Trong báo cáo tổng kết này, chúng tôi xin trình bày kết quả phân loại phân tử ADN của 7 loài tảo độc, hại thuộc ba chi Alexandrium, Prorocentrum và Pseudonitzschia do Viện Hải Dương học
Trang 1Viện khoa học và công nghệ việt nam
viện công nghệ sinh học
Báo cáo tổng kết đề tài nhánh năm 2005
“Nghiên cứu, phân tích ADN của tảo độc, tảo gây
hại ở biển (7 loài)”
Thuộc đề tài cấp Nhà nước, chương trình KC- 09-19
“Điều tra, nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số vùng nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven biển,đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do
chúng gây ra“
doTS Chu Văn Thuộc làm chủ nhiệm
Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS Đặng Diễm Hồng
6132-21
02/10/2006
Trang 2có thể bắt gặp những dạng biến thái của loài khi điều kiện sống thay đổi Điều này có thể gây khó khăn cho phương pháp phân dựa trên các đặc điểm hình thái Vì vậy, phương pháp phân loại bằng kĩ thuật sinh học phân tử sẽ góp phần giải quyết những khó khăn này
Trong báo cáo tổng kết này, chúng tôi xin trình bày kết quả phân loại phân tử ADN của 7 loài tảo độc, hại thuộc ba chi Alexandrium, Prorocentrum và Pseudonitzschia do Viện Hải Dương học Hải phòng cung cấp bao gồm:
Alexandrium sp5,Alexandrium sp (C), Alexandrium sp16; Prorocetrum sp1, Prorocetrum sp 3, Pseudo-nitzschia sp ‘2, Pseudo-nitzschia sp (G3)- dựa trên việc
đọc và so sánh trình tự một phần đoạn gen 18 S rADN đối với các loài thuộc chi Alexandrium và chi Prorocentrum, đoạn gen ITS1-5.8 S-ITS2 đối với các loài thuộc chi Pseudonitzschia Trên cơ sở kết quả đọc trình tự thu được, tên và mối quan hệ về phát sinh chủng loại giữa loài được phân lập ở Hải Phòng với các loài
Alexandrium spp., Pseudo-nitzschia sp., Prorocentrium sp khác đã được công bố
được kiểm tra dưới kính hiển vi laser quét Axiovert 100M của hãng CarlZeiis
- Plasmit, tế bào khả biến, enzym giới hạn được mua từ một số hãng như Invitrogen (Mỹ), Pharma ( Thuỵ Điển), Biolabs (Anh)…
- Các trình tự gen 18S của các loài thuộc chi Alexandrium và chi Prorocentrum, ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia được công bố trên ngân
Trang 3- Cặp mồi Alex F-U18 R, U Pro F- U18 R dùng để nhân đoạn gen mã hoá cho
18S rADN của các loài thuộc chi Alexandrium, Prorocentrum và cặp mồi PseuF-
PseuR nhân đoạn ITS1- 5.8 S- ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia đã
được thiết kế và đặt mua tại hãng Invitrogen (Mỹ)
II.2 Phương pháp nghiên cứu
* ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp của Y.K Hong có cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam (Đặng Diễm Hồng và CS., 2002)
* Các phương pháp sinh học phân tử được tiến hành chủ yếu theo sách cẩm nang phòng thí nghiệm về tạo dòng phân tử (Sambrook, Russell, 2001)
* Thiết kế mồi:
+ Để thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen mã hoá cho 18S rADN của các loài thuộc chi Alexandrium và chi Prorocentrum, đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia chúng tôi đã tiến hành tra cứu trình tự nucleotit gen 18S rARN và trình tự đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc ba chi nói trên trên ngân hàng gen Quốc tế, so sánh các trình tự nhận được và sử dụng các phần mềm chuyên dụng để thiết kế 3 cặp mồi đặc hiệu bao gồm Alex- U18R (nhân các loài thuộc chi Alexandrium), Upro18 F- U18R (nhân các loài thuộc chi Prorocentrum)
và PseuF- PseuR (nhân các loài thuộc chi Pseudonitzschia)
t Theo tính toán lí thuyết cặp mồi Alex18F- U18R, U Pro18F - U18R sẽ nhân
được đoạn gen 18S có kích thước vào khoảng 1,1Kb và cặp mồi PseuF -Pseu R sẽ nhân được đoạn ITS1-5,8S-ITS2 có kích thước vào khoảng 825bp
* Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt như sau: Thành phần phản ứng:
20 àl hỗn hợp phản ứng chứa 1àl ADN khuôn; 2àl buffer 10X;1,5àl dNTP nồng
độ 2.5Mm mỗi loại; 1àl primer mỗi loại, 0,3 Taq polymerase
Chu trình nhiệt:
Trang 4+ Chu trình nhiệt nhân 1 phần đoạn 18S của các loài thuộc chi Alexandrium:
940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 51 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp lại 35 chu kì,720C- 5 phút, giữ ở 40C
+ Chu trình nhiệt nhân 1 phần đoạn 18S của các loài thuộc chi Prorocentrum:
940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 55 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp lại 40 chu kì,720C- 5 phút, giữ ở 40C
+ Chu trình nhiệt nhân đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia: 940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 55 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp lại35 chu kì,720C- 5 phút, giữ ở 40C Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, sau đó nhuộm với Ethidium bromide và quan sát trên máy soi tử ngoại
* Sau khi chạy điện di kiểm tra, sản phẩm PCR được gắn vào vector pCRđ2.1 TOPOđ và được biến nạp vào vi khuẩn E Coli chủng DH5αT1, cuối cùng được
nuôi trên môi trường chọn lọc LB có bổ sung Ampicilin, X-gal chloro-3-indolyl β-D- galactopyranoside) ADN plasmit được tách chiết và kiểm tra sự có mặt của một phần đoạn gen 18S (đối với các mẫu thuộc chi Alexandrium, Prorocentrum) và đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 (đối với các mẫu thuộc chi Pseudonitzschia)
(5-Bromo-4-* Trình tự nucleotit ở mẫu nghiên cứu được thực hiện trên máy đọc trình tự tự
động ABI PRISM 377 DNA Sequencer, sử dụng ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit của hãng Perkin-Elmer Dựa trên chương trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000)
và DNASTAR chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại của 7 loài được nghiên cứu với trình tự của các loài thuộc 3 chi Alexandrium, Prorocentrum, Pseudonitzschia đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế
Phần III Kết quả và thảo luận
III.1 Tách chiết ADN tổng số
Kết quả tách chiết ADN tổng số được trình bày trên hình 1
M 1 2 3 4 5 6 7
Trang 5+ Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đ−ợc kiểm tra trên máy UV- 1601 của hãng Shimadzu Từ kết quả điện di trên gel agarose 1% và trên máy UV-1601 cho thấyADN tổng số tách chiết có nồng độ và độ tinh sạch cao cho phép tiến hành các nghiên cứu tiếp theo
III.2 Nhân đoạn gen mã hoá cho 18S rARN và đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng kĩ thuật PCR
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nh− đã đề cập ở trên Kết quả đ−ợc trình bày ở hình 2
này gắn vào vecto tách dòng và biến nạp vào tế bào EColi sẽ gây khó khăn cho
việc chọn lọc các dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp Vì vậy với 3 mẫu Alexandrium và 2 mẫu Prorocentrum, sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu đ−ợc sản phẩm PCR đặc hiệu Kết quả của quá trình thôi gel đ−ợc chỉ ra ở hình 3
Hình 1 ADN tổng số của 7 mẫu tảo độc, hại
GiếngM: Marker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 1, 2, 3: ADN tổng số của Alexandrium sp 16, A sp (C), A.sp5
Giếng 4, 5 : ADN tổng số của Prorocentrum sp 3, P.sp 1
Giếng 6, 7: ADN tổng số của Pseudonitzschia sp (G3), P sp’2
1 2 3 M 4 5 6 7
Hình 2 Sản phẩm PCR của 7 mẫu tảo độc, hại
Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi AlexF- U18R của Alexandrium sp (C), A sp 5,
A sp 16
Giếng M: Marker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 4, 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi UPro18F- U18R của Prorocentrum sp 1 và P sp 3
Giếng 6, 7: Sản phẩm PCR với cặp mồi PseuF- PseuR của Pseudonitzschia sp’2, P sp (G3).
Trang 6
III.3.Tách dòng đoạn gen 18S rADN, ITS1-5,8S-ITS2
Với sản phẩm PCR rất đặc hiệu ở trên, chúng tôi tiến hành tách dòng theo TOFO Kit (Invitrogen) Các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen mong muốn đ−ợc kiểm tra bằng PCR-Checking và cắt bằng enzym giới hạn
Hình4 Kết quả PCR checking các dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp (TTH)
Giếng1 : Đối chứng khuẩn lạc xanh- dòng tế bào không mang vecto tái tổ hợp
Giếng 2, 3, 4: Dòng tế bào của Alexandrium sp(C), A sp 16, A.sp 5 mang vecto TTH
Giếng M: 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 5, 6: Dòng tế bào của Prorocentrum sp 1, P.sp 3 mang vecto TTH
Giếng 7, 8: Dòng tế bào của Pseudonitzschia sp’2, P sp (G3) mang vecto TTH
Hình 3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau quá trình thôi gel
Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR với cặp mồi PseuF-PseuR của Pseudonitzschia sp’ 2, P sp
(G3)
GiếngM: Maker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 3, 4, 5: Sản phẩm PCR sau khi thôi gel của Alexandrium sp (C), A sp 5, A sp 16
Giếng 6, 7: Sản phẩm PCR sau khi thôi gel của Prorocentrum sp 1 và P sp 3
Trang 7III.4 Xử lí kết quả đọc trình tự
1 2 3 4 M 5 6 7 8
Hình 5 Sản phẩm cắt bởi enzym giới hạn EcoRI
Giếng 1, 2, 3 : Sản phẩm cắt ADN plasmit tái tổ hợp của mẫu Alexandrium sp (C), A.sp (5), A.sp(16)
Giếng 4: Đối chứng - AND plasmit tách từ khuẩn lạc xanh
Giếng M: Maker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 5, 6: Sản phẩm cắt ADN plasmit tái tổ hợp của mẫu Prorocentrum sp(1), P sp (2)
DC 1 2 3 4 5
Hình 6 Kết quả tách chiết ADN plasmit
Giếng DC : ADN plasmit tách chiết từ khuẩn lạc xanh
Giếng 1, 2,3, 4, 5 : ADN plasmit tái tổ hợp
Trang 8Sau khi xác định trình tự đoạn gen 18S rADN của 3 mẫu thuộc chi
Alexandrium: Alexandrium sp (C), A.sp 5, A.sp 16 ; 2 mẫu thuộc chi Prorocentrum: Prorocentrum sp 1, P sp 3 và đoạn trình tự ITS1-5,8S- ITS2 của 2
mẫu thuộc chi Pseudonitzschia, chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự thu được của 7 mẫu nghiên cứu nói trên với 31 trình tự của các loài thuộc 3 chi Alexandrium, Prorocentrum, Pseudonitzschia được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế với sự hỗ trợ của phần mềm DNAStar và ClustalX
1, Xây dựng cây phát sinh chủng loại của chi Alexandrium và định tên cho
Alexandrium sp (C), A.sp 5, A.sp 16
Sử dụng phương pháp ClustalW trong bộ phần mềm DNAStar để so sánh trình
tự của 3 mẫu nghiên cứu với 12 trình tự của các loài Alexandrium được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế chúng tôi thu được tỷ lệ phần trăm tương đồng của từng cặp trình tự các loài trong chi Alexandrium (ma trận tam giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) Kết quả chỉ ra ở bảng 2
Bảng 2 Tỉ lệ % tương đồng và khoảng cách di truyền giữa các loài trong chi
Alexandrium
Bảng 2 cho thấy độ tương đồng giữa các loài tảo thuộc chi Alexandrium từ
92,5% (giữa loài Alexandrium leei và A.cohorticula) đến 99,9% (giữa các loài
Alexandrium minutum và A ostenfeldii, A.affine và A.sp 16, A.sp 16 và A.sp (C), A.cohorticula và A tamiyavanichii) Qua kết quả trên có thể nhận thấy sự chênh
lệch về độ tương đồng không lớn giữa các loài trong chi này chứng tỏ gen 18S rADN có tính bảo thủ cao do vậy việc đọc và so sánh trình tự đoạn gen 18S rất thích hợp cho việc xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của loài và trên loài Dựa trên hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền của các loài thuộc chi Alexandrium, cây phát sinh chủng loại được xây dựng
Trang 9
Hình 6 Cây phát sinh chủng loại của 15 loài Alexandrium spp dựa trên việc so
sánh trình tự nucleotit đoạn gen 18S rADN
* Định tên mẫu Alexandrium sp 16 và A sp (C )
Dựa trên bảng hệ số tương đồng chúng tôi nhận thấy:
- Alexandrium sp 16 có độ tương đồng cao nhất với A.sp (C) và A affine
( 99,9%) sau đó đến A.cohorticula (98,9%), A.catenella (98,6%)
- Dựa vào cây phát sinh chủng loại ta thấy Alexandrium sp 16 cùng với loài
A.sp (C) làm thành một nhóm và nằm ngay cạnh A affine
- Alexandrium sp (C) có độ tương đồng cao nhất với A.sp 16 (99,9%), sau đó
là A affine ( 99,8%), A.cohorticula (98,8%), A.catenella(98,6%)
Như vậy, dựa vào hệ số tương đồng và cây phát sinh chủng loại chúng tôi xếp
hai mẫu Alexandrium sp 16 và A sp (C ) vào loài A affine
Trang 10Tiến hành xử lí và so sánh trình tự hai mẫu Prorocentrum sp 1, P sp 3 với trình
tự của 7 loài Prorocentrum đã được công bố trên ngân hàng gen chúng tôi thu
được bảng hệ số tương đồng và cây phát sinh chủng loại như trên hình 7 và bảng
3
Bảng 3 Tỉ lệ % tương đồng và khoảng cách di truyền giữa các loài trong chi
Prorocentrum
Hình 7 Cây phát sinh chủng loại của 9 loài Prorocentrum spp dựa trên việc so
sánh trình tự nucleotit đoạn gen 18S rADN
* Định tên mẫu Prorocentrum sp 1, P.sp 3
- Mẫu Prorocentrum sp 1 có hệ số tương đồng cao nhất với Prorocentrum
mexicanum (100%) sau đó là các mẫu P.sp 3 với hệ số tương đồng là 99,8%, P minimum (99,7%)
- Mẫu Prorocentrum sp3 có hệ số tương đồng cao nhất Prorocentrum mexicanum
và P.sp 3 (99,8%) sau đó là các mẫu P minimum (99,7%) , P micans (99,2%)
- Dựa trên cây phát sinh chủng loại thì Prorocentrum sp1 là loài P.mexicanum,
Trang 11Như vậy Prorocentrum sp 1 là loài P.mexicanum (vì có hệ số tương đồng là 100%) còn loài P.sp 3 có thể được xếp vào P.mexicanum hoặc là P micans
3, Xây dựng cây phát sinh chủng loại của chi Pseudonitzschia và định tên
Trang 12Hình 8 Cây phát sinh chủng loại của 14 loài Pseudnitzschia spp dựa trên việc so
sánh trình tự nucleotit đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2
* Định tên mẫu Pseudonitzschia sp’2
- Bảng hệ số tương đồng cho thấy Pseudonitzschia sp’2 có hệ số tưong đồng cao
nhất với P.cf autralis (83,1%) sau đó là P autralis (82,8%), P
micropora( 81,3%) Trên cây phát sinh chủng loại Pseudonitzschia sp’2 nằm
cạnh P.cf autralis và P autralis Như vậy có thể xếp Pseudonitzschia sp’2 vào
loài P.cf autralis
* Định tên mẫu Pseudonitzschia sp (G3)
- Hệ số tương đồng của Pseudonitzschia sp ( G3) với P pungens đạt giá trị cao
nhất (98,8%) sau đó là P multiseries (83,2%), P.cf autralis (79,4%)
- Trên cây phát sinh chủng loại Pseudonitzschia sp (G3) nằm cạnh P.pungens Vì
vậy, mẫu Pseudonitzschia sp (G3) có thể là loài P pungens
Tóm tắt sơ bộ kết quả định tên của 7 mẫu tảo độc, hại được nghiên cứu
1 Alexandrium sp 16 18S r ARN Alexandrium affine
2 Alexandrium sp (C ) 18S r ARN Alexandrium affine
3 Alexandrium sp 5 18S r ARN Alexandrium minutum
4 Prorocentrum sp 1 18S r ARN Prorocentrum mexicanum
5 Prorocentrum sp 3 18S r ARN Prorocentrum mexicanum
hoặc là P.micans
6 Pseudonitzschia sp’2 ITS1-5,8S- ITS2 Pseudonitzschia cf
australis
Trang 13IV Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1 Đã tách chiết và tinh sạch được ADN tổng số của 7 mẫu vi tảo độc, hại là:
Prorocentrum sp1, Prorocentrum sp3, Alexandrium sp5 , Alexandrium sp16 Alexandrium sp (C), Pseudoniszschia sp’2, Pseudonitzschia sp (G3) được phân
lập ở Đồ Sơn và Cát Bà, Hải Phòng
2 Đã thiết kế thành công cặp mồi cặp mồi Alex18F/U18R, UPro18F/U18R để
nhân đoạn gen 18 S rADN của các mẫu thuộc chi Alexandrium ,Prorocentrium và
cặp mồi PseuF/ PseuR để nhân đoạn ITS1- 5.8S- ITS2 của các mẫu tảo thuộc chi
Pseudonitzschia Sử dụng các cặp mồi nêu trên, đoạn gen 18S rADN và đoạn
ITS1- 5.8S- ITS2 có kích thước khoảng 1.1kb và 825 bp của 7 mẫu trên đã được nhân bằng kỹ thuật PCR
3 Đã tạo dòng phân tử các sản phẩm PCR của các mẫu trên bằng việc sử dụng hệ vector tách dòng pCR2.1đ-TOPOđ, tách chiết các plasmit tái tổ hợp có gắn đoạn gen đã nhân được đảm bảo chất lượng cho việc xác định trình tự nucleotit
4 Trình tự nucleotid của đoạn gen 18S rADN và đoạn ITS1- 5.8S- ITS2 của 7 mẫu vi tảo độc, hại trên đã được xác định
5 Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các mẫu vi tảo nêu trên với một số loài vi
tảo khác thuộc chi Alexandrium, Prorocentrum, Pseudonitzschia có quan hệ gần
với chúng về mặt tiến hoá đã được phân tích
6 7 mẫu vi tảo độc, hại đã được định tên dựa trên việc đọc và so sánh trình tự nucleotid của đoạn gen 18S rADN và đoạn ITS1-5,8S-ITS2 với sự hỗ trợ của các
phần mềm máy tính chuyên dụng Mẫu Alexandrium sp5 là loài A minutum , A sp16 và A.sp (C) là loài A affine Mẫu Prorocentrum sp1 được định tên là loài
Prorocentrum mexicanum; P sp3 có thể là loài Prorocentrum mexicanum hoặc
không loại trừ có thể là P.micans; mẫu Pseudonitzschia sp’2 có thể là loài
Pseudonitzschia cf australis và Pseudonitzschia sp (G3) có thể là loài Pseudonitzschia pungens
