Hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn th ơng hàn đa kháng thuốc

Kỹ thuật này có ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu cao, thời gian xét nghiệm ngắn hơn so với các kỹ thuật khác, có khả năng phát hiện được 4 loài vi khuẩn thương hàn trong một lần xét nghiệm

bộ Y tế

_

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ

hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để Chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn thương hàn

Lời cảm ơn

Thay mặt nhóm nghiên cứu, tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp

ở các cơ sở sau đây, đã giúp đỡ nhiệt tình và vô t− để công trình có thể hoàn thành: Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, bệnh viện Trung −ơng Huế (Thừa Thiên Huế) và bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội); Labo trung tâm Y sinh học, Bộ môn

Vi sinh Y học, Phòng NCKH, Phòng Tài vụ (ĐHY Hà Nội); Vụ Khoa học-Đào tạo (Bộ Y tế)

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Lê Văn Phủng

Những chữ viết tắt

PCR Polymerase Chain Reaction

RIA Radioimmunoassay (Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ)

IHA Indirect Haemaglutination (Ng−ng kết hồng cầu gián tiếp)

CHL Chloramphenicol

MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

NAL Nalidixic Acid

CAT Chloramphenicol Acetyltransferase

Cat Gen cat

Taq Thermus aquaticus

TAE Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE)

EMBL European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh học

phân tử châu Âu)

DDBJ DNA Data Bank of Japan (Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản)

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin

sinh học Quốc gia, Mỹ)

Nh÷ng ng−êi thùc hiÖn

TT Hä vµ tªn Häc hµm, häc vÞ

chuyªn m«n

C¬ quan

1 Lª V¨n Phñng PGS TS, Vi sinh vËt §¹i häc Y Hµ Néi

2 NguyÔn Träng TuÖ ThS, Sinh häc §¹i häc Y Hµ Néi (Th− ký)

3 Ph¹m Thanh T©n BS, §a khoa §¹i häc Y Hµ Néi (Th− ký tµi chÝnh)

4 Bïi Kh¾c HËu PGS TS, Vi sinh vËt §¹i häc Y Hµ Néi

5 TrÇn Hång V©n BS, §a khoa §¹i häc Y Hµ Néi

6 Cao V¨n Viªn PGS TS, TruyÒn

ThS, Vi sinh vËt BÖnh viÖn trung −¬ng HuÕ

8 Phan V¨n BÐ B¶y BS, Vi sinh vËt BÖnh viÖn ®a khoa §ång Th¸p

9 Lª ThÞ Ph−îng BS, TruyÒn nhiÔm BÖnh viÖn ®a khoa §ång Th¸p

Mục lục

Phần A: Tóm tắt các kết quả nghiên cứu nổi bật 7

1 Đóng góp mới của đề tài 7

2 áp dụng vào thực tiễn 7

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương đã được phê duyệt 7

4 ý kiến đề xuất 7

Phần B: báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu 8

Đặt vấn đề 8

Chương 1: Tổng quan 9

1.1 Tình hình bệnh thương hàn trên thế giới và trong nước 9

1.1.1 Bệnh thương hàn trên thế giới 9

1.1.2 Bệnh thương hàn trong nước 10

1.2 Salmonella 11

1.2.1 Phân loại và danh pháp 11

1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên 12

1.2.3 Vật liệu di truyền 12

1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh thương hàn 12

1.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 12

1.3.2 Huyết thanh học 14

1.3.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 14

1.4 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn thương hàn 15

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

Chương 3: Kết quả nghiên cứu 22

3.1 Thiết kế mồi 22

3.2 Kết quả PCR đa mồi với các chủng Salmonella mẫu 25

3.3 Kết quả tối ưu phản ứng PCR đa mồi 27

3.4 Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi 31

3.5 Theo dõi sự hiện diện của vi khuẩn thương hàn trong máu 32

3.6 Phản ứng chéo 33

3.7 Kháng kháng sinh của Salmonella và gen cat 34

Chương 4: Bàn luận 36

4.1 Bộ mồi cho PCR đa mồi chẩn đoán bệnh thương hàn 36

4.2 Tối ưu các điều kiện phản ứng PCR đa mồi 37

4.3 Độ nhạy của phản ứng PCR 38

4.4 Độ đặc hiệu và phản ứng chéo của phản ứng PCR 39

4.5 Về khả năng phát hiện đa đề kháng thông qua gen cat 40

4.6 Về khả năng theo dõi bệnh thương hàn của PCR đa mồi 41

Kết luận 42

Kiến nghị 42

Tài liệu tham khảo 43

Phụ lục

Phần A: Tóm tắt các kết quả nghiên cứu nổi bật

1 Đóng góp mới của đề tài

- áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán căn nguyên gây bệnh thương hàn Kỹ thuật này có ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu cao, thời gian xét nghiệm ngắn hơn so với các kỹ thuật khác, có khả năng phát hiện

được 4 loài vi khuẩn thương hàn trong một lần xét nghiệm; lượng bệnh phẩm cần ít (chỉ bằng 1/10 so với cấy máu) Vì vậy, bệnh được chẩn đoán sớm hơn trước

- Phát hiện khả năng đa kháng thuốc của vi khuẩn thương hàn cùng một lúc với chẩn đoán căn nguyên Điều này phục vụ cho điều trị đúng sớm hơn, không cần thời gian chờ đợi làm kháng sinh đồ

- Tiên lượng bệnh tốt hơn do biết sớm được đa đề kháng hay không và theo dõi được hiện diện của vi khuẩn trong máu sẽ điều chỉnh được kháng sinh

đang sử dụng

- Đưa kỹ thuật giải trình tự gen, áp dụng lần đầu tiên, vào trường

ĐHY Hà Nội; góp phần nâng cao chất lượng đào tạo và nghiên cứu khoa học của Trường

- Góp phần đào tạo sinh viên với việc đưa sinh viên tiếp cận các kỹ thuật cao, mới trên thế giới

2 áp dụng vào thực tiễn

- Chẩn đoán sớm bệnh thương hàn hoặc phát hiện vi khuẩn thương hàn ngoài môi trường (nước, thực phẩm)

- Phát hiện sớm khả năng đa đề kháng của vi khuẩn thương hàn

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương đã được phê duyệt

- Đề tài đã hoàn thành tốt tất cả các nội dung đã được phê duyệt trong

đề cương: đưa được ra quy trình thực hiện phản ứng PCR đa mồi, có 2 tính năng tốt: 1) phát hiện được 4 loài vi khuẩn thương hàn thường gặp ở nước ta và 2) phát hiện được khả năng đa đề kháng của căn nguyên gây bệnh

- Đã đào tạo 1 sinh viên đại học và 2 cao học

Phần B: báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu

Đặt vấn đề

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, bệnh thương hàn (typhoid fever) và phó thương hàn (paratyphoid fever) vẫn đang là vấn đề sức khoẻ quan trọng ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển Khu vực

đông-nam châu á và châu Phi là những vùng có dịch thương hàn lưu hành và

là một trong những vấn đề y tế nan giải hiện nay

Vấn đề thương hàn càng trở nên trầm trọng hơn do hiện nay đã xuất hiện

và lan tràn rất nhanh các chủng vi khuẩn thương hàn đa đề kháng, làm cho

điều trị khó khăn hơn nhiều và những biến chứng trầm trọng hơn (thủng ruột)

có thể xuất hiện do chẩn đoán chậm và điều trị đặc hiệu không kịp thời

Các phương pháp thông thường chẩn đoán bệnh thương hàn đòi hỏi 4-6 ngày trong trường hợp dương tính và 7 ngày trong trường hợp xác định âm tính Vì vậy, đã không đáp ứng được yêu cầu cấp bách của điều trị thương hàn Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR bổ sung cho các kỹ thuật chẩn đoán kinh điển Kỹ thuật này cho kết quả nhanh hơn và

độ nhạy cũng cao hơn rất nhiều Tuy vậy, các công trình này đều chỉ tập trung

vào phát hiện S typhi hoặc S paratyphi A bằng các phản ứng riêng lẻ và

không phát hiện được khả năng đa đề kháng của chúng Điều đó gây tốn kém

và không đáp ứng được nhu cầu của điều trị

Việc tăng “phổ” phát hiện của PCR đối với các Salmonella khác (S paratyphi B và S paratyphi C chẳng hạn) và phát hiện sơ bộ khả năng đa đề

kháng của chúng là cần thiết cho việc điều trị có hiệu quả cao hơn hiện nay

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Hoàn chỉnh hệ thống

PCR đa mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn thương hàn đa kháng thuốc”

Chương 1: Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh thương hàn trên thế giới và trong nước

1.1.1 Bệnh thương hàn trên thế giới

Bệnh thương hàn hiện nay tập trung chủ yếu ở các nước đang phát triển;

tuy vậy, ở các nước phát triển vẫn có các trường hợp bệnh lẻ tẻ do người nhập

cư, du lịch hoặc những người có công việc phải đi lại với các nước đang lưu

hành bệnh Vì vậy, bệnh thương hàn không những vẫn là vấn đề y tế quan

trọng ở các nước đang phát triển mà vẫn còn là vấn đề phải được quan tâm ở

tất cả các nước trên thế giới

Theo Edelman và cộng sự [1], năm 1984 số bệnh nhân mắc bệnh thương

hàn là 12,5 triệu người Đến năm 1997, Hội nghị quốc tế về bệnh thương hàn

tại Indonesia và năm 1999 tại Đài loan đã thông báo, hàng năm có khoảng 33

triệu người mắc, trong đó khoảng 1,5 triệu ca tử vong [2] Như vậy, thời gian

gần đây, tình hình mắc bệnh thương hàn trên thế giới tăng lên

Tại Cộng hoà dân chủ Congo, một vụ dịch thương hàn lớn dã xảy ra từ

ngày 27/9/2004 đến 1/2005 với 42.564 trường hợp mắc bệnh, 214 ca chết trong

tổng số 696 trường hợp viêm phúc mạc và thủng ruột (WHO, 2006) (WWW

who.int/vaccine_rearch/diseases/diarrhoeal/en/)

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới [3], tình hình mắc bệnh thương

hàn ở một số khu vực trên thế giới như sau:

Như vậy, châu á vẫn là khu vực có bệnh thương hàn trầm trọng nhất Một

thống kê dưới đây cho thấy rõ hơn tình hình này ở các quốc gia cụ thể:

Bảng 2 Tình hình bệnh thương hàn trong khu vực Đông Nam châu á

ở các nước đang phát triển khác, bệnh thương hàn vẫn đang gia tăng: ấn

độ, Pakistan, Bangladesh, Trung Quốc, Nepal; ở Trung và Nam Phi như Chi

Lê, Peru, Mehico; châu Phi như Nigeria, Madagasca tỷ lệ mắc lên tới 810/100.000 dân [4]

Thương hàn cũng được ghi nhận với mức độ gia tăng tại các nước phát triển như Mỹ, Pháp, Anh, Thuỵ Sỹ; gần đây, là Nga, CH Séc, Tajikistan và đặc biệt là đã có 2 vụ dịch thương hàn xảy ra do cuộc chiến tranh sắc tộc kéo dài giữa Bosnia và Hersegovia [5]

Tóm lại, bệnh thương hàn vẫn là vấn đề y tế lớn ở các nước đang phát triển và vẫn là mối quan tâm của tất cả các nước trên thế giới vì khả năng giao lưu thuận tiện hiện nay

1.1.2 Bệnh thương hàn trong nước

Bệnh thương hàn ở nước ta được ghi nhận là trầm trọng kể từ đầu thập kỷ

90 Năm 1992, một vụ dịch thương hàn đã xảy ra ở Bỉm Sơn (Thanh Hoá) với

31 trường hợp đã được ghi nhận [6] Năm 1995, một vụ dịch thương hàn lớn đã xảy ra ở Kim Sơn (Ninh Bình), sau đó lan ra các tỉnh thành khác [7-9] Năm

1998, dịch lớn đã xảy ra ở Lai Châu với tỷ lệ mắc 284,54/100.000 dân [10]

ở miền Trung, từ năm 1990 - 1994 có 1.453 trường hợp mắc (Nguyễn

Đình Sơn và CS); năm 1996 đã xảy ra dịch lớn ở Thừa thiên - Huế, sau đó là Quảng Nam, Ninh Thuận và một số tỉnh khác [11-14]

ở miền Nam, từ năm 1990-1994 đã ghi nhận 55.397 trường hợp mắc thương hàn, tỷ lệ mắc và chết tăng dần, đỉnh cao là năm 1995 với sự xuất hiện

các chủng Salmonella typhi đa kháng [15-17] Trong vòng 18 năm

(1981-1998), tại 19 tỉnh thành phía Nam, có 123.651 trường hợp mắc bệnh, trong đó

có 70 trường hợp tử vong (Phạm Kim Sắc và CS) [18]

Theo thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương [10], tỷ lệ mắc bệnh thương hàn trên 100.000 dân như sau:

cao nhất trong cả nước

Theo tài liệu của Bộ Y tế [15], từ năm 1991 đến tháng 3/1999, có 152.405

trường hợp mắc bệnh; trong số đó, có 112 trường hợp tử vong; phân bố cụ thể

như sau:

Bảng 4 Số mắc và chết do thương hàn từ 1991-3/1999

Năm 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 3/1999 Tổng Mắc 7.597 9.209 14.069 20.539 30.901 27.394 19.397 20.815 2.484 152.405

Tại Đồng Tháp, cũng trong khoảng thời gian như trên, tổng số mắc là

15.395, tử vong 26 trường hợp Đặc biệt, bệnh viện đa khoa Tỉnh cho biết, từ

tháng 4/1997 - 4/1998 đã điều trị 778 trường hợp thương hàn, trong đó 26

trường hợp có biến chứng thủng ruột [16]

Như vậy, bệnh thương hàn ở nước ta vẫn trong tình trạng trầm trọng và có

thể bùng phát dịch dễ dàng nếu không quan tâm đầy đủ đến dây chuyền dịch

tễ học của bệnh, trong đó có việc chẩn đoán sớm, chẩn đoán chính xác và điều

trị kịp thời, đúng đắn Vì nếu không, đây sẽ là nguồn gieo rắc mầm bệnh ra

cộng đồng và trong bối cảnh vệ sinh môi trường chưa đảm bảo như nước ta,

việc ô nhiễm nguồn nước và thực phẩm, dẫn đến gây dịch, là khả năng có thể

xảy ra bất cứ lúc nào

1.2 Salmonella

1.2.1 Phân loại và danh pháp

- Phân loại:

Phân loại Salmonella rất phức tạp Giống Salmonella thuộc họ vi khuẩn

đường ruột (Enterobacteriaceae) Gần đây (7/12/2005), người ta cho rằng,

giống Salmonella chỉ có 2 loài: Salmonella bongori và Salmonella enterica

Loài S enterica có 6 loài phụ:

1 enterica, 2 salamae, 3a arizonae, 3b diarizonae, 4 houtenae,

5 obsolete (nay là bongori), 6 indica

Trên 99,5% các Salmonella gây bệnh cho người thuộc loài phụ enterica

Cách phân loại này phản ánh chính xác hơn các cách phân loại trước đây

về mối liên quan di truyền giữa các thành viên trong giống

- Danh pháp:

Danh pháp chính xác của Salmonella typhi là Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhi; S paratyphi A là Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi A; tương tự như vậy đối với S paratyphi

B và C

Tuy vậy, do tính chất phức tạp và không thực tế của danh pháp chính

thống, hiện nay, người ta vẫn dùng theo thói quen cũ là Salmonella typhi (đúng ra, phải viết là Salmonella Typhi ); và cũng như vậy đối với các Salmonella paratyphi A, B và C

Mỗi Salmonella mang các yếu tố kháng nguyên O, H khác nhau; tạo ra

rất nhiều týp huyết thanh (hiện tại có trên 2000) [19]

1.2.3 Vật liệu di truyền

Ngoài chromosome mã hoá cho các kháng nguyên O, H và Vi,

Salmonella có thể chứa các plasmid khác nhau; trong đó hay gặp nhất là các

plasmid kháng thuốc hoặc plasmid chịu trách nhiệm về các đặc tính chuyển hoá khác, thường được dùng trong định loại vi khuẩn (ví dụ như lên men

đường lactose, sucrose…) (Le Minor et al, 1973, 1974) Các Salmonella còn

chứa các phage ôn hoà (template phage), các phage này chịu trách nhiệm về

các biến đổi kháng nguyên thường gặp ở nhiều loài Salmonella khác nhau

(Bergey’ Manual, 1984)

1.3 Tình hình nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán bệnh thương hàn 1.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn có giá trị khẳng định bệnh Tuy vậy, tỷ lệ phân lập

được vi khuẩn không cao, nhất là các trường hợp bệnh nhân đến muộn

- Cấy máu: trong các bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn thương hàn, máu là bệnh phẩm thường dùng nhất Tỷ lệ phân lập được Salmonella từ

máu trong tuần đầu của bệnh khoảng 70-80%, sau đó giảm dần xuống 60 và 40% vào tuần thứ 2 và 3 Tuy vậy, rất ít khi gặp bệnh nhân vào viện ngay tuần

đầu của bệnh

- Cấy tuỷ xương: cho kết quả nhanh và tỷ lệ dương tính cao nhất

(90%) [20, 21] Tuỷ xương đặc biệt hữu ích trong những trường hợp bệnh nhân

đã điều trị dở dang ở tuyến trước, khi mà trong máu, lượng vi khuẩn đã giảm

nhưng vì Salmonella là loại vi khuẩn ký sinh nội bào, nên trong tuỷ xương (hệ

thống lưới nội mô, chúng tồn tại bên trong tế bào) chúng tránh được tác động của nhiều loại kháng sinh Tuy vậy, kỹ thuật lấy bệnh phẩm rất phức tạp

- Cấy phân: tỷ lệ dương tính rất thấp (<10%) trong giai đoạn đầu của

bệnh nhưng tăng dần lên trong những tuần sau do vi khuẩn được đào thải ra

ngoài qua đường mật Tuy vậy, cấy phân dương tính với Salmonella chưa

khẳng định được bệnh nhân đang mắc bệnh thương hàn vì có tình trạng người lành mang vi khuẩn

- Cấy đào ban: có nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ dương tính tới 63% [20]

Tuy vậy, không phải bệnh nhân thương hàn nào cũng xuất hiện đào ban và kỹ thuật lấy bệnh phẩm từ đào ban cũng khó khăn

- Cấy nước tiểu: tỷ lệ dương tính thấp (7%) [20] và thường là dương

tính trong giai đoạn muộn của bệnh vì vi khuẩn đã gây nhiễm khuẩn huyết, sau

đó mới được đào thải ra ngoài qua đường tiết niệu

- Cấy dịch mật, dịch tá tràng: tỷ lệ dương tính thấp, muộn, lấy bệnh

phẩm khó khăn

- Cấy kết hợp nhiều loại bệnh phẩm: kết hợp cấy máu, cấy tuỷ xương,

cấy dịch mật cho tỷ lệ dương tính cao hơn [22] Tuy vậy, điều này khó thực hiện khi phải đối mặt, cùng một lúc, với nhiều bệnh nhân trong vụ dịch

Hoffman và CS đã nghiên cứu trên 154 bệnh nhân thương hàn, cho thấy

tỷ lệ phân lập được S typhi từ các loại bệnh phẩm, lần lượt như sau: tuỷ xương

85,6%; dịch tá tràng 57,6%; máu 54,2% và phân 35,6% [22]

Tại bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, trong số 778 bệnh nhân được nhận vào

điều trị thường hàn, có 268 trường hợp cấy máu dương tính với S typhi, tỷ lệ

dương tính là 43,4% [16]

ưu điểm của phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn là cho chẩn đoán xác định (đặc hiệu) và có vi khuẩn để làm kháng sinh đồ một cách chính xác;

nhưng nhược điểm cơ bản của nó là cho kết quả chậm, thường là từ 3 - 5 ngày;

và tỷ lệ dương tính không cao (kém nhạy) Chính vì vậy, tìm kiếm thêm các biện pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao là nhu cầu cần thiết

1.3.2 Huyết thanh học

- Phản ứng Widal: đây là phản ứng ngưng kết trực tiếp, đã được áp

dụng từ lâu (hơn 80 năm nay) Đến nay, vẫn còn được áp dụng ở nhiều nước

đang phát triển [23-25] vì kỹ thuật đơn giản và giá thành thấp Giá trị của nó chủ yếu phục vụ cho các nghiên cứu hồi cứu về dịch tễ học; giá trị phục vụ chẩn đoán bệnh hạn chế vì cho kết quả chậm (sau mắc bệnh từ 1-2 tuần trở lên) Mặc khác, phản ứng này cũng dương tính trong những trường hợp đã dùng vacxin, cũng như phản ứng chéo với một số kháng nguyên của các

Enterobacteriaceae khác [26, 27]

- ELISA: có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn Widal [28] nhưng không ổn

định (52 - 95%, tuỳ theo tác giả và loại bệnh phẩm)

- RIA, IHA: có độ nhạy và đặc hiệu khá cao nhưng chỉ làm được ở một

số ít cơ sở có điều kiện trang thiết bị tốt [4, 29, 30]

Nhược điểm của các phương pháp huyết thanh học là đều cho kết quả chậm (do phải có thời gian để cơ thể hình thành kháng thể), vì vậy giá trị phục

vụ cho điều trị không cao

1.3.3 Kỹ thuật sinh học phân tử

- Kỹ thuật PCR: Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu dùng

kỹ thuật PCR bổ sung cho các kỹ thuật chẩn đoán kinh điển [31, 32] Kỹ thuật này cho kết quả nhanh hơn, độ nhạy cũng cao hơn rất nhiều [33] và đã được áp dụng không những cho người mà còn cho động vật [34] hoặc cho giám sát thực phẩm [35-37] và giám sát môi trường [38-40] Tuy vậy, các công trình này đều

chỉ tập trung vào phát hiện S typhi hoặc S paratyphi A bằng các phản ứng

riêng lẻ và không phát hiện được khả năng đa đề kháng của chúng [41-43]

Điều đó gây tốn kém và không đáp ứng được nhu cầu của điều trị

Để có thể khuyếch đại đặc hiệu được đoạn gen đặc trưng cho từng loài

Salmonella, các tác giả thường tập trung khai thác các gen mã hoá cho các

kháng nguyên đặc hiệu của chúng Hashimoto và CS [32] dựa vào gen mã hoá

cho kháng nguyên Vi, vì cho rằng, ngoài S typhi, chỉ một số ít vi khuẩn (Citrobacter freundii chẳng hạn) sản xuất kháng nguyên này; còn Hirose và

CS [41] lại dựa vào các gen mã hoá cho kháng nguyên lông (H) và các gen mã hoá cho các enzym đặc hiệu trong quá trình sinh tổng hợp kháng nguyên thân (O)

Về loại hình PCR, nhiều loại PCR đã được áp dụng: PCR đơn mồi [44],

đa mồi [45-47] hoặc định lượng [31, 48-50] Mỗi loại PCR có những ưu, nhược

điểm của nó; tuỳ theo từng trường hợp cụ thể mà áp dụng cho phù hợp Trong chẩn đoán bệnh thương hàn, xu thế hiện nay là dùng PCR đa mồi với kỹ thuật Real-Time [31, 49, 50]

Tuy vậy, ở nước ta, việc ứng dụng những tiến bộ như trên còn chậm Đã

có nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cho mục đích này (Lê Huy Chính và CS, 2000) Tác giả cho rằng, vì PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (hàng trăm lần cao hơn các phương pháp thông thường), thời gian cho kết quả nhanh hơn nhiều (5-6 giờ) so với các phương pháp chẩn đoán khác (4-6 ngày) nên ứng dụng nó trong chẩn đoán bệnh thương hàn là rất giá trị Tuy vậy, đây mới chỉ

là nghiên cứu thử nghiệm với 1 loại Salmonella (S typhi), không áp dụng được cho các loại Salmonella khác và đặc biệt là không có khả năng phát hiện đa đề

chưa đủ trong thực tế bệnh lý ở nước ta [51]

Làm thế nào để có thể phát hiện được các loại Salmonella gây bệnh

thường gặp ở nước ta và phát hiện khả năng đa đề kháng của chúng trong 1 phản ứng PCR duy nhất, nhằm giảm tối thiểu thời gian chẩn đoán xác định bệnh, định hướng cho điều trị và có khả năng chấp nhận được (về mặt kinh tế) khi làm đi làm lại nhiều lần, nhằm theo dõi và đánh giá nhanh chóng hiệu quả của điều trị?

Đó là những vấn đề cần thiết hiện nay và cũng chính là mục tiêu cần giải quyết của nghiên cứu này

1.4 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn thương hàn

Salmonella typhi đa kháng thuốc không còn là câu chuyện hiếm trên thế

giới [55-58] Kháng 6 kháng sinh (amoxicillin, chloramphenicol, streptomycin, spectinomycin, sulfonamides và tetracycline (đa đề kháng kiểu ACSSpSuTe; viết tắt theo thứ tự từng kháng sinh) là 48,8%

Dòng DT104 có kiểu cách đa đề kháng ACSSpSuTe là 83,2%, trong đó

có cả chủng sản xuất β-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum lactamase, ESBL) loại TEM-52 (0,3%) với MIC của ciprofloxacin rất cao (>

beta-32 àg/ml) [55]

Trong các kiểu đa đề kháng đã công bố, kiểu nào cũng thấy có mặt chloramphenicol [59-72]

Salmonella paratyphi A, B và C cũng kháng nhiều kháng sinh, trong đó

có cả ciprofloxacin (MIC > 4 àg/ml) và nalidixic acid (NAL) [73]

Tình hình kháng fluoroquinolone ngày càng trầm trọng và gây quan ngại lớn cho điều trị thương hàn trong tương lai, vì cho đến nay, nhóm kháng sinh

này vẫn là nhóm chủ đạo trong điều trị các vi khuẩn thương hàn đa kháng thuốc [74-76]

ở nước ta, các chủng vi khuẩn thương hàn đa đề kháng đã xuất hiện từ năm 1993 tại Kiên Giang và đã lan tràn mạnh ra nhiều vùng trên cả nước [18] Chúng kháng lại hầu hết các kháng sinh thông thường vẫn dùng điều trị thương

hàn, ví dụ như tại Bệnh viện đa khoa trung ương Huế, 1999-2001: Salmonella typhi (N=973) đã kháng chloramphenicol 93,5%, ampicillin 90,1%, co-

trimoxazole 93,3%, tetracycline 90,1%, doxycyclin 91,5% Tình hình cũng tương tự như vậy ở bệnh viện đa khoa Đồng Tháp (N=147), 2002: chloramphenicol 91,1%, ampicillin 91,5%, co-trimoxazole 91,2%, tetracycline 91,1%, doxycyclin 91,5% (Nguyễn Thị Nam Liên và Phan Văn Bé Bảy, 2003)

Gen kháng các kháng sinh này đã được chứng minh là đều cùng nằm trên một R-plasmid (Lê Văn Phủng và CS, 1999-2002) [63]), vì vậy khả năng truyền tính kháng thuốc của chúng rất lớn

Tình hình kháng thuốc hiện nay còn trầm trọng hơn do đã xuất hiện, và ngày càng nhiều, các chủng đa đề kháng như trên, đồng thời kháng cả nalidixic acid (Đồng Tháp 97,2%, An Giang 90% - Phan Văn Bé Bảy, 2002)

và giảm độ nhạy cảm với fluoroquinolone Cơ chế của hiện tượng đề kháng

này đã được chứng minh là do đột biến điểm ở gen gyrA trên nhiễm sắc thể của Salmonella typhi (Lê Văn Phủng và CS, 2002) [77]

Việc điều trị bệnh thương hàn đa kháng thuốc, đặc biệt là kháng cả NAL, rất khó khăn Thời gian cắt sốt dài hơn, thời gian nằm viện kéo dài hơn, kháng sinh phải dùng liều cao hơn và kéo dài hơn, biến chứng hay gặp hơn, nhiều trường hợp phải can thiệp ngoại khoa do thủng ruột (Lê Thị Phượng, 1999)

Nguyên nhân đa đề kháng của Salmonella thường là do R-plasmid

[78-87] Đây là một plasmid có kích cỡ lớn [52] và thường mang nhiều gen kháng các kháng sinh khác nhau, bao gồm ampicillin [88, 89], tetracyclin [67, 90], trimethoprim [91, 92] và đặc biệt là chloramphenicol [59-72]

Có thể dễ dàng nhận thấy rằng, trong tất cả các mô hình đa đề kháng do R-plasmid đã được nghiên cứu, mô hình nào cũng thấy xuất hiện kháng chloramphenicol, không thấy kháng chloramphenicol đơn thuần [61, 64, 67,

79, 84, 93-97] Nhận xét này là cơ sở để nghĩ rằng, có thể dùng dấu ấn kháng kháng sinh này là chỉ điểm của sự đa đề kháng

Kháng chloramphenicol thường xuất hiện ở các vi khuẩn Gram âm do cảm ứng Cơ chế của hiện tượng này là do enzym Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT); enzym này liên kết đồng hoá trị với 1 hoặc 2 nhóm acetyl, từ acetyl-S-coenzyme A, với nhóm hydroxyl trên phân tử chloramphenicol Sự acetyl hoá này ngăn cản chloramphenicol gắn với ribosome trong quá trình sinh tổng hợp protein; vì vậy, ngăn cản tác động của chloramphenicol đến quá trình sinh học quan trọng này [98, 99] Gen kháng

chloramphenicol (cat gene) nằm trên plasmid và luôn luôn đi kèm với các gen

kháng nhiều kháng sinh khác [99, 100]

Chloramphenicol đã là kháng sinh chọn lựa trong điều trị bệnh thương

hàn qua nhiều thập kỷ Tuy vậy, từ khi xuất hiện R-plasmid ở Salmonella, nó

dần dần trở nên kém hiệu quả và hiện nay, những chủng đa đề kháng đã kháng lại hoàn toàn kháng sinh này và vì vậy, chloramphenicol đã không còn là thuốc chọn lựa cho điều trị bệnh thương hàn ở những vùng có dịch thương hàn lưu hành các chủng đa đề kháng [68]

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp

nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Máu bệnh nhân thương hàn (đã được xác định bằng cấy máu +): 36 mẫu,

do bệnh viện đa khoa Đồng Tháp và Trung ương Huế cung cấp

- Máu bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết (cấy máu +) do các vi khuẩn không

phải Salmonella: 115 mẫu, do các bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, Trung ương

Huế và Thanh Nhàn (Hà Nội) cung cấp

- Máu người lành: 60 mẫu, chọn lọc từ những người khoẻ mạnh trong đợt khám sức khoẻ định kỳ của cơ quan

2.2 Vật liệu, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất chính

- Tách chiết ADN: Kit Qiagen (QIAmp DNA Blood Mini Kits 51304) (Đức)

- Dung dịch MgCl2 25 mM, Applied Biosystems

- dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Applied Biosystems

- Taq Gold DNA Polymerase, Applied Biosystems

- Mồi: 10 cặp mồi đặc hiệu (đặt hàng, Invitrogen) (Bảng 5)

- Agarose NA, Amersham Biosciences (Mỹ)

- Đệm tra mẫu (Gel loading buffer) (Invitrogen)

- Dung dịch đệm TAE 50x, Applied Biosystems

- Ethidium bromide 0,5 àg/ml, Applied Biosystems

2.2.2 Máy móc chính

- Máy định danh vi khuẩn: BioMérieux, Inc., (Mỹ)

- Máy PCR: Gene Amp PCR System 9700 (Mỹ)

- Máy PCR: Mastercycler Gradient, Eppendorf (Đức)

- Máy giải trình tự gen: ABI Biosystems Avant 3100 (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh: Avanti 30 Centrifuge, Beckman (Mỹ)

- Máy điện di ngang: Advance Co Ltd (Nhật bản)

- Hệ thống máy đọc gel, máy in ảnh: Chemi Doc EQ Bio-Rad (Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định danh vi khuẩn

Các vi khuẩn dùng trong nghiên cứu đều được định danh lại trên máy

định danh tự động, Vitek-32 (BioMérieux, Inc., Mỹ) với các sinh phẩm (GNI

và GPI Card) mua từ chính Hãng

2.3.2 Chọn kháng nguyên đặc hiệu, thiết kế mồi và giải trình tự gen

- Chọn kháng nguyên đặc hiệu: Mười kháng nguyên đặc hiệu cho

từng loài Salmonella thông qua các yếu tố kháng nguyên O, H đặc hiệu và

CAT:

• S typhi O9, [O2], H1-d và Vi

• S paratyphi A O2, H1-a

• Thiết kế mồi bằng phần mềm chuyên dụng: Primer3 v 0.2

• Thử thách tính chất bổ sung giữa các cặp mồi: Dùng phần mềm từ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

- Giải trình tự gen: Theo nguyên lý kết thúc chuỗi của Sanger [101], dùng BigDye Terminator 3.1 với máy giải trình tự gen tự động (ABI Biosystems Avant 3100, Mỹ)

2.3.3 PCR đa mồi với các vi khuẩn mẫu

2.3.3.1 Salmonella typhi, S paratyphi A, B và C

Nuôi cấy vi khuẩn: thạch thường, 35°C/18 giờ

Tách chiết ADN: lấy vi khuẩn đã nuôi cấy 18 giờ, hoà trong PBS với độ

đục tương đương Mc Farland 0,5; đun cách thuỷ 100°C/10 phút, sau đó ly tâm

4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy dịch nổi chuyển sang ống sạch khác, cặn ly tâm bỏ đi

Chuẩn bị hỗn hợp mồi: Các mồi được giữ riêng biệt trong lạnh sâu, khi

làm PCR thì pha thành một hỗn hợp với nồng độ 10 àM cho mỗi mồi Hỗn hợp mồi này được pha vừa đủ cho 1 lần chạy PCR, không dùng lại cho lần sau

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR:

2.3.3.2 Các vi khuẩn khác, không phải Salmonella: Quy trình tách chiết ADN

và các điều kiện cho PCR giống như các Salmonella Các vi khuẩn là S aureus, E coli, B cepacia, K pneumoniae, P aeruginosa, E cloacae, P mirabilis, Pseudomonas spp, P multocida, C freundii

2.3.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho PCR đa mồi

2.3.4.1 Nhiệt độ gắn mồi

Nhiệt độ gắn mồi được thay đổi nhờ máy PCR (Mastercycler Gradient,

Eppendorf) có chức năng gradient nhiệt độ, máy tự động tính toán, phân chia

các mức nhiệt độ trong giải nhiệt độ chọn lựa (G=10):

46; 46,3; 47,4; 49,2; 51,5; 54,1; 56,8; 59,5; 62; 64,1; 65,7; 66,5 (°C) Khi vận hành, mỗi hàng giếng trên máy có nhiệt độ riêng theo đúng chế

độ đã cài đặt Vì vậy, mỗi lần chạy, sẽ có 12 kết quả khác nhau với 12 loại nhiệt độ khác nhau tạo ra Căn cứ vào kết quả đó, có thể chọn được nhiệt độ tối

ưu

Khi tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu, chỉ có chỉ số này thay đổi còn các chỉ

số khác đều giữ nguyên

2.3.4.2 Nhiệt độ kéo dài mồi

Tiến hành tương tự như “nhiệt độ gắn mồi”, nhưng nhiệt độ kéo dài mồi thì thay đổi, còn các điều kiện khác thì giữ nguyên Giải nhiệt độ như sau: 68,0; 68,2; 68,6; 69,4; 70,3; 71,4; 72,5; 73,6; 74,6; 75,5; 76,1; 76,4 (°C)

2.3.5 PCR chẩn đoán và theo dõi bệnh thương hàn

- Bệnh phẩm: máu, gồm 3 nhóm:

+ Nhóm I: bệnh thương hàn đã được xác chẩn bằng cấy máu, mỗi

bệnh nhân được lấy máu qua 4 ngày liền, mỗi ngày 1 lần (để tìm độ nhạy của

PCR và theo dõi sự hiện diện của Salmonella trong máu theo thời gian)

+ Nhóm II: người lành (để tìm độ đặc hiệu của PCR)

+ Nhóm III: bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do các vi khuẩn không phải Salmonella (cũng đã được chọn lọc qua cấy máu dương tính, để tìm phản

ứng chéo của PCR)

Lấy bệnh phẩm: lấy 1 ml máu, chống đông bằng EDTA (nồng độ cuối

cùng 10 mM) Nếu chưa xử lý ngay thì để trong lạnh sâu (- 20°C)

Tách chiết ADN từ máu: Kit Qiagen (QIAmp DNA Blood Mini Kits

5 Ly tâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy ống

6 Thêm 200 àl methanol, lắc cho đều rồi lại ly tâm nhẹ

7 Lấy hỗn dịch ở bước 6 vào cột QIAamp Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

8 Lấy cột ra, thêm 500 àl dung dịch đệm AW1 Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

9 Cho thêm vào cột 500 àl AW2 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong

3 phút

10 Cho thêm vào cột 200 àl dung dịch đệm AE hoặc nước cất Để

ở nhiệt độ phòng 1 phút Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Thu lấy dịch ly tâm để chạy PCR (ADN khuôn mẫu)

- Tính độ nhạy: Số mẫu PCR (+) trong nhóm bệnh/ Tổng số mẫu thương hàn

(+) (%)

- Tính độ đặc hiệu: Số mẫu PCR (-) trong nhóm lành/ Tổng số mẫu lành

(%)

- Tính phản ứng chéo: Số mẫu PCR (+) trong nhóm nhiễm khuẩn khác/

Tổng số mẫu nhiễm khuẩn khác (ngoài thương hàn) (%)

2.3.6 Địa điểm lấy mẫu và thực hiện các kỹ thuật

• Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi: Bộ môn Vi sinh Y học và Labo trung tâm Y sinh học, Trường đại học Y Hà Nội

• Đánh giá kỹ thuật PCR: Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp và bệnh viện trung ương Huế có bệnh nhân thương hàn đã xác chẩn bằng cấy máu

dương tính với Salmonella

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

3.1 Thiết kế mồi

Bộ mồi dùng để chẩn đoán 4 loài Salmonella đề xuất trong nghiên cứu

gồm 10 cặp mồi (Bảng 5); trong số đó, 8 cặp đã có trình tự được công bố trên ngân hàng gen (GenBank), nên các mồi được thiết kế dựa trên các trình tự này rất thuận lợi; hai cặp mồi còn lại (H1:b và H1:c) chúng tôi không tìm thấy trên ngân hàng gen nên phải tự giải trình tự gen, sau đó mới thiết kế được mồi đặc hiệu Hai đoạn gen tự giải trình tự (tại Labo Trung tâm, trường đại học Y Hà Nội) đã được đăng ký trên ngân hàng gen (GenBank, Accession No AY657000 và AY657001) Nguyên bản trên GenBank được trình bày dưới

đây

3.1.1 §o¹n gen FliC-b (AY657001)vµ ®o¹n måi cho H1:b (g¹ch ch©n):

LOCUS AY657001 1488 bp DNA linear BCT 12-JUL-2004

DEFINITION Salmonella enterica isolate VCMM 4477 flagellar antigen H1:b

(fliC)gene, complete cds

ACCESSION AY657001

VERSION AY657001.1 GI:49854240

SOURCE Salmonella enterica

ORGANISM Salmonella enterica; Bacteria; Proteobacteria;

Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae;

Salmonella

REFERENCE 1 (bases 1 to 1488)

AUTHORS Phung,L.V and Tue,N.T

JOURNAL Submitted (18-JUN-2004) Microbiology, Hanoi Medical

University, 1-Ton That Tung, Hanoi 04, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers

ORIGIN

1 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa

61 tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc

121 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt

181 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc

241 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct

301 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg

361 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag

421 gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcg aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg

481 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatactttaa gtgtacagga tgcctatacg

541 ccaaaaggta ccgctgttac cagagatgtt accacctata aaaatggtgg tactactctt

601 acagcaccta acgcagcagc aattgatacc gctttaggta cgactggtgc ggcgggtact

661 gcggctgtga aatttaaaga cggtaactac ttcgttgagg tgaccggtac aactaaagat

721 ggtctgtatg aagcgacagt tgatgcagct ggcgcggtga caatgaccgc aaataaagca

781 acagtaactg gggctagtac agttactgaa aaccaaattg tagacgctgt tacaccgacg

841 ccagttgata cagtcgcagc agctactgca ttgaccaatg caggtgtgac aggtgcgaca

901 ggtaatacca gcttggttaa aatgtcattt gaagataaaa atggcaaagt tactgatgcg

961 ggttacgcgc ttaaagttgg aaatgattat tatgccgctg attacgatga aaaaactggt

1021 gagataaaag ctaaaactgt aaattatact gacgctactg gtgcgacaaa aaccggtgct

1081 gtgaaatttg gcggtgcgaa tggtaaaact gaagttgtga ccaccgttga tggtaatact

1141 tatcaggcta gtgatgtaaa agggcataat ttccagagtg gtggcgcttt aagcgaggct

1201 gtaaccacta aaactgaaaa cccgctggct aaaattgatg ccgcgctggc gcaagttgat

1261 gcgctgcgtt ctgacttggg tgcggttcag aaccgtttca actccgctat caccaacctg

1321 ggcaataccg taaacaacct gtctgaagcc cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg

1381 accgaagtct ccaacatgtc ccgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ctccgttctg

1441 gcgcaggcga accaggttcc gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa

3.1.2 §o¹n gene FliC-c (AY657000) vµ ®o¹n måi cho H1:c (g¹ch ch©n):

LOCUS AY657000 1474 bp DNA linear BCT 12-JUL-2004

DEFINITION Salmonella enterica isolate VCMM 3420 flagellar antigen H1:c

(fliC)gene, partial cds

ACCESSION AY657000

VERSION AY657000.1 GI:49854235

SOURCE Salmonella enterica

ORGANISM Salmonella enterica; Bacteria; Proteobacteria;

Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae;

Salmonella

REFERENCE 1 (bases 1 to 1474)

AUTHORS Phung,L.V and Tue,N.T

JOURNAL Submitted (17-JUN-2004) Microbiology, Hanoi Medical

University, 1-Ton That Tung, Hanoi 04, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers

ORIGIN

1 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa

61 tcccagtctg ctctgggtac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc

121 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt

181 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatttcta ttgcgcagac cactgaaggc

241 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct

301 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgtctg

361 aacgaaatcg accgtgtatc cggtcagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag

421 gacaacactc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg

481 aagcagatca actctcagac cctgggccta gatacgctga atgtgcagaa aaaatatgat

541 gtgagcgata ctgctgtagc tgcttcctat tccgactcga aacagaatat tgctgttcct

601 gataaaacag ctattactgc aaaaattggt gcagcaacca gtggtggtgc tggtataaaa

661 gcagatatta gctttaaaga tggcaagtat tacgcgactg tcagtggata cgatgatgcc

721 gcagatacag ataaaaatgg aacctatgaa gtcactgttg ccgcagatac aggagcagtt

781 acttttgcga ctacaccaac agtggttgac ttaccaactg atgcaaaagc agtttcaaaa

841 gttcaacaga atgatactga aatagcagca acaaatgcga aagctgcatt aaaagctgca

901 ggagttgcag atgcagaagc tgatacagct actttagtga aaatgtctta tacagataat

961 aatggcaaag ttattgatgg tgggttcgca tttaagacct ccggtggtta ttatgcagca

1021 tctgttgata aatctggcgc agctagcttg aaagttacta gctacgttga cgctaccact

1081 ggtaccgaaa aaactgctgc gaataaatta ggtggcgcag acggtaaaac cgaagttgtt

1141 actatcgacg gtaaaaccta caatgccagc aaagccgctg ggcacaactt caaagcacag

1201 ccagagctgg cggaagcggc tgctacaacc actgaaaacc cgctgcagaa aattgatgct

1261 gctttggcgc aggtggatgc gctgcgttct gacctgggtg cggttcagaa ccgtttcaac

1321 tccgctatca ccaacctggg caataccgta aataacctgt cttctgcccg tagccgtatc

1381 gaagattccg actacgcgac cgaagtttcc aacatgtctc gcgcgcagat tctgcagcag

1441 gccggtacct ccgttctggc gcaggcgaac cagg

3.2 Kết quả PCR đa mồi với các chủng Salmonella mẫu

3.2.1 Salmonella typhi

Hình 1 Salmonella typhi kháng chloramphenicol

Ba băng đặc hiệu cho S typhi: H1:d (750 bp); O:9 (615 bp); Vi (439 bp); O:2 (258 bp) chung với S paratyphi A; và băng kháng thuốc, Cat (219 bp)

M: ADN mẫu (Marker), thang 100 bp; T: S typhi

3.2.2 Salmonella paratyphi A

Hình 2 S paratyphi A

Hai băng đặc hiệu cho S paratyphi A: H1:a (329 bp) và O:2 (258 bp)

M: ADN mẫu (Marker), thang 100 bp; A: S paratyphi A

T M

750 615 439 258 219

M A

329 258

219 151

3.3 Kết quả tối −u phản ứng PCR đa mồi

3.3.1 Tối −u nhiệt độ gắn mồi

1: 46 oC 2: 46,3 oC 3: 47,4 oC 4: 49,2 oC 5: 51,5 oC

6: 54,1 o C 7: Marker 8: 56,8 o C 9: 59,5 o C 10: 62 o C

11: 64,1 o C 12: 65,7 o C 13: 66,50 C

Hình 5: Hình ảnh điện di trên gel agarose 2%, 100V/80mA sản phẩm PCR đa

mồi khi thay đổi nhiệt độ gắn mồi

Bảng 6: Tóm tắt kết quả phản ứng PCR đa mồi khi thay đổi nhiệt độ gắn mồi

59,5 +++ +++ +++ +++ +++ -

62 +++ +++ +++ +++ +++ + 64,1 +++ +++ +++ +++ +++ + 65,7 +++ +++ +++ +++ +++ + 66,5 +++ +++ +++ +++ +++ +

Khi nhìn vào kết quả điện di, tất cả các mồi cần thử của S typhi đều cho

băng dương tính, tuy nhiên có sự khác nhau về đậm độ mầu và kích thước băng ADN ở 3 nhiệt độ đầu (46; 46,3; 47,4oC) các băng được đánh giá (+) và (++)

do có đậm độ mầu của băng nhạt và kích thước nhỏ hơn Từ nhiệt độ thứ tư cho đến hết các băng được đánh giá là (+++) do có đậm độ mầu của băng rất

rõ và kích thước của băng lớn

Mặt khác, khi nhìn vào kết quả điện di ta thấy có những băng không đặc hiệu ở một số nhiệt độ như:

+ Có băng không đặc hiệu với kích thước nhỏ và đậm độ rất nhạt ở phía

trên của băng FliC-d (750 bp) ở các điều kiện nhiệt độ: 46; 46,3; 47,4; 49,2;

51,5; 62; 64,1; 65,7; 66,5 oC Kích thước của băng này khoảng > 1000 bp

+ Có băng không đặc hiệu với kích thước vừa và đậm độ nhạt ở khoảng

giữa 2 băng Prt (258 bp) và ViaB (439 bp) ở các điều kiện nhiệt độ: 46; 46,3;

47,4; 49,2; 51,5 oC Kích thước của băng này khoảng 400 bp

+ Có băng không đặc hiệu với kích thước vừa và đậm độ nhạt ở phía

dưới của băng Prt (258 bp) ở các điều kiện nhiệt độ: 47,4; 49,2; 51,5 oC Kích thước của băng này khoảng 100 bp

Như vậy dựa vào đậm độ mầu, kích thước băng ADN và có tạo băng không đặc hiệu hay không, chúng tôi thấy rằng khoảng nhiệt độ gắn mồi tốt nhất là từ 54,1 - 59,5oC

3.3.2 Tối ưu nhiệt độ kéo dài mồi

Các thành phần của PCR được trộn và chia đều ra 12 mẫu phản ứng Khi máy chạy, chỉ có nhiệt đội kéo dài mồi là thay đổi giữa các giếng khác nhau Kết quả sau khi chạy PCR, điện di thu được như sau: