Bước đầu phát hiện nhiễm hantaanvirut trên quần thể bệnh nhân tại một số tỉnh đồng bằng miền bắc việt nam 1998 2000

Hantaan virút có bốn nhóm huyết thanh HT ký sinh ở bốn loài gậm nhấm riêng biệt là: Virút Hantaan với loài Apodenu; Virút Seoul với loài Rattus; Virit Puumala với loài Cleiữrionomys và v

BO Y TE VIEN VE SINH DICH TE TRUNG UGNG

BƯỚC ĐẦU PHAT HIEN

NHIEM HANTAANVIRUT TREN QUAN

THỂ BỆNH NHÂN TộI MỘT SỐ TỈNH

DONG BANG MIEN BAC VIET NAM

1998 - 2000

elle

CHU NHIEM DE TAI:

PGS.TS TRUGNG UYEN NINH

_/ | ul

HÀ NỘI 9 - 2000

FAS 212I<e

DANH SACH CAN BO THAM GIA THUC HIEN DE TAI

GS.TS Hoàng Thuỷ Nguyên,

GS.TS Hoàng Thủy Long, GS.TS Trần Văn Tiến, GS5.TS Huỳnh Phương Liên,

Cán bộ tham gia dé tai:

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

1 TS.Nguyễn Hồng Hạnh,

2 TS Lê Quỳnh Mai,

3 CN Trương Thừa Thắng

4 KTV Nguyễn Thị Thành,

5 TS Hoàng Văn Tân,

-6 BS Nguyễn Văn Tâm

Viện y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới

7 TS Cao Văn Viên

Vụ Y tế dự phòng, Bộ Y tế

8 TS.Trịnh Quân Huấn

Kết quả chẩn đoán huyết thanh của các mẫu thí nghiệm

đối với kháng nguyên virut Dengue, Viêm não Nhật bản B

và Chikungunya

Sự phân bố bệnh phẩm nghi mắc Hantaan virut theo địa

dư, lứa tuổi

Sự phân bố bệnh phâm nghi mắc Hantaan virút theo

lứa tuổi Kết quả huyết thanh học Vectơ truyền bệnh Hantaan virút ở một số tỉnh miền Bắc

Việt nam

Kết luận

Đề nghị Tài liệu tham khảo

Trang

3-10 11-11 11-13 13-17

46

AT

48 - 54

NHONG CHO viET TAT TRONG BAO CAO

Centre of infection Diseases

Trung tâm các bệnh nhiễm trùng

Centre of Diseases Control

Trung tam kiém soat bénh tat

Enzym linked Immunosorbent Assay

Thử nghiệm miễn dịch men

Haemorrhagic Fever with Renal Syndrom

(Sốt xuất huyết hội chứng thận)

Hantaanvirus Pulmonary Syndrome

(Sốt xuất huyết hội chứng phổi)

Hemagglutination Inhibition test

Huyét thanh

(Immunofluorescent indirect Antibody Technique)

Ky thuat mién dich huynh quang gian tiép

(Immunofluorescent direct Antibody Technique)

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

lgM Capture ELISA

Kỹ thuật mién dich enym phat hién IgM

Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization tests

Kỹ thuật trung hoà và Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử

Sốt Dengue

Sốt xuất huyết Dengue

Tổ chức Y tế Thế giới

Viện Vệ sinh Dịch tế Trung Ương

World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế giới)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt xuất huyết hội chung than (HFRS) dã gây nên những trận dịch làm ảnh hưởng

đến sức khoẻ của cộng đồng nhân dân các nước Trung quốc, Triều tiên và các phần

khác ở châu Au va chau A Can nguyên của bệnh này đã duoc Ho Wang Lee HW (12, 13), Trường Đại học Tổng hợp Seoul, Hàn quốc phát hiện vào năm 1976 Tác

giả không những đã dưa ra thường qui giám sát chẩn đoán huyết thanh và phân lập viiút Hantaan trong phòng thí nghiệm mà còn sẵn xuất và nêu hướng nghiên cứu

Vacxin để phòng bệnh này trong tương lai

Cac Hantaan virtit thudc ho Buryaviridae lA tac nhân chính gây nên hai thể là sốt

xuất huyết hội chứng thận (SXHHCT- Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome- HERS) và sốt xuất huyết hội chứng phổi ở người (SXHHCP- Hantaanvirus pulmonary syndrome - HPS) Để phân Diệt các virút trong nhóm, người ta thường dùng các phần ứng huyết thanh để phát hiện kháng thể IgM và IgG thông qua các kỹ thuật ELISA, Ngưng kết hạt, Ngưng kết hồng cầu, Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

hoặc phản ứng Trung hoà giảm đám hoại tử (PRNT) hay phân lập trên các dong té

bao VERO- £6, LLC-MK2 réi nhan biét bang phan tng miễn dịch huỳnh quang voi kháng thể đơn đồng Hantaan virút có bốn nhóm huyết thanh (HT) ký sinh ở bốn loài gậm nhấm riêng biệt là: Virút Hantaan với loài Apodenu; Virút Seoul với loài Rattus; Virit Puumala với loài Cleiữrionomys và virút Prospect Hill véi loài

Microtus, Cac virút Hantaan, Seoul và Puumala gây nên bệnh sốt xuất huyết hội

chứng thận với thể lâm sàng diễn biến từ nhẹ đến nặng Như vậy ổ chứa virút để

truyền bệnh Hantaan là chuột

Năm 1932, Cộng hoà liên bang Nga phát hiện bệnh này tại thung lũng sông Amur (34) ở miễn Tây Nam nước Nga Trong dại chiến thế giới lần thứ II đã có 12.000

lính Nhật bản mắc bệnh này khi đóng quân tại thung lũng trên Mùa thu năm 195I, khí quân đội Hoa Kỳ tham chiến ở miễn Bắc Triểu tiên cũng đã có nhiều lính mắc bệnh với hội chứng sốt cao, nhức đầu, đau các khớp, xuất huyết Các nhà Dich té học của cic nude Hungary, Czechoslovakia, Bulgaria, Romania, Yugoslavia cũng thấy bệnh này xuất hiện tại bán đảo Scandinavia Chiu và CS (3) cũng thấy Hantaan

virút hội chứng thận ở Mongolia và19 tỉnh Trung quốc

Trong những năm gần đây, ở Việt nam số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng giống bệnh sốt xuất huyết Dengue nhưng các xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh với các kháng nguyên 4 týp virút Dengue, Viém nado Nhat ban B, Chikungunya va phan lap

trên tế bào mudi Aedes albopictus dong C6/36 rồi nhận biết bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng 4 týp virút Dengue đều cho kết quả âm

tính Vậy trong số bệnh nhân này liệu có người mắc bệnh do Hantaan virút gây nên

hay không? Đứng trước vấn đề đó, chúng tôi đã tiến hành xin đăng ký và được Bộ Y

tế chấp thuận cho phép tiến hành đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ:

"Bước đầu phát hiện nhiễm Hanfaan virút trên quân thể bệnh nhân tại một số

tỉnh đồng bằng miền Bắc Việt nam từ năm 1998 đến năm 2000"

,

Mục dích của Đề tài là:

Thông qua việc phát hiện kháng thể kháng virút Hantaan ở một số người bệnh và

một vài loài gâm nhấm sinh sống tại vùng này để có thể hình dung bộ mặt dịch tễ

học mô tả ban đầu tình hình nhiễm Hanmtaan virút tại một số tỉnh đồng bằng miền

Bắc Việt nam trong giai đoạn 1998 - 2000 Trén cơ sở kinh phí hạn hẹp cũng như trên cơ sở mục dích nghiên cứu cần có thời gian đủ để thực hiện, bởi vậy để tài được thiết kế qua hai giai đoạn:

1 Giu đoạn 1998 - 2000:

Mô tả bạn đầu tình hình nhiễm Hantaan virút trên quần thể bệnh nhân và mối liên

quan giữa bệnh nhân với ổ chứa là chuột

2 Giai đoạn sau năm 2000

Mở rộng điều tra trên quần thể dân cư và ổ chứa virút Hantaan

CHƯƠNG I

TONG QUAN TAI LIEU

1d Lich sté va tinh hinh bénh Hantaan virit

Chuột là nguyên nhân chính lưu truyền bệnh Hantaan virút Người dầu tiên phát hiện ra Hantaan virút là Lee HW và Lee PW vào năm 1976 (12, 13) Lúc

đầu họ đặt tên là Sốt xuất huyết Triêu tién (Korean Hemorhagic Fever- KHF)

và bây giờ gọi là bệnh do virút Hantaan từ phổi của chuột đồng gây nên (24,

25) Virút Hantaan lần đầu tiên được phân lập từ phối của loại chuột đồng

(Apodemus agrarits) ma virdt nay gay nén nhitng trận dịch xuất huyết với hội

chứng phổi ở nhiều nước trên thế giới Những nghiên cứu hồi cứu về tình bình Dịch tế ở nước Cộng hoà nhân dân Trung họa, ở vùng Tây Nam A của Liên

bang XO Viét, ving Bankan, ban dao Scandinavia thi nguyên nhân chính các

vụ dịch đó là do Hantaan virútL thuộc họ Bunyavirus gây nên (27, 28) Virút phân lập được từ phối của loài chuột (C/e@thrionomys @Ïareolus) sống gần các sông hồ (1) Giám sát huyết thanh bệnh nhân của các nước: Thuy điển, Phần

lan, Hungary, Yugoslavia và phần Đông Âu của nước Nga thì thấy rằng týp huyết thanh Puumala và Hantaan đều lưu hành ở các vùng này

Kháng nguyên của Virút Hantaan còn được phát hiện ở người dân sống trong thành phố các nước Hàn quốc, Trung quốc và Nhật bản Có thể tại các vùng nay virút truyền từ người sang chuột nhà (Rattus norvegicus va Rattus rattus) với các triệu chứng lâm sàng thể nhẹ như viêm thận, choáng hoặc xuất huyết hay triệu chứng giống với bệnh cúm nhưng có albumine trong nước tiểu (14) Virút ở chuột sống trong thành phố được đặt tên là Virút Seoul; Bằng phương pháp huyết thanh virút này đã thấy ở châu Phi, miền Bắc và miền Nam châu

Mỹ, Ấn do, mién Trung du cia New Guinea; Tay Thai Bình dương (bao gồm

cả Hawaii Fiji, Philippine, Đài loan và một vài cảng biển của Hoa kỳ Người

ta đã tiến hành phân lập trên chuột bất được ở châu Mỹ thì kết quả thấy virút giống như Hantaan (19, 20) Mặc dù triệu chứng lâm sang không giống như những điểu đã biết nhưng huyết thanh vẫn ghi nhận có kháng thể kháng

Hantaan virút (44, 52) Một điểu làm mọi người ngạc nhiên khi phát hiện thấy

1% số máu dự trữ tại Ngân hàng máu Hoa kỳ có kháng thể kháng với virút Hantaan Người ta cũng phát hiện thấy một số người mắc bệnh này ở thể mãn tính tại các phòng thí nghiêm nghiên cứu về chuột ở các nước Nhật bản, Pháp,

Bi (Belgium) va Han quốc Cũng có những báo cáo về tính nguy hại của virút

Hantaan đối với những nhà khoa học khi nghiên cứu về bệnh này tại các nước

Nhat ban, Bi, Han quéc va Anh (21, 48).

Bởi vậy Hantaan và các virút trong nhóm đã là nguyên nhân chính gây nên những bệnh về thận ở lục địa Âu - A với các triệu chứng nghiệm trọng như xuất huyết, Ở Tây A có tỷ lệ mắc trên một trăm ngàn dân từ 5% đến trên 20%

Tỷ lệ mắc thấp được tìm thấy ở những người mắc Hantaan thể thận ở vùng bán

dao Scandinavia Tat ca những bệnh nhân thể nhẹ và một vài trường hợp xuất hiện thể thận ở vùng Bankan và phần Viễn Đông nước Nga thì việc giám sát

huyết thanh bệnh nhân có thể thấy hai thể là: thể diển hình hoặc thể không

điển hình (22,33)

Có 4 týp huyết thanh là Hantaan, Seoul, Puumala và một týp mới phân lập được từ giống chuột Äficrotus pensyhanicus sống trong đồng cỏ ở Hoa kỳ Các bằng chứng về huyết thanh hoc của Virút Prospect HiJ1 đã được tìm thấy ở

người Mỹ chuyên nghiên cứu về thú, nhưng dấu hiệu lầm sàng về tình trạng

nhiễm bệnh này là không rõ rằng

Virút gây nên bệnh sốt xuất huyết được mô tả đặc điểm là làm xuất huyết ở bệnh nhân Chúng có thể là nguyên nhân làm thay đổi trật tự chứa trong RNA

cla ho Flavivirus, Arenavirus vA Bunyavirus Bénh s6t vang, nguyén nhan

chính đo muỗi mang Flavivirus; mac di đã được mô tả hồi đầu thể kỷ, nó

cũng thuộc nhóm virút gây nên bệnh sốt xuất huyết

Cần bệnh mang đấu hiệu trên với sự phân biệt của nó sẽ khiến các thày thuốc lâm sàng chú ý đến tình hình dịch tế của bệnh sốt xuất huyết mà lúc đó còn

gọi là Sốt xuất huyết Triều tiên và bên cạnh đó còn một bệnh khác mà nguyên nhân là do virut Hantaan thuộc họ 8#unyaviridae gây nên Cồn bây giờ gọi là sốt xuất huyết hội chứng thận (Hemorrhagic Fever with Renal Syndrom-

HFRS) Từ những trường hợp người sống ở thành phố bị mắc, bệnh sẽ lan truyền tiếp sang chuột sống ở vùng ngoại ô các nước Triều tiên, Nhật bản và Trung quốc Dịch viêm thận lan truyền sang bán đảo Scandinavia Một số bệnh nhân không có triệu chứng xuất huyết nên nếu căn cứ vào dấu hiệu của sốt xuất huyết thì dễ bị lâm lẫn Tuy nhiên nguyên nhân của toàn bộ bệnh được biết của virút này đã được mô tả đặc điểm bởi có triệu chứng protein niệu và ure huyết, Virút được truyền một cách lặng lẽ từ nước thải của người

mang bệnh sang chuột và chuột lại tích trữ ở trong phổi, nước bọt và nước tiểu

(50) Toàn bộ ổ chứa virút trong chuột nhà được lan truyền sang liên họ

Muroidea va ho Muridae (giéng Apodemus va Rattus) hay ho Cricetidae (gidng: Clethrionomys va Microtus) Boi vậy tên của virút Muroid gây bệnh thận đã được gợi ý xếp vào nhóm gây bệnh Hantaan virút (7),

Năm 1932, các nhà khoa học người Nga đã phát hiện một bệnh mới ở hạ lưu

sông Amur nằm ở miền Tây Nam nước Nga Trước đó, hàng năm thường có

những đợt dịch xảy ra tại thung lũng sông Amur, ranh giới giữa Manchuria và Liên bang Số viết (34) Rất gần đoạn cất chéo của đồng sông Amur, chay doc

,

theo là các nhánh sông Manchurian của nó và đã có 12.000 trường hợp mắc bệnh trên tổng số một triệu quân đội Nhật bản dóng tại vùng này Những nghiên cứu hoàn toàn độc lập gần đây của các nước đã chỉ ra rằng virút là căn nguyên của bệnh có các triệu chứng lâm sàng và dịch tễ giống nhau (9,33) Tất cả các nhà khoa học Nga và Nhật bản đã thành công trong việc phân lập virút từ mầu tĩnh mạch, cơ và nước tiểu của những bệnh nhân tình nguyện mắc

bệnh này ở vào những ngày đầu mắc bệnh (8) Hàng loạt những lần cấy truyền

gây miễn dịch trên người đã cho kết quả tốt Tuy nhiên, họ đã không có kinh nghiệm trong nghiên cứu về động vật Một đội thám hiểm người Nga đã tiến

hành nghiên cứu bệnh này ở miền Tây nước Nga vào năm 1939 - 1940; Trong

khi dó Nhật bản cũng có số liệu từ 1936 đến 1942 về bệnh này Người Nga gọi bệnh này là Churilov do virút gây nên; Còn các nước phía Tây gọi là dịch xuất huyết viêm thận Trước đó người Nhật đã khu trú tình hình địch tễ bệnh sốt xuất huyết (Ryukosei shukkelsu netsu) và gọt tên trên cơ sở địa lý của từng

vùng để đặt tên các trường hợp mắc bệnh của họ như: dich Ertaokiang (Nidoko

fever), sốt Songo (Sunwu) và dịch Tayinshan Theo Y văn của Hoa kỳ thì họ

cho đó là dịch sốt xuất huyết Nhưng ngược lại, những năm sau đó người Nga

có khuynh hướng nghĩ rằng bệnh trên chẳng qua là bệnh sốt xuất huyết với hội chứng thận vì những dấu hiệu dịch tễ được phát hiện sớm (ở miền Tây) là xuất

huyết thận

Mùa thu năm 1951, nhiều binh lính Hoa kỳ đóng ở Triểu tiên bất đầu xuất

hiện ốm với triệu chứng: ớn lanh, sốt cao, kiệt sức, chán ăn, nhức đầu như búa

bổ, phần nhiều người bệnh cảm thấy dau cơ và đau khớp, buồn nôn, mặt hồng

hào rồi biểu hiện sự xuất huyết bao gồm đốm xuất huyết, xuất huyết mảng và xuất huyết ở đáy mắt (củng mạc) Các xét nghiệm thường biểu lộ rõ ràng về sự thay đổi bạch cầu và protein niệu Đáng chú ý là người bệnh ốm đột ngột, nhịp

đập tim không ổn dịnh, sinh lý không bình thường, dị ứng và xuất hiện ban

xuất huyết, bạch cầu tăng và xuất huyết giống như bệnh đậu mùa; Viêm thận nhẹ hay rối loạn chức năng khác của thận (7, 37)

Cuối năm 1951, người ta đã lấy được 80 mẫu máu của 1000 người đã từng sống Lại khu vực này Một năm sau đó, một nghìn trường hợp khác cũng được kiểm tra lại tại Triều tiên Tất cả các trường hợp bao gồm cả đội quân Hoa kỳ

và Hàn quốc đều có đáp ứng kháng thể Năm 1953, tất cả các trường hợp đều

được kiểm tra và sang năm [954 thì dừng; Kết quả có 3.200 lính Hoa kỳ mắc Dịch tiếp tục lan trần trong đám lính và thường xảy ra hàng năm Dịch này trở thành một vấn để lớn khi lan sang đến quân đội của Hàn quốc và vì thế việc giám sát vượt qua cả khu phi quân sự Bệnh ngày một lan rộng từ người dân sống ở địa phương đến những người dân sống xung quanh khu vực này của Hàn quốc Mặc dù tỷ lệ chết vượt quá !0% và có khoảng 5% bệnh nhân được thày thuốc cứu chữa nhưng kết quả không khả quan cho công việc khống chế bệnh này (38)

Trong cuộc chiến tranh Triểu tiên, các thầy thuốc quân đội Hoa kỳ đã thiết lập một Trung tâm điều trị bệnh sốt xuất huyết ở gần Uijonbu (nay đã đóng cửa) Nơi dây đã có một số lượng lớn bệnh nhân Nam hàn mắc bệnh này, Tất cả các bệnh nhân đều được đưa về bệnh viện trung tâm bằng máy bay trực thăng: Tại

dây bệnh nhân được điểu tra và chăm sóc cẩn thận (49) Quân đội Hoa kỳ

nhiều lần muốn phối hợp với Nga và Nhật bản để tiến hành nghiên cứu vật chủ

bao gồm cả khi, tỉnh tính, các thú nhỏ và nuôi cả các tế bào người

Trong khu tái dịnh cư của người dân vùng phi quân sự, những người mắc bệnh

thường là người dân Nam hàn, Một số ít trường hợp, mắc nhẹ, thời gian mắc

ngắn và thường là ở trẻ em trên 10 tuổi Không có một bằng chứng tìm thấy ở một bộ phận người dân có khả năng chống lại với bệnh này

Năm 1958 và 1959, các thày thuốc Nga đã xác mình mối liên quan giữa lâm sàng, bệnh học và dịch tễ bệnh sốt xuất huyết Họ đã nghiên cứu ở Yaroslav Oblast, dọc phía thượng lưu sông Volga, Phần Đông Âu của dãy núi Uran thuộc Nga, kết quả chỉ thấy bệnh nhân mắc Hantaan virút thể thận Họ cũng ghỉ nhận cớ một vài bệnh nhân mắc bệnh được gọi là sốt Tula Theo báo cáo từ

1930 đến 1934, ở Tula có 5 trường hợp chết trên tổng số 915 trường hợp mắc bệnh này Bởi vậy sốt Tula được mô tả như bệnh Hantaan virút thể thận (HFRS) Bệnh này đã từng gây ra các trận dịch ở Liên bang cộng hoà Xô Viết trước kia Điều đó đã nói lên rằng bệnh Hantaan virút thể thận đã từng lan trần rộng rãi miền Đông châu Âu đến miền Tây dãy núi Uran; Từ phía Tây Bắc đến vùng Murmansk Oblast, và từ miền Tây Nam tới Hungaria, Romania

và Yugoslavia Dịch viêm thận trải dài suốt bán đảo Scandinavia (6) Hơn nữa, rất có khả năng đã xuất hiện những trận dịch lớn giữa miền Tây Liên bang Nga đến phía Bắc Trung quốc (Machuria), Triều tiên và Châu Âu Năm 1957 Chiu và C5 (3) đã báo cáo có bệnh nhận mắc Hantaan virút thể thận ở sa mạc

Mongolia thuộc nước Cộng hoà nhân dân Trung Hoa Sau lần phát hiện đó

(1963), bệnh Hantaan virút thể thận đang là một vấn đề cần quan tâm ở miền Nam và miền Trung nước Công hoà nhân dân Trung hoa Năm 1981, bệnh Hantaan virút thể thận đã ghi nhận có 19 tỉnh thành của Trung quốc và trải

dài từ Châu Âu đến Châu A

Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh Hantaan virút thể thận ở các vùng cũng khác

nhau Theo số liệu của Viện nghiên cứu các bệnh do virút gây ra của trường

đại học Tổng hợp Korea (Bảng 1) thì số người mắc nhiều nhất là Trung quốc: 100.000 đến 150.000 trường hợp/ năm; Rồi đến Liên xô 11.000 trường hợp Nhưng khi đề cập đến tình hình Hantaan virút phân bố ở nhiều quốc gia thì lại phải kể đến các nước Đông Âu: cao nhất là Phần lan, thấp nhất là Anh

6

Bang I Những số liệu bệnh nhân mắc Hantaan virút thể thận

ở các nước trên thế giới

Số TT | Tên nước Số bệnh nhân mac HFRS

Châu Á

1 Trung quốc 100 000 - 150 000/ Năm

Nhin vao Hinh t Vé sự phân bố bệnh nhân mắc Hantaan virút ở vùng nông

thôn, thành thị và động vật sống trong nhà thi thấy có rải rác từ châu Mỹ qua

châu Phi và đặc biệt miền Tây Bắc châu A rồi đến Đông Âu

Bệnh sốt xuất huyết Argentine và Bolivian

Trong số virut gây bệnh sốt xuất huyết, chỉ có sốt xuất huyết Argentine là

nguyên nhân của Jin areiavirus và Sốt xuất huyết Bolivian là nguyên nhân

gay bénh Machupo Arenavirus Tat cả chúng đều có ở Calomys sp trong tự nhiên, chúng có thể lưu hành qua dường hàng không và gây bệnh thận chơ người Từ những virut tiểm tầng này không gây bệnh cho Cøfomys, nhưng với kháng nguyên virut này thì lại có trong phổi và trong nước bọt Chúng có thể lan truyền bệnh sang chuột nhất, chuột cống Chúng phát triển song song với

Hantaanvirrut cia họ Burnyaviruses Hon nữa, hình thái đặc thù của

hantaanvirut không có những nét đặc trưng giống như Arenavirus (31, 32), bao gồm cả kích thước lẫn hạt viroplasm Tuy nhiên những chuỗi RNA và đoạn gen có đầu 3° của Hantaan virút thì chỉ có ở họ Bunyavirues Tuy nhiên, có thể Hantaan virut không c6 quan hé vét Arenavirus

Dich té

Bệnh sốt xuất huyết thể thận do Hantaan virút gây ra thường xuất hiện ở vùng nông thôn, các trang trại hay trong quân đội khi đi đã ngoại phải ngủ ngoài trời Tuy nhiên những tài liệu gần đây (29) còn cho biết thêm bệnh này được

phát hiện khắp nơi trên thế giới

Sự phân bế

Theo kết quả giám sát huyết thanh học và những tài liệu báo cáo cho thấy Hantaan virút phân bố khấp nơi trên thế giới Virút Hantaan tốn tại trong chuột đồng, chuột sống trong thành phố và có cả ở chuột nuôi trong phòng thí nghiệm (2!, 51) Sự phân bố bệnh nhân mắc Hantaan virút thể thận, chuột đồng, chuột sống trong các vùng thành thị, chuột nuôi trong các phòng thí nghiệm ở trên thế giới đã chỉ ra trong Hinh 2

Kết quả của việc phát hiện kháng thể kháng Hantaan hoặc Seoul virut trên người và chuột sống trong thành phố cho thấy bệnh này đã có mặt tại: Châu

My (Alaska, Argentina, Brazil, Canada, Columbia, Hoa ky, quan dao Hawaii);

Ving Tay Thai Binh Duong va Dong Nam Chau A (Burma, Fiji, Héng kong,

India, Malaysia, Sri Lanka, Singapore, New Guinea, Philippine, Dai loan, Thai lan) Châu Phi (Cộng hoà Trung Phi, Ai cap, Gabon, Nigeria, Sudan,

Madagascar, Uganda).

1.2 Virut Hantaan

Đoạn cuối của chuỗi nucleotid có 3 đoạn RNA riêng lẻ, đầu 3° chỉ cho thấy 4 týp huyết thanh của virút Hantaan thuộc họ Bưnyaviridae (45) Bốn týp huyết thanh mày đều có đáp ứng trên tế bào Vero - E6 và định týp bằng các kỹ thuật Kháng thể miễn dịch huỳnh quang (The Immunofluorescent technique), Thi nghiệm Trung hoà giảm đám hoại tử (Plaque- reduction neutralization test), xét nghiệm Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay), xét nghiệm Miễn dịch enzym (Enyme- linked immunosorbent assay), xét nghiém Ngung két hat va Ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemadsorption and Hemaggliutination inhibition (HI) test)

Mối liên hệ kháng nguyên của 4 týp huyết thanh có hiện tượng chéo rất rõ trong thí nghiệm kháng thể huỳnh quang (45, 46) Ngược lại, chúng ít có quan

hệ hoặc không có hiện tượng chéo khi tiến hành phản ứng trung hoà (45, 46)

Gần dây, người ta đang dùng kháng thể đơn dòng để phân lập hantaanvirut

Bởi vậy việc cung cấp kháng thể đơn dòng đế phân lập giống virut là hết sức cần thiết; Mặt khác, vẫn phải phát hiện kháng thể virút Hantaan bằng phản

ứng trung hoà (32, 46)

1.3 Ổ chứa virut Hantaan dé truyền bệnh

Phần lớn virút được chuột bài tiết qua nước bọt và nước tiểu (Apodemus agrarius (17) va Clethrionomys glareolus (55)) Su bai tiét virut Hantaan ở

giống chuột Apodezmus qua nước bọt ít nhất là một tháng một lần và qua nước tiểu là cả 12 tháng

Sự lan truyền virút Hantaan đã được chứng minh theo đường nằm ngang ở

chuột 4/odemws Trong nhiều thí nghiệm người ta đã thấy chuột Ajodermiws

mang mâm bệnh và lan truyền virút Hantaan Thường sau 10 ngày chuột

Apodemus mang virút Hantaan thì có khả năng truyện bệnh này Điều đó

chứng tỏ việc vệ sinh và tẩy trùng là vô cùng cần thiêt sau khi tiến hành thí nghiệm trên chuột Chuột Apodemxs mang mầm bệnh và lan truyền virút Hantaan qua nước bọt, nước tiểu hoặc phân Chuột nhà, chuột cống và chuột làm thí nghiệm sẽ nhiễm virút này trong vòng tử 1 đến 2 tuần (17) rồi truyền tiếp qua người Gặp điều kiện thuận lợi bệnh Hantaan virút hội chứng thận sẽ

bùng nổ thành dịch (Hình 3)

11

Hinh 3 Chu ky truyền bệnh Hantaan virtt

Ổ chứa virút Hantaan tiên phát trong thiên nhiên

Theo báo cáo về dịch tễ của Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều tiên thì ổ chứa virút Hantaan là giống chuột A?odemts agrariuscorea; Cdn ở Phần lan và phía

Tây dãy núi Uran thì virút Puumala lại nằm trong chuột đồng và giống

Clethrilonomys glareolus, Trong các thành phố của Cộng hoà dân chủ nhân dan Triểu tiên, Nhật bản và Trung quốc thì giống chudét Rattus rattus và Rattus norvegicus là ổ chứa của virút Seoul Kháng nguyên Hantaan virút đã được phát hiện thấy ở 16 giống chuột khác nhau trong đó có 4 loài ở Cộng hoà liên bang Xô viết và Trung quốc (40, 54) Theo kết quả thí nghiệm thì chuột cống rất nguy hiếm vì nó mang cả Hantaan lẫn Seoul virút Trong thực tế đã có những trận dịch xảy ra tại các phòng thí nghiệm của các Viện nghiên cứu như:

Bỉ, Trung quốc, Nhật bản, Anh và Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều tiên

Vectơ truyền bệnh Hantaan virút

Người ta đã biết rằng Hantaan virút là một thành viên của họ Bunyaviridae nó

có thể lan truyền trong nhóm chân đối Có giả thuyết cho rằng virút Hantaan thường Ẩn dấu trong loài chuột sống ở ngoài đồng (8) Cho đến tận bây giờ, người ta vẫn chưa phân lập được virút Hantaan từ nhóm động vật chân đốt cũng như nuôi virút này trong tế bào một lớp có nguồn gốc từ động vật chân

d6t (Arthropods)

Nhóm người hay mắc bệnh Hantaan virút

Bệnh thường xuất hiện ở nhóm tuổi từ 20 đến 50 Hiếm khi gặp ở trẻ em dưới

10 tuổi và những người già Đàn ông dễ mắc hơn đàn bà Nạn nhân là những

,

12

người nông dân mới bước vào nghề có công việc thường xuyên ở ngoài đồng; Còn đối với những người lính thì thường xảy ra ở những người hay phải đi dã ngoại Nhưng nhìn chung thì nhóm người hay mắc bệnh do virút Hantaan gây

ra là:

- Những người làm công tác trong phòng thí nghiệm có nghiên cứu bệnh này

- Những công nhân nuôi động vật thí nghiệm

- Công nhân chăn nuôi

- Những phòng thí nghiệm giám sát chuột

- Các nhà sinh vật học,

- Quân đội

- Nông dân,

- Thợ sẵn và những người hay đi cẩm trai

1.4 Phát hiện và phân lập virút Hantaan

1.4.1 Phân lập virút Hantaan

A Mau phân lập virút Hantaan được lấy từ bệnh nhân hoặc chuột Công việc này thường rất khó khan

a Thu thập mẫu từ bệnh nhân

Hantaan và Seoul virút thường được lấy từ huyết thanh hay máu toàn phần của bệnh nhân có triệu chứng lầm sàng diển hình từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 9 sau khi sốt Ngoài máu và huyết thanh, người ta còn có thể lấy nước bọt, phân,

nước tiểu của bệnh nhân để phân lập Nhưng kết quả thường kém

b Thu thập ổ chứa virút,

Người ta cũng có thể phân lập virút Hantaan từ những ổ chứa virút như:

- Virút Hantaan ban ddu duge phan lap tit phéi cha Apodemus agrarius coreae

- Từ phổi và lách của C!ethrionomys glareolus

- Từ phổi và lách của loại chuột nhà (Ra/fus norvegicus và Rattus raftus) hoặc trong chuột nuôi trong phòng thí nghiệm

B Tỷ lệ phân lập dương tính cao nếu bệnh phẩm được giữ tươi hoặc cất trong lạnh sâu - 70 ”C hay trong Nitrogen lỏng hoặc đá khô Nếu cất virút Hantaan trong lạnh sâu cần thay đổi pH để bảo đảm virút sống bên lâu

C Chuẩn bị mẫu thí nghiệm,

Huyết thanh hay máu toàn phân trước khi cấy vào dòng tế bào cần phải pha loãng theo tỷ lệ từ 10% đến 20% trong môi trường Eagle (Eagle`s minimum

essential medium) với 10% huyết thanh bào thai bê (Fetal bivine) Còn đối với

các mô bệnh phẩm khác thì cần rửa cẩn thận, nghiền trong máy thật kỹ rồi hoà trong môi trường Eagle; Sau đó ly tâm, chất lấy nước nổi và cuối cùnglấy

dung dịch nổi đó để cấy vào tế bào nuôi

13

D Lấy nước nổi để phân lập

Phan lập trên động vật

Dé dang phan lập Hantaan và các virút có quan hệ gần nếu được thực hiện với

số mẫu của động vật thí nghiệm khác nhau; Đặc biệt đối với các vật chủ chứa virut (chuột giống Apodemis, Clethrionomys và các gống chuột khác) rất

thuận lợi cho việc phân lập virut Các giống virut Seoul và các giống virut có

quan hệ gần dễ dang nhân lên trên chuột thí nghiêm (15) Những nghiên cứu

huyết thanh học trong phòng thí nghiệm về vụ dịch Hantaan virut hội chứng

thận bùng nổ đều là từ chuột thí nghiệm; Chúng có đáp ứng kháng thể rất cao Chuột bạch ổ không phải là vật chủ tốt cho việc gây nhiễm mặc đù khi gây

nhiễm tỷ lệ chết cao

Kinh nghiệm cho thấy khi gây nhiễm virút Hantaan theo đường cơ bắp (vùng cổ) với liều lượng 0,5 mi thì thường dùng loại chuột trưởng thành Thế nhưng kết quả phân lập tốt nhất vẫn là trên chuột giống Apodemus (24)

Để có kết quả phân lập thì phải mất từ 20 đến 30 ngày hoặc trên 60 ngày Hiệu giá kháng thể thường đạt tới 512 hoặc huỳnh quang dương tính Kháng nguyên

hầu hết hay lấy ở phổi, dịch phổi hay trong nước nổi nuôi tế bào

Nếu âm tính thì phải cấy truyền nhiều lần mới có kết

Phan lap trên tế bào nuôi

Hantaan virút và các virút trong nhóm gần còn có thể phát hiện trực tiếp qua nước nổi nuôi tế bào Tuy nhiên cũng phải cấy truyền nhiều lần vì hiệu gía ban đầu hay thấp hoặc dễ bị nhiễm trùng

Gần đây người ta hay chọn đồng tế bào Vero-E6 đế phân lập virút Hantaan

(American Type Culture Collection, C 1008) Những dòng tế bào khác cũng hay được dùng là tế bào biểu bì phổi A-549 (ATCC CCL 185) và tế bào phổi chuột tiên phát

Huyết thanh bệnh nhân hay máu toàn phân hoặc mô được gây nhiễm vào dòng

tế bào Vero-E6 với khối lượng tiv Im] đến 2 ml vào tế bào một lớp của chai

nuôi tế bào cỡ 25 cm Sau đó cho thêm môi trường phát triển để đạt đến thể

tích cuối cùng từ 5 ml đến 7 mi Nuôi tiếp trong tủ ấm 37 °C (nhiệt độ thích

hợp là 35 °C)

Sau 12 - 14 ngày, nhận biết sự có mặt của virút bằng:

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng Đối với những chủng hoang dại thì phải cấy truyền nhiều lần mới cho kết quả

,

14

- Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử (PRNT)

1.4.2 Phát hiện Hamtaan virút bằng kỹ thuật huyết thanh học

1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFAT) đã giúp cho Lee HW và Lee PW(12)

phát hiện kháng nguyên Hantaan virút từ phổi của giống chuột Apodemus

agrarius vào năm 1976 và phái hiện kháng thể kháng lại kháng nguyên này

trong huyết thanh bệnh nhân mắc bệnh sốt xuất huyết Triều tiên (KHE:

Korean hemorrhagic fever) và trong huyết thanh từ chuột hoang dại Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi tại các viện nghiên cứu về virút, huyết thanh

dịch té học và các phòng thí nghiệm về bệnh học của các bệnh Hantaan virút

và các virút liên quan

Kỹ thuật kháng thể miễn dịch huỳnh quang có hai loại:

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct IED technique)

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Tndereet IEA technique)

2 Kỹ thuật miễn dịch enzyvme

Hiện nay, với bệnh này thì việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác là cần

thiết để chăm sóc và điều trị kịp thời đối với bệnh nhân mắc Hantaan virut hội

chứng thận Tuy nhiên, cho đến tận gần đây kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiện IgM (MAC-ELISA) mới được dùng để sử dụng một máu đơn chẩn đoán

bệnh Hantaan virút một cách đặc hiệu và nhanh chóng Kỹ thuật này đã được

Triêu tiên và Trung quốc áp dụng để phát hiện sớm hàng trăm bệnh nhân với chẩn đoán lâm sàng là sốt do Hantaan virút gây nên hội chứng thận Kết quả với máu một đã phát hiện hơn 95% bệnh nhân có đáp ứng kháng thể IgM đối với Hantaan viút, Bởi vậy kỹ thuật MAC-EBLISA hoàn toàn nhạy cảm với Hantaan virút Trong một thí nghiêm khác với hàng trăm mẫu máu bệnh nhân

được làm xét nghiệm và kiểm tra kỹ càng thì thấy sự sai sót chỉ xấp xi khoảng

1% Một số huyết thanh của bệnh nhân mắc Hantaan hội chứng thân ở thể cấp của các nước Hy lạp và Yugoslavia được xét nghiệm bằng kỹ thuật MAC- ELISA cũng cho kết quả tương tự như khi dùng kỹ thuật này phát hiện bệnh nhân trong ving Chau A

Hiệu giá IgM cao (lớn hơn 1/ 5000) thì thường thấy ở bệnh nhân mắc ở giai đoạn cấp tính Hiệu giá kháng thể IgM cao thường kéo dài một vài tuần, thậm

chí mặc dù kháng thể đặc hiệu thấp nhưng có thể kéo dài đến một năm hoặc

lâu hơn nữa,

Kháng thể IgG thường xuất hiện chậm hon kháng thé IgM, hiệu giá lại thấp

nhưng tổn tại lâu dài Dựa vào tính chất này người ta đưa ra kỹ thuật phát

hiện đồng thời cả hai loại kháng thể IgM và IgG

15

3 Kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu trong chẩn đoán

Hantaan virút hội chứng thận,

Rất khó khăn trong việc truyền và giữ giống virút Hantaan trong phòng thí nghiệm đế chấn đoán huyết thanh bệnh Hantaan virút hội chứng thận Bởi vậy

kỹ thuật miễn địch huỳnh quang gián tiếp trở thành một kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh chuẩn thức trong phòng thí của Lee HW và Lee PW (12) Để tiến hành kỹ thuật nầy, nguồn kháng nguyên chủ yếu được lấy từ phổi của động vật

mắc bệnh, Điều này gây nên sự phiền phức và nguy hiểm Để tránh sự phức

tạp trên, các nhà khoa học đã gây phiễm virút Hantaan lên dòng tế bào cảm thụ và chuột bạch ổ (10) Nhờ có hệ thống này chúng ta đã chủ động được nguồn kháng nguyên về số lượng cũng như chất lượng

Hiệu giá Ngưng kết hồng cầu (HA) của Hantaan virút đã được phát hiện đầu

tiên bằng phương ly tâm siêu t6c (Schmaljohn C.; Dalrymple J.) Nhiều thực

nghiêm về sau cho thấy kháng nguyên Ngưng kết hồng cầu có thể chuẩn bị từ não chuột bạch và tế bào nuôi sau đó tiến hành xứ lý bằng Sucrose - acetone (41, 43) Nhờ có nguồn kháng nguyên này, người ta đã thấy kết quả của kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy ngang bằng nhau Kháng thể Ngăn ngưng kết hồng cầu có thể tổn tại lâu dài trên 20 năm đối với bệnh nhân mắc bệnh Hantaan virút hội chứng thận; Nhưng

kỹ thuật này khi giám sát huyết thanh thì thường thấy có hiện tượng chéo

Kết quả cho thấy kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu đặc hiệu hơn kỹ thuật miễn địch huỳnh quang Bởi vậy kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu thường

được chọn đầu tiên để giám sát bệnh Hantaan virút về mặt huyết thanh học

Đây là một kỹ thuật khá nhạy cảm và đồi hỏi ít trang bị trong khi đó kỹ thuật

miễn dịch huỳnh quang lại cần những trang bị đất tiền như: kính hiển vi huỳnh

quang, các kháng thể, conjugate đặc hiệu

Kỹ thuật này phải trải qua các bước tiến hành như sau:

- Chuẩn bị kháng nguyên ngưng kết hồng cầu

- Chuẩn độ hiệu gía kháng nguyên

- Kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầuphát hiện hiệu giá kháng thể,

4 Kỹ thuật Trung hoà và kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử

(Plaque assay and plaque- reduction neutralization tests)

Hantaaan virút giống 76-118 có thể tạo nên những đám hoại tử trên tế bào một lớp (30) Trong thực tế, có nhiều virút mà trong đanh sách virút mà các nhà nghiên cứu khoa học Hoa kỳ thu thập được trên tế bào nuôi (American Type Culture Collection - ATCC VR 938) thi thay chúng có thể hình thành những đám hoại tử

16

Giống Hantaan virút ban đầu đễ đàng thích ứng với tế bào A 549 (ATCC CCL,

185) Những dám hoại tử của virút Hantaan tạo trên dòng tế bào A 549 rõ rang

như dòng tế bào LLUC- MK 2 (ATCC CCL 7) Gần đây người ta còn chọn được

dòng tế bào Vero - E6 để tiến hành kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử Việc

xuất hiện dòng tế bào này đã tạo điều kiện cho kỹ thuật Trung hoà giam đám hoại tử tiến hành dễ dàng với độ nhạy cảm cao

1.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh Hantaan virút thể thận

Nhiều người mắc bệnh Hamtaan virút thể thận sống ở vùng nông thôn của

Triều tiên, Trung quốc, Nhật bản và các nước Đông Nam châu A đều có triệu

chứng lâm sàng mà nguyên nhân giống với bệnh do virút Seoul (14, 15) gay nên Chuột sống trong các đô thị (RaffuUs norvegicus và Raffus raffäs) và chuột

thí nghiệm là những ổ chứa chính truyền bệnh này sang người Triệu chứng lâm sàng của bệnh này là: Sốt cao, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn, nhức đầu, đau

cơ, đau bụng, xuất huyết niêm mạc, gan to Dấu hiệu cận lâm sàng còn thấy protein niệu, tỷ lệ thể tích huyết cầu, bạch cầu,-tiểu cầu tăng cao

Bệnh thường thể hiện ở hai dạng: Thể mãn tính (11) và thể ác tính (29) Thể ác

tính thường xảy ra ở các nước châu A 0 Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều tiên có hàng trăm trường hợp bệnh nhân ở nông thôn và thành thị mấc; Tỷ lệ chết xấp xi 5% Ở Nhật bản, cuối năm 1985 có 126 trường hợp mắc, chết I1 Năm 1960, có khoảng 150 bệnh nhận nhập vào bệnh viện thanh phố Osaka thì

có 3 người chết (50) Theo báo cáo của các nhà khoa học Trung quốc năm

1984 có 100.000 bệnh nhân, năm 1985 là 150.000 trường hợp với tỷ lệ chết nằm trong khoảng từ 7% đến 15% Theo các nhà nghiên cứu khoa học Nga thì trong vòng năm năm đã có tới 11.000 trường hợp mắc bệnh này (16)

Phần lớn bệnh nhân mắc bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận ở châu Âu là ở thể mãn tính Hàng trăm trường hợp bệnh nhân ở các nước từ Bắc Âu như: Phần lan, Na uy, Thụy điển đến Đông Âu như: Bungaria, Czchoslovakia, Hungary, Romania, Yugoslavia, Anh, Đức, Bỉ, Pháp và Hy lạp) đều có bệnh nhân mắc sốt xuất huyết với hội chứng thận (5, 16, 2l)

Hiện nay, việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác bệnh nhân mắc Hantaan virút hội chứng thận là cần thiết để chăm sóc và điều trị kịp thời

17

,CHƯƠNG II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các huyết thanh của bệnh nhân và chuột hoàn toàn âm tính với:

Kháng nguyên Dengue các typ

Kháng nguyên Viêm não

Kháng nguyên Chikungunya

Và không phát hiện ra virút Dengue trong các phân lập trên tế bào muỗi

Aedes albopictus dòng C 6/36

2.1.1.2 Cac dung cu:

Dụng cụ để tiến hành phản ứng huyết thanh:

- Phiến nhựa vi lượng đáy hình chữ U của hãng Cook

- Que cầu để trộn huyết thanh cỡ 20 kÌ và 50 kí,

- Máy so độ dục

- Máy lắc để tiến hành phản ứng

- Hốt vô trùng

- Tủ ẩm

- Máy ly tâm tốc độ trung bình và tốc độ cao

- Binh dung Nitrogen lỏng

-.Tu lanh sâu

- Máy doc ELISA, model Pasteur 01254, Phap

- Các loại Pipetman của GiLSON voi cdc c& 20u1, 100ju1, 1000p, 5000 pl

2.1.1 3 Các sinh phẩm

- Bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán SD/ SXHD do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ương sản xuất

- BO sinh phẩm Ngăn ngưng kết hồng cầu do Viện VSDTTW sản xuất

~ Bộ sinh phẩm HantaDia của Hội chữ thập xanh Hàn quốc sản xuất

- Các sinh phẩm và hoá chất để phân lập virut Dengue:

- Các chủng virút Dengue được sử dụng trong nghiên cứu là những chủng tiêu biểu, ổn định và hiện đang được dùng tại Phòng thí nghiệm chuẩn thức Viện

VSDTTU để sản xuất kháng nguyên Dengue Đó là các chủng virút:

18

Virút Giống

Dengue | Hawaii

Dengue 2 NewGuinea C Dengue 3 H87 Dengue 4 H 241

Chủng Virút Viêm não Nhật bản của Phòng thi nghiém Viém nao, Vien VSDTTW cung cấp

Chủng Chikungunya do Viện VSDTTW cấp

Các khang thé don dong do CDC Forth Collin, Colorado, Hoa kỳ cưng cấp

Kháng thể huỳnh quang mua của Viện Pasteur Pari, Phap

hấp vô trùng ở 110 °C trong 10 phúi

Sau đó có thể pha tiếp:

> Môi trường phát triển DMEM có 15% FBS để nuôi tế bào muỗi Áedes

FBS 20

Nước cất 2 lần vừa đủ 1000

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên Dengue trên tế bào muỗi

Aedes albopictus dong C6/36

Nuôi và bảo quản tế bào muỗi Aedes albopicrws đồng C6/36 theo thường

qui của phòng thí nghiệm chẩn doán virút Arbo, đại học tổng hợp Queensland,

Brisbane; Australia và phòng thí nghiệm chuẩn thức chẩn đoán SXHD, Viện VSDTTU

2.2.2 Kỹ thuật phân lập vừút Dengue

(Theo thường quy của Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật CDC (Forth Collins,

Colorado, Hoa kỳ) Các giai đoạn dược tiến hành nhu sau (Hình 3):

>

Gáy nhiễm virút vào tế bào

Chọn những chài tế bào tốt (mọc kín trên mặt đầy của chai), thay môi trường phát triển bằng môi trường duy trì, mdi chai Imi

Đánh dấu trên chai tế bào tương đương số thứ tự của mẫu, chọn một chai làm chứng tế bào

Gây nhiễm 0,Imi bệnh phẩm (máu toàn phần hoặc huyết thanh), láng đều trên

bề mặt tế bào, ủ 28°C/ 60°

Thêm 6ml] môi trường duy trì vào mỗi chai tế bào, ủ 28°C từ 7 đến 14 ngày

Dinh tp vưút bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

1 Kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp phát hiện virutf Dengue

(Direct Fluorescent Antibody - DFA)

Sau 7 ngày ủ tại 28 °C, tế bào được tách ra khỏi đáy chai nuôi cấy bằng que cạo

tế bào {craper) hoặc vỗ nhẹ vào thành chai, tách Iml môi trường có chứa tế bào

vào ống ly tâm,

Ly tâm 1500 vòng / 10 phút, loại bỏ nước nổi

20

Hình 3: SƠ ĐỒ PHÂN LẬP VIRUT DENGUE

-

trung hoa

Mién dich huynh quang

Thêm [ml dém phét phat (PBS) pH 7,2 vào mỗi ống ly tâm, lắc đều làm bong tế

bao trong PBS

Đánh đấu số thứ tự của mẫu trên lam kính Í2 giéng theo hinh “chit chi “ danh | giếng cho chứng tế bào Nhỏ 201L hỗn dịch tế bào của mỗi mẫu vào các giếng tương Ứng

Để khô tự nhiên, cố định trong axeton lạnh / 30 phút, để khô

Cho 201 khang thể đa dòng (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất cả các giếng có tế bào, ủ 37 °C/30 phút trong hộp giữ ẩm Ngâm trong PBS/10 phút,

tráng qua nước cất, để khô tự nhiên

Cho 20.1 cong hgp gin Fluorescen (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất

cả các giếng trên, ủ 37 ?C/ 30 phút trong hộp giữ ẩm Ngâm trong PBS/ I0 phút, tráng qua nước cất, để khô tự nhiên

Nhỏ lên bề mặt lam kính 1 giọt dụng dịch gắn (đầu tự nhiên hoặc glycerin 90%/

PBS) Phủ trên lam kính Í kính mỏng Soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

Nhận định kết quả:

Tế bào chứng hoàn toàn không phát sáng

Mẫu đương tính: phát sáng của huỳnh quang xung quanh màng tế bào

2 Kỹ thuật huỳnh quang gian tiếp phát hiện tắp virut Dengue

(Indirect Fluorescent Antibody - IFA)

Tất cả mẫu đương tính sẽ tiếp tục định típ bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

gián tiếp (IFA) Các bước tiến hành như sau:

2 giếng hàng đầu nhỏ bệnh phẩm dương tính đã biết

2 giếng hàng thứ hai cho tế bào âm tính (tế bào không có virút Dengue)

Nhỏ 20uHI hỗn dịch tế bào của mỗi mẫu vào 8 giếng cuối lam kính

Để khô tự nhiên, cố định trong axeton lạnh / 30 phút, để khô

Nhỏ 20411 kháng nguyên hỗn hợp 4 týp virút Dengue

22

Cho 20L kháng thể đơn dòng (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào các hàng giếng tương ứng

Ủ 379C/ 30 phút trong hộp giữ ẩm

Ngam trong PBS/ 10 phút, tráng qua nước cất, để khô tự nhiên

Cho 2011 cộng hợp gắn Fluorescen (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất

cả các giếng trên

U 37 °C/ 30 phút trong hộp giữ ẩm

Ngâm trong PBS/ I0 phút, trắng qua nước cất, để khô tự nhiên

Nhỏ lên bể mặt lam kính [ giọt dung địch gắn (đầu tự nhiên hoặc glycerin 90%/

PBS) Phủ trên lam kính I kính mỏng

Soi đưới kính hiển vi huỳnh quang

Nhận định kết quả:

Chứng đương: Phát sáng xanh lá mạ bao quanh tế bào

Chứng âm: Hoàn toàn không phát sáng

Mẫu dương tính: Phát sáng của huỳnh quang xung quanh màng tế bào giống chứng dương

Các mẫu âm tính được tiếp tục nuôi tại 28 °C trong 7 ngày, sau đó lặp lại phương

pháp trên

2.2.3 Kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu

(Hemagglutination Inhibition Tests - HI)

Nguyên ly: Virut Dengue có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ngỗng ở điều kiện

pH nhất định Dựa vào cơ sở này, kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu được xây đựng

để phát hiện và chuẩn độ virút trong hỗn địch chưá virút (Hình 4)

Kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu được tiến hành theo hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị các sinh phẩm

a

b Chuẩn bị hồng cầu ngỗng

Xử lý huyết thanh: Để loại bổ các chất ngưng kết hồng cầu (NKHC) và Ngăn ngung kết hhồng cầu (NNKHC)

Chuẩn độ kháng nguyên bằng kỹ thuật Ngưng kết hồng cầu (NKHC):

Kháng nguyên được sản xuất trên tế bào muỗi Aedes albopictus dong C6/36 hoặc trên não chuột bạch mới đẻ bằng phương pháp Protamin sulphate hay Saccaro Axetone

Giai đoạn 2: Tiên hành kỹ thuật Ngăn ngưng kết hồng cầu

a Các bước tiến hành

Pha loãng bậc hai huyết thanh đã xử lý:

Cho 0,025 ml khang nguyén 8 đơn vị đã pha loãng ở trên/ giếng vào tất cả các giếng

Lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng 60 phút hoặc qua đêm ở + 4 ?C,

Cho 0,5 ml hồng cầu ngỗng 0,5%/ giếng vào tất cả các hàng giếng

Lắc nhẹ

Để tấm nhựa 45 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

Cùng với phản ứng chính phải tiến hành các đối chứng

b Cách đọc kết quả:

Giếng nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu ®#> Dương tính

Giếng nào có ngưng kết hồng cầu » Am tinh,

Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân là độ pha loãng cuối cùng

của huyết thanh gây ngăn ngưng kết hồng cầu

Dựa vào kết quả huyết thanh kép, có thể đánh giá các kiểu đáp ứng miễn dịch như sau:

+ Kiểu đáp ứng tiên phát:

Khoảng cách giữa huyết thanh lần I và huyết thanh lần II trên 7 ngày

Hiệu giá của huyết thanh lần II cao hơn huyết thanh lần I trên 4 lần

Hiệu giá huyết thanh lần II nhỏ hoặc bằng 1/1280

+ Kiểu đáp ứng thứ phái:

Hiệu giá của huyết thanh lần II cao hơn huyết thanh lần Ï trên 4 lần

Hiệu giá huyết thanh lần HI cao trên 1/ 2560

2.244 Kỹ thuật MAC-ELISA

(gM capture ELISA for dengue - MAC-ELISA)

Nguyên lý: Xem Hình 5

25