Nghiên cứu khả năng đối kháng với VIBRIO và đánh giá tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú của một số chủng BACILLUS phân lập từ trùn quế

Nghiên cứu khả năng đối kháng với VIBRIO và đánh giá tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú của một số chủng BACILLUS phân lập từ trùn quế

LỜI CẢM ƠN

Thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học là một trong những cơ hội giúp chúng tôihọc hỏi thêm nhiều kỹ năng, nâng cao tinh thần kỹ luật, luôn học hỏi, tìm tòi để thựchiện công việc, đồng thời cũng giúp chúng tôi có thêm kỹ năng giải quyết vấn đề Đểđạt được kết quả này, ngoài sự cố gắng của bản thân phải kể đến sự giúp đỡ của thầy

Và đặc biệt chúng tôi xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và Cô Dương NhậtLinh, người đã tận tình chỉ dẫn, động viên, tạo cho em niềm say mê nghiên cứu

Bên cạnh đó chúng tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ độngviên, giúp chúng tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian qua

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2011

Nhóm 3

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 13

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN TÔM 17

1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6] 17

1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5] 17

1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41] 18

1.2.1 Phân loài 18

1.2.2 Các giai đoạn phát triển 19

1.2.3 Tuổi thành thục 20

1.2.4 Tập tính ăn 21

1.2.5 Lột xác 21

1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23] 22

1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ BỆNH CHO TÔM [34, 36] 24

1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 25 1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8] 25

1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40] 26

1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm 30

1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản [35, 39, 22, 9, 30] 31

1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 37

1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5] 37

1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản 40

1.7 VI KHUẨN BACILLUS 42

1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus 42

1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12] 42

1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17] 43

1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24, 28] 44

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 47

2.2 VẬT LIỆU 47

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 47

2.2.2 Môi trường - hóa chất 47

2.2.3 Thiết bị - dụng cụ 48

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 49

2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS 50

2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG 51

2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26] 51

2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26] 52

2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27] 53

2.7 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS 55

2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1] 55

2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú [11] 55 2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ 59

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60

3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS 61

3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG 64

3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc 64

3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp 67

3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY 73

3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V parahaemolyticus 73 3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V alginolyticus 83

3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V harveyi 92

3.4 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS: 103

3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết 103

3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú 104

Chương 4 107

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107

4.1 KẾT LUẬN 108

4.2 KIẾN NGHỊ 108

TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

PHỤ LỤC 114

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA One-way analysis of variance

PL Postlarvae (hậu ấu trùng)

TCBS Thiosulphate citrate bile salts sucrose

DANH MỤC CÁC ĐƠN VỊ ĐO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập 61Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc 64Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp 67Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 72Bảng 3.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 74Bảng 3.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 75Bảng 3.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 77Bảng 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 78Bảng 3.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL) 80Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL) 82Bảng 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL) 83Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V alginolyticus ( tính trên

LOG10 CFU/mL) 85Bảng 3.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL) 86

Bảng 3.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL) 88Bảng 3.15 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V alginolyticus (tính trên

LOG10 CFU/mL) 89Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 91Bảng 3.17 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 93Bảng 3.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 94Bảng 3.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 96Bảng 3.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 98Bảng 3.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL) 99Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết 102

Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus 103

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1 Thử khả năng đối kháng của chủng Bacillus đối với V.

parahaemolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ 69

Biểu đồ 3.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V.

alginolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ 69

Biểu đồ 3.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus đối với V harveyi theo

thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ 70

Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với

Biểu đồ 3.13 Sự biến đổi mật độ của V alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú 19

Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio 21

Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm 23

Hình 1.4 Trùn quế 37 Hình 1.5 Vi khuẩn Bacillus 41

Hình 1.6 Cấu trúc của bào tử 42

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm 48

Hình 2.2 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc 51

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy 53

Hình 2.5 Thuần hóa tôm 56

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử nghiệm lên ấu trùng tôm sú 56

Hình 2.6 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm 57

Hình 2.7 Hộp bố trí thí nghiệm 57

Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy 60

Hình 3.2 Nhuộm gram Bacillus 60

Hình 3.3 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc 65

Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp 71

Hình 3.5 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ 107 ở ngày 5 102

Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết 103

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế quốc dân và thu hút nhiều lao động Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ.

Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề nuôi tôm ở ViệtNam còn nhiều vấn đề tồn đọng mà vấn đề quan trọng nhất là dịch bệnh gây chết hàngloạt đã gây nhiều tổn thất cho người nuôi tôm nói riêng và ngành thủy sản nói chung.Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản dophần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dướiđáy ao nuôi

Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi khuẩn

Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tôm sú, trong nhóm

này có V harveyi và V parahaemolyticus là các lòai vi khuẩn có độc lực cao, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú Các lòai Vibrio khác như: V vulnificus, V.

alginolyticus, V splendidus, được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú

thương phẩm Khi Vibrio xuất hiện trong nước với mật độ cao, có thể gây chết hàng

loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 % [2, 7]

Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩmthủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh tế.Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây bệnhcũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm bảo được

sự phát triển bền vững

Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thếkháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trườngtrong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng vững chắccho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới Khác với biện pháp hóa học

và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn, bền vững đối vớingười nuôi và tiêu dùng

Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong

nuôi trồng thủy sản Nhưng Bacillus vẫn được xem là đối tượng quan trọng vì đã có nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus giúp thủy sản sinh trưởng nhanh,

tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được báo cáo nhiều nhất là khả

năng đối kháng với Vibrio và khả năng tạo bào tử của nó.

Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số

chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật,

pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho độngvật thủy sản [5]

Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI

KHÁNG VỚI VIBRIO VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN ĐỐI VỚI ẤU TRÙNG TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ TRÙN QUẾ”

Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế tiếp tục được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh và đánh giá

tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm Thành công của

đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển thành chế phẩm vi sinh

trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm Vibrio spp gây ra trên

động vật thủy sản

Mục tiêu

 Tái phân lập Bacillus từ trùn quế và phân trùn quế.

 Thử khả năng đối kháng của Bacillus với V harveyi, V parahaemolyticus, V.

alginolyticus.

 Đồng nuôi cấy Bacillus với 3 loài vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra sự thay đổi mật

độ của vi khuẩn Vibrio theo thời gian nuôi cấy.

 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus.

Chương 1 T

ỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN TÔM

1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]

Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thủy sản có giá trị thương phẩm cao và

cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á nhưTrung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Việt Nam và Ecuador Nghề nuôi tôm khôngchỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn

có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống chongười nuôi thủy sản [6] Hiện nay, nghề nuôi tôm nước lợ ở nhiều nước trên thế giới đã

và đang chịu ảnh hưởng nghiêm trọng do môi trường nuôi ô nhiễm và dịch bệnh phátsinh, đặc biệt là mô hình nuôi tôm sú thâm canh Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm bịthất bại liên tục đã bị bỏ hoang, gây nên những tác động nghiêm trọng về kinh tế xãhội Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đếnnăm 1997 chỉ còn 660.000 tấn [3]

1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5]

Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sảnnói riêng của nước ta đã và đang phát triển mạnh mẽ Theo thống kê của Bộ Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2008, diện tích nuôi trồng thủy sản đã được

mở rộng lên trên 1 triệu ha và sản lượng đạt gần 2,45 triệu tấn, tăng gấp 12 lần so vớinăm 1980 Bên cạnh đó, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam ngày càng tăng mạnh,năm 2008 đạt trên 4,5 tỷ USD, đứng thứ tư trong những ngành hàng có kim ngạch xuấtkhẩu cao nhất của cả nước.[5]

Tuy nhiên, thực tế cho thấy giá cả hấp dẫn và ổn định của con tôm trên thịtrường thế giới cùng với giá đất tương đối thấp của vùng Duyên Hải đã đưa đến sựbùng nổ việc phát triển nghề nuôi tôm Điều đáng lưu ý là kỹ thuật nuôi tôm tuy khôngquá phức tạp, nhưng bản thân hệ sinh thái khá biến động đối với việc nuôi thâm canh,

hệ thống sản xuất thiếu tính bền vững đã dẫn đến nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm.Tại Việt Nam, trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lanrộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng.Theo sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bạc Liêu năm 2008 - 2009, nhiều hộ dântại 3 đơn vị của tỉnh đã chuyển gần 1.000 ha đất nuôi tôm công nghiệp kém hiệu quảsang làm muối Trước tình hình trên, nhiều chương trình nghiên cứu liên quan đến việcxác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi, cụ thể ở Đồng bằng Sông Cửu

Long cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV

(White Spot Syndrom Virus) [3]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41]

Tôm Sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tiếng Anh là Giant Tiger

Loài: Monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.2.2 Các giai đoạn phát triển

Nauplli: 6 giai đoạn: 36-51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ

4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng, không cần cho ăn

N1:dài khoảng 0,40 mm, dày 0,20 mm

N2: dài khoảng 0,45mm, dày 0,20 mm

N3: dài khoảng 0,49 mm, dày 0,20 mm

N4: dài khoảng 0,55 mm, dày 0,20 mm

N5: dài khoảng 0,61 mm, dày 0,20 mm

Zoea: 3 giai đoạn: 105-120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần,mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vất phiêu sinh

Z1: dài khoảng 1 mm, dày 0,45 mm, xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt Z2: dài khoảng 1,9 mm, xuất hiện mặt và chủy

Z3: dài khoảng 2,7 mm, xuất hiện gai trên bụng

Mysis: 3 giai đoạn : 72 giờ, các Mysis bơi hướng xuống sâu, đuôi đi trước, đầu

Postlarvae: giai đoạn gần trưởng thành

Juvenile: giai đoạn trưởng thành

1 Trứng tôm Giai đoạn 1: Naupli Giai đoạn 2: Zoeal

Giai loạn 3: Mysis Giai đoạn 4: Postlarva Giai đoạn 5: Juvenile

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú

1.2.3 Tuổi thành thục

Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi Xác định

sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ.Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, chỉ khi nào tìm thấy được tinhtrùng ở cuối ống dẫn tinh

Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH, gonal inhibiting hormone)được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tớituyến giáp sinap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra Sự thành thục sinh dục củatôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt sẽ thúc đẩy chu kỳ lột xác,đem lại sự thành thục mau chóng hơn

Số lượng trứng đẻ của tôm cái: nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng buồngtrứng và trọng lượng cá thể: trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn Khi con cái thànhthục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng Nếucắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thì cho số lượng trứng từ 200.000 - 600.000 trứng

Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ) trứng sau khi đẻđược 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-28 oC sẽ nở thành ấu trùng (Nauplii) Tôm sú đẻ quanhnăm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3-4 và tháng 7-10.

Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm, con cái chừng 2 năm

1.2.4 Tập tính ăn

Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống và di chuyển chậm hơn là xácthối rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnh vụnhữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng Tôm sống ngoài tự nhiên ăn 85% làgiáp xác, cua nhỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại 15% là cá, giun nhiều tơ,thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu cơ, cát bùn

Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút Nuôi tôm sú trong

ao thì hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối Tôm bắt mồi bằng càng, sau

đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày

1.2.5 Lột xác

Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ nhấtđịnh, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm Sựlột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác nhưng không tăng thểtrọng

Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: Lớp biểu bìgiữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theosau là phần bụng và các phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốncong mình toàn cơ thể Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ với tôm nhỏ, 1-2 ngàyđối với tôm lớn Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môitrường sống thay đổi đột ngột Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, cóthể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời

Hormone hạn chế sự lột xác lột xác (MIH, molt - inhibiting hormone) được tiết

ra do các tế bào trong cơ quan của cuống mắt, truyền theo sợi trục tuyến xoang, chúng

tích luỹ lại và chuyển vào trong máu, nhằm kiểm tra chặt chẽ sự lột xác Các yếu tố bênngoài như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, đều có ảnh hưởng tới sự lột xác của tôm.

1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]

Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau

Vibrio có hình que, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,5×3μm, hai đầu khôngm, hai đầu không

đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, qua nhiều lần cấy truyền thì tính chất phẩy khuẩn

biến mất, là vi khuẩn gram âm.Vibrio không tạo bào tử, không tạo giáp mô, di động

nhờ tiêm mao ở đầu Đây là loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tăng trưởng nhanh trongmôi trường có tính kiềm (8,5 - 9), ưa môi trường có muối với nồng độ khác nhau tùytheo loài Sống được ở nhiệt độ 16-42 oC Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị diệtbởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khô, chỉ tồn tại 10 phút ở 55oC [4]

Vibrio là một trong những tác nhân gây ra dịch bệnh lớn ở động vật giáp xác và

cá Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng

thành Dịch bệnh có thể gây chết 100%

Bệnh do Vibrio là một trong những nguyên nhân chính gây chết cho tôm nuôi trên toàn thế giới Loài vi khuẩn Vibrio phân bố rộng rãi , thường gây nhiễm trùng

trong các trại trại sản xuất giống cũng như trong ao nuôi tôm gây thiệt hại nghiêm

trọng Bệnh do Vibrio gây ra chủ yếu là do một số loài như: V harveyi, V vulnificus,

V parahaemolyticus, V alginolyticus, V penaeicida …

Sự bùng nổ dịch bệnh có thể xảy ra khi nhân tố môi trường làm tăng nhanh sốlượng vi khuẩn tồn tại sẵn trong máu tôm ở mức thấp, hoặc bằng cách xâm nhập quarào cản vật chủ

Vibrio xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua nhiều con đường như sau:

 Lớp vỏ ngoài của động vật thủy sản là hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại mầm

bệnh Tuy nhiên, Vibrio có thể gây bệnh trên vỏ và có thể xâm nhập qua vết thương ở

lớp vỏ ngoài hay lỗ chân lông

 Mang dễ bị tổn thương dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn bởi vì mang chỉ đượcbao bọc bởi lớp vỏ mỏng

 Tuyến tiêu hóa và ruột giữa không được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài nên mầmbệnh từ nước, thức ăn, chất thải có thể xâm nhập vào trong cơ thể [23]

Bệnh do Vibrio gây ra có thể là kết quả của môi trường nuôi xấu, do tôm đã yếu

vì mắc bệnh khác và trong một số trường hợp do độc lực mạnh của một số loài Vibrio.

Nếu tôm bị nhiễm cục bộ ở một số nơi trên bề mặt cơ thể do bị trầy xướt hay ởđường ruột thì có thể thấy các triệu chứng như: tạo thành chổ viêm có bao và có thể cómàu đen trên thân, viêm ruột hay hoại tử đốm ở gan Nếu tôm bị nhiễm toàn diện thì cóthể thấy các đốm đen ở cơ quan lympho, tim, mang, [31]

Một số bệnh do Vibrio gây ra

 V salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh.

 V parahaemolyticus, V harveyi gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú

 V alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú.

 V parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus, V anguillarum gây bệnh đỏ

thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây bệnh máu vón cục ở cua, gây bệnh ấu trùngnhuyễn thể [5]

Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm

1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ BỆNH CHO TÔM [34, 36]

Nuôi trồng thủy sản với quy mô công nghiệp không thể tránh khỏi dịch bệnhlàm tôm chết, gây tổn thất cho người nuôi Để đối phó với tình trạng dịch bệnh người tathường sử dụng kháng sinh (Tetracycline, Streptomycin ) Tuy nhiên khi sử dụng mộtloại thuốc quá lâu, sử dụng không đúng liều lượng, thời điểm sẽ gây ra hiện tượngkháng thuốc Đáng lo ngại hơn là gen kháng có thể truyền cho thế hệ sau hoặc truyềnngang giữa các tế bào vi khuẩn thông qua tiếp hợp, tải nạp, tạo những chủng vi khuẩnmang gen kháng kháng sinh và có thể gây bệnh cho người Khi đã xảy ra hiện tượngkháng thuốc thì sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc phòng và điều tri bệnh cho vật nuôi,

dễ bùng phát các trận dịch khó kiểm soát, gây thiệt hại kinh tế

Bên cạnh đó dư lượng thuốc kháng sinh ảnh hưởng đến giá trị xuất khẩu tôm.Tôm xuất khẩu thường bị trả về do dư lượng kháng sinh còn quá nhiều Dư lượngthuốc còn lại trong thịt, nội tạng của vật nuôi, khi sử dụng vật nuôi làm thực phẩmchúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Ngoài kháng sinh người nuôi còn dùng nhiều hóa chất độc hại khác để tiêu diệtcác loài không mong muốn như dùng Sulfat đồng để diệt tảo, các chất diệt cá tạp nhưNicotin, các loại thuốc trừ sâu Các hóa chất này có thể tiêu diệt các loài khôngmong muốn nhưng đồng thời cũng tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật có lợi cho ao nuôi.[36]

Bên cạnh đó, mô hình nuôi tôm hiện nay đa phần không có hệ thống xử lý nướcthải Do vậy lượng hóa chất cùng với nước thải của hệ nuôi đưa trực tiếp ra môi trườngngoài gây ô nhiễm nguồn nước Tiến sĩ khoa học Nguyễn Văn Trương - Viện TàiNguyên Sinh Thái cho rằng nếu chỉ có một vài hộ nuôi xả bỏ chất thải ra biển thìkhông sao, nhưng vài chục ngàn hộ dân cùng thải nước như vậy ắt hẳn cả vùng biển bị

ô nhiễm, biển lại thông với sông nên ảnh hưởng càng thêm nghiêm trọng hơn [34] Đặcbiệt, cần thận trọng khi sử dụng thuốc trừ sâu hữu cơ vì chúng có độc tính, gây ảnhhưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người do cơ chế tích lũy sinh học

Tóm lại, vấn đề sử dụng hóa chất cũng như kháng sinh chỉ giải quyết tình trạngbệnh trong nhất thời nhưng nó lại mang đến không ít tác hại trong đời sống và kinh tế

 Hóa chất và kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi sinh vật có hại mà còn diệt luôn visinh vật có lợi

 Hóa chất, kháng sinh có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm

 Nguy cơ tạo ra vi sinh vật kháng thuốc, có thể truyền tính kháng thuốc cho tácnhân gây bệnh cho người

 Ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái, đến quần thể sinh vật trong hệ sinh thái…

1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]

Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ "pro" có nghĩa là dànhcho và "biosis" có nghĩa là sự sống.[25] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩakhác nhau, nó được sử dụng lần đầu tiên năm 1965 để mô tả một chất được tạo ra bởimột protozoon để kích thích sự tăng trưởng của một con khác

Đến những năm 1970 nó được mô tả chất chiết từ mô có tác dụng tăng sinh mô Năm 1974, Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các visinh vật và chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng hệ vi sinh vậtruột

Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “một vi sinh vật sống

bổ sung qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện vi sinh vậtđường ruột” [8]

Năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld đưa ra định nghĩa về probiotic như sau:

“Probiotic là chế phẩm hay sản phẩm chứa vi sinh vật sống xác định với số lượng đủ có

thể làm thay đổi hệ vi sinh vật tại một phần của cơ thể ký chủ và nhờ đó tạo ra các hệquả có lợi cho sức khỏe ký chủ”.

Trải qua lịch sử, probiotic được định nghĩa ngày càng cụ thể hơn Theo địnhnghĩa hiện được thông qua bởi FAO/WHO năm 2001: “probiotic là những vi sinh vậtsống mà khi dùng với lượng thích hợp, kiểm soát chặt chẽ sẽ đem lại lợi ích sức khỏecho vật chủ” [13, 5]

1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]

1.5.2.1 Tiết ra các hợp chất ức chế [40]

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in-vitro kìmhãm được các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản Những nghiên cứu này cũng chứngminh khả năng kìm hãm vi khuẩn khác của những dòng vi khuẩn thông thường dễ tìmthấy trong môi trường

Theo Sugita và cs (1997) những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trườngnhững chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm vi khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể visinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môitrường Sự hiện diện những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột,trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vikhuẩn cơ hội, gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh Sản phẩm có thể là chất kháng sinh,siderophore, men phân hủy, H2O2, acid hữu cơ…

Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định được nên được gọi chung là chất ứcchế Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là loại tiết ra chất kháng vi khuẩn (bacteriocin)chống lại các vi khuẩn Gram (+) Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản lànhóm Gram (-) Vì vậy, tác động ức chế của vi khuẩn lactic trong nuôi trồng thủy sản

bị hạn chế nhưng nó là vi khuẩn không có hại và là đối tượng cạnh tranh chỗ cư trú

Nhiều vi khuẩn khác cũng tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh

như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus Cơ chế tiết ra chất chống lại

vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong môitrường nước

1.5.2.2 Cạnh tranh nơi cư trú [40]

Olsson và cs (1992) khẳng định cạnh tranh chỗ bám trong ruột của vật chủ cóảnh hưởng rất quan trọng đến sức khoẻ của vật chủ Việc bám dính được vào lớp màngnhầy của ruột là rất cần thiết để vi khuẩn thiết lập quần thể trong hệ ruột của cá Khảnăng bám dính lên thành ruột là tiêu chuẩn lựa chọn đầu tiên của vi khuẩn hữu ích Sựbám dính trên màng ruột có thể là chuyên biệt, không chuyên biệt

Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng

cách tranh giành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác Người ta đãchứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột, hay

niêm mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này cạnh tranh vượt trội

và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V anguillarum và A.

hydrophila.

1.5.2.3 Cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng [40]

Nhiều quần thể vi sinh vật cùng tồn tại trong cùng một hệ sinh thái thì sẽ có sựcạnh tranh về dinh dưỡng và năng lượng Cạnh tranh trong giới vi sinh vật chủ yếu làxảy ra ở nhóm dị dưỡng như cạnh tranh các chất hữu cơ mà chủ yếu là nguồn carbon

và năng lượng Rico-Mora (1998) đã cho một dòng vi khuẩn được chọn lọc có khảnăng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ Tác giả cấy vi khuẩn này vào bể nuôi

tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus thì vi khuẩn Vibrio này không phát triển và thử

nghiệm in-vitro không thấy có sự ức chế Do đó chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh

tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ Do vậy những dòng vi khuẩn chọn

lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và dinh dưỡng

1.5.2.4 Tương tác với thưc vật thủy sinh [40]

Nhiều dòng vi khuẩn khác có khả năng kích thích sự phát triển của tảo.Tuynhiên theo các nghiên cứu gần đây một số dòng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt một sốloài tảo, đặc biệt là tảo gây ra hồng triều Những chủng vi khuẩn này có thể không tốtđối với một số loài tảo có lợi trong nuôi trồng thủy sản

1.5.2.5 Cải thiện chất lượng nước

Verschuere và cs (2000) cho rằng cải thiện chất lượng nước là một cơ chế tácđộng của “vi sinh vật hữu ích” trong thủy sản khi đưa vi sinh vật hữu ích vào nướcgiúp cải thiện chất lượng nước mà không có tác động trực tiếp lên cơ thể vật nuôi,

thường liên quan đến các nhóm Bacillus [28]

Stanier và cs (1963) đã nghiên cứu được là nhóm vi khuẩn Gram (+) thườngphân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm Gram (-) Duy trì những mật độGram (+) trong ao nuôi sẽ hạn chế được sự tích lũy vật chất hữu cơ trong ao trong suốtquá trình nuôi, ổn định quần thể tảo nhờ sự sản sinh CO2 từ quá trình phân hủy các vậtchất hữu cơ

Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi khuẩnhữu ích trong nuôi trồng thủy sản Chất lượng nước có liên quan mật thiết đến tính chấtnền đáy của thủy vực, quá trình hấp thụ và giải phóng các chất làm biến đổi chất lượngnước, đặc biệt là sự hấp thụ và giải phóng dinh dưỡng của nền đáy

Vũ Ngọc Út (1999) cho rằng các vi khuẩn có lợi phân huỷ các chất hữu cơ có từthức ăn dư thừa, các chất bài tiết của tôm cá và có thể ngăn ngừa sự phát triển của vikhuẩn gây bệnh trong ao nuôi, giúp giảm ô nhiễm đáy ao

Theo Nguyễn Đình Trung (2004), một trong những cơ chế hoạt động của men visinh là các men có tác dụng phân huỷ các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chấthữu cơ đơn giản Sau đó các chủng loại vi sinh vật phát huy tác dụng

hợp chất hữu cơ đơn giản thành các chất vô cơ (CO2, NH3) Xu thế tăng cao của NH3được làm giảm do hai loài vi sinh vật tự dưỡng theo chu trình sau

Nitrosomonas

NH 4 + + 1,5 O 2 —› NO 2 - + 2H + + H 2 O Nitrobacter

NO 2 - + 0,5O 2 —› NO 3

- Giảm tảo: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ

trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muốidinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong trong ao nuôi tôm cáctháng cuối không nhỏ hơn 30 cm

 Giảm bệnh: vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trường thích hợp sẽ phát

triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của nguyên sinh động vật, các vi

sinh vật và Vibrio có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng Giảm các tác nhân gây

bệnh cho tôm nuôi

Nhờ đó mà hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh, giảm thay nướctrong quá trình nuôi, góp phần cải thiện chất lượng nước trong hệ thống nuôi trồngthủy sản.[40]

2.1.1.1 Nguồn dinh dưỡng và tăng cường khả năng tiêu hóa

Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn probiotic có nhiều lợi ích cho quá trình

tiêu hóa của động vật thuỷ sản Ở cá, Bacteroide và Clostridium spp cung cấp cho vật

chủ các acid béo và vitamin Ngoài ra, một số vi khuẩn có thể tham gia vào quá trìnhtiêu hóa bằng cách sản xuất enzym ngoại bào như protease, lipase, cũng như cung cấpyếu tố tăng trưởng cần thiết Vi sinh vật có thể cung cấp như một nguồn thực phẩm bổsung và hoạt động của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa có thể là nguồn cung cấp vitaminhay acid amin thiết yếu [13]

2.1.1.2 Tăng cường đáp ứng miễn dịch [13]

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi vi khuẩn

probiotic Đã có chứng minh cá hồi cầu vồng sử dụng vi khuẩn Clostridium butyricum thì sức đề kháng của cá được tăng cường chống lại Vibrio bằng cách tăng cường hoạt

động thực bào của bạch cầu

Rengpipat và các cộng sự báo cáo rằng việc sử dụng Bacillus sp (dòng S11) đã kích hoạt cả hai hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào ở tốm sú (Penaeus

monodon) [24]

Balcazar đã chứng minh rằng một loài Bacillus ảnh hưởng tích cực lên sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá con tôm trắng trong hỗn hợp các chủng vi khuẩn (Bacillus

và Vibrio sp) và nêu ra một bảo vệ hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh là vi khuẩn

Vibrio harveyi và hội chứng virus đốm trắng Bảo vệ này là do sự kích thích hệ miễn

dịch, bởi tăng cường hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn [14]

2.1.1.3 Hoạt động kháng virus

Một vài vi khuẩn probiotic có tác động kháng virus, mặc dù cơ chế này vẫnchưa được biết, trong phòng thí nghiệm có thể chỉ ra, bất hoạt virus có thể được thựchiện bởi hóa chất và những chất sinh học như: dịch chiết của tảo, sản phẩm ngoại bàocủa vi khuẩn

Kamei và cs (1988) đã báo cáo rằng chủng Pseudomonas spp., Vibrios spp., phân lập từ nơi ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHNV (infectious

hematopoietic necrosis virus) với tỉ lệ giảm > 50%.[25]

Direkbusarakom và cs (1998) đã phân lập được 2 chủng Vibrio.sp NICA 1030

và NICA 1031 từ nơi ấp trứng tôm sú, 2 chủng này có hoạt tính kháng virus IHNV và

OMV (Oncorhynchus masou virus) với tỉ lệ giảm từ 62 và 99% tương ứng.[29]

2.1.2 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm

Probiotic giải pháp điều trị bệnh cho thủy sản an toàn, thuận lợi vì:

 Hạn chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn có hại

 Phân giải chất hữu cơ tích tụ nền đáy

 Phân giải khí độc được tạo thành từ nền đáy trong quá trình nuôi

 Cải thiện tiêu hóa trong đường ruột tôm, cá

 Hiệu quả tốt, chi phí cải tạo ao vụ sau thấp

 Nâng cao năng suất thu hoạch

 Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn

 Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi

 Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt

 Giảm chi phí thay nước.

 Giảm chi phí sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong việc điều trị bệnh

Do đó, sử dụng probiotic có tác dụng phòng bệnh, tăng tỷ lệ sống, nâng caonâng suất ao nuôi Hơn nữa, sử dụng probiotic để quản lý ao nuôi còn có tác dụng hạnchế sử dụng hóa chất bừa bãi, gây tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái và ảnhhưởng đến chất lượng sản phẩm

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng

thủy sản [35, 39, 22, 9, 30]

2.1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới [40]

Theo Balcázar và cs (2006), probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản Nhưng việc sử dụng probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi.[13]

Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chấtkháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gâybệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệuquả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn

Theo Vijayabaskar và cs (2008), ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ

thể là nhóm vi khuẩn Bacillus spp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do

vi khuẩn A hydrophila gây ra.

Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippin, khi việc sử

dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩnkháng thuốc, xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người nếu sửdụng quá liều lượng Do đó, probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ởPhilippin, nghiên cứu của Moriarty (1999) cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tômbệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học

Garriques và Arevalo, (1995) đưa dòng Vibrio alginolyticus vào bể ương ấu trùng tôm (Litopenaeus vannamei) mỗi ngày Tỷ lệ sống trung bình và trọng lượng tôm

cao nhất trong bể có thêm vi khuẩn hữu ích so với bể xử lý bằng kháng sinh

oxytetracyline và đối chứng Số bể có bổ sung vi khuẩn Vibrio alginolyticus, không thấy xuất hiện vi khuẩn gây bệnh V parahaemolyticus, trong khi các nghiệm thức còn

lại có khoảng 10% mẫu có mặt vi khuẩn này

Sugama và Tsumura (1998) đã cấy dòng BY-9 với mật độ 106 CFU/mL vào bể

ương ấu trùng tôm sú làm giảm mật độ Vibrio và cho tỷ lệ sống cao hơn đối chứng.

Griffith (1995) cho rằng nhờ đưa men vi sinh vào trong bể ương tôm giống ởEcuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệsinh các bể nuôi, sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm sử dụng các chất diệt khuẩnđến 94%

Theo Maeda và Liao (1994) dòng PM-4 được cấy hàng ngày trong 7 ngày liềnvào vào bể ương ghẹ 200 m3 (Portunus trituberculatus), kết quả mật độ Vibrio tỷ lệ

nghịch với mật độ PM-4 Tỷ lệ sống trung bình của 7 lần thử nghiệm với PM-4 là27,2%, tỷ lệ sống của 6 trên 9 lần thử nghiệm không có PM-4 là 6,8%

Bên cạnh đó mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chấthữu cơ ở đáy ao do thức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làmmôi trường sống của vật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gâythiệt hại lớn trong nuôi thuỷ sản Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rấtquan trọng trong các ao nuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạtđộng của vi sinh vật Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vaitrò rất quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷsản thâm canh Moriarty (1996) đã kết luận hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đếnchất lượng nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừcác sản phẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2-, H2S

Qiao Zhenguo và cs (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng

cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) dùng cải thiện chất lượng môi

trường nước [30]

Nghiên cứu của Graslund và cs (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan

sử dụng men vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùnđáy ao nuôi

2.1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic ở Việt Nam [40]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các men vi sinh để cải thiệnmôi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít Trongnhững năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh

và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khátốt

Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và cs (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằngchế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làmtăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còntăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng

Theo Võ Thị Thứ và cs., (2006) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nướcnuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốtthông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giốngnhư giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi Tác dụng của chế phẩm lên sự tăngtrưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng nhanh.[9]

Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 của Trung tâmnghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng góp phần đưanăng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ Nhiều hộ nuôi tôm có xử lýchế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắcphục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năngsuất [39]

Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầumang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà

hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh Trong suốt quá trìnhnuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh [35]

Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2000) tìm hiểu tác dụng của men

vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tômcàng xanh với liều lượng 1g/m3 và nhịp sử dụng khác nhau Tác giả cho biết vớinghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì nghiệmthức sử dụng hàng ngày là tốt nhất Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột

ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng

luôn giữ được ổn định Điều này cho thấy hiệu quả tích cực của men vi sinh trong sảnxuất giống tôm càng xanh [22]

Nghiên cứu Nguyễn Thanh Phương (2007) sử dụng 3 loại men vi sinhEcomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hìnhnước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu

trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio sp trong môi trường bể

ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1 76,6% Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu về hiệu quả và phương thức sửdụng men vi sinh trong môi trường ương nuôi tôm càng xanh nhằm cải thiện môitrường và nâng cao năng suất ương ấu trùng

- Một số chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có mặt ở Việt Nam

 Chế phẩm của viện sinh học Nhiệt Đới TPHCM [35]

 Chế phẩm Bio II gồm có: vi khuẩn Bacillus spp ( 1011 CFU/g),

Lactobacillus spp (109 CFU/g), nhóm nấm men Saccharomyces spp (108 CFU/g) Chếphẩm này có tác dụng kích thích tiêu hóa của tôm

 Chế phẩm VEM thành phần gồm có: chế phẩm EM có thêm 2 chủng vikhuẩn lactic (109 CFU/mL), nhóm Bacillus (109 CFU/mL), nhóm nấm men (107CFU/mL) và nhóm vi khuẩn quang dưỡng (107 CFU/mL) Chế phẩm này làm tăng hiệuquả đề kháng với vi sinh vật gây bệnh cho tôm và khả năng làm sạch môi trường aonhư: H2S, NH3, NO3

 Chế phẩm của Viện Công nghệ sinh học (trung tâm khoa học công

nghệ quốc gia) [9]

 Chế phẩm sinh học BioF có chứa tế bào sống chủng vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus được sử dụng trong ao nuôi trồng thủy sản Chế phẩm này có

tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas và Vibrio gây

ra Chế phẩm BioF có 9,2 x 108 - 8,9 x 109 CFU/g

 Chế phẩm sinh học BIOCHIE bào gồm một số chủng thuộc chi Bacillus

(Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và chi Lactobacillus

dùng để xử lý nước trong ao nuôi thủy sản Các chủng trên có khả năng phân hủy cáchợp chất hữu cơ từ thức ăn và chất thải của tôm, làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chutrình thay nước, tăng độ oxy hòa tan Chóng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩnlàm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh

 BIOCHIE được dùng cùng với chế phẩm BioF ứng dụng cho nuôi tômthịt đã mang lại kết quả tốt Liều lượng sử dụng là 1011 CFU/1000 m3 nước phun 15ngày/lần Chế phẩm BioF được trộn vào thức ăn với liều lượng 109 CFU /1kg thức ăn(hay là 3g/1kg thức ăn) trong suốt quá trình nuôi

 Chế phẩm sinh học Bio.DW [35]

Là tập hợp các vi sinh được phân lập tuyển chọn nhằm làm sạch nền đáy vàphòng bệnh cho tôm nuôi công nghiệp Chế phẩm ở dạng bột đóng gói do Viện Côngnghệ Sinh học thuộc Trung tâm khoa học công nghệ quốc gia nghiên cứu và ứng dụng

Thành phần gồm 2 chủng nấm sợi Aspergillus oryzae và Aspergillus phoenecis NT1

và 2 chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis

Cách dùng: 2 tuần/1 lần với liều lượng dùng 2,5 - 5 kg/ha

 Chế phẩm sinh học Men Bac [35]

Là sản phẩm của công ty TNHH Toba, Việt nam nhằm mục đích xử lý nước aonuôi tôm

Thành Phần: Bacillus mensentericus, Lactobacillus acidophillus, Bacillus subtillis, Streptococcus facium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Bacillus licheniformis, Aspergilus oryzace, Saccharomyces cerevisiae, enzyme và các chất dinh dưỡng.

Công dụng: Phân hủy nhanh chóng thức ăn thừa, phân tôm, vỏ tôm ở đáy ao,

hấp thụ khí độc NH3, H2S, NO2, chống ô nhiễm đáy ao, tạo chất lượng nước tốt Phòngchống bệnh đen mang, phồng mang, đóng rong, mòn đuôi, phát sáng Tạo nguồn vikhuẩn tự nhiên có lợi cho ao nuôi, ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn có hại chotôm Gia tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước, ổn định độ pH, màu nước Giảm độđục của nước, tạo ra các chất dinh dưỡng vô cơ giúp tảo và các vi sinh vật có lợi pháttriển ổn định Giúp tôm khỏe mạnh, mau lột xác, tăng trọng nhanh, đạt năng suất cao.Cách dùng: rải trực tiếp xuống ao nuôi mà không cần phải hòa vào nước hoặc sục khí:1kg/1000 m3, 10 - 15 ngày rải 1 lần

 Men vi sinh Bio - Probiotic tôm, cá [35]

Các vi sinh vật có lợi cho đường ruột: Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophillus, Saccharomyces cerevisae > 3.108 CFU/g Các enzyme tiêu hoá: Amylase,Cellulase, Protease

Công dụng: tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thụ chất dinh dưỡng, hạn chếđược các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hoá và bệnh do vi khuẩn, tăng sức đề kháng củatôm, tăng tốc độ sinh trưởng, tăng tỷ lệ sống, tăng năng suất và chất lượng cá, tôm nuôi

và giảm hệ số thức ăn

Cách sử dụng: dùng cho mọi lứa tuổi của tôm; Dùng trong suốt quá trình nuôi

sẽ ngăn được bệnh phân trắng Trộn đều 500g Bio-Probiotic cho 100kg thức ăn;Trường hợp tôm, cá biếng ăn dùng liều gấp đôi

 Chế phẩm làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá Bio – DW [35]

Thành phần: các vi sinh vật hữu hiệu: Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophillus, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisae Các enzyme: Amylase,

Cellulase, Protease

Tác dụng: phân huỷ nhanh thức ăn thừa, giảm lượng khí độc như H2S, NO3,NH3, làm sạch nước và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp đã bị ô nhiễm Tăngcường sự phân huỷ và chuyển hoá các chất thải hữu cơ, làm sạch và ổn định môitrường và nền đáy ao nuôi tôm, cá công nghiệp Tăng tỉ lệ sống và năng suất.

Cách sử dụng: hoà tan Bio-DW vào nước với tỉ lệ 1/50 rồi tạt đều khắp mặt

nước ao, đồng thời chạy hệ thống quạt nước hoặc hệ thống sục khí đáy Không sử dụngthuốc kháng sinh hoặc thuốc sát trùng trong vòng 2 ngày trước và sau khi dùng Bio-

DW Cải tạo ao trước khi thả giống, dùng với lượng 200g/1000 m3

+ Hai tháng đầu: 250g/1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần

+ Hai tháng sau: 500g/ 1000 m3 nước; 10 ngày xử lý 1 lần

Trường hợp ao bị ô nhiễm quá nặng thì sử dụng 1000g/1000 m3 nước, sục khí hayquạt nước suốt ngày đêm, mỗi tuần xử lý 1 lần cho đến khi nước hết ô nhiễm

2.2 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2.2.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]

Trùn đất có mặt ở khắp mọi nơi trên thế giới, với khoảng 4.500 loài, trong đó ởViệt Nam có trên 110 loài, nhưng chỉ có sáu tới tám loài được nuôi để sử dụng và sản

xuất phân bón Trong số đó có loài Eisenia fetida (trùn Quắn) và đặc biệt là loài

Perionyx excavatus (thường gọi là trùn đỏ hay trùn Quế) là được nuôi phổ biến nhất.

Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ

Megascocidae (họ cự dẫn), ngành ruột khoan Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường

sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại vớiphần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địaphương sống trong đất

Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần, nhập nội và đưa vàonuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác

ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch Kích thước trùn quế trưởngthành từ 10 - 15 cm, nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô khoảng 15 - 20% Hàmlượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 - 70%, lipid: 7 -8%, chất đường: 12 - 14%, tro 11 - 12%

Do có hàm lượng protein cao nên trùn quế được xem là nguồn dinh dưỡng bổsung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, trùn quế còn đượctrong y học, công nghệ chế biến thức ăn gia súc…

Phân trùn (vermicompost) là phân hữu cơ 100%, được tạo thành từ phân trùnnguyên chất và một phần được phân hủy từ chất hữu cơ Phân trùn chứa đựng hỗn hợp

vi sinh hoạt tính cao, chất xúc tác sinh học, phần cặn bã của cây trồng và động vật cũngnhư kén trùn Phân trùn gần như không mùi, nếu có cũng ít hoặc không gây ra sự khóchịu cho người Độ pH của phân trùn ~7

Hình 1.4 Trùn quế

 Những lợi ích mà phân trùn trong nông nghiệp.

hiệu quả ngay lập tức mà không gây hiện tượng cháy cây

Chương 4.Phân trùn giàu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước, cónhiều hơn 50% chất mùn, ngoài ra còn có các khoáng chất cần thiết cho cây như N, P,

K, Ca…

thụ hơn

tăng trưởng, cải tạo đất, duy trì khả năng giữ nước mà còn có thể ngăn ngừa các bệnh

về rễ Chất mùn trong phân loại trừ những độc tố và nấm, vi khuẩn hại trong đất giúpđẩy lùi những bệnh của cây trồng

hữu cơ Điều này ngăn không cho cây trồng hấp thụ nhiều phức hợp khoáng hơn nhucầu Những phức hợp khoáng này sau đó sẽ được phóng thích từ từ khi cây cần đến

pH quá cao vốn khiến cây trồng không thể hấp thu dinh dưỡng từ đất

cây trồng ngay cả ở nồng độ thấp đồng thời kích thích sự phát triển về mật độ vi khuẩntrong đất

Chương 10. IAA (Indol Acetic Acid) trong phân trùn là mộttrong những chất kích thích tăng trưởng hữu hiệu cho cây trồng.

khả năng giữ nước của đất cho cây

Tại Philippin, trùn quế được liệt kê vào danh mục thức ăn có giá trị dinh dưỡngcao cho nuôi trồng thuỷ sản

Tại Việt Nam, từ năm 2000 đã có nhiểu nghiên cứu sử dụng trùn quế trong chănnuôi gà và heo, trên từ cở sở đó cũng bắt đầu có những nghiên cứu và ứng dụng trùnquế trong nuôi trồng thủy sản Như nghiên cứu quá trình tự phân của trùn quế nhằm tạo

ra sản phẩm giàu đạm làm thức ăn cho tôm và cá con, nghiên cứu sử dụng trùn quế như

là nguổn protein làm thức ăn cho cá trê lai

Những ứng dụng từ trùn quế trong việc nuôi trồng thủy sản mang lại hiệu quảkinh tế đáng kể, trùn quế được một số trung tâm khuyến ngư khuyên dùng làm thức ăncho tôm cá, giúp tăng sức đề kháng, giảm được nhiều bệnh do vi sinh vật Đồng thờiphân trùn cũng được các trung tâm khuyến ngư khuyên dùng để xử lý ao tôm, gây màunước

11.1.1 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản

Trong nông nghiệp, trùn quế được coi là loại thức ăn đạm cao cấp cho vật nuôi.Các loài cá, baba, tôm, ếch, lươn, cua biển đều rất thích ăn trùn Đối với gia súc, giacầm, trùn là loại thức ăn bổ dưỡng Tuy nhiên, trùn quế tươi chỉ có thể để không quámột ngày ở nhiệt độ thường nên rất khó lưu trữ

Từ thực tế đó, tiến sĩ Võ Thị Hạnh cùng các cs thuộc Phòng Vi sinh Viện Sinhhọc nhiệt đới đã tạo ra 3 chế phẩm sinh học từ trùn quế trong đó chế phẩm BIO-T vàBIO-PT được dùng trong thủy sản.[32] Các chế phẩm này có thể được bảo quản, lưutrữ trong thời gian dài, từ 6 - 10 tháng Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là