Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

HỌC VIỆN QUÂN YĐÀO TUYẾT TRINH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ, MỨC ĐỘ KHÁNG KHÁNG SINH, TỶ LỆ MANG GEN magA, rmpA Ở CÁC CHỦNG Klebsiella pneumoniae PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUN

HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐÀO TUYẾT TRINH

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ, MỨC ĐỘ KHÁNG

KHÁNG SINH, TỶ LỆ MANG GEN magA, rmpA

Ở CÁC CHỦNG Klebsiella pneumoniae PHÂN LẬP

ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI

TRUNG ƯƠNG (1/2007-12/2011)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2016

ĐÀO TUYẾT TRINH

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ, MỨC ĐỘ KHÁNG

KHÁNG SINH, TỶ LỆ MANG GEN magA, rmpA

Ở CÁC CHỦNG Klebsiella pneumoniae PHÂN LẬP

ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

công trình nghiên cứu có tên: “Bacterial and clinical characteristics of

severe Klebsiella pneumoniae infections at the National Hospital for

Tropical Diseases” Kết quả công trình này là thành quả nghiên cứu của tập

thể mà tôi là một thành viên chính Tôi đã được toàn bộ các thành viên trongnhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng công trình này vào trong luận án

để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Đào Tuyết Trinh

Trước tiên, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Văn Ca và PGS.TS Lê Thu Hồng những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu Các Thầy, Cô đã cho tôi nhiều ý kiến hướng dẫn quí báu, động viên và giúp đỡ tôi giải quyết những khó khăn vướng mắc trong quá trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Kính,

PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, PGS.TS Heiman F.L Wertheim, TS Peter Hobby, PGS.TS Nguyen Thái Sơn tuy không trực tiếp hướng dẫn, song các

Thầy đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm luận án, hỗ trợ tôi về kiến thức và kỹ thuật giúp tôi hoàn thành được nghiên cứu này.

Tôi xin gửi lời cám ơn tới Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford, Tập thể Bộ môn vi sinh Học viện Quân y, đã luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các Thày cô trong Hội đồng chấm luận án các cấp, đã đóng góp ý kiến sâu sắc và tỉ mỉ cho luận án của tôi được hoàn thiện.

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể anh chị em khoa xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, là gia đình thứ hai của tôi, các anh chị đã luôn giúp đỡ tôi trong công việc hàng ngày, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và công tác.

Tôi cũng xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

Đảng uỷ, Ban giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Đảng

ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y Phòng Đào tạo sau Đại học Học viện Quân y cùng các phòng ban Học viện Quân y, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi công tác, học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án

Xin gửi lời cám ơn chân thành tới các anh chị em bạn bè, các cháu, đã luôn động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vô cùng to lớn để tôi thực hiện và hoàn thành luận án này.

Cuối cùng, tôi xin cám ơn tới những người thân trong gia đình, cảm ơn

Mẹ, luôn bên tôi trong những lúc khó khăn Xin cảm ơn chồng và các con thân yêu của tôi đã luôn sát cánh bên tôi, là nguồn động viên lớn lao để tôi có thể vượt qua những khó khăn trong quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả

Đào Tuyết Trinh

1.2.2 Phân loại serotype và gen của K pneumoniae 12

1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán K pneumoniae 18

1.3 Tình hình nghiên cứu K pneumoniae 23

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới về K pneumoniae 23

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.3.1 Môi trường, sinh phẩm và thiết bị sử dụng để nuôi cấy, định danh

K pneumoniae và làm kháng sinh đồ

32

2.3.2 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong PCR 36

2.4.4 Kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc của K pneumoniae 42

kháng kháng sinh của chúng

3.1.1 Phân bố tỷ lệ K pneumoniae ở các loại bệnh phẩm 56

3.1.2 Kết quả về mức độ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae

phân lập được

60

3.2 Tỷ lệ mang gen magA, rmpA; serotype của một số các chủng

K pneumoniae phân lập được theo bệnh phẩm

72

3.2.1 Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng phân lập được theo

bệnh phẩm

72

3.2.2 Kết quả xác định serotype của các chủng K pneumoniae phân lập

được theo loại bệnh phẩm

4.1.1 Phân bố tỷ lệ K pneumoniae ở các loại bệnh phẩm 82

4.1.2 Mức độ kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn K pneumoniae

phân lập được

87

4.2 Tỷ lệ mang gen magA, rmpA; serotype của một số chủng

K pneumoniae phân lập được theo bệnh phẩm

96

4.2.1 Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng K pneumoniae phân

lập được theo bệnh phẩm

96

4.2.2 Kết quả xác định serotype của các chủng K pneumoniae phân lập

được theo các loại bệnh phẩm

100

KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN

CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AND Acid Deoxyribo Nucleic

API 20E Analytical Profile Index Enterobacteriaceae

(Tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn đường ruột)ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome

(Hội chứng suy hô hấp cấp tính)

ASTS Antibiotic Sensitivity Testing Study

(Chương trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc kháng sinh)

ATCC American Type Culture Collection

(Tên thương mại của hệ thống chủng chuẩn theo tiêuchuẩn của Hoa Kỳ)

(Số đơn vị khuẩn lạc trong 1 ml mẫu)CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

(Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm)

Dntp Desoxyribonucleotide triphosphate

ESBLs Extended Spectrum Beta-Lactamase

(Beta-Lactamases hoạt phổ rộng)

(Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người)

K pneumoniae Klebsiella pneumoniae

magA mucoviscosity associated gene A

(Gen liên quan chất nhày)MIC Minimum Inhibitory Concentration

(Nồng độ ức chế tối thiểu)

NKH Nhiễm khuẩn huyết

(Phản ứng khuếch đại chuỗi)SHV-1 Sulfhydryl - Variable

1.1 Tình hình kháng kháng sinh của K pneumoniae ở một số nước

Châu Á Thái Bình Dương

25

2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR thường 49

3.1 Phân bố tỷ lệ K pneumoniae ở các loại bệnh phẩm khác nhau 56

3.2 Phân bố tỷ lệ K pneumoniae theo nhóm tuổi và giới 57 3.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae phân lập

3.8 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae phân lập

được trong bệnh phẩm đờm từ năm 2007 đến 2011

65

3.9 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae phân lập

được trong bệnh phẩm máu từ năm 2007 đến 2011

66

3.10 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae phân lập

được trong bệnh phẩm mủ từ năm 2007 đến 2011

67

3.11 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K pneumoniae phân lập

được từ năm 2007 đến 2011

68

3.12 Tỷ lệ sinh ESBL của các chủng K pneumoniae phân lập được 70

3.13 Tỷ lệ K pneumoniae theo số kháng sinh bị kháng 71

3.14 Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng K pneumoniae

phân lập được

72

3.15 Tỷ lệ mang gen magA của các chủng K pneumoniae phân lập

được theo các loại bệnh phẩm

74

3.16 Tỷ lệ mang gen rmpA của các chủng K pneumoniae phân lập

được trong các mẫu bệnh phẩm

75

3.17 Tỷ lệ xác định serotype của các chủng K pneumoniae 76

3.1 Phân bố tỷ lệ K pneumoniae theo giới 573.2 Phân bố tỷ lệ phân lập K pneumoniae theo nhóm tuổi 583.3 Phân bố tỷ lệ phân lập K pneumoniae theo năm 593.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh của chủng K pneumoniae phân lập

được từ năm 2007 đến 2011

69

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và ứng dụng những thành tựu

kỹ thuật mới vào y học đã giúp khống chế nhiều loại bệnh nhưng bệnh nhiễmkhuẩn vẫn có chiều hướng gia tăng Hàng năm, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong docác căn nguyên vi khuẩn còn cao, điển hình là các trường hợp nhiễm khuẩn do

các vi khuẩn Gram âm [55], [80] Một trong các căn nguyên đó là Klebsiella

pneumoniae Loài vi khuẩn này là một vi sinh vật cơ hội gây ra các bệnh

nghiêm trọng như nhiễm trùng huyết, viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu,bệnh phổi mạn tính và nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm trùng ở những bệnh nhânsuy giảm miễn dịch và gây tỷ lệ tử vong tương đối cao [58]

Hàng năm loài vi khuẩn này gây ra 66% các trường hợp viêm phổi ởngười già (mắc phải tại cộng đồng) ở Mỹ, 15 - 40% tại Malaysia và Nhật Bản

[80] Ở Đài Loan, Hàn Quốc, Ấn Độ và Thái Lan Klebsiella pneumoniae là

nguyên nhân gây nên 50% các trường hợp áp xe gan và nhiễm khuẩn huyết ởnhững người nghiện rượu, đái tháo đường với tỷ lệ tử vong dao động từ 50 đến100% [53], [80]

Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng

trong điều trị các bệnh lý nhiễm trùng, vào năm 1929 Fleming phát hiện một hoạt chất do nấm Penicillium notatum tiết ra có khả năng diệt Staphylococcus

aureus ở bệnh viện Saint Marie [4] Năm 1940, nhóm các nhà khoa học ở đại

học Oxford đã tinh chế được penicillin và mở ra kỷ nguyên dùng kháng sinh

để điều trị các bệnh nhiễm trùng Hiện nay có trên 4.000 kháng sinh tiết ra từnấm và vi khuẩn, hơn 30.000 kháng sinh bán tổng hợp và trên 100 loại khángsinh được dùng trong y học [9] Tuy nhiên, trong thực tế do việc sử dụng khángsinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện nhiều chủng

vi khuẩn kháng kháng sinh và đa kháng kháng sinh, gây nên một mối nguy cơcho y tế toàn cầu phải đối mặt với sự thất bại trong việc điều trị các bệnh nhiễm

trùng Trong số các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng sinh thì

Klebsiella pneumoniae cũng đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến Mức độ

kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae cũng thay đổi theo từng quốc gia

và khu vực địa lý

Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê của chương trình giám sát quốc gia vềtính kháng thuốc kháng sinh ASTS (Antibiotic Sensitivity Testing Study): tỷ lệ

Klebsiella đề kháng các kháng sinh thuộc phân nhóm cephalosporin là hơn

30% (năm 1999) và tăng lên hơn 50% (năm 2004) Trên 99% các chủng vi

khuẩn này còn nhạy cảm với imipenem [9], [10] Việc xác định căn nguyên gây

nhiễm khuẩn nói chung và Klebsiella pneumoniae nói riêng cũng như xác định

độ nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh là việc làm cần thiết giúp cácthầy thuốc lâm sàng có phương hướng sử dụng kháng sinh hợp lý, góp phầnlàm giảm tỷ lệ tử vong, giảm chi phí điều trị [3], [4]

Bên cạnh những nghiên cứu xác định tỷ lệ gây nhiễm khuẩn và mức độ

kháng thuốc kháng sinh của Klebsiella pneumoniae thì ngay từ năm 1980, đã

có nghiên cứu về một số yếu tố độc lực như độ bám dính, kháng nguyên O vàyếu tố vỏ có liên quan đến bệnh sinh của loài vi khuẩn này [60] Nghiên cứu

của tác giả Alyssa S S cho biết những chủng Klebsiella pneumoniae mang

kháng nguyên vỏ K1 thường có độc tính cao [31]

Năm 2007, tác giả Fang C.T., Kuo-Ming Y và cộng sự đã nghiên cứubệnh sinh của áp xe gan và nhận thấy căn nguyên gây áp xe gan có liên quan

đến vai trò của Klebsiella pneumoniae thuộc serotype K1 và K2 [50], [67].

Serotype K2 thường gặp ở những chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhânviêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết [58] Nghiên cứu

của Wen-Liang Y và cộng sự cũng cho biết, những chủng Klebsiella

pneumoniae có kháng nguyên vỏ, mang gen magA, và rmpA thường gây áp xe

gan vì gen magA mang đặc trưng kiểu hình và độ nhày của vi khuẩn, làm tăng khả năng kháng thực bào và khả năng gây bệnh của vi khuẩn [58] Gen rmpA

được biết đến với vai trò trong việc tổng hợp polysaccharide ngoại bào liên

quan đến chất nhầy của Klebsiella pneumoniae [58], [100].

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trong nước đa số mới chỉ tập trung vào việc

xác định kiểu hình và mức độ kháng thuốc kháng sinh của Klebsiella

pneumoniae mà chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen và serotype của loài vi

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, với mong muốn góp phần đáp ứng

yêu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh do Klebsiella

pneumoniae gây nên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài luận án:

Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (1/2007-12/2011), với 2 mục tiêu sau:

- Xác định sự phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các bệnh phẩm và mức độ kháng kháng sinh của chúng.

- Xác định tỷ lệ mang gen magA, rmpA; Serotype của một số chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được theo bệnh phẩm.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ PHÂN LOẠI KLEBSIELLA

Nhờ kỹ thuật nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch là Hans

Christina Gram phát minh năm 1884 mà có thể phân biệt được Klebsiella và

Streptococcus pneumoniae Klebsiella là một trong những chi quan trọng thuộc

họ vi khuẩn đường ruột, được đặt theo tên của nhà vi khuẩn học người Đức làEdwin Klebs (1834 - 1913) [80]

Chi Klebssiella gồm các loài: K pneumoniae, K aerogenes, K ozaenae,

K rhinoscleromatis, K gramanulomatis, K oxytoca, K ornitholytica, K planticola và K terrigena [16], [80] Sự tương đồng về cấu trúc ADN đã cho

phép xếp 4 loài K pneumoniae, K aerogenes, K ozaenae, K rhinoscleromatis thành các loài phụ (subspecies) thuộc loài K pneumoniae Ba loài K.

ornitholytica, K planticola và K terrigena được xếp vào một chi mới là Raoultella [16].

Klebsiella có trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người trưởng thành, với số lượng nhỏ, có thể gặp ở đường hô hấp trên Klebsiella cũng là thành viên

của hệ vi khuẩn bình thường ở nhiều loài động vật và phân bố rộng rãi ngoàimôi trường

Nguồn lây nhiễm Klebsiella chủ yếu từ đường tiêu hóa, có thể từ họng,

da (đặc biệt vùng da gần đáy chậu có nhiều vi khuẩn) Vi khuẩn có thể xâmnhập vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như qua dụng cụ phẫu thuật, ốngdẫn lưu, qua bàn tay nhân viên y tế, qua thức ăn bị ô nhiễm

Klebsiella là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội, ở cộng đồng hoặc trong bệnh

viện, là một trong số các căn nguyên thường gây nhiễm khuẩn bệnh viện

(NKBV) Trong số các loài thuộc chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae (K.

pneumoniae) là loài gây bệnh điển hình và quan trọng nhất Căn cứ vào kháng

nguyên O, K pneumoniae được chia thành 9 nhóm, trong đó nhóm O1 là hay gặp nhất Dựa vào cấu trúc vỏ của K pneumoniae, người ta chia thành 77

serotype [80] Hầu hết các cơ quan trong cơ thể đều có thể bị nhiễm trùng do

K pneumoniae, điển hình là bệnh viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết (NKH), viêm

màng não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, [15], [16], [53]

1.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ K PNEUMONIAE

1.2.1 Đặc điểm sinh học của K pneumoniae

1.2.1.1 Hình thể

K pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, trên tiêu bản nhuộm Gram, vi

khuẩn thường đứng thành từng đôi K pneumoniae có kích thước 0,3 - 1 x 0,6

- 6 m, không có lông nên không có khả năng di động và không sinh nha bào

Vi khuẩn có nhiều pili, đây là thành phần quan trọng tham gia vào độc lực của

K pneumoniae

K pneumoniae có vỏ dày, kích thước có thể gấp 2 - 3 lần tế bào vi khuẩn.

Vỏ có bản chất là polysacharide [15]

1.2.1.2 Kháng nguyên

K pneumoniae có kháng nguyên O và kháng nguyên K.

Kháng nguyên O bản chất là LPS (lipopolysaccharide) là kháng nguyênthân của vi khuẩn, mang tính đặc hiệu nhóm LPS là một phức hợp protein,poliosid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên,poliosid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc.Kháng nguyên O không bị phá hủy ở 100oC trong 2 giờ nhưng bị mất tính

kháng nguyên khi bị xử lý bằng Formol 0,5% Dựa vào kháng nguyên O, K.

pneumoniae được chia thành 9 nhóm [80].

Kháng nguyên K (bản chất là polysaccharide) - là kháng nguyên vỏ hoặckháng nguyên bề mặt mang tính đặc hiệu type Kháng nguyên K có tác dụng

giúp vi khuẩn tránh được tế bào thực bào Kháng nguyên K nằm ở bên ngoàikháng nguyên thân O sẽ ngăn không cho kháng thể kháng lại kháng nguyên Ogắn với các quyết định kháng nguyên, làm cho hiện tượng ngưng kết kháng

nguyên O không xảy ra Dựa vào cấu trúc kháng nguyên K của K pneumoniae

người ta chia thành 77 serotype huyết thanh Do vậy, muốn phát hiện đượckháng nguyên O cần phải phá hủy kháng nguyên K bằng cách xử lý ở 1000C/20phút [48], [80]

1.2.1.3 Các yếu tố độc lực

K pneumoniae có trong đường hô hấp và đường tiêu hóa của khoảng

5% người bình thường, loài vi khuẩn này cũng là thành viên của hệ vi khuẩn

bình thường ở nhiều loài động vật và phân bố rộng ngoài môi trường K.

pneumoniae là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội, ở cộng đồng hoặc trong bệnh

viện, là một trong số các căn nguyên gây nhiễm trùng bệnh viện K.

pneumoniae với nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm

nhập, lan truyền và gây bệnh [15], [53], [93]

* Bám và xâm nhập

+ Bám (adherence):

Bám là bước đầu tiên để vi sinh vật có thể xâm nhập vào cơ thể gâynhiễm trùng Quá trình bám gồm 2 bước: giai đoạn đầu là bám không đặc hiệuhay bám có thể đảo ngược Giai đoạn thứ 2 là bám đặc hiệu hay bám không thểđảo ngược Cơ chế bám đặc hiệu cần có sự tham gia của hai thành phần là thụ

thể và yếu tố bám (adhesin, ligand) Các thụ thể đặc hiệu này có thể là

glycoprotein hoặc glycolipid K pneumoniae bám vào niêm mạc đường hô hấp

và đường tiết niệu nhờ các thành phần cấu trúc ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn làpili (fimbriae) và một yếu tố kết dính có khả năng ức chế mannose [48], [59]

+ Xâm nhập (invasion):

Sau khi bám, K pneumoniae có thể xâm nhập vào tế bào, khoảng giữa

các tế bào hoặc mô của cơ thể Sự xâm nhập của vi khuẩn có vai trò tham giacủa các chất ngoại bào do chúng sản xuất ra, còn gọi là các invasin (bản chất làprotein hay enzym) [59]

* Vỏ

Vỏ glycocalyx bản chất polysaccharide, giúp vi khuẩn bám, không bị đào

thải ra ngoài và có thể tránh được tác động của thực bào do có khả năng ngăncản tế bào thực bào bám, ức chế sinh C3 convertase và C3b của bổ thể, hoặc chephủ C3b làm cho tế bào thực bào không nhận ra Với lớp vỏ dày (kích thước có

thể gấp 2 - 3 lần tế bào vi khuẩn) nên K pneumoniae có độc lực cao hơn các loài

có vỏ mỏng [15], [27], [80]

* Nội độc tố

Nội độc tố chính là LPS (lipopolysaccharide), LPS gồm 3 phần: phần lõi(core), chuỗi bên đặc hiệu O mang tính kháng nguyên đặc hiệu type và lipid Achịu trách nhiệm độc tính

Cơ chế tác động của nội độc tố LPS: LPS được giải phóng ra từ màngngoài của vách tế bào vi khuẩn, vào máu gắn với protein tạo thành phức hợp.Gây nên nhiều hội chứng: hội chứng đáp ứng viêm quá mức, hội chứng hô hấpcấp, sốc nhiễm khuẩn huyết Gram âm hay sốc nội độc tố, suy đa tạng và tử

vong Tổn thương do LPS trong nhiễm khuẩn do K pneumoniae hay gặp là

nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm màng não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đườngtiết niệu, [15]

* Độc tố ruột

Độc tố ruột do K pneumoniae tiết ra có bản chất là protein, ổn định với

nhiệt và acid Độc tố ruột làm tan hồng cầu người, có thể làm tăng tính thấmcủa mao mạch Ngoài ra, độc tố ruột làm tăng nồng độ đường, cholesterol,

alkaline phosphatase và acid photphat trong máu K pneumoniae có khả năng

sinh hai loại độc tố ruột (chịu nhiệt và không chịu nhiệt) [35], [66]

* Khả năng cạnh tranh sử dụng sắt

K pneumoniae có khả năng cạnh tranh sử dụng sắt với cơ thể chủ và với

vi khuẩn khác nhờ enterochelin (phenolte siderophore) và aerobactin

(hydroxamate siderphore) [15], [59], [80]

* Bacteriocin

K pneumoniae có khả năng sinh bacteriocin có tác dụng ức chế một số vi

khuẩn khác (do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào) vàcảm ứng quá trình chết theo chương trình của các tế bào chủ [15], [41]

Tóm lại, sự hủy hoại mô, tổ chức trong nhiễm trùng K pneumoniae do

tác động tổng hợp của các yếu tố độc lực, bao gồm yếu tố bám và xâm nhập,độc tố, vỏ của vi khuẩn…

1.2.1.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của K pneumoniae

Cơ chế đề kháng kháng sinh của K pneumoniae về cơ bản cũng giống cơ

chế đề kháng kháng sinh của các trực khuẩn Gram âm

* Tạo ra các enzym

+ Tạo ra các enzym làm biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc của phân tử khángsinh làm kháng sinh mất tác dụng Những enzym này có thể nằm ở thành tếbào, bảo vệ sự vững chắc của tế bào Ví dụ penicillinase phá huỷ penicillin, -lactamase thuỷ phân nhóm -lactam… Người ta đã tìm thấy hơn 20 loại enzymphá huỷ kháng sinh nhóm - lactam và 17 enzym phá huỷ kháng sinh nhómaminosid Sản sinh ra -lactamase là cơ chế chủ đạo của sự đề kháng Nhữngenzym này có tác dụng thuỷ phân các phân tử có vòng -lactam, do đó gây bấthoạt kháng sinh [71], [81]

+ Các enzym do gen đề kháng tạo ra có thể:

- Biến đổi cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh làm kháng sinh mất tácdụng (ví dụ acetyl hoá hoặc phospho hoá hay adenyl hoá các aminosid hoặcchloramphenicol);

- Phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh (ví dụ -lactamase làmcho các kháng sinh nhóm -lactam mất tác dụng);

- Vi khuẩn tăng tổng hợp các enzym chuyển hoá tế bào để bù lại lượngenzym đã bị kháng sinh tác động Ví dụ tăng tổng hợp enzym transferase Cơchế kháng thuốc này chủ yếu hình thành đối với chloramphenicol, penicillin,ampicillin và cephalosporin

Trong hơn 20 năm của cuối thế kỷ trước, rất nhiều kháng sinh mới thuộcnhóm - lactam đã được đưa vào sử dụng và vi khuẩn đã kháng lại nhóm khángsinh này do tác dụng thuỷ phân của các - lactamases Có thể do áp lực chọnlọc của việc sử dụng kháng sinh và sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị đãdẫn đến sự chọn lọc những - lactamases khác nhau Một trong những nhómkháng sinh mới là cephalosporins được đưa vào sử dụng rộng rãi để điều trị các

bệnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm (trong đó có K pneumoniae) vào

những năm 1980 cũng bị đề kháng với tỷ lệ ngày càng gia tăng [57], [89], [78] - lactamase do gen mã hoá nằm trên plasmid ở vi khuẩn Gram âm đầutiên được mô tả là TEM-1 vào thập kỷ 60 Enzym này được tìm thấy ở một

chủng E coli phân lập được trong máu của một bệnh nhân người Hy Lạp tên là

Temoniera nên được gọi là TEM [89], [78] Qua trung gian plasmid vàtransposon, TEM-1 lan truyền sang các loài vi khuẩn khác, và hiện nay người

ta tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau thuộc họ Enterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa….

Năm 1983, các nhà khoa học báo cáo về plasmid-trung gian lactamase có khả năng thủy phân cephalosporin phổ rộng được gọi beta-lactamase hoạt phổ rộng (ESBLs - Extended Spectrum Beta - Lactamases).ESBLs là các  - lactamases có khả năng đề kháng các penicillin, các

beta-cephalosporin thế hệ I, thế hệ II, thế hệ III và aztreonam do chúng có khả năng

ly giải các kháng sinh này; ESBLs này thường không tác động tới hoạt tính củacephamycins (cefoxitin, cefotetan, moxalactam) hoặc carbapenem (imipenem,meropenem) và bị ức chế bởi các chất ức chế  - lactamase như clavulanicacid, sulbactam hay tazobactam [45], [57], [92]

ESBLs là các - lactamase được mã hóa trên plasmid có nguồn gốc từ cácenzym TEM-1 hay TEM-2, OXA và SHV-1 -lactamase thường được tìm

thấy ở K pneumoniae là SHV-1 Gen mã hoá cho SHV-1 nằm trên nhiễm sắc thể ở K pneumoniae [45], [92]

Cùng với việc phát hiện ESBLs thì carbapenems là lựa chọn điều trị các

bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng gây ra bởi vi khuẩn sinh ESBLs Năm 1994, ở

Nhật Bản báo cáo Metallo-beta-lactamase có khả năng thủy phân carbapenems

K pneumoniae sinh carbapenemase (KPCs), KPCs được mã hóa bởi các gen blaKPC nhờ một transposon Tn3, Tn440 Đây là một yếu tố di truyền có khả

năng chèn vào plasmid đa dạng của vi khuẩn Gram âm trong đó có K.

pneumoniae Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên plasmid nên khả năng lan truyền

tính kháng kháng sinh rất nhanh và còn có thể cộng hợp với các gen kháng kháctrên plamid làm cho những chủng mang gen này có tính đa kháng mạnh hơn

Plasmid mang blaKPC cũng thường kết hợp với các yếu tố quyết định sức đề kháng đối với các kháng sinh khác Đến năm 2001, K pneumoniae sinh

carbapenemases được báo cáo ở Bắc Carolina KPCs mang tính khángcarbapenem dẫn đến những thách thức trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn gây ra bởiloài vi khuẩn này và làm cho thầy thuốc lâm sàng gặp nhiều khó khăn trong điều trị

K pneumoniae [45], [84], [92].

* Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương

Vi khuẩn giảm mức độ thấm thuốc qua thành tế bào hoặc giảm tính

thấm của màng nguyên tương hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng (ví

dụ kháng aminosid) Khi nghiên cứu ở một số loài trực khuẩn Gram âm người

ta thấy ở thành tế bào có cấu trúc đặc biệt hình ống (cấu trúc porin), những độtbiến tại các kênh dẫn - porin cũng ảnh hưởng và tác động tới nhiều họ kháng

sinh, làm cho kháng sinh không lọt vào trong tế bào K pneumoniae có màng

ngoài chống lại khả năng thấm của những kháng sinh ưa nước Một trongnhững cơ chế thấm của các kháng sinh nhóm -lactam được thực hiện qua các

kênh vận chuyển (porin), nên khi có sự thay đổi cấu trúc hình ống porin của K.

pneumoniae thì kháng sinh -lactam không lọt được vào bên trong tế bào vi

khuẩn Do K pneumoniae sản xuất vượt mức một loại beta-lactamase không

phải carbapenemase như AmpC cephalosporinase hoặc ESBL kết hợp với việcgiảm tính thấm màng ngoài do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào

của kháng sinh Ở K pneumoniae kênh porin màng OmpK35 và OmpK36 giữ

vai trò quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều tham giavào khả năng kháng carbapenem [71], [76]

Việc bất hoạt các aminosid bởi những enzym làm thay đổi chúng là cơchế chính: những enzym này làm bất hoạt kháng sinh do thay thế những gốc –

OH bằng những gốc phosphoryl, adenyl, acetyl Chúng được mã hoá bởi cácplasmid hay các transposon; nhưng cũng đã có những enzym mã hoá bởi gennằm trên nhiễm sắc thể được mô tả Những enzym này được gọi làaminoglycosid acetyltransferase (AAC) mã hóa bởi cùng plasmid như ESBL,hay aminoglycosid phosphotransferase (APH) chúng xúc tác những phản ứng

khác nhau Những enzym này khu trú ở ngoài màng bào tương của vi khuẩn K.

pneumoniae và sự thay đổi sinh hoá của aminosid làm giảm sự vận chuyển vào

trong tế bào và mất khả năng ức chế việc tổng hợp protein của vi khuẩn Những chủng K pneumoniae sinh AAC và APH sẽ có khả năng đề kháng với các

kháng sinh nhóm aminosid [71], [76]

* Tạo ra các isoenzym

K pneumoniae thay đổi con đường chuyển hoá làm cho kháng sinh

không can thiệp vào quá trình chuyển hoá của vi khuẩn K pneumoniae kháng

sulfamid là do vi khuẩn tạo ra một isoenzym không có ái lực với sulfamid nên

bỏ qua tác động của kháng sinh [71]

Trong số các cơ chế kháng kháng sinh của K pneumoniae, cơ chế vi

khuẩn sinh enzym, nhất là vi khuẩn sinh -lactamase phổ rộng cần được đặcbiệt quan tâm, vì khi vi khuẩn sinh ESBLs thì sẽ đề kháng toàn bộ nhóm -lactam, nhất là cephalosporins - các kháng sinh được dùng phổ biến hiện nay.Bên cạnh đó, việc sản sinh các enzym carbapenemases hoặc metallo-beta-

lactamase bởi K pneumoniae có thể làm cho vi khuẩn đề kháng với tất cả các

kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, bao gồm cả carbapenem [45], [92]

1.2.2 Phân loại serotype và gen của K pneumoniae

K pneumoniae là một loài vi khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae Tuy nhiên, có sự khác biệt giữa K pneumoniae và các Enterobacteriaceae khác là sự hiện diện của lớp vỏ polysaccharide dày, được

cho là yếu tố độc lực quan trọng giúp K pneumoniae tránh hiện tượng thực bào

[15], [65]

K pneumoniae đang được ngành y tế của nhiều nước trên thế giới quan

tâm đến bởi khả năng gây bệnh và mức độ đề kháng kháng sinh Các thể lâm

sàng nhiễm khuẩn do K pneumoniae ở người đã thay đổi kể từ khi vi khuẩn này

được phát hiện cách đây hơn 100 năm Mô hình nhiễm khuẩn cộng đồng trên

toàn cầu do K pneumoniae cũng thay đổi theo khu vực địa lý Tại Hoa Kỳ, châu

Âu, Úc, và Ác-hen-ti-na, loài vi khuẩn này thường gây nhiễm trùng đường tiết

niệu, ống thông mạch máu, gây viêm đường mật Ở châu Á và Nam Phi, K.

pneumoniae là căn nguyên chủ yếu gây viêm phổi trong hai thập kỷ qua Tại

châu Á, đặc biệt ở Đài Loan thường gặp K pneumoniae gây áp xe gan, viêm nội

nhãn và viêm màng não [65]

Gần đây một số nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu các yếu tố độc

lực của K pneumoniae, bao gồm gen magA và rmpA, serotype K1, K2 và kiểu

hình chất nhày [36], [67] Các nhà khoa học Đài Loan đã giải trình tự bộ gene

của chủng NTUH-K2044 phân lập từ trường hợp áp xe gan đầu tiên do K.

pneumoniae phát hiện ở Đài Loan [65].

Hình 1.1 Bản đồ bộ gen của nhiễm sắc thể của chủng K pneumoniae

NTUH-K2044 và plasmid

Nguồn: theo Keh - Ming W và CS (2009) [65]

Ghi chú: từ ngoài vào trong: vòng tròn thứ nhất và thứ hai là vùng mã hóa; vòng tròn thứ ba cho thấy GC (Groups Clusters) đối xứng; ở vòng tròn thứ tư: phần màu xanh là transposon, phần màu xanh lá cây là sự tái tổ hợp, màu đỏ là chèn trình tự nucleotide; vòng tròn thứ năm và thứ sáu là tARN và rARNs [65].

Các yếu tố liên quan đến độc lực của K pneumoniae như độ bám dính có

fimbriae bám và không có fimbriae bám, bacteriocin, đại thực bào chứa sắt,

kháng nguyên O và vỏ polysaccharide Vỏ polysaccharide bao quanh K.

pneumoniae có liên quan đến bệnh sinh, đồng thời có tác dụng bảo vệ ngăn cản

các yếu tố diệt khuẩn trong huyết thanh và làm suy yếu hiện tượng thực bào[58] Bởi vậy, polysaccharide có thể được coi là yếu tố quyết định độc lực của

K pneumoniae [74], [93], [103] Những yếu tố độc lực chính của K pneumoniae để gây các bệnh nhiễm trùng như: serotype, kiểu hình

hypermucoviscosity, lipopolysaccharide, đại thực bào có chứa sắt và pili [101]

Mức độ độc lực của K pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn khác nhau, như đối với serotype của chủng vi khuẩn K pneumoniae được chia thành 77

serotype và độc lực của serotype ở các vùng địa lý khác nhau thì rất khác nhau

[101] Trong số 77 serotype kháng nguyên vỏ của K pneumoniae theo phân

loại thì serotype K1, K2, K4 và K5 đã được chứng minh có độc lực cao khi gâynhiễm khuẩn thực nghiệm ở chuột, đồng thời các serotype này cũng gây nhiễm

trùng nặng ở người và động vật [93] Do vậy những chủng K pneumoniae có serotype K1, K2 thì độc lực cao hơn so với những chủng K pneumoniae không

có serotype K1, K2 [101] Serotype K1 thường gặp trong các trường hợp viêmphổi và áp xe gan, gây biến chứng nặng nề làm nhiễm khuẩn hệ thống thầnkinh trung ương như viêm màng não [93] Trong thời gian gần đây, người tacòn xác định được K1 là một tác nhân gây nhiễm khuẩn ở mắt Serotype K2,K4 và K5 là nguyên nhân thường gây viêm tử cung ngựa và cũng liên quan đếnviêm phổi mắc phải cộng đồng ở người [50], [93]

Nghiên cứu của Chuang Y P và cộng sự (2006) cho biết: những chủng

K pneumoniae thuộc serotype K1 và K2 hay gây nhiễm khuẩn hô hấp,

serotype K8, K9, K10 thường gây nhiễm khuẩn tiết niệu [40]

Nghiên cứu một số nước trên thế giới cho thấy, các chủng K pneumoniae

phân lập từ bệnh phẩm nước tiểu, đờm trên bệnh nhân viêm phổi, nhiễm trùng

tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết thường thuộc serotype K2 [101] Serotype K2,K21, K55 thường gặp ở châu Âu và phổ biến nhất là miền Bắc nước Mỹ Trongkhi đó serotype K1 lại chiếm ưu thế trong nhiễm khuẩn huyết, áp xe gan và

viêm màng não tại Đài Loan [101] Ở Hàn Quốc, các chủng K pneumoniae thuộc serotype K1 gặp ở bệnh nhân bị áp xe gan, còn ở Úc các chủng K pneumoniae

thuộc serotype K54 thường phân lập được từ nước tiểu, đờm, máu [101]

K pneumoniae có serotype K1, K2 thường gây bệnh hơn so với chủng

K pneumoniae không có serotype K1, K2 do có sự khác biệt vì đối với chủng

K pneumoniae có serotype K1, K2 có kiểu hình hypermucoviscosity, do vậy

có khả năng sản sinh chất nhày làm tăng độ nhớt và độ bám dính của vi khuẩn

trên môi trường nuôi cấy, đây là điều kiện giúp K pneumoniae có khả năng bám

dính vào các mô cơ thể chống lại cơ chế đào thải của cơ thể người bệnh [101]

Các nghiên cứu về gen của K pneumoniae gồm có: cps (capsular polysaccharide synthesis), rmpA, (regulator mucoid phenotype A), magA

(mucoviscosity associated gene A) Chức năng của các gen này là hoàn toàn

khác nhau, như gen cps thực hiện việc tổng hợp polysaccharide Gen rmpA

chịu trách nhiệm điều hoà sự tổng hợp các polysaccharide ngoại bào và sinh ra

các kiểu hình hypermucoviscosity Chủng K pneumoniae mang gen rmpA cùng sự hiện diện của serotype K1 làm tăng tính độc của K pneumoniae và khả

năng gây bệnh càng cao [77], [101]

Hầu hết các chủng K pneumoniae có lớp ngoài được cấu trúc một mạng

lưới sợi mịn có nguồn gốc từ vỏ polysaccharide Cấu trúc này được mã hóa bởi

vỏ capsular polysaccharide (cps) cụm gen trên nhiễm sắc thể và được điều

chỉnh tích cực của gen magA (gen liên quan đến chất nhày), rmpA (điều chỉnh

của kiểu hình nhầy) qua trung gian plasmid [101]

Gen magA mã hóa protein màng ngoài 43 kD Gen magA nằm trong

operon có liên quan đến serotype K1 hay nói cách khác, các operon có chứa

gen magA là thuộc serotype K1 và gen magA có khả năng chống lại yếu tố thực

bào do vậy hay gây áp xe gan, viêm màng não [101] Gen magA còn là nhiễm sắc thể đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng do Klebsiella như nhiễm

khuẩn huyết, viêm phổi cũng như áp xe phổi và áp xe gan [58], đồng thời cũng

mang đặc trưng kiểu hình và độ nhày của K pneumonia, làm tăng khả năng chống lại hiện tượng thực bào, làm cho K pneumonia càng trở nên độc hơn [58] Gen magA (gen liên quan đến chất nhày) gần đây đã được xác định trong các chủng K pneumoniae gây áp xe gan ở bệnh nhân không chỉ ở Đài Loan mà còn các nước khác trên thế giới Chủng K pneumoniae mang gen magA thì độc

lực tăng và có thể gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng nề, dẫn đến tỷ lệ tử vongcao [37], [77] Nghiên cứu về K pneumoniae tại Đài Loan cho thấy, sự kết hợp của gen magA với kiểu gen chất nhày có liên quan đến sinh bệnh học của thể

áp xe gan Gen rmpA được biết đến với chức năng chịu trách nhiệm tổng hợp

vỏ ngoài polysaccharide của kiểu hình chất nhày Ngoài magA thì rmpA cũng

có thể đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện của kiểu hình chất nhày [93]

1.2.3 Khả năng gây bệnh của K pneumoniae

K pneumoniae có thể gây nên các bệnh sau:

1.2.3.1 Nhiễm khuẩn huyết

K pneumoniae được xếp trong số các tác nhân hàng đầu gây nhiễm

khuẩn huyết (NKH) Nguồn nhiễm khuẩn thường là ở đường tiêu hóa (viêmruột, viêm đường mật…), đường tiết niệu (viêm bể thận…), sinh dục (sau nạo,phá thai…), sau các chấn thương, mổ, đặt dẫn lưu…Những trường hợp nặng,thường có các ổ nhiễm khuẩn thứ phát (ổ di căn) ở các cơ quan: sinh dục (viêmmào tinh hoàn), viêm gan, đường mật, màng não - não (viêm màng não, áp xenão, viêm tủy), phổi (viêm phổi, áp xe phổi), viêm nội tâm mạc, viêm khớp…[7], [14], [15]

Trong số các trường hợp NKH do K pneumoniae hay gặp biến chứng

sốc, suy thận, hội chứng suy hô hấp cấp tính ARDS (Acute respiratory distress

syndrome), xuất huyết… Trong đó, sốc nhiễm khuẩn là biến chứng nặng, có

thể xảy ra với NKH do các loài vi khuẩn gây nên, đặc biệt là NKH do K.

pneumoniae Đặc điểm lâm sàng của sốc NKH là suy tuần hoàn cấp với tụt

huyết áp, kèm theo suy nhiều phủ tạng, đặc biệt là hội chứng suy hô hấp cấptính ở người lớn, suy thận và suy tim cấp, đông máu rải rác nội mạc và xuấthuyết phủ tạng…[7]

1.2.3.2 Viêm phổi

K pneumoniae gây viêm phổi cộng đồng và viêm phổi bệnh viện, bệnh

thường gặp ở người già, nghiện rượu, suy giảm miễn dịch và trẻ sơ sinh thường

tỷ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị sớm Vai trò gây viêm phổi cộng

đồng của K pneumoniae đã phát hiện trên 100 năm trước đây Ngày nay, mặc

dù tỷ lệ nhiễm K pneumoniae tại cộng đồng dường như đã giảm, tuy nhiên tỷ

lệ tử vong vẫn còn khá cao [7], [15], [65]

1.2.3.3 Áp xe gan

K pneumoniae cũng thường là căn nguyên gây áp xe gan Đặc điểm lâm

sàng khi bệnh nhân bị áp xe gan thường có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, chóngmặt, đau bụng, bệnh nhân cảm thấy đau tức ở vùng mạng sườn phải Khámphát hiện thấy gan to, sốt nhẹ hoặc vừa, ít khi thấy vàng da Đau tăng khi thởsâu hoặc khi nằm nghiêng bên phải Bệnh nhân thường sốt cao, có cơn rét run,

vã mồ hôi Siêu âm gan thấy nhiều ổ hoặc một ổ giảm tỷ trọng và chọc hút thấy

mủ nhiều ổ hoặc một ổ Cấy mủ áp xe dễ dàng phân lập được K pneumoniae [7]

1.2.3.4 Viêm màng não

K pneumoniae có thể gây viêm màng não, áp xe não với đặc điểm lâm

sàng thường là khởi phát cấp diễn, sốt dao động, có cơn rét run… Một số trườnghợp kèm NKH có thể có sốc nội độc tố, trụy mạch, huyết áp tụt [7], [15]

Hội chứng màng não thường là phát triển nhanh, rầm rộ, tương đối đầy

đủ triệu chứng: nhức đầu dữ dội, nôn dễ dàng, táo bón Trẻ em thường nôn, bỏ

bú, ngủ gà, quấy khóc, thở không đều, da tím tái hay co giật… các dấu hiệu

biểu hiện tăng áp lực nội sọ Chọc ống sống thắt lưng dịch não tủy có đặc điểmđiển hình của viêm màng não mủ là dịch não tủy đục; xét nghiệm có: proteintăng cao (1 - 2g/lít), glucoza giảm thấp, đôi khi chỉ có vết, tế bào tăng, trong đóchủ yếu bạch cầu đa nhân tăng, có thể gặp tế bào thoái hóa Cấy khuẩn dịch

não tủy cũng dễ dàng phân lập được K pneumoniae [7].

Ngoài ra có thể tìm thấy ổ nhiễm khuẩn tiên phát như viêm tai, viêmxương chũm, viêm xoang, viêm phổi, viêm đường tiết niệu…

1.2.3.5 Một số bệnh khác

K pneumoniae có thể gây viêm nội nhãn, viêm tủy xương, viêm cơ - khớp

với đặc điểm lâm sàng thường là khởi phát cấp diễn, có khi dữ dội với biểuhiện: sốt cao liên tục, gai rét, nhức đầu, đau mỏi cơ khớp…[7], [15] Nghiên cứu ở

Đài Loan đã phân lập được K pneumoniae ở bệnh nhân bị viêm nội nhãn [93]

1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán K pneumoniae

1.2.4.1 Phương pháp hiển vi

Phương pháp nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật cơ bản có giá trịcao trong việc định hướng chẩn đoán xác định loài vi khuẩn gây bệnh Trên

tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm và các dịch nuôi cấy, K pneumoniae có

hình trực khuẩn, bắt màu Gram âm

1.2.4.2 Nuôi cấy phân lập

K pneumoniae là loài vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ngộ, phát triển dễ

dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như môi trường thạch thường,thạch máu Nhiệt độ thích hợp từ 35 - 37oC, pH từ 7 - 7,2 Sau 24 giờ trên môitrường đặc, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc to, nhầy, màu xám Dùng quecấy tách khuẩn lạc từ mặt thạch có thể thấy sợi dính dài trên 5 mm giữa quecấy và khuẩn lạc

Bệnh phẩm máu: cấy vô trùng vào canh thang BHI

Các bệnh phẩm khác: dịch mủ, dịch não tủy, dịch màng phổi, nước tiểu…cấy vào môi trường phân lập thạch máu, mac conkey, sô cô la, endo, uriselect.Trong môi trường canh thang BHI, vi khuẩn mọc nhanh và đục đều, sau

24 giờ sẽ tạo lắng cặn dưới đáy ống nghiệm, cặn thường rất nhày

Trên môi trường thạch máu, mac conkey: vi khuẩn phát triển thành khuẩnlạc dạng M, màu xám, nhày

Trên môi trường endo: khuẩn lạc dạng M (có thể dạng R), màu tím, đườngkính 3 - 4 mm

Trên môi trường uriselect: khuẩn lạc dạng S, màu xanh, đường kính 3 - 4

mm, có thể gặp một số khuẩn lạc dạng R [7], [16]

K pneumoniae lên men và sinh hơi trên nhiều loại đường như: glucose,

galactose, saccarose, mantose, lactose, manit Phản ứng oxydase (-), urease (+),catalase (+), citrat (+), phản ứng VP và indol có thể (+/-), ornithin decarboxylase (-),arginin decarboxylase (-), lysin decarboxylase (+), H2S (-) [15]

* Kỹ thuật kháng sinh đồ

Các chủng K pneumoniae để nhạy cảm với kháng sinh theo phương pháp

kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch, đồng thời xác địnhnồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration -MIC) bằng máy tự động VITEK 2 - Compact

+ Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch [13], [42]:

- Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có mức độ nhậy cảm với các

loại kháng sinh khác nhau, biểu hiện của sự khác nhau đó bằng đường kínhvòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh khi có sự tiếp xúc giữa vikhuẩn với khoanh giấy kháng sinh

- Chuẩn bị: chủng vi khuẩn thuần 18 - 24 giờ, thạch Muller-Hinton, khoanh

giấy kháng sinh và dụng cụ chuyên khoa

độ 108 vi khuẩn/ml;

 Cấy vi khuẩn: làm khô mặt thạch trước khi cấy (để đĩa thạch 15 phúttrong tủ ấm) Dùng tăm bông nhúng vào hỗn dịch 108 vi khuẩn/ml Ria đều lênmặt thạch, sau đó quay 1800 và ria lại;

 Đặt khoanh giấy kháng sinh: dùng panh đầu nhọn hoặc kim tiêm vôtrùng đặt các khoanh giấy theo tiêu chuẩn CLSI (Clinical and LaboratoryStandards Institute 2007);

 Sau đó để ở nhiệt độ phòng 30 phút để kháng sinh khuyếch tán vàothạch trước khi ủ ấm;

 Ủ ấm ở 350 C, sau 18 - 24 giờ đọc kết quả

- Cách đọc kết quả: theo quy định chung, người ta phân loại độ nhạy cảm

- Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu - MIC:

 Nguyên lý: Cấy chủng vi khuẩn lên môi trường nuôi cấy có chứa các

nồng độ kháng sinh khác nhau, quan sát xem chủng vi khuẩn không phát triểnđược ở nồng độ kháng sinh nào

 Phương pháp phát hiện ESBLs [42], [46]

Nguyên lý: thay đổi pH (acidimetric) hoặc thay đổi màu của hỗn hợp

tinh bột iode (iodometric) hoặc thay đổi màu của cơ chất bị biến đổi dưới tácđộng của - lactamase (Chromogenic)

1.2.4.3 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh ra năm 1985 vàđược sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại Đây là kỹ thuật chophép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệ gen ADN của sinh vật bằngmột cặp mồi đặc hiệu Dựa vào trình tự đoạn gen được công bố trên ngân hàngquốc tế ta thiết kế được các mồi bổ sung đặc hiệu gồm mồi xuôi và mồi ngược

so với chiều phiên mã của gen

PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn ADN trong ống nghiệm dựa vàocác chu kỳ nhiệt Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứadung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng từ 10µl đến 50µlvới các thành phần chủ yếu:

* Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có

hoạt tính tối đa ở 720C và bền được với nhiệt độ;

* 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, vàCytosine (d ATP, dTTP, dGTP, và dCTP);

* ADN chứa các đoạn ADN đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng;

* Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide cóchiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu vớitrình tự của hai đầu đoạn ADN sẽ được nhân bản;

* Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp;

* Dung dịch đệm Tris - KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng [25]

+ Nguyên tắc của PCR: phản ứng PCR là một chuỗi các chu kỳ nối tiếp

nhau gồm 3 bước (3 giai đoạn nhiệt độ):

- Bước 1 (giai đoạn biến tính ADN): trước tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên

940C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi ADN sẽ bị mất đi, nhờvậy ADN đích bị biến tính thành các mạch đơn

- Bước 2: (giai đoạn gắn mồi hay giai đoạn bắt cặp): tiếp theo nhiệt độ sẽđược hạ đến 550C - 650C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp

bổ xung vào hai đầu của đoạn ADN đích

- Bước 3: (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được đưa lên 720C là nhiệt độ thích

hợp cho hoạt tính enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của

đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi ADN đích để bắt nguồn cho sự tổnghợp nên mạch bổ xung

Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì 72oC trong khoảng từ 5 đến 10phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR, sau đó hạ nhiệt

độ xuống còn 4oC để bảo quản sản phẩm

Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần Sau mỗichu kỳ, từ một sợi ADN ta có được hai sợi mới Các đoạn ADN vừa nhân bảntrong mỗi chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó sau mỗichu kỳ tổng hợp được lượng ADN gấp đôi, như vậy sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2nbản ADN khuôn ban đầu

Hình 1.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR

* Nguồn: theo Sheryl A W (2010) [87 ]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ K PNEUMONIAE

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới về K pneumoniae

1.3.1.1 Tình hình nhiễm khuẩn do K pneumoniae

K pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp xe

gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu,… Nhiễm khuẩn do K pneumoniae còn hay

gặp ở bệnh nhân mắc các bệnh ác tính, giảm bạch cầu, bệnh nhân bị suy giảm

miễn dịch, dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài Vì vậy, nhiễm khuẩn do K.

pneumoniae thường gặp nhiều ở các khoa hồi sức tích cực, khoa chăm sóc

bệnh nhân sau phẫu thuật Đa số các công trình nghiên cứu đều cho thấy xu

hướng tăng cao tỷ lệ nhiễm khuẩn do K pneumoniae [40], [67], [80] Thế giới

hàng ngày, hàng giờ vẫn phải đối mặt với các vụ dịch bệnh nhiễm trùng donhiều căn nguyên khác nhau gây ra, trong đó các căn nguyên vi khuẩn luônđóng một vai trò quan trọng Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã

thực hiện các đề tài nghiên cứu về lĩnh vực này không chỉ ở tầm quốc gia màcòn hợp tác Quốc tế nhằm mục đích tìm ra phương cách để đẩy lùi dịch bệnh,

hạ thấp tỷ lệ tử vong và giảm chi phí điều trị Trong một nghiên cứu về NKH

do vi khuẩn Gram âm ở Berlin - Đức của tác giả Geerdes H F đã cho biết:

trong 10 năm (1979 - 1989), tỷ lệ NKH do Klebsiella spp là 5,5% [52].

Wen-Chien K cùng cộng sự (CS) đã thực hiện một nghiên cứu rộngkhắp trong thời gian 2 năm (1/1996 - 12/1997), với mạng lưới liên kết của 12

bệnh viện ở nhiều nước khác nhau, trên 440 bệnh nhân bị NKH do K.

pneumoniae với 445 mẫu dương tính từ bệnh phẩm máu cho thấy tỷ lệ NKH

mắc phải tại cộng đồng có sự khác biệt giữa các quốc gia: 68% ở Đài Loan,43% ở Mỹ, 39% ở Úc, 34% ở Nam phi, 22% ở Châu Âu và 17% ở Ác-hen-ti-

na Đồng thời các tác giả nhận thấy, phần lớn các trường hợp NKH do K.

pneumoniae đều có liên quan đến suy giảm miễn dịch do mắc bệnh mạn tính

trước đó hoặc xảy ra trên cơ thể có các yếu tố thuận lợi để mắc các bệnh nhiễmtrùng như nghiện rượu, đái tháo đường, nhiễm HIV [99]

Theo tác giả Obiamiwe U và CS thì tỷ lệ viêm phổi trên đối tượng

người già do K pneumoniae ở Malaysia và Nhật Bản dao động 15 - 40%, còn

với những người nghiện rượu ở Mỹ, con số này lên tới 66%, tỷ lệ tử vong ở

nhóm nghiện rượu rất cao (50 - 100%) Kết quả nghiên cứu cho thấy K.

pneumoniae đã gây ra 8% các trường hợp NKBV tại Mỹ và loài vi khuẩn này

nằm trong nhóm 8 căn nguyên gây NKBV hàng đầu và đứng thứ hai trong

nhóm các vi khuẩn Gram âm gây NKBV (sau E coli) Hàng năm, ở Mỹ có trên

3 triệu người mắc bệnh viêm phổi, bệnh thường xảy ra vào mùa đông hoặc ởnhững nơi có thời tiết lạnh Nếu không được điều trị kịp thời, tỷ lệ tử vong do

bệnh viêm phổi gây ra là trên 30% [80]

Trong 2 thập kỷ qua, các khu vực thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Úc rất

ít gặp trường hợp viêm phổi ở cộng đồng do K pneumoniae Nhưng tại châu Á

và châu Phi, loài vi khuẩn này vẫn là căn nguyên quan trọng gây viêm phổicộng đồng [98].

1.3.1.2 Tình hình kháng kháng sinh của K pneumoniae

Kháng sinh trong điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nói chung và

nhiễm khuẩn do K pneumoniae luôn là sự lựa chọn hàng đầu Tuy nhiên, việc

lựa chọn kháng sinh như thế nào cho hợp lý và khoa học thì cho đến nay vẫncòn là một vấn đề nan giải Việc lựa chọn kháng sinh hợp lý vừa có hiệu quảđiều trị bệnh, giảm chi phí cho người bệnh và cho xã hội, vừa góp phần hạn chếtình trạng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh

Nghiên cứu của Obiamiwe U đã đưa ra khuyến cáo: tùy từng bệnh cảnh

nhiễm khuẩn do K pneumoniae gây nên mà sử dụng kháng sinh nhóm

cephalosporin đơn độc hoặc phối hợp thêm với một kháng sinh thuộc nhóm

aminoside, khi xuất hiện chủng K pneumoniae có thể sinh enzym beta-lactamase

đề kháng lại các kháng sinh nhóm cephalosporins thì sự lựa chọn là carbapenem,

đặc biệt là imipenem [80] Năm 1997, Tổ chức Y tế thế giới đã công bố tình hình

kháng kháng sinh của K pneumoniae ở một số nước thuộc khu vực châu Á Thái

Bình Dương như sau [9]:

Bảng 1.1 Tình hình kháng kháng sinh của K pneumoniae

ở một số nước Châu Á Thái Bình Dương

Quốc

Hồng Kông

Nhật Bản Hàn Quốc

622 0,0 176

1

10, 5

25 4 5,1

AM 131

5

90, 2

260 3

85, 5

131 2

85, 0

100 1

98 351

1

93, 3

179 7

93, 2

45 7

96, 7 CT

X

131

5

30, 1

135 8

2,5 261

1

14, 9

40 9

31, 1 CXM 131

5

44, 7

264 0

14, 9

110 8

11, 0

154 1

33, 4

86 57, 0

CF 131

5

51, 1

409 20,

8

141 3

3,8 100

1

52, 0

69, 3

CL 237 56,

3

43 2,3 208

2 51, 8

SXT 420 66,

0

259 0

26, 7

100 1

42, 0

143 8

6,7 270

6

54, 8

46 7

72, 6

Ghi chú: AK: amikacin; AM: ampicillin; CTX: cefotaxim; CXM: cefuroxime; CF:

cephalotine; CL: chloramphenicol; SXT: co-trimoxazol; GM: gentamycine

*Nguồn: theo Lê Đăng Hà và CS (1999) [9]

Qua bảng trên ta thấy K pneumoniae đã kháng ampicillin với tỷ lệ rất

cao, thay đổi từ 85 - 98% tùy từng nước Amikacin, cefotaxim bị đề kháng ở

mức độ thấp hơn (khoảng 30%) Riêng với fluoroquinolon, tỷ lệ đề kháng thay

đổi từ 1,3% ở Nhật Bản đến 26,2% ở Philipin

Năm 1999, Yoichi H đã thông báo về 2 trường hợp nhiễm khuẩn do K.

pneumoniae kháng lại các kháng sinh thuộc phân nhóm cephalosporin ở Nhật

Bản [111]

Theo NNISS (National Nosocomial Infections Surveillance System): kếtquả so sánh năm 2003 với giai đoạn 1998 - 2002 cho thấy tỷ lệ kháng các

cepholosporin thế hệ 3 của K pneumoniae ở Mỹ tăng lên 47% Ở Pháp tỷ lệ K.

pneumoniae kháng ceftazidime là 40% Tính chung trên toàn khu vực châu Âu,

các chủng K pneumoniae phân lập được tại các khoa Điều trị tích cực kháng

ceftazidime với tỷ lệ là 42% [55]

Tại Ấn Độ: các chủng K pneumoniae phân lập được từ nước tiểu có tỷ lệ

nhạy cảm với tobramycine (63,6%), amikacin (54,5%), cefotaxime (31,8%), vàceftriaxone (13,6%) [94]

Nghiên cứu ở Pakistan cho thấy: tỷ lệ đề kháng cephalexin của K.

pneumoniae là 75%, ceftriaxone (85%), cefotaxime (82,5%) tiếp theo là các

quinolone: ciprofloxacin (55%), ofloxacin (47,5%), nalidixic acid (42,5%),norfloxacin (35%), amoxicillin/clavulanic acid (12,5%) và kháng carbapenam

(imipenem, meropenem) là 7,5% Chiếm 47,5% số chủng K pneumoniae phân

lập được có khả năng sinh ESBL [28]

Năm 2011, các nhà khoa học ở Trung Quốc báo cáo tỷ lệ nhiễm K.

pneumoniae trên trẻ sơ sinh ở châu Phi và đã xác định tỷ lệ kháng kháng sinh