điều kiện môi trường thay đổi, ngao có thể nổi lên và tiết ra nhớt kéo thành bè di chuyển đi nơi khác Theo tác giả N guyễn Tác An và N guyễn Văn Lục (1994) thì ngao phân bố ở vùng hạ triều với thời gian phơi bãi từ 2-8 giờ/ngày Độ sâu cực đại tìm thấy ngao lúc nước ròng là 1,5 - 2,5 m và nhiệt độ 26 - 31ºC N guyễn Hữu Phụng (1996) cho rằng ngao phân bố ở những vùng có nền đáy cát hay cát bùn, trong đó cát phải chiếm từ 60-90% với kích cỡ hạt từ 0,006-0,2500 mm Theo Trương Quốc Phú (1999), ngao phân

bố chủ yếu ở vùng trung triều và dưới triều, nơi có độ dốc tương đối bằng phẳng Theo Chu Chí Thiết và Martin S Kumar (2008), ngao là loài động vật thân mềm, phân bố ở vùng biển có biên độ dao động về độ mặn (0–34‰) và nhiệt độ (15–32ºC) Chúng phân bố tự nhiên ở vùng triều, từ vùng cao triều tới vùng thấp triều, nơi có nền đáy cát

và cát pha bùn (20% bùn và 80% cát)

Theo nghiên cứu của Trương Quốc Phú (1999), sự biến động của độ mặn sẽ ảnh hưởng đến việc di chuyển của ngao N ếu độ mặn thay đổi ngao sẽ di chuyển ra xa bờ hoặc khu vực gần cửa sông (với cá thể nhỏ), những cá thể lớn khó di chuyển thì vùi mình xuống đáy Khoảng độ mặn thích hợp cho ngao sinh trưởng và phát triển là từ 7 - 25‰

N ghiên cứu cũng cho biết, chất đáy là yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của ngao N gao phân bố ở những vùng có đáy là cát bùn, trong đó thành phần của cát chiếm tỷ lệ từ 86 – 91% và bùn chiếm từ 9–14% N ếu như đáy có bùn quá nhiều thì ngao sẽ bị chết do ngạt, hoặc cát quá nhiều nền đáy không giữ được nước, đáy khô dẫn đến nhiệt độ tăng lúc phơi bãi cũng không thích hợp với ngao (Trương Quốc Phú, 1999)

N ghiên cứu của N gô Thị Thu Thảo và Lâm Thị Quang Mẫn (2012), đã nhận định

các yếu tố môi trường chính ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của M lyrata là thời gian phơi

bãi, nhiệt độ và độ mặn N hiệt độ cao kết hợp với độ mặn cao làm giảm đáng kể tỷ lệ

sống của ngao

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014

- Mẫu bệnh phNm được thu tại 4 tỉnh miền Bắc: Hải Phòng, N am Định, Thái Bình, Thanh Hóa

- Thí nghiệm được thực hiện tại: Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1– Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc N inh

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Để thực hiện các nội dung của để tài, chúng tôi sử dụng đối tượng nghiên cứu là

ngao Meretrix sp bệnh và ngao Meretrix sp khỏe nuôi tại Hải Phòng, Thái Bình, N am

Định, Thanh Hóa

2.3.2 Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu

- Dụng cụ thu mẫu: Túi PE đã tiệt trùng, bộ giải phẫu (panh, kéo, dao…)

- Dụng cụ dùng để phân tích mẫu và nghiên cứu vi khuNn: Ống nghiệm, đĩa petri, đầu côn, ống eppendorf, ống fancol, que cấy, đèn cồn, dụng cụ dùng để nhuộm gram…

- Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

+ Cân điện tử + Máy sục khí + Pipet tự động

2.3.3 Môi trường, hóa chất phục vụ nghiên cứu

- Môi trường:

Môi trường dùng để pha loãng vi khuNn: N ước muối sinh lý 0,85%

Môi trường thạch chọn lọc cho vi khuNn Vibrio sp:Thiosulfate-citrate-bile

Bộ hóa chất nhuộm gram, H2O2, Oxydase, KOH, N aOH, cồn

Kít API 20E (BioMerieux, Pháp)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

- Mẫu ngao thu từ những hộ có dấu hiệu ngao chết hàng loạt

- Mẫu ngao khỏe thu từ những hộ ngao khỏe mạnh bình thường

Mẫu thu được bảo quản trong túi PE và bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C-8°C trong thờigian

từ 24- 48 h

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn

Dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuNn ở động vật thủy sản của Frerichs và Millar (1983, 1993) và Whitman (2004)

N uôi cấy phân lập và định danh vi khuNn

Gây nhiễm vi khuNn

Gây nhiễm vi khuNn ở nhiệt độ 33°C và độ mặn

Mẫu ngao có dấu hiệu chết hàng loạt và mẫu ngao

khỏe