Thử tính kháng khuẩn của FLAVONOID trên ADN GYRASE của STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Thử tính kháng khuẩn của FLAVONOID trên ADN GYRASE của STAPHYLOCOCCUS AUREUS

KHOA SINH HỌC



VÕ THỊ HỒNG HẠNH

THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID

TRÊN ADN GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS TRẦN CÁT ĐÔNG

Tp Hồ Chí Minh, 2012

KHOA SINH HỌC



THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID

TRÊN ADN GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS TRẦN CÁT ĐÔNG

Tp Hồ Chí Minh, 2012

Đề tài khóa luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ

Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM, dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS

Trần Cát Đông và ThS Vũ Thanh Thảo.

Kính gửi đến PGS TS Trần Cát Đông và Th.S Vũ Thanh Thảo lời biết ơn chân

thành vì sự quan tâm, kiên nhẫn và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho

em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Kính gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM lòng biết

ơn về những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho em, là nền tảng để thực hiện đề tài.

Gửi đến chị Nguyễn Thị Linh Giang, anh Nguyễn Minh Thái, các anh chị cùng

các bạn ở Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược lời cảm ơn về sự nhiệt tình

giúp đỡ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt đề tài này.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh và là nguồn động lực giúp tôi

vượt qua khó khăn.

Xin chân thành cảm ơn !

Sinh Viên

MỤC LỤC

CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG iii

ĐẶT VẤN ĐỀ iv

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN vi

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH vii

1.2 TỔNG QUAN VỀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS xi

1.3 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID xiii

1.4 ENZYM ADN GYRASE (TOPOISOMERASE II) xix

1.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN xxiv

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU xxvi

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU xxvii

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU xxx

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN xxxviii

3.1 Đường cong sinh trưởng của MRSA, MSSA xxxix 3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chất thử xli 3.3 Kết quả chiết tách sơ bộ enzym gyrase xliv 3.4 Kết quả tách chiết plasmid xliv 3.5 Thử nghiệm tính siêu xoắn gyrase xlvii CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN

VÀ ĐỀ NGHỊ l 4.1 Kết luận li 4.2 Đề nghị li TÀI LIỆU THAM KHẢO lii

CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Desoxyribonucleic

ARN Acid Ribonucleiic

ATCC American Type Culture Collection

CFU Colony froming unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc

DMSO Dimethylsulfoxid

MHA Môi trường thạch Muller-Hinton

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

LB Môi trường Luiria-Bertani

TSA Môi trường Tryptic Soy Agar

TSB Môi trường Tryptic Soy Broth

MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin

MSSA Staphylococcus aureus nhạy methicillin

MHA Thạch Mueller-Hinton

MHB Mueller-Hinton broth

SDS Natri Dodecyl Sulfat

BLB Bacillus Lysic Buffer

OD Optical density - Mật độ quang

VRSA Staphylococcus aureus kháng vancomicin

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh Staphylococcus aureus xi

Hình 1.2 Nguồn gốc flavonoid xiv

Hình 1.3.Khung cơ bản flavonoid xiv

Hình 1.4 Khung chalcon xv

Hình 1.5 Hoạt động của topoisomerase II tại chạc ba sao chép xx

Hình 3.6 Các chất thử sử dụng trong đề tài xli Hình 3.7 Kết quả kháng MRSA và MSSA của các chất thử xli Hình 3.8 MIC của các chất thử với MRSA xlii Hình 3.9 MIC của các chất thử với MSSA xlii Hình 3.10 MIC của ofloxacin đối với MRSA và MSSA xliii Hình 3.11 Kết quả điện di các mẫu protein trên gel polyacrylamide xliv Hình 3.12 Điện di plasmid trên gel agarose xlv Hình 3.13 Tháo xoắn plasmid bằng NaOH xlv Hình 3.14 Tháo xoắn plasmid bằng H2O2 xlvi Hình 3.15 Plasmid được tháo xoắn bởi topoisomerase I và tinh chế xlvii Hình 3.16 Thử nghiệm tính siêu xoắn plasmid của enzym gyrase xlviii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc cơ bản một vài flavonoid đặt trưng [21] xiv

Bảng 3.2 Tăng trưởng của MRSA, MSSA theo thời gian xxxixBảng 3.3 Kết quả định tính sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn các chalcon xliBảng 3.4 Kết quả xác định MIC của các chất thử xlii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phát minh ra thuốc kháng sinh là một trong những đột phá lớn của y học hiện đại Nhờ đó, rất nhiều căn bệnh nhiễm trùng đã trở nên có thể kiểm soát được một cách hữu hiệu Tuy nhiên, sự gia tăng trong tiếp thị và sử dụng thuốc kháng sinh đã khiến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y học hiện đại Tốc độ phát triển của các loại thuốc kháng vi khuẩn mới cũng không thể bắt kịp sức căng của vi khuẩn kháng thuốc Rất nhiều nhà khoa học đã bắt đầu

lo lắng về nó, và họ rất nỗ lực tìm cách giải quyết vấn đề nan giải này

Tại Việt Nam, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn là một thách thức lớn cho công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe Theo thông báo của trung tâm theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn – Antibiotic Susceptibility Test Surveillance (ASTS) – thường gặp ở Việt Nam, năm 2004 [11]: có 15.262 chủng vi khuẩn được phân lập tại 6 cơ sở (bệnh viện và viện), đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam của Việt Nam Kết quả phân lập cho thấy tại mỗi nơi cũng khác nhau [11] Trong các loại vi khuẩn kháng thuốc thường gặp, 4 chủng nguy hiểm có mức đề kháng cao, thường là yếu tố góp phần làm thất bại trong điều trị tại bệnh viện là

Satphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Streptococcus faecalis.

Các hãng dược phẩm và các cơ quan nghiên cứu khắp thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các chất kháng khuẩn mới chống lại chúng Mỗi năm đều có vài kháng sinh mới được chấp nhận để góp phần đẩy lùi bệnh truyền nhiễm Mặc dù vậy, để có được một kháng sinh mới cần nhiều thời gian nghiên cứu và chi phí cao Do đó, một

xu hướng mới ngày nay là phối hợp những kháng sinh có sẵn trong thiên nhiên để tìm ra tác dụng chống lại vi khuẩn Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian và chi phí Bên cạnh đó việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên cũng tránh được những độc tính của thuốc khi chúng được sử dụng trên cơ thể người

Flavonoid là một hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật Những năm gần đây khi nghiên cứu, sàng lọc các chất không phải là kháng sinh có nguồn gốc từ dược liệu, các nhà khoa học đã phát hiện apigenin, luteolin, và dẫn chất

flavon có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin [22].

Staphylococcus aureus là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng trên

người và động vật Mặc dù hiện nay đã phát hiện ra nhiều kháng sinh mới nhưng

chúng không tác động trên Staphylococcus aureus đề kháng methicillin Vancomycin là phương kế cuối cùng trong điều trị Staphylococcus aureus kháng đa thuốc, nhưng gần đây đã có báo cáo Staphylococcus aureus đề kháng vancomycin

[19]

Do đó, việc nhiễm khuẩn đang là vấn đề nghiêm trọng trong lâm sàng và việc nghiên cứu những kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của chúng là mục tiêu của việc nghiên cứu khoa học liên tục và ứng dụng từ nghiên cứu Từ thực tế

đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“THỬ TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID TRÊN ADN

GYRASE CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS”

Với các mục tiêu cụ thể như sau:

- Khảo sát đường cong tăng trưởng để xác định thời gian thu nhận ADN gyrase

- Tách chiết sơ bộ ADN gyrase

- Thử hoạt tính ADN gyrase có mặt chất kháng khuẩn flavonoid

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh và một số khái niệm liên quan

Theo quan niệm cũ, kháng sinh là những chất hay hợp chất có cấu trúc hóa học xác định, chiết xuất từ vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm…) dùng với liều lượng nhỏ (hàng µg) có tác động ngăn sự phát triển các vi sinh vật khác Định nghĩa này do Waksman đưa ra vào năm 1940 để phân biệt các loại thuốc mới được khám

phá là penicillin (một sản phẩm của loại nấm Penicillum) với các chất sulfamid tổng

hợp đã được phát hiện vào những năm 30 Sau đó khi các chất kháng khuẩn khác được bán tổng hợp từ tác nhân tự nhiên hay tổng hợp toàn phần thì định nghĩa này không còn phù hợp nữa [31]

Ngày nay, khái niệm “kháng sinh” được dùng để chỉ những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hay tổng hợp có tác động kháng khuẩn nồng độ thấp [27] Chính vì vậy mà phạm vi tìm kiếm các kháng sinh mới được mở rộng nhiều.Chỉ một số ít kháng sinh được sử dụng như tác nhân hóa trị liệu, còn đa số những kháng sinh khác thì do độc tính cao hoặc không có tác động trong cơ thể người và động vật Ngoài ra, một số kháng sinh được sử dụng không nhằm mục đích điều trị, ví dụ nisin được dùng làm chất bảo quản thực phẩm [31]

1943, các loại vi khuẩn kháng thuốc cũng xuất hiện [9]

Sự đề kháng kháng sinh là một vấn đề thường gặp đối với vi khuẩn Sự đề kháng kháng sinh vô cùng nguy hiểm vì có thể tạo ra ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc (lờn thuốc) trong cộng đồng Một số kháng sinh tỏ ra rất hữu hiệu trong điều trị nghiễm khuẩn như ampicillin, tetracillin, chloramphenicol…hiện nay đã bị kháng bởi các vi khuẩn có thể đến 90 - 95% Vì vậy, đề kháng kháng sinh đang là

vấn đề báo động và báo động đã chuyển sang màu đỏ, khi các loại vi khuẩn bệnh viện kháng loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay đã xuất hiện một cách độc lập tại ít nhất ở tám quốc gia khác nhau [8].

Có hại loại đề kháng kháng sinh

• Đề kháng tự nhiên

Là sự đề kháng của tất cả các chủng trong cùng một loài hoặc cùng một chi đối với một loại kháng sinh hay nói cách khác nó là phổ kháng sinh thông thường của một kháng sinh

- Enterococcus đề kháng tự nhiên với lincomycin

- Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli đề

kháng tự nhiên với Penicillin G do kháng sinh này không thể thâm nhập vào tế bào vi khuẩn đó

Cơ sở di truyền đề kháng loại này chủ yếu là nhiễm sắc thể Sự đề kháng tự nhiên có tính di truyền theo loài [9]

• Đề kháng thu nhận

Là đề kháng xuất hiện do có sự đột biến nhiễm sắc thể từ một chủng vi khuẩn bình thường nhạy cảm hoặc vi khuẩn nhận được gen đột biến đề kháng từ bên ngoài Đặc điểm của loại đề kháng này là phát triển và thay đổi theo thời gian, cách

sử dụng kháng sinh, có tính chất khu vực [9]

1.1.3 Nguyên nhân vi khuẩn đề kháng kháng sinh

Nguyên nhân của sự đề kháng có thể do tự nhiên nhưng sự góp phần của con người cũng không kém phần quan trọng do việc sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh ngày cành một nhiều của người sử dụng và ngay chính người thầy thuốc làm mức độ đề kháng ngày càng trầm trọng hơn

Có bốn nguyên nhân chính:

Sử dụng kháng sinh không hợp lý

Sử dụng không đúng kháng sinh để điều trị những bệnh không phải do vi khuẩn gây ra đang góp phần vào sự lan rộng của vi khuẩn kháng thuốc Theo ước tính của Trung tâm kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Mỹ, 1/3 tổng số đơn thuốc kháng sinh dành cho bệnh nhân ngoại trú là không cần thiết Kháng sinh không gây

hại cho virus Khi mọi người uống kháng sinh để điều trị các bệnh do virus gây ra chẳng hạn như cúm hoặc cảm lạnh, chúng tấn công vi khuẩn ''tốt'' trong cơ thể Hậu quả là số vi khuẩn có lợi giảm và cơ thể người uống cung cấp điều kiện thuận lợi để

vi khuẩn ''xấu'' sinh sôi [8]

Không tuân thủ phác đồ điều trị

Mặc dù kháng sinh có hiệu quả trong việc tấn công vi khuẩn nhạy cảm song một số vẫn có thể sống sót đặc biệt là nếu bệnh nhân không uống đủ lượng thuốc cần thiết để làm việc đó Những loại vi khuẩn kháng thuốc còn sống này nhân lên

và việc tiêu diệt chúng trở nên khó khăn hơn nhiều Vi khuẩn kháng thuốc cũng có thể lây truyền từ người này sang người khác Lời khuyên của bác sĩ là nếu được kê đơn một loại kháng sinh, hãy uống tất cả thuốc theo chỉ dẫn ngay cả khi cảm thấy tốt hơn Không nên sử dụng kháng sinh còn thừa để điều trị một dạng bệnh khác [8]

Sử dụng kháng sinh cho gia súc và thực vật

Kể từ những năm 1950, nông dân đãsử dụng kháng sinh, kể cả các kháng sinh dành cho người, trong chăn nuôi gia súc, gia cầm Họ bổ sung kháng sinh vào thức

ăn để trung hòa hiệu ứng của các điều kiện nuôi nhốt chật chội, vệ sinh kém, cũng như làm động vật tăng trưởng nhanh

Tại Mỹ, mỗi năm có tới 1/3 tổng lượng kháng sinh được sản xuất được bổ sung vào thức ăn động vật Lượng kháng sinh nhiều khi không đủ để chữa bệnh cho vật nuôi và dẫn tới tình trạngkháng kháng sinh ở mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm, gây ra vấn đề sinh thái lớn cũng như đe doạ sức khoẻ con người Những vi khuẩn kháng kháng sinh thông thường đó tồn tại trong quá trình giết mổ và chế biến, khiến người tiêu dùng có nguy cơ nhiễm chúng khi ăn hoặc thậm chí chạm vào thịt hoặc động vật sống Nếu chúng gây ra các bệnh nghiêm trọng ở người, kháng sinh thông thường sẽ không có hiệu quả

Ngoài ra, kháng sinh còn được sử dụng để phun lên thực vật để tiêu diệt vi khuẩn Dư lượng kháng sinh trên các quả và rau này có thể tấn công vi khuẩn có lợi trong ruột người và tiếp tay cho vi khuẩn có hại, kháng thuốc sống sót

Vì vậy, sử dụng kháng sinh hợp lí, ngăn chặn việc sử dụng kháng sinh không theo đơn thuốc trong chăn nuôi và thực vật đang là một vấn đề phức tạp, cần một giải pháp nhiều mặt [8]

Sự lạm dụng kháng sinh không kê đơn

Nhiều người đã uống kháng sinh để trị cảm lạnh mà không biết rằng nó chỉ có hiệu quả đối với bệnh nhiễm khuẩn Sử dụng quá liều cũng dẫn tới sự xuất hiện của nhiều dạng vi khuẩn kháng thuốc

Theo các nhà khoa học, kháng kháng sinh là không thể tránh khỏi song có nhiều biện pháp khả thi để làm chậm tốc độ của vấn đề này Các biện pháp trên nhiều công trình nghiên cứu đang được thực thi, bao gồm cải thiện việc kiểm soát bệnh truyền nhiễm, bào chế kháng sinh mới và sử dụng thuốc hiệu quả hơn Barbara Murray thuộc Đại Học Texas cho biết cả các biện pháp đơn giản cũng có tác dụng, chẳng hạn như nhân viên y tế rửa tay thường xuyên hơn, xác định và nhanh chóng cách ly bệnh nhân có các bệnh nhiễm khuẩn kháng thuốc, cải thiện hệ thống thoát nước cũng như đảm bảo nước sạch ở các nước đang phát triển

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), các quốc gia cần chia sẻ thông tin về tình trạng kháng kháng sinh cũng như nâng cao ý thức của công chúng, bác sĩ, bác sĩ thú

y và nông dân về vấn đề này bằng nhiều hình thức chẳng hạn như thảo luận trực tiếp hoặc phát tờ rơi Các chuyên gia cũng yêu cầu WHO, Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) và Văn phòng Bệnh dịch Động vật Quốc tế phối hợp để thu thập dữ liệu, tiêu chuẩn hoá các phương pháp kiểm tra và soạn thảo quy tắc sử dụng kháng sinh ở vật nuôi [8]

1.1.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Sản xuất enzym để phá hủy hoạt tính của thuốc

Staphyloccoci kháng penicillin G là do sản xuất được β-lactam, một số trực khuẩn Gram (-) cũng sản xuất được enzym này Các vi khuẩn Gram (-) kháng được aminoglycoside là nhờ các enzym adenylylase, phosphorylase hay acetylase, còn kháng với chloramphenicol là do vi khuẩn tiết chloramphenicol acetyltransferase [6].

Thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

Tetracycline tích tụ bên trong những vi khuẩn nhạy cảm, trong khi đó ở những vi khuẩn đề kháng thì thuốc không tích tụ bên trong tế bào được Các vi khuẩn kháng polymyxin, amikacin và một số aminoglycoside khác cũng là do thiếu khả năng thẩm thấu của màng tế bào [6].

Điểm gắn của thuốc có cấu trúc bị thay đổi

Một số vi khuẩn kháng aminoglycoside do đột biến nhiễm sắc thể làm mất

hoặc thay đổi một loại protein đặc biệt ở tiểu đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn, được sử dụng như là điểm gắn của thuốc ở những vi khuẩn nhạy cảm Những vi khuẩn kháng erythromycin cũng là do những thụ thể trên tiểu đơn vị 50S đã bị thay đổi, còn kháng penicillin là do vi khuẩn có thể mất hay đã làm thay đổi các PBP (penicillin bingding protein) [6]

1.2 TỔNG QUAN VỀ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.2.1 Đặc điểm

Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn Gram dương sắp xếp dạng chùm

nho, hoặc xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy, đường kính 0,7-1,2 µm, không di động, không sinh bào tử và thường không có vỏ [9]

Hình 1.1 Hình ảnh Staphylococcus aureus

S aureus thuộc loại hiếu – yếm khí tùy ý, mọc dễ trên nhiều loại môi trường

có nồng độ muối cao lên đến 15% Trên môi trường thạch thông thường S aureus

tạo khuẩn lạc S (Smooth-trơn) đường kính 1-2 mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 37°C khuẩn lạc thường có màu vàng chanh (do sản xuất hai loại sắc tố carotenoid, δ-carotenoid

và rubixanthene) Trên môi trường thạch máu, S aureus phát triển nhanh gây tiêu huyết, tiết ra năm loại hemolysin (α, β, γ, δ, ε), S aureus làm đục môi trường canh

thang, để lâu nó có thể lắng cặn

S aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ (phụ thuộc vào khả năng thích

ứng với nhiệt độ tối đa 45°C) và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có bào tử khác (bị diệt ở 80°C trong 1 giờ trong khi các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 60°C

trong 30 phút) S aureus cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi

trường [9]

S aureus thường kí sinh tai, mũi, họng Có khoảng 40-50% người có mang S aureus ở mũi và có thể ở da Vi khuẩn này thường gây bệnh cho người giảm đề

kháng hoặc chúng có thể có nhiều yếu tố độc lực S aureus là vi khuẩn gây bệnh

thường gặp nhất và có thể gây ra nhiều bệnh khác nhau như: nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm da, viêm tai, viêm xoang, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm độc thức ăn, viêm ruột cấp, hội chứng da phồng rộp, hội chứng sốc nhiễm độc

Staphylococcus aureus là mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng vì nó là tác

nhân hàng đầu gây bệnh mắc phải ở bệnh viện Loài vi khuẩn gram dương này có yếu tố độc lực quyết định gây nhiều bệnh trong lâm sàng, bao gồm mụn nhọt thông thường, ngộ độc thức ăn, hội chứng sắc tố độc, viêm xương tủy, viêm phổi hoại tử

và viêm nội mạc tim

Các chủng S aureus kháng methicillin (MRSA) thường đề kháng đa thuốc và

chỉ nhạy với vancomycin, là thách thức trong việc điều trị và kiểm soát nhiễm trùng trong bệnh viện Từ khi được công bố vào những năm 1960, nhiễm MRSA tăng đều trong các bệnh viện ở Mỹ, Theo hệ thống giám sát nhiễm trùng bệnh viện quốc gia,

của trung tâm kiểm soát và phòng bệnh ở Mỹ, MRSA chiếm 51,7% của chủng S

aureus phân lập từ bệnh nhân ở hơn 300 đơn vị chăm sóc đặc biệt khắp Mỹ trong

năm 2002 Tỉ lệ MRSA tại Hàn Quốc năm 1988 là 46% nhưng đến năm 2000 là 74%, tại Đài Loan năm 1981 là 20% và 2002 là 69% Vào tháng 6/2002 một mẫu

đầu tiên của S aureus đề kháng vancomycin (VRSA) được phân lập ở Mỹ và tính

đến tháng 5/2004, đã có tất cả 03 trường hợp VRSA được phát hiện, từ 1996-2002

phát hiện tổng cộng 24 trường hợp nhiễm S.aureus đề kháng trung gian với

vancomycin [35]

1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus

Sự đề kháng penicillin và cephalosporin là do S aureus có khả năng tiết lactam Tính kháng thuốc được truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay giao phối [6]

Kháng nafcillin, methicillin, oxacillin thì không phụ thuộc vào β-lactam (do

Staphylococcus aureus đột biến nên thay đổi một loại penicillin bingding protin

(PBP) nên thuốc không gắn vào vi khuẩn được) [6]

Cơ chế đề kháng của Staphylococcus aureus đối với berberin liên quan đến

bơm đa đề kháng thuốc ở vi khuẩn (MDRs-Multi Drug Resistance pumps) [6]

1.3 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID

1.3.1 Định nghĩa, nguồn gốc, cấu trúc, phân loại

Flavonoid là một hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật Flavonoid

có nguồn gốc từ flavus trong tiếng latinh có nghĩa là màu vàng, tuy nhiên một vài flavonoid có màu đỏ, xanh, tía hay màu trắng [10]

1.3.2 Nguồn gốc

Flavonoid (hay bioflavonoid) là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, có trong hơn nửa các loại rau quả dùng hàng ngày, được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỉ 20: Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986) Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về các đặc tính của vitamin C và flavonoid [3]

Phần lớn các flavonoid có màu vàng Ngoài ra, còn có những chất màu xanh, tím, đỏ, hoặc không màu

Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây Trong cây, flavonoid giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng,…), một số còn có tác dụng điều hoà sự sinh trưởng của cây cối [21]

Hình 1.2 Nguồn gốc flavonoid

1.3.3 Cấu trúc

Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòng benzene A, B liên kết bởi một đường thẳng có 3 carbon, hay nói cách khác flavonoid là những chất có cấu tạo khung theo kiểu diphenyl propan C6-C3-C6 [2]

Hình 1.3.Khung cơ bản flavonoid

- Biflavonoid là những flavonoid được cấu tạo từ hai monomer flavonoid

- Triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid

- Flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignanFlavonoid có thể tồn tại ở dạng glycon (gồm khung cơ bản) hay ở dạng glycosis (gồm khung cơ bản gắn với đường ở vị trí khác nhau)

Bảng 1.1 Cấu trúc cơ bản một vài flavonoid đặt trưng [21]

ISOFLAVONOID NEOFLAVONOID

Cấu trúc hóa học chalcon được các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu trên toàn thế giới Đặc biệt quan tâm đến các phương pháp tổng hợp và hoạt tính sinh học của chalcon Danh pháp “chalcon” được dề nghị bởi Kostanecki và Tambor [6].Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C, không có dị vòng C như các flavonoid khác Đây là những chất có màu vàng đến màu cam

Hình 1.4 Khung chalcon

Chalcon có chủ yếu trong một số hoa của họ Cúc (Asteraceate) và cũng có thể

có trong các bộ phận khác của cây như vỏ, lá, quả, rể

1.3.5 Hoạt tính sinh học của flavonoid và chalcon

Các dẫn chất flavonoid có khả năng chống lại các gốc tự do, chống oxy hóa…

vì flavonoid làm bền thành mạch, khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, E, selen và kẽm [4]

Tác dụng chống độc: làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan [7]

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt [7]

Tác dụng chống lở loét của flavanon và chalcon-glycoside của rể cam thảo được dụng để chữa đau dạ dày [10]

Flavonoid làm bền thành mạch, giảm sức thẩm thấu các ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh hồng cầu qua thành mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch,rối loạn tuần hoàn võng mạc [4]

Tác dụng của flavonoid trên vi khuẩn đã được chứng minh Flavonoid có tác dụng yếu trên MRSA, nhưng khi phối hợp một số kháng sinh sẽ làm giảm MIC của các kháng sinh này do các flavonoid làm tăng tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với

kháng sinh Trên E coli sản sinh ESBL (Extended Spectrum β-Lactamase) cũng có

tác dụng tương tự [5] [6]

Chalcon tuy là một nhóm phụ của flavonoid nhưng gần đây có nhiều dẫn chất được báo cáo có tác dụng sinh học rất đa dạng Nhiều hợp chất nhóm này có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, và có các đặc tính kháng viêm [10] [26] Chúng cũng là dẫn chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp flavonoid, vốn

là những hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều tác dụng sinh học.Bên cạnhnhóm chalcon truyền thống, các nghiên cứu gần đây về hoạt tính sinh học của các dẫn chất chalcon dị vòng như quinolinyl chalcon, các chalcon chứa vòng 1,4-dioxan đã thể hiện tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt

Chalcon và các dẫn chất của chalcon đã được tổng hợp và thử nghiệm invitro

với hoạt tính kháng nấm tương đối mạnh so với amphotericin B và Ketoconazol [26]

Một số hợp chất và dẫn xuất chalcon hoạt tính mới được nghiên cứu như là 2’,6’-dihydroxy-4’-methoxydihydrochalcon được chứng minh có tác dụng với dòng

tế bào ung thư biểu mô và hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilus và

sự chỉ ra rằng quá trình tổng hợp ADN ở Proteus vulgaric hay tổng hợp ARN ở S

aureus bị ức chế mạnh bởi flavonoid Tổng hợp protein, lipit cũng bị ảnh hưởng

nhưng với mức độ rất ít Tác giả cho rằng các vòng B của flavonoid có thể đóng vai trò quan trọng trong liên kết đan xen hay sắp xếp hidro tổng hợp acid nucleid của vi khuẩn, vì vậy có thể giải thích cơ chế ức chế sinh tổng hợp ADN, ARN của flavonoid [18]

Ohemeng và cộng sự đã sàng lọc được 14 loại flavonoid ức chế ADN gyrase

của Staphylococcus epidermidis, S aureus, E coli, S typhymurium và

Stenotrohpomonas maltophilia.

Gần đây, Plaper và cộng sự đã báo cáo rằng quercetin có tác dụng trên tiểu

đơn vị gyrB của ADN gyrase E coli, ức chế hoạt động ATPase của enzym này Hay

sự ức chế xảy ra trên topoisomerase IV bằng cách thay thế amino acid tại vi trí 410 gyrB Điều này càng chúng tỏ hoạt động kháng khuẩn của flavonoid bằng cách ức chế lên ADN gyrase [18]

Ức chế chức năng màng tế bào chất

Một nhóm nghiên cứu trước đây đã tìm thấy sophorafla vanone G có khả năng

kháng S aureus và Streptococci thông qua ức chế chức năng màng tế bào chất Cơ

chế tác động flavanon lên màng tế bào chất đã được báo cáo gần đây Ảnh hưởng của sophoraflavanon G được nghiên cứu trên màng liposom có cấu trúc tương tự màng tế bào vi khuẩn, màng này có nhiệm vụ bao bọc và ngăn cách dịch tương bào với vỏ tế bào, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sophoraflavanon G kháng khuẩn bằng cách làm giảm tính linh động lớp trong và lớp ngoài của màng [18]

Ikigai và cộng sự đã nghiên cứu tính kháng khuẩn mạnh mẽ của catechin được tìm thấy trong trà xanh Catechin thuộc họ flavonoid có tác dụng kháng cả vi khuẩn Gram (+) hơn Gram (-) Nhóm nghiên cứu đi đến kết luận catechin chủ yếu hoạt động làm tổn thương màng tế bào vi khuẩn Giả thiết đưa ra nhằm giải thích kết luận trên Đầu tiên, catechin có thể xâm nhập và phá vỡ chức năng hàng rào lớp đôi photpholipit, sau đó là dung hợp màng, kết quả là sự thất thoát vật liệu di truyền trong lớp màng vi khuẩn Và nhóm cũng đã chứng minh sự thất thoát màng xảy ra bởi catechin được giảm đáng kể khi màng liposom có hiện diện chất béo tích điện tích âm Vì thế tính nhạy cảm catechin có thể thấp vi khuẩn Gram âm so với Gram dương [25]

Hoạt động trên màng tế bào chất bởi quercetin được phát hiện bởi Mirzoeva chính là một trong cơ chế kháng khuẩn mới được nghi ngờ và góp phần thử nghiệm các hợp chất flavonoid trên ADN gyrase của Ohenmeng và cộng sự

Sự ức chế chuyển hóa năng lượng

Haraguchi và các đồng nghiệp gần đây đã tiến hành khảo nghiệm hoạt động kháng khuẩn của hai retrochalcon (licochalcone A và C) từ rể cây cam thảo Những

chất flavonoid này được chứng minh là có tác động ức chế đối với S aureus và

Micococcus luteus nhưng không tác động trên vi khuẩn E coli Trong một thử

nghiệm sơ bộ, licochalcon kết hợp các chất tiền phóng xạ ức chế các đại phân tử (ADN, ARN và protein), qua đó đưa ra giả thuyết các licochalcon có thể can thiệp vào quá trình chuyển hóa năng lượng tương tự thuốc kháng sinh kháng khuẩn bằng

cách ức chế hô hấp vi khuẩn mục tiêu, vì năng lượng cần thiết cho hoạt động hấp thu của các chất chuyển hóa khác nhau và sinh tổng hợp các đại phân tử [18]

Các licochalcon còn ức chế mạnh mẽ sự hấp thụ oxy trong S aureus và

Micococcus luteus nhưng không ức chế đối E coli Licochalcone còn tác dụng tốt

lên phổ kháng khuẩn các nhóm vi khuẩn trên

Haraguchi và cộng sự cũng chứng minh rằng licochalcon A và C có hiệu quả

ức chế NADH-cytochrom C reductase, nhưng không tác dụng trên cytochrom C oxidase hoặc NADH-CoQ reductase Vì thế nhóm đưa ra đề xuất rằng vị trí ức chế của retrochalcone là giữa CoQ và cytochrom C trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp của vi khuẩn [18]

1.4 ENZYM ADN GYRASE (TOPOISOMERASE II)

1.4.1 Tổng quan về ADN gyrase

Trong quá trình sao chép, trước tiên chuỗi xoắn ADN phải được tách rời và giữ dưới dạng mạch đơn Việc tách mạch do các ennzym có lên là helicase thực hiện bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các base nhờ năng lượng giải phóng từ các nucleoside 5’triphosphat Mạch tách ra được ổn định bởi protein SSB (Single Strand Binding) Mặt khác, một vấn đề dặt ra cho nhiễm sắc thể dạng vòng khi sao chép là làm sao giảm áp lực xoắn ở đầu mỗi chĩa ba sao chép đang tiến tới ADN topoisomerase chính là giải pháp [3]

ADN gyrase (topoisomerase II) hay gọi đơn giản là gyrase, được phát hiện

1976 bởi Gellert và cộng sự [27], là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao chép và phiên mã Nó có khả năng tháo các nút nảy sinh do các biến đổi cấu trúc của chuỗi xoắn kép bằng cách cắt cả hai mạch của phân tử ADN khi không có mặt ATP [3] Tại vị trí đã được đánh dấu bởi protein B, gyrase sẽ tác động, cắt ADN; làm tháo xoắn ra 2 phía protein B Với cơ chế là cắt tạm thời hai chuỗi của ADN, có tác dụng sắp xếp lại siêu soắn, tạo ra siêu xoắn trái của chuỗi xoắn kép và phản ứng này cần 1 ATP

Hình 1.5 Hoạt động của topoisomerase II tại chạc ba sao chép

Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công nhóm thuốc dẫn xuất từ quinolon, các kháng sinh bán tổng hợp, tác dụng do ức chế enzym ADN gyrase, ngăn sự sao chép nhiễm sắc thể, không cho vi khuẩn sinh sản như ciprofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, perfloxacin [11]

Với tình trạng lạm dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh bừa bãi của người dùng thuốc và cả thầy thuốc gây ra tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Chính vì vậy nghiên cứu những kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của chúng là mục tiêu của việc nghiên cứu khoa học liên tục và ứng dụng từ nghiên cứu.Hợp chất tự nhiên flavonoid đã được nghiên cứu và nhiều ứng dụng rộng rãi trong hoạt động kháng khuẩn đặc biệt vi khuẩn Gram (+) Ví dụ như galangin,

pinocembrin, ponciretin, genkwanin, sophoraflavanon G và các dẫn xuất của nó [18].

1.4.2 Tổng quan về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzym gyrase Thu nhận chế phẩm enzym thô

Ngoại trừ một số trường hợp enzym quan tâm là enzym ngoại bào từ vi sinh vật (enzym được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào) và các enzym ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợp còn lại, bước đầu tiên trong nghiên cứu enzym là phải thu nhận dịch chiết enzym từ nguyên liệu Để thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzym, trước hết phải phá vỡ tế bào Có nhiều cách để phá vỡ như dùng siêu âm, dùng enzym (lysozym, mutanolizin), máy nén, sốc nhiệt (làm đông đá-tan đá liên tục), nghiền với cát thủy tinh, hay kết hợp tác dụng va đập trong môi trường có cát thủy tinh…

Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzym quan tâm thấp

Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzym, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein/enzym để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hòa tan enzym trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp

Để kết tủa enzym từ dịch chiết thô, người ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfat, do muối này có mức độ hòa tan rất cao trong nước (có thể đạt tới 720g/l, ở nhiệt độ 25°C), ít làm mất hoạt tính enzym, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzym Một ưu điểm nữa của muối này là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết Cần loại bỏ muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo [2]

Có hai loại gel trao đổi ion là: trao đổi anion (anionit) và trao đổi cation (cationit) Gel trao đổi ion được tổng hợp bằng cách gắn một nhóm chức tích điện dương như DEAE (diethylaminoethyl) hoặc nhóm chức tích điện âm như SP (sulphopropyl) lên chất nền cellulose, sephadex hay sepharose… tùy thuộc nhóm chức tích điện gì mà chúng sẽ có ion trao đổi điện tích trái dấu với nhóm chức Sắc

kí trao đổi ion thường được dùng ở bước tinh sạch ban đầu để sơ bộ phân chia các protein khác nhau do sự khác nhau về độ tích điện Tùy theo pH của môi trường sắc

kí mà protein sẽ tích điện dương hay âm, khi được cho lên cột trao đổi ion, chúng sẽ thay thế ion trao đổi của gel nếu các phân tử mẫu có cùng điện tích với ion trao đổi

Ái lực liên kết giữa các protein/enzym với gel trao đổi ion phụ thuộc mức độ tích điện của các phân tử mẫu và chúng được đẩy hay rửa chiết (eluted) ra khỏi gel nhờ vào sự thay đổi nồng độ muối hay pH của môi trường Phương pháp sắc kí trao đổi ion còn được dùng để thu nhỏ thể tích của mẫu nghiên cứu Điều này rất hữu ích khi việc kết tủa các protein bằng dung môi hữu cơ hay bằng ammonium sulfat có những bất tiện [2]

Sắc kí lọc gel hay còn gọi là sắc kí lọc rây phân tử

Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thước khác nhau trong hệ thống mạng lưới phân tử của gel sắc

kí Gel thường dùng là sephadex, sepharose Các phân tử mẫu khi đi qua một hệ thống các hạt gel nếu có kích thước nhỏ hơn kích thước của lổ gel thì có thể chui vào trong các hạt gel và do đó thời gian đi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân tử có kích thước lớn chỉ đi được vào khoảng trống giữa các hạt gel Nhờ vậy, phương pháp cho phép phân chia các đại phân tử khác nhau về khối lượng hay kích thước phân tử Phương pháp sắc kí lọc gel không áp dụng được với lượng thể tích mẫu lớn, vì vậy ít được dùng cho bước tinh sạch ban đầu Tuy vậy, nếu lượng mẫu được

cô đặc lại thành thể tích nhỏ thì vẫn có thể dùng phương pháp lọc gel [2]

Ly tâm siêu tốc

Phương pháp này cho phép phân chia các hợp chất khác nhau về khối lượng

và kích thước phân tử, liên quan đến tỉ trọng của chúng trong dung dịch Tuy nhiên nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên nguyên tắc trường lực ly tâm của các

một gradient nồng độ của chất nền, thường là glycerol hay sucrose Mẫu được cho lên bề mặt gradient (nồng độ cao nhất dưới đáy và thấp nhất trên mặt), sau khi ly tâm ở tốc độ cao trong một thời gian đủ dài, mẫu sẽ di chuyển vào trong gradient chất nền và tạo thành những vùng riêng biệt tùy thuộc vào tỷ trọng của chúng Sau khi ly tâm, mẫu được rút ra nhẹ nhàng theo từng lớp, hoặc đục lỗ nhỏ ở dưới đáy ống ly tâm để lấy mẫu ra theo từng phân lớp [2].

Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch chế phẩm enzym

Phương pháp thường dùng nhất để đánh giá hay kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm protein hay enzym là điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) biến tính và không biến tính Phương pháp điện di gel polyacrylamide biến tính sử dụng gel và đệm có chứa sodium dodecyl sulfate (SDS) Các phân tử protein trong môi trường

có SDS sẽ bị duỗi thẳng và trở nên tích điện âm, vì vậy di chuyển về cực dương trong điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng Sau quá trình điện di, gel được nhuộm bằng coomassie hay bằng bạc nitrat

Ngày nay, việc nhận dạng các protein hay enzym thu được có thể dễ dàng được thực hiện bằng kĩ thuật phân tích khối phổ (mass spectrometry-MS) Với hệ thống phân tích này, các protein được phân cắt bằng một protease đặc hiệu (thường dùng là trypsin) thành các mảnh peptid nhỏ, sau đó được đưa vào hệ thống phân tích khố phổ Thông qua hệ thống này, phổ các đỉnh peptid được xác định khối lượng phân tử chính xác, và bằng cách so sanh với khối phổ của các protein trong ngân hàng dữ liệu protein quốc tế, protein cần phân tích sẽ được nhận dạng [2].

1.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

1.5.1 Phương pháp khuếch tán trên bản thạch

Phương pháp đặt đĩa giấy

Thường áp dụng đối với kháng sinh có tác động trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ - đây là thử nghiệm đi trước thử nghiệm tìm MIC).Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng một lớp huyền dịch vi khuẩn Chất thử sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế

Nhược điểm: nếu thuốc thử và hóa chất khó khuếch tán vào bản thạch sẽ làm sai lệch kết quả và phải tính toán phức tạp

Phương pháp đục lỗ

Nguyên tắc: dùng đĩa thạch đã được trãi sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đến đáy hộp Cho dung dịch thử vào các lỗ tròn, chất thử sẽ khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo vùng ức chế quanh lỗ (vòng kháng khuẩn)

Nhược điểm: cần phải thăm dò tìm ra dung dịch đệm và môi trường để thuốc khuếch tán tốt Phương pháp này cũng đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm

Phương pháp ống trụ

Nguyên tắc: kháng sinh được cho vào ống hình trụ, đặt vào bản thạch, kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế xung quanh nơi đặc kháng sinh Đo đường kính, đường kính này tỉ lệ nghịch với MIC, do đó ta có thể dựa vào đường kính này tra bảng đối chiếu để biết

Trong phương pháp trên, chất thử được coi là có tính kháng khuẩn nếu có vòng ức chế rõ ràng Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại thử nghiệm bằng phương pháp pha loãng.

Phương pháp Epsilometer (E-test)

Là phương pháp khuếch tán trên thạch khá mới E-test là một dải plastic được bao bởi một gradient nồng độ kháng sinh liên tục trên một mặt, mặt kia có thước chia tỷ lệ của kháng sinh Dải này được đặt trên bề mặt đĩa thạch có vi khuẩn và ủ qua đêm, một vùng ức chế phát triển hình elip hình thành xung quanh dải MIC được đọc ở chổ giao nhau vùng ức chế với dải Hiện nay, phương pháp E-test chưa phổ biến Việt Nam

1.5.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

MIC là nồng độ thấp nhất của một chất kháng khuẩn, trong những điều kiện nhất định, ức chế sự tăng trưởng của một vi khuẩn thử nghiệm quan sát được bằng mắt thường sau khi ủ qua đêm Kĩ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn

có thể áp dụng cho các phòng thí nghiệm vi sinh, bệnh viện, viện vệ sinh dịch tễ và các cơ sở nghiên cứu

Thông qua MIC người ta có thể ước lượng được liều lượng sử dụng của kháng sinh trong lâm sàng và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh nhằm đánh giá tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viên và cộng đồng Ngoài ra phương pháp này còn sử dụng xác định hoạt lực của một loại kháng sinh mới

Giá trị MIC cần xác định là kết quả trung bình của 3 lần thử nghiệm:

MIC= (n1+n2+n3)/3