Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Trong số các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng sinh thì Klebsiella pneumoniae đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến.. Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn nói chung và Klebsi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và ứng dụng nhữngthành tựu kỹ thuật mới vào y học đã giúp khống chế nhiều loại bệnhnhưng bệnh nhiễm khuẩn vẫn có chiều hướng gia tăng Hàng năm, tỷ

lệ mắc bệnh và tử vong do các căn nguyên vi khuẩn còn cao, điểnhình là các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Gram âm Một

trong các căn nguyên đó là Klebsiella pneumoniae Loài vi khuẩn này

gây ra các bệnh nghiêm trọng như nhiễm trùng huyết, viêm phổi,nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh phổi mạn tính và nhiễm khuẩnbệnh viện, ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch và gây tỷ lệ tửvong tương đối cao

Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cáchmạng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên, trong thực tế

do việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đãdẫn đến sự xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh và đakháng kháng sinh, gây nên một mối nguy cơ toàn cầu đe dọa nền yhọc hiện đại Trong số các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc

kháng sinh thì Klebsiella pneumoniae đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến Mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae thay

đổi theo từng quốc gia và khu vực địa lý

Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê của chương trình giám sátquốc gia về tính kháng thuốc kháng sinh ASTS (Antibiotic

Sensitivity Testing Study): tỷ lệ Klebsiella đề kháng các kháng sinh

thuộc phân nhóm cephalosporin là hơn 30% (năm 1999) và tăng lênhơn 50% (năm 2004) Trên 99% các chủng vi khuẩn này còn nhạy

cảm với imipenem Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn nói

chung và Klebsiella pneumoniae nói riêng cũng như xác định độ

kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn là việc làm cần thiết để giúpcác thầy thuốc lâm sàng có phương hướng sử dụng kháng sinh hợp

lý, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong, giảm chi phí điều trị

Bên cạnh những nghiên cứu xác định tỷ lệ gây nhiễm khuẩn và

mức độ kháng thuốc kháng sinh của Klebsiella pneumoniae thì ngay

từ năm 1980, người ta đã nghiên cứu về một số yếu tố độc lực như độbám dính, đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O và vỏ capsule cóliên quan đến bệnh sinh của vi khuẩn này Năm 2007, tác giả FangC.T., Kuo-Ming Y và cộng sự đã nghiên cứu bệnh sinh của áp xegan và nhận thấy căn nguyên gây áp xe gan có liên quan đến vai trò

của Klebsiella pneumoniae thuộc serotype K1 và K2 Serotype K2

thường gặp ở những chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhânviêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết.Nghiên cứu của Wen-Liang Y và cộng sự cũng cho biết, những

chủng Klebsiella pneumoniae có kháng nguyên vỏ, mang gen magA,

và rmpA thường gây áp xe gan vì gen magA mang đặc trưng kiểu

hình và độ nhày của vi khuẩn, làm tăng khả năng kháng thực bào và

khả năng gây bệnh của vi khuẩn Gen rmpA được biết đến với vai trò

trong việc tổng hợp polysaccharide ngoại bào liên quan đến chất

nhầy của Klebsiella pneumoniae.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trong nước đa số mới chỉ tập trungvào việc xác định kiểu hình và mức độ kháng thuốc kháng sinh của

Klebsiella pneumoniae mà chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen

và serotype của loài vi khuẩn này

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương hàng năm tiếp nhận sốlượng lớn bệnh nhân vào viện với bệnh cảnh lâm sàng thường đadạng và nặng, trong đó có một số lượng tương đối nhiều bệnh nhân bị

nhiễm khuẩn do Klebsiella pneumoniae.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, với mong muốn góp phầnđáp ứng yêu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh do

Klebsiella pneumoniae gây nên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (1/2007-12/2011),

với 2 mục tiêu:

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định sự phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các bệnh phẩm và mức độ kháng kháng sinh của chúng.

2 Xác định tỷ lệ mang gen magA, rmpA; Serotype của một số chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được theo bệnh phẩm.

CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Xác định được sự phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các

bệnh phẩm

2 Xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được trong các mẫu bệnh phẩm.

3 Xác định được tỷ lệ các chủng Klebsiella pneumoniae mang gen

magA, rmpA phân lập được tại Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương.

4 Xác định tỷ lệ các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được

Chương 1: Tổng quan tài liệu 27 trang;

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu 25 trang;

Chương 4: Bàn luận 24 trang;

Kết luận 02 trang; Kiến nghị 01 trang; Danh mục các công trìnhnghiên cứu có liên quan 01 trang

Tài liệu tham khảo (tổng số 114 tài liệu, 26 tài liệu tiếng Việt, 88tài liệu tiếng Anh)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ PHÂN LOẠI KLEBSIELLA

Klebsiella là một trong những chi quan trọng thuộc họ vi khuẩn

đường ruột, được đặt theo tên của nhà vi khuẩn học người Đức là

Edwin Klebs (1834 - 1913) Klebsiella có trong hệ vi khuẩn bình

thường ở ruột người trưởng thành, với số lượng nhỏ, có thể gặp ở

đường hô hấp trên Klebsiella cũng là thành viên của hệ vi khuẩn

bình thường ở nhiều loài động vật và phân bố rộng rãi ngoài môi

trường Trong số các loài thuộc giống Klebsiella, Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) là loài gây bệnh điển hình và quan trọng nhất Căn cứ vào kháng nguyên O, K pneumoniae được chia

thành 9 nhóm, trong đó nhóm O1 là hay gặp nhất Dựa vào cấu trúc

vỏ của K pneumoniae, người ta chia thành 77 serotype.

1.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ KLEBSIELLA

1.2.1 Đặc điểm sinh học của K pneumoniae

1.2.1.1 Hình thể

K pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn thường đứng thành từng đôi K pneumoniae có kích

thước 0,3 - 1 x 0,6 - 6 m

1.2.1.2 Kháng nguyên

K pneumoniae có kháng nguyên O và kháng nguyên K.

Kháng nguyên O bản chất là LPS (lipopolysaccharide)- khángnguyên thân của vi khuẩn, mang tính đặc hiệu nhóm LPS là mộtphức hợp protein, poliosid và lipid, trong đó protein làm cho phứchợp có tính kháng nguyên, poliosid quyết định tính đặc hiệu kháng

nguyên còn lipid quyết định tính độc Dựa vào kháng nguyên O, K pneumoniae được chia thành 9 nhóm.

Kháng nguyên K (bản chất là polysaccharide) - là kháng nguyên

vỏ hoặc kháng nguyên bề mặt mang tính đặc hiệu type Kháng nguyên

K có tác dụng giúp vi khuẩn tránh được tế bào thực bào Dựa vàokháng nguyên K người ta chia vi khuẩn thành 77 serotype

1.2.1.3 Các yếu tố độc lực

K pneumoniae có trong đường hô hấp và đường tiêu hóa của

khoảng 5% người bình thường, loài vi khuẩn này cũng là thành viêncủa hệ vi khuẩn bình thường ở nhiều loài động vật và phân bố rộng

ngoài môi trường K pneumoniae với nhiều yếu tố độc lực tạo điều

kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh, baogồm: yếu tố bám và xâm nhập, vỏ, nội độc tố, độc tố ruột, khả năngcạnh tranh sử dụng sắt, bacteriocin

1.2.1.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của K pneumoniae

Tạo ra các enzym

Tạo ra các enzym làm biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc của phân tửkháng sinh làm kháng sinh mất tác dụng Những enzym này có thểnằm ở thành tế bào, bảo vệ sự vững chắc của tế bào

Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương

Vi khuẩn giảm mức độ thấm thuốc qua thành tế bào hoặc giảmtính thấm của màng nguyên tương hoặc làm mất hệ thống vận chuyển

qua màng K pneumoniae có màng ngoài chống lại khả năng thấm

của những kháng sinh ưa nước

Tạo ra các isoenzym

Trong số các cơ chế kháng kháng sinh của K pneumoniae, cơ

chế vi khuẩn sinh enzym, nhất là vi khuẩn sinh -lactamase phổ rộngcần được đặc biệt quan tâm, vì khi vi khuẩn sinh ESBLs thì sẽ đềkháng toàn bộ nhóm -lactam, nhất là cephalosporins - các khángsinh được dùng phổ biến hiện nay Bên cạnh đó, việc sản sinh các

enzym carbapenemases hoặc metallo-beta-lactamase bởi K pneumoniae có thể làm cho vi khuẩn đề kháng với tất cả các kháng

sinh thuộc nhóm beta-lactam, bao gồm cả carbapenem

1.2.2 Phân loại serotype và gen độc lực của K pneumoniae

Các yếu tố liên quan đến độc lực của K pneumoniae như độ

bám dính có fimbriae bám và không có fimbriae bám, bacteriocin,đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O và vỏ polysaccharide Những

yếu tố độc lực chính của K pneumoniae để gây các bệnh nhiễm trùng

như: serotype huyết thanh, kiểu hình hypermucoviscosity,lipopolysaccharide, đại thực bào có chứa sắt và pili Mức độ độc lực

của K pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn khác nhau, như đối với serotype của chủng vi khuẩn K pneumoniae được chia thành 77

serotype và độc lực của serotype ở các vùng địa lý khác nhau thì rất

khác nhau Trong số 77 serotype kháng nguyên vỏ của K pneumoniae theo phân loại thì serotype K1, K2, K4 và K5 đã được

chứng minh có độc lực cao khi gây nhiễm khuẩn thực nghiệm ởchuột, đồng thời gây nhiễm trùng nặng ở người và động vật SerotypeK1 thường gặp trong các trường hợp viêm phổi và áp xe gan, gâybiến chứng nặng nề làm nhiễm khuẩn hệ thống thần kinh trung ương

như viêm màng não K pneumoniae có serotype K1 có K2 thường có

kiểu hình hypermucoviscosity do vậy có khả năng sản sinh chất nhàylàm tăng độ nhớt và độ bám dính của vi khuẩn trên môi trường nuôi

cấy, làm cho K pneumoniae tính độc lực cao hơn so với các

serotype khác và dẫn đến gây tử vong

Các nghiên cứu về gen của K pneumoniae gồm có: cps (capsular polysaccharide synthesis), rmpA, (regulator mucoid phenotype A), magA (mucoviscosity associated gene A) Chức năng của các gen này

là hoàn toàn khác nhau, như gen cps thực hiện việc tổng hợp polysaccharide Gen rmpA chịu trách nhiệm điều hoà sự tổng hợp các

polysaccharide ngoại bào và sinh ra các kiểu hình

hypermucoviscosity Gen magA mã hóa một protein màng ngoài 43

kD Gen magA nằm trong operon có liên quan đến serotype K1 hay các operon có chứa gen magA là có serotype K1 và gen magA chống lại thực bào do vậy hay gây áp xe gan, viêm màng não Gen magA còn đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng do Klebsiella như

nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi và áp xe gan, đồng thời cũng mangđặc trưng kiểu hình và độ nhày của loài vi khuẩn này làm tăng khả

năng chống lại hiện tượng thực bào Gen magA gần đây đã được xác định trong các chủng K pneumoniae gây áp xe gan ở bệnh nhân không chỉ ở Đài Loan mà còn các nước khác trên thế giới Chủng K pneumoniae mang gen magA thì độc lực tăng và có thể gây nên bệnh

cảnh lâm sàng nặng nề, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao đối với người bệnh

Nghiên cứu về K pneumoniae tại Đài Loan cho thấy, sự kết hợp của gen magA với kiểu gen chất nhày có liên quan đến sinh bệnh học của thể áp xe gan Ngoài magA thì rmpA cũng đóng vai trò quan trọng

trong biểu hiện kiểu hình chất nhày

1.2.3 Khả năng gây bệnh của K pneumoniae

1.2.3.1 Nhiễm khuẩn huyết

1.2.4.2 Nuôi cấy phân lập

K pneumoniae là loài vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ngộ, phát

triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạchthường, thạch máu Nhiệt độ thích hợp từ 35 - 37oC, pH 7- 7,2

Kỹ thuật kháng sinh đồ:

Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch;

Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu – MIC; Phương pháp phát hiện ESBLs.

1.2.4.3 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

Đây là kỹ thuật cho phép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệgen ADN của sinh vật bằng một cặp mồi đặc hiệu

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ K PNEUMONIAE

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới về K pneumoniae

1.3.1.1 Tình hình nhiễm khuẩn do K pneumoniae

K pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp

xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu,

Wen-Chien K cùng cộng sự (CS) đã thực hiện một nghiên cứurộng khắp trong thời gian 2 năm (1/1996 - 12/1997), với mạng lướiliên kết của 12 bệnh viện ở nhiều nước khác nhau, trên 440 bệnh

nhân bị NKH do K pneumoniae với 445 mẫu dương tính từ bệnh

phẩm máu cho thấy tỷ lệ NKH mắc phải tại cộng đồng có sự khácbiệt giữa các quốc gia: 68% ở Đài Loan, 43% ở Mỹ, 39% ở Úc, 34%

ở Nam phi, 22% ở Châu Âu và 17% ở Ác-hen-ti-na

1.3.1.2 Tình hình kháng kháng sinh của K pneumoniae

Theo NNISS (National Nosocomial Infections SurveillanceSystem): kết quả so sánh năm 2003 với giai đoạn 1998 - 2002 cho

thấy tỷ lệ kháng các cepholosporin thế hệ 3 của K pneumoniae ở Mỹ tăng lên 47% Ở Pháp tỷ lệ K pneumoniae kháng ceftazidime là 40% Tính chung trên toàn khu vực châu Âu, các chủng K pneumoniae phân lập được tại các khoa Điều trị tích cực kháng

ceftazidime với tỷ lệ là 42% Năm 2011, các nhà khoa học ở Trung

Quốc báo cáo tỷ lệ nhiễm K pneumoniae trên trẻ sơ sinh ở châu Phi

và đã xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae với

ampicillin và chloramphenicol đều chiếm 83,3%; tỷ lệ khángcephalexin và cefotaxim đều chiếm 50%; kháng ceftriaxon,ceftazidim và cefoperazon với tỷ lệ bằng nhau (16,7%)

1.3.1.3 Tình hình nghiên cứu về serotype và gen của K pneumoniae

Serotype K1, K2 kết hợp các kiểu hình chất nhầy chính là yếu tố

độc lực của K pneumoniae và đặc biệt serotype K1, K2 có thể bảo vệ

vi khuẩn tránh được hiện tượng thực bào của bạch cầu đa nhân trungtính và tránh được sự tác động của kháng sinh

Nghiên cứu của Kuo-Ming Y và CS tại Singapore và Đài Loantrong thời gian 2002 - 2004 với đối tượng bệnh nhân áp xe gan nhiễm

K pneumoniae được cấy từ bệnh phẩm mủ và máu, cho thấy serotype

K1 chiếm là 46,6% và K2 chiếm tỷ lệ là 20,5% Trong đó 100% số

chủng đều mang gen magA và rmpA Ở hai trung tâm Y tế Đài Loan

năm 2008 tác giả Yu W L đã nghiên cứu 50 chủng K pneumoniae

phân lập được từ bệnh nhân áp xe gan nguyên phát Trong đó K1

(n=26; 52%), K2 (n=10; 20%) và rmpA chiếm 90%

1.3.2 Nghiên cứu trong nước về K pneumoniae

Phạm Thị Hằng và cộng sự nghiên cứu tại Bệnh Viện Nhi Trungương (2005) cho biết: các kiểu đa kháng kháng sinh của 132 chủng

K pneumoniae gây nhiễm khuẩn huyết ở bệnh nhi (trên một tháng

tuổi), trong đó kiểu kháng từ 6 kháng sinh trở lên chiếm 80% Tại

Bệnh viện Nhi Đồng 2 (2007), K pneumoniae kháng

trimethoprim/sulfamethoxazol (74%), cefuroxime (71,2%),cefotaxime (65,3%), gentamycine (63,6%), ceftazidime (53,1%),netilmycine (43,52%), amikacin (42,9%) Theo Phạm Hùng Vân vànhóm nghiên cứu MIDAS trong nghiên cứu đa trung tâm về tình hìnhkháng imipenem và meropenem của trực khuẩn Gram âm ở 16 bệnh

viện tại Việt Nam (5/2008 - 11/2009), thì tỷ lệ K pneumoniae kháng

imipenem là 3,2% và kháng meropenem là 1,2%

Tóm lại, đa số kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều

cho thấy K pneumoniae thực sự là một tác nhân gây bệnh quan

trọng Loài vi khuẩn này ngày càng gia tăng tỷ lệ đề kháng với cáckháng sinh thường dùng trên lâm sàng Các tác giả cũng đã nghiên

cứu về gen và phân bố serotype của các chủng K pneumoniae, tuy

nhiên đa số nghiên cứu về khía cạnh này mới chỉ dừng lại trong phạm

vi một vài quốc gia với số mẫu nghiên cứu chưa lớn Đây chính là lý

do mà Đơn vị nghiên cứu Lâm sàng - Đại học Oxford đã hợp táccùng khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ươngnghiên cứu về sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen

magA, rmpA ở các chủng K pneumoniae phân lập được theo các mẫu

bệnh phẩm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

Đối tượng nghiên cứu gồm 537 chủng vi khuẩn K pneumoniae phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị nhiễm khuẩn do K pneumoniae nằm điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương,

trong đó:

- 166 chủng vi khuẩn K pneumoniae hồi cứu từ (1/2007 đến

12/2008) được lưu giữ tủ lạnh âm 200C

- 371 chủng vi khuẩn K pneumoniae tiến cứu từ (1/2009-12/2011) phân lập từ các mẫu bệnh phẩm.

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng

- Chủng vi khuẩn K pneumoniae phân lập và định danh từ các

mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân

- Chủng vi khuẩn K pneumoniae được lưu giữ tại khoa xét

nghiệm

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Không phân lập được vi khuẩn K pneumoniae từ các mẫu bệnh

phẩm của bệnh nhân nằm điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đớiTrung ương từ 1/2009 đến 12/2011

Các chủng phân lập lần 2 từ cùng một bệnh nhân

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Địa điểm

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 12 năm 2011

2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.3.1 Môi trường, sinh phẩm và thiết bị sử dụng để nuôi cấy,

định danh K pneumoniae và làm kháng sinh đồ

2.3.1.1 Môi trường - sinh phẩm

* Môi trường cấy máu: chai cấy máu của Becton Dickinson - Mỹ.

* Môi trường phân lập xác định K pneumoniae

+ Thạch máu (Blood agar) của hãng Oxoid – Anh;

+ Thạch Sô-cô-la của hãng Oxoid – Anh;

+ Thạch Uri-Select 4 của hãng Oxoid – Anh;

+ Thạch Mueller - Hinton của Bio-Merieux;

+ Thạch mềm của hãng Oxoid – Anh

* Kít định danh K pneumonia: API 20E hoặc card Gram (-) của

Bio-Merieux – Pháp

* Khoanh giấy kháng sinh để làm kháng sinh đồ của hãng Oxoid –

Anh hoặc Card kháng sinh đồ Gram (-) mã số 411924 của Merieux - Pháp

Bio-2.3.1.2 Các chủng chuẩn quốc tế để kiểm tra chất lượng

* Escherichia coli ATCC 25922

* Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

* Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

+ Tủ an toàn sinh học Telstar Bio-II-A - Mỹ;

2.3.2 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong PCR

2.3.2.1 Sinh phẩm, hóa chất

+ dNTP’s của hãng Roche - Mỹ;

+ MgCl2 của hãng Qiagen - Đức;

+ Nước khử ion của hãng Sigma - Mỹ;

+ Hostar taq ADN polymerase của hãng Qiagen - Đức;

+ K1, K2, K5, K20, K54, K57, magA, rmpA, của Sigma- Mỹ

+ Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng invitrogen - Mỹ;+ Ethidium bromide dùng để nhuộm gel của hãng Sigma- Mỹ;+ ADN ladder- Sm 1283 của hãng Fermentas - Mỹ;

+ TBE 10X của hãng BD - Mỹ;

+ TAE (Tris Acetate EDTA) hãng Sigma - Mỹ;

+ PBS (Phosphate buffer Saline) hãng Sigma - Mỹ

2.3.2.2 Thiết bị - Dụng cụ

+ Máy ly tâm của hãng Eppendorf, Đức;

+ Máy PCR Eppendorf - MasterCycler grandient, Đức;

+ Máy điện di mini của hãng Bio-Rad, Pháp;

+ Máy đọc gel Geldoc hãng Bio-Rad, Pháp;

+ Máy chụp ảnh gel hãng Bio-Rad, Pháp

+ Dụng cụ, bao gồm:

- Pipet eppendorf của Đức hoặc Gilson, Nhật Bản loại 10 µl, 20

µl, 200 µl và 1000 µl;

- Týp vô trùng eppendorf loại 1,5ml;

- Týp phản ứng huỳnh quang loại 0,2ml;

- Týp trắng không có huỳnh quang loại 0,2ml;

2.4 PHƯƠNG PHÁP, KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích, phương pháp nghiêncứu phòng thí nghiệm

2.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy K pneumoniae

2.4.2.1 Kỹ thuật cấy máu

2.4.2.2 Kỹ thuật cấy dịch não tủy

2.4.2.3 Kỹ thuật cấy đờm

2.4.2.4 Kỹ thuật cấy dịch rửa phế quản

2.4.2.5 Kỹ thuật cấy dịch màng phổi, dịch màng bụng

2.4.2.6 Kỹ thuật cấy dịch mủ

2.4.2.7 Kỹ thuật cấy nước tiểu

2.4.2.8 Kỹ thuật cấy dịch họng

2.4.3 Kỹ thuật phân lập K pneumoniae

2.4.3.1 Theo dõi các chai cấy máu

2.4.3.2 Phân lập, định danh K pneumoniae

+ Lấy chai máu dương tính ra, dùng kim tiêm vô trùng hút hỗndịch tương đương 0,5 ml, cấy phân vùng vào môi trường thạch máu,thạch Sô-cô-la Để đĩa thạch máu để tủ ấm ở 370C qua đêm.

+ Các loại bệnh phẩm đã nuôi cấy trên các môi trường khác nhauđược lấy ra khỏi tủ ấm Quan sát hình dạng, màu sắc, số lượng khuẩnlạc, tiến hành nhuộm Gram Nếu là trực khuẩn Gram âm thì tiếp tụctiến hành các thử nghiệm sau:

- Hoặc sử dụng card định danh vi khuẩn Gram âm và máy địnhdanh tự động Vitek 2

2.4.4 Kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc của K pneumoniae 2.4.4.1 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer)

* Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có mức độ nhậy cảm

với các loại kháng sinh khác nhau, biểu hiện của sự khác nhau bằngđường kính vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh khi có

sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với kháng sinh

2.4.4.2 Phương pháp xác định nồng độ (MIC) của kháng sinh với

K pneumoniae.

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của vi khuẩn với khángsinh bằng máy tự động VITEK 2 - Compact dựa trên nguyên lý: hệthống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sựphát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặnlại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng

2.4.4.3 Phương pháp phát hiện ESBLs

* Nguyên lý: Quan sát hiện tượng kháng hay giảm nhạy cảm của

các trực khuẩn đường ruột đối với các cephalosporin (thử nghiệmsàng lọc) - Thử nghiệm cộng lực giữa các cephalosporin thế hệ 3,4

và clavulanat, nếu có cộng lực dương thì ESBL dương tính