ĐẶC ĐIỂM CỦA NIỆU BÀO ĐỒ TRONG CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA TRẺ EM

Niệu bào đồ là tiến trình thăm dò hoạt động hormon sinh dục nữ, đánh giá quá trình ngấm estrogen, trưởng thành của biểu mô tam giác bàng quang - âm đạo qua các tế bào bong ra trong nước

ĐẶC ĐIỂM CỦA NIỆU BÀO ĐỒ TRONG CÁC GIAI ĐOẠN

nữ Các nghiên cứu này đã tạo ra phương pháp phiến đồ âm đạo ( colpocytogramme) Từ đó, các nghiên cứu khác nhau ở nhiều quốc gia cho phép hoàn thiện kỹ thuật nhuộm phiến đồ âm đạo, giá trị của phương pháp này trong các trường hợp bình thường và bệnh lý Các nghiên cứu của Papanicolaou và Shorr đã tạo ra nền tảng cho phương pháp thăm dò tế bào hiện đại [13], [14]

Tuy nhiên, hoạt động của các hormon sinh dục còn gây ảnh hưởng đến các

tế bào biểu mô của các tổ chức khác như niêm mạc miệng (Ziskin và

Moulton-1948, Vincze, Talf và Liscio - 1959), môi bé (Del Castillo và Videla-1965), trực tràng ( Arcangeli và Bonofiglio-1963), đặc biệt là trong lắng cặn của nước tiểu

Các nghiên cứu đầu tiên về tế bào trong nước tiểu thuộc về các tác giả người Argentine Biot và Beltran Nunez là những người đầu tiên đã công bố nghiên cứu “ Các biến đổi tế bào trong lắng cặn của nước tiểu liên quan đến chu kỳ kinh nguyệt” khả năng áp dụng như là test chẩn đoán rụng trứng” năm 1944 Các tác giả lấy nước tiểu buổi sáng, sau khi quay ly tâm và nhuộm tế bào bằng Iod để dễ đếm, đã quan sát thấy ở phụ nữ giai đoạn trưởng thành sinh dục có sự bong tế bào phong phú liên quan đến giai đoạn rụng trứng Trái lại ở giới nam, và giới nữ giai đoạn mãn kinh không có hiện tượng trên Những năm sau đó, Biot và Beltran đã nêu các giá trị về phương diện lâm sàng của các

nghiên cứu về biến đổi tế bào nước tiểu Các tác giả đã phát triển kỹ thuật nhuộm tế bào từ kỹ thuật Shorr trong nhuộm phiến đồ âm đạo Áp dụng kỹ thuật nhuộm màu chuyên biệt này cho phép quan sát được hình thái các tế bào và phản ứng bào tương giống như trong phiến đồ âm đạo Các tác giả đã khẳng định trong nghiên cứu công bố “Các thay đổi quan sát trong tế bào cặn lắng nước tiểu tương đồng với các thay đổi tế bào trong phiến đồ âm đạo được thực hiện cùng lúc trên cùng các bệnh nhân” [27]

Các nghiên cứu của Lencioni cũng kết luận có liên quan chặt chẽ giữa các tế bào biểu mô trong nước tiểu và phiến đồ âm đạo trong đáp ứng tế bào hormon và gọi tên của phương pháp tế bào này là niệu bào đồ (urocytogramme) Niệu bào

đồ là tiến trình thăm dò hoạt động hormon sinh dục nữ, đánh giá quá trình ngấm estrogen, trưởng thành của biểu mô tam giác bàng quang - âm đạo qua các tế bào bong ra trong nước tiểu

Các tế bào trong lắng cặn nước tiểu chủ yếu từ sự bong ra của biểu mô malpigi

ở thành sau của vùng tam giác bàng quang Âm đạo và tam giác bàng quang

là các tổ chức có cùng nguồn gốc phôi thai học

Chính vì những vấn đề trên, trong chuyên đề này chúng tôi tập hợp lại một cách có hệ thống những các đặc điểm phôi thai học và tế bào học liên quan đến niệu bào đồ, giới thiệu hình ảnh của niệu bào đồ từ giai đoạn sơ sinh đến thời

kỳ dậy thì, cũng như kỹ thuật xét nghiệm niệu bào đồ, các ứng dụng của xét nghiệm tế bào này trong lĩnh vực Nội tiết Nhi khoa

II ĐẶC ĐIỂM TẾ BÀO HỌC CỦA NIỆU BÀO ĐỒ

Các tế bào trong lắng cặn nước tiểu chủ yếu có nguồn gốc từ bàng quang, tam giác bàng quang và niệu quản Niêm mạc bàng quang, niệu quản hệ thống tiết niệu được bao phủ bởi lớp tế bào biểu mô đặc hiệu gọi là biểu mô trung gian

đã được mô tả từ lâu Các nghiên cứu thực nghiệm đã xác định được mối liên quan giữa hoạt động của hormon sinh dục và biểu mô của tam giác bàng quang ở phụ nữ Estrogen hoạt động kích thích thay đổi hình thái các tế bào biểu

mô tam giác bàng quang, làm xuất hiện trong nước tiểu các tế bào keratin hóa,

có bào tương giàu glycogen Các tế bào này khác biệt rõ ràng với các tế bào biểu mô type transitionel bao phủ toàn bộ phần còn lại của hệ thống tiết niệu Raynaud (1962) đã gọi chúng là “ các tế bào tiết niệu nhạy cảm với estrogen

” Hình thái học của chúng tương tự như các tế bào niêm mạc âm đạo Chúng ta

sẽ nghiên cứu nguồn gốc phôi thai học, tế bào học của vùng tam giác bàng quang

2.1 Nguồn gốc phôi thai học của tế bào biểu mô tam giác bàng quang và tử cung - âm đạo

2.1.1 Nguồn gốc phôi học của biểu mô tam giác bàng quang

Ở phôi người vào ngày phát triển thứ 30, phần tận cùng của ruột sau được dãn rộng tạo thành một bóng rỗng được giới hạn bởi các tế bào nội bì (endoblaste) Khoang rỗng phủ bởi các tế bào nội bì (endoblaste ) này là ngã ba của hệ tiêu hóa và tiết niệu, tạo thành ổ nhớp Vào tuần thứ năm, một vách ngăn gọi là cựa niệu nang, sẽ tiến dần xuống dưới để gắn liền với màng nhớp, chia ổ nhớp

ra 2 phần: phần sau là ống hậu môn – trực tràng, phần trước là xoang niệu sinh dục Trong khi tiến xuống phía dưới, cựa niệu nang đi qua phía sau đoạn nối của ống Wolff với các túi niệu quản Ống Wolff - phát sinh từ trung bì trung gian bởi vậy có nguồn gốc trung bì, nối vào xoang niệu – sinh dục Trong quá trình phát triển sau đó, t ư thế của ống Wolff thay đổi tùy thuộc vào tiến triển của vị trí sát nhập của nó vào thành xoang niệu – sinh dục Khi phôi phát triển chiều dài đến 15mm, các ống Wolff v à niệu quản đổ vào bàng quang ở các vị trí cách xa nhau Sau đó, như sơ đồ, các ống Wolff sát nhập vào đoạn trên của niệu quản Tiến triển sau đó của xoang niệu- sinh dục phụ thuộc theo đặc điểm giới tính nam hay nữ

Do các ống Wolff và niệu quản có nguồn gốc trung bì, nên bàng quang không được bao phủ hoàn toàn bởi lá nội bì Phần bàng quang được giới hạn giữa 2 lổ niệu quản và lổ niệu đạo có nguồn gốc trung bì, tạo thành một hình tam giác, gọi là tam giác bàng quang [1],[6], [12]

2.1.2 Nguồn gốc phôi học của biểu mô tử cung– âm đạo:

Ở giai đoạn phát triển trung tính (chưa biệt hóa giới tính ), phôi thai của 2 giới ngoài ống Wolff ( đã trình bày ở trên) còn có 2 ống Muller cũng đựoc tạo ra từ

lá trung bì Trong giai đọan phát triển của bào thai nữ, những đoạn dưới của hai ống Muller sát nhập với nhau ở đường giữa, tạo thành ống tử cung – âm đạo

Ở đoạn trên ống tử cung âm đạo, vách ngăn hai ống Muller đã sát nhập nhau bị tiêu đi và đoạn này tạo ra thân - eo tử cung Ở đoạn dưới của ống tử cung âm đạo, hai thành biểu mô của hai đoạn ống Muller sát nhập với nhau tạo

ra lá biểu mô âm đạo Đoạn trên lá biểu mô âm đạo tạo ra một phần cổ tử cung, còn đoạn dưới tạo ra đoạn trên của âm đạo Chung quanh đoạn trên của lá biểu

mô âm đạo xuất hiện chỗ lồi vây quanh cổ tử cung Sự tiêu đi của biểu mô ở chỗ lồi ấy tạo ra túi cùng âm đạo

Đoạn dưới âm đạo -nối vào thành sau của xoang niệu sinh dục, được bao phủ bởi biểu mô của xoang niệu sinh dục có nguồn gốc nội bì Như vậy biểu mô âm đạo có 2 nguồn gốc: khoảng 4/5 trên biểu mô âm đạo có nguồn gốc từ củ Muller

từ lá trung bì, còn biểu mô của đoạn 1/5 dưới của âm đạo phát sinh từ xoang niệu – sinh dục có nguồn gốc nội bì Như vậy ở người nữ, tam giác bàng quang,

tử cung, túi cùng 2 bên - là nơi lấy bệnh phẩm chủ yếu khi làm phiến đồ âm đạo

và phần trên âm đạo có cùng nguồn gốc lá trung bì [1],[6],[10],[12]

Đây là cơ sở quan trọng để giải thích sự tương đồng giữa niệu bào đồ và phiến đồ

âm đạo [6], [10],[12], [18]

Các tế bào biểu mô dù ở các tổ chức khác nhau nhưng đều có đặc điểm tế bào đặc trưng tùy theo nguồn gốc phôi thai của chúng

2.2 Đặc điểm tế bào học tam giác bàng quang

2.2.1 Đặc điểm biểu mô bàng quang

Biểu mô bàng quang được xếp vào nhóm biểu mô trung gian (biểu mô lát giả tầng) Biểu mô bàng quang có thể thay đổi hình dạng theo mức độ co thắt hay dãn nở của bàng quang Lớp biểu mô này có thể chia làm 3 lớp tế bào từ màng đáy cho đến bề mặt Lớp tế bào đáy nằm trên mô liên kết có khả năng

co dãn, có cấu tạo như một màng đáy thực sự, tiếp đến là lớp tế bào trung gian có độ dày khác nhau tùy theo mức độ đầy hay rỗng của bàng quang Trên cùng, là lớp tế bào bề mặt có kích thước lớn, thường có 2 nhân, đôi khi có đa nhân, có hình dạng như chiếc ô, khác hẳn tế bào lớp dưới Lớp tế bào bề mặt tạo ra hàng rào thẩm thấu ngăn cách nước tiểu và dịch mô Chúng tạo ra một lớp màng đặc biệt được cấu tạo bởi các phó đơn vị hình lục giác đường kính

này kết hợp cùng với thể Golgi và có đặc tính hóa học đặc biệt ( thành phần chính của cầu nối lipide là cerebroside) [1],[12]

2.2.2 Biểu mô “ dạng đảo nhú” của tam giác bàng quang

Cifuentes (1947) [18] là người đầu tiên đã chống lại quan điểm cho rằng hệ

tiết niệu được bao phủ toàn bộ bởi cùng tế bào biểu mô tiết niệu Khi quan sát nội soi, ông đã mô tả những vùng đặc biệt màu trắng sữa Các đảo nhú này khác biệt rõ rệt với các phần còn lại của biểu mô tiết niệu Chúng khư trú dưới dạng các tiểu đảo lan tỏa trong tam giác bàng quang, được tạo thành bởi lớp biểu mô lát tầng và rất biến đổi một cách rất nhạy cảm dưới tác dụng kích thích nội tiết Các tiểu đảo này có nguồn gốc từ một biến dạng dị hóa khư trú dưới tác dụng của estrogen Bur (1957) nhận định rằng các tiểu đảo dạng lát trong tam giác bàng quang như lớp phủ âm đạo là vết tích của “ những cuộc tranh chấp

biểu mô” trong thời kỳ phôi thai

2.3 Đặc điểm tế bào cặn nước tiểu

Niêm mạc biểu mô hệ tiết niệu có đặc điểm bong dần ra trong nước tiểu Nước tiểu bình thường không có vi khuẩn hay hồng cầu, các tế bào viêm, chỉ có một ít bạch cầu [12]

Các thành phần tế bào chủ yếu hiện diện trong cặn nước tiểu có thể được phân loại theo mức độ quan trọng như sau:

+ Có rất nhiều tế bào biểu mô bong ra từ tam giác bàng quang

+ Tế bào nhầy

+ Bạch cầu

+ Các cặn tinh thể

+ Các tế bào của bàng quang và niệu quản

+ Các vi sinh vật như amibes, trichomonas, và các ký sinh trùng khác

2.3.1 Các tế bào tam giác bàng quang

Các tế bào biểu mô của các tiểu đảo của biểu mô lát tầng, rải rác từ vùng trung tâm tam giác bàng quang cho đến niệu quản, có các đặc tính giống như tế bào biểu mô ở âm đạo, và được tận dụng để làm niệu bào đồ Chúng gồm

+ Các tế bào cận đáy thường là các tế bào trung gian kích thước lớn hơn các tế bào đáy, có bào tương ưa base, tỷ lệ nhân/ bào tương nhỏ hơn tế bào đáy + Các tế bào trung gian, xuất phát từ lớp trung gian của biểu mô malpighi, đặc trưng bởi bào tương ưa base nhẹ và nhân có kích thước nhỏ hơn rõ rệt so với

tế bào đáy và cận đáy

+ Các tế bào bề mặt là các tế bào malpighi kích thước lớn, đa diện, có bào tương

ưa eosine và nhân đông tụ ( là những tế bào ở lớp trên cùng ) hoặc nhân có kích thước rất nhỏ ( các tế bào ở lớp sâu hơn ) Các tế bào này bong ra trong nước tiểu, các đặc điểm hình dạng được nhận diện dựa vào các đặc điểm sau:

Màu sắc của bào tương khi nhuộm màu: khi nhuộm các tế bào có bào tương

bắt màu đỏ nhạt, người ta gọi chúng là các tế bào ưa eosine (eosinophile), khi bào tương bắt màu màu xanh dương là các tế bào ưa base ( cyanophile)

Hình dạng: Các tế bào có hình đa diện là tế bào bề mặt và trung gian, các tế

bào cận đáy và tế bào đáy có dạng thuôn dài hay hình tròn

Kích thước: Các tế bào bề mặt có kích thước lớn nhất, các tế bào trung gian có

kích thước trung bình, kích thước tế bào cận đáy và tế bào đáy nhỏ dần Kích thước các tế bào tam giác bàng quang trong cặn nước tiểu trong niệu bào đồ tương đương với các tế bào ở phiến đồ âm đạo [10], [12]

Bảng 1 Kích thước của các tế bào của niệu bào đồ [27]

( So sánh với các tế bào của phiến đồ âm đạo)

S: Tế bào bề mặt ( Cellules superficielles)

I: Tế bào trung gian (Cellules intermediaires) B: Tế bào đáy ( Cellules basales)

Đặc điểm nhân tế bào: Nhân tế bào có dạng đông tụ ( pycnotique) trong các tế

bào bề mặt ưa eosine, và dạng hình cầu trong các tế bào trong các tế bào trung gian, trong các tế bào đáy nhân tế bào to, tròn chiếm gần hết bào tương Nhân dạng đông tụ, bắt màu đậm đồng nhất, đường kính nhỏ hơn 5 µ , rất dễ nhận thấy

dưới kính hiển vi quang học Chỉ số tế bào bề mặt ưa eosine có nhân đông tụ có giá trị quan trọng để đánh giá hoạt động estrogen

Bảng 2 Phân loại và đặc điểm của các tế bào niệu bào đồ [27]

2.3.3 Bạch cầu

Các tế bào bạch cầu ít gặp trong niệu bào đồ, chỉ khi có nhiễm trùng đường tiểu hay ở trẻ gái tiền dậy thì Các tế bào bạch cầu hạt, nhân đa dạng nhiều thùy Các tế bào mủ không đều, bờ không đều không nét Đường kính

từ 8 - 12µ

2.3.4 Hồng cầu

Có thể có số lượng rất ít hồng cầu trong niệu bào đồ do hoạt động kinh nguyệt hoặc tổn thương viêm ở ống niệu – sinh dục Đó là các tế bào dạng đĩa, tròn, hai mặt lõm nếu nhìn nghiêng Tế bào không nhân, đường kính 4-7 µ

2.3.5.Các tinh thể

Các dạng khác nhau của tinh thể có thể được quan sát thấy tùy theo thói quen ăn uống Các tinh thể thường gặp là tinh thể của axit uric, oxalat calcium, phosphat calcium, bilirubin…

2.3.6 Các tế bào ngoài tam giác bàng quang

+ Các tế bào bàng quang lớp đáy có kích thước nhỏ, hình thuôn dài, các tế bào bề mặt gọi là các tế bào hình cây dù, kích thước lớn, thường có hai nhân hay nhiều nhân, chúng không có hiện tượng phân chia bề mặt với đặc tính ưa eosine hay nhân đông đặc trưng của các biểu mô tầng nhạy cảm với sự kích thích hormon

+ Các tế bào niệu quản thường bong ra với với số lượng hạn chế

+ Các tế bào niệu đạo luôn có dạng kích thước nhỏ

2.3.7 Amibes, trichomonas, và các ký sinh trùng khác

Rất hiêm khi quan sát thấy amibe trong cặn nước tiểu Y văn ghi nhận có 2 trường hợp, có dạng hình tròn hay bầu dục, kích thước từ 15- 60µ lớn hơn các

tế bào trung gian và tế bào đáy, bào tương có tính cyanose yếu, các hạt bên trong

có màu vàng cam, có thể có các hồng cầu đang bị thực bào, có thể di động

2.4 Các đặc điểm chung của quá trình bong tế bào

Dưới tác động của estrogen và progesteron các tiểu đảo biểu mô lát tầng của tam giác bàng quang có một quá trình tăng sinh và biệt hóa, rồi bong tróc ra nước tiểu Đặc tính bong tróc này là cơ sở của niệu bào đồ, nhờ đó mà chúng

ta mới phân tách được tế bào từ nước tiểu

Quá trình bong tế bào bao gồm tất cả các thành phần tế bào mà chúng tôi đã

mô tả ở trên (2.3.1), với số lượng nhất định có thể xác định các đặc điểm số lượng và chất lượng của tế bào tùy theo phương cách đánh giá

Có 2 phương cách:

- Tổng số toàn bộ các tế bào bong tróc

- Tỷ lệ phần trăm các thành phần tế bào ở các dạng khác nhau

Đánh giá mức độ phong phú của tế bào bong ra là một trong những yếu tố quan trọng trong phương pháp chẩn đoán tế bào – hormon

Thời điểm mà buồng trứng hoạt động thấp nhất ( giai đoạn tiền dậy thì) mật

độ tế bào rất nghèo nàn, ngược lại khi hoạt động của estrogen bình thường hay tăng cao, tế bào bong ra rất phong phú

Phương cách bong tế bào : Hình ảnh tế bào có thể có liên hệ với phương thức bong tróc tế bào Các tế bào có thể đơn lẻ, hay từng nhóm, từng đám, từng mảng, tương tự hình ảnh của phiến đồ âm đạo dưới tác dụng của estrogen trong chu kỳ kinh nguyệt Hiện diện của các tế bào riêng lẻ là chỉ số của hoạt động

estrogen trong pha kích thích trứng của chu kỳ kinh hay trong khi điều trị estrogen Trái lại, hình ảnh tế bào tụ thành nhóm là hiện tượng sau rụng trứng Sau rụng trứng là thời kỳ loại bỏ tế bào, các tế bào bong ra từng đám, từng mảng với số lượng nhiều và dễ nhận thấy nhất

QUẢ NIỆU BÀO Đ

Niệu bào đồ là quá trình thăm dò hoạt động của hormon sinh dục trên cơ sở đánh giá số lượng và chất lượng các dạng tế bào khác nhau có trong cặn nước tiểu, được nhận diện bằng các thuốc nhuộm tế bào khác nhau Các tế bào biểu

mô này bong ra từ các tiểu đảo biểu mô lát tầng của tam giác bàng quang - (Lencioni 1953) [27]

Do đặc điểm các tế bào biểu mô tam giác bàng quang bong ra trong môi trường dịch lỏng ( nước tiểu) không có chất nào tạo thuận lợi cho sự kết dính tế bào, hơn nữa nước tiểu là môi trường rất dễ gây thối rửa, nên có rất nhiều vấn

đề về kỹ thuật để thực hiện niệu bào đồ Trong phần này chúng tôi sẽ trình bày một số kỹ thuật và phương pháp đã được áp dụng với các lợi điểm và bất lợi cũng như phương pháp đang sử dụng hiện nay

3.1.Nguyên tắc kỹ thuật [2],[7],[8], [13],[14],[19],[23],[24],[27],[30] Các kỹ

thuật niệu bào đồ được phân tích theo các bước chuẩn bị như sau

- Kỹ thuật phân tách tế bào trong nước tiểu

- Rửa bệnh phẩm

- Kỹ thuật cố định và làm khô

- Kỹ thuật nhuộm màu

3.1.1.Kỹ thuật phân tách tế bào trong nước tiểu

Để phân tách tế bào đường dẫn tiểu từ trong môi trường dịch lỏng, người ta

đã áp dụng các kỹ thuật sau

- Lọc nước tiểu

- Ly tâm nước tiểu

- Làm khô nước tiểu

- Kỹ thuật hút

- Sử dụng phin lọc “ Millipore ”

3.1.1.1 Kỹ thuật lọc nước tiểu

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc lọc nước tiểu bằng giấy lọc lót trong một đáy phễu Các chất giữ lại trên giấy lọc sẽ được lấy ra và phết lên lam kính Phương pháp này được Del Castillo, Argonz và Galli Mainini áp dụng ( 1946-1948), chỉ có giá trị khi có hoạt động kích thích của estrogen, trong các trường hợp thiếu estrogen tế bào thu nhận được rất ít Hơn nữa, các sợi xơ của giấy lọc, các chất nhầy, các chất tinh thể lắng đọng trong nước tiểu thường gây khó khăn khi đọc tiêu bản

3.1.1.3 Kỹ thuật làm khô

Ferrer (1948) đã sử dụng buồng thu giữ chất lắng cặn, trong đó có đặt sẵn một phiến kính, toàn bộ dụng cụ được đặt vào một phễu lót sẵn giấy lọc Các tế bào cặn lắng thu giữ trên lam kính sẽ được cố định và nhuộm màu…

3.1.1.4 Kỹ thuật hút

Galli và Abinzano ( 1956) đã dùng ống thủy tinh có đầu nối với một sonde mềm, đầu kia gắn vào một bơm tiêm Người ta gắn đầu sonde với một bấc cotton

và nhúng ống sonde vào tận đáy bình chứa nước tiểu Dùng bơm tiêm hút 5-

bào, phải làm khô bấc cotton và phết đầu bấc vào lam kính nhiều lần

3.1.1.5 Sử dụng phin lọc “ Millipore ”

Dựa trên kỹ thuật phân tách tế bào ung thư từ môi trường dịch lỏng bằng cách dùng hệ thống hút qua màng , Rosemblatt, Baechler và Volet (1967) đã áp dụng vào niệu bào đồ Kỹ thuật này dùng các phin lọc “ Millipore” có đường kính tối đa 5µ , được nối với hệ thống hút khá phức tạp gổm có bóng cao su rỗng, bơm tiêm kim loại, và hệ thống su-pap để hút dịch Khi hút nước tiểu hay các dịch lỏng cơ quan khác qua lớp phin lọc các tế bào được giữ lại để cố định và nhuộm màu.Von Haam ( 1961) và Meyer đã dùng kỹ thuật này nghiên

cứu niệu bào đồ cho 100 phụ nũ bình thường và 100 phụ nữ sẩy thai cho kết quả xuất sắc

Eckert và Patterson ( 1963) đã so sánh phương pháp ly tâm với phương pháp dùng phin “ Millipore” cho kết quả tương đương nhau Hơn nữa, trong chẩn đoán tế bào hormon, phương pháp này quá đắt và tiến hành lâu, cần có e-kip đặc biệt, dựng lam tế bào khó khăn hơn khi dùng phương pháp ly tâm Cuối cùng khi hút dịch qua lớp lọc sẽ làm tan rã các tế bào cần cho chẩn đoán tế bào –hormon ( Haour, Conti-1970 ; O’Morchoe -1970) Do vậy kỹ thuật này được dành cho chẩn đoán tế bào của ung thư trong môi trường dịch cơ thể

3.1.2 Rửa bệnh phẩm

Trong nước tiểu có nhiều chất nhầy, các tinh thể, và các yếu tố khác làm khó khăn cho quá trình đọc tiêu bản cho nên người ta đã áp dụng nhiều kỹ thuật khác nhau rửa bệnh phẩm để loại bỏ các tạp chất ( Martinez, Amegaza, Lencioni, Oberti de Viale và Alonzo – 1965) Nhiều dung dịch rửa khác nhau đã được

sử dụng như dung dịch bicarbonate, dung dịch muối đẳng trương, nước tinh khiết, dung dịch sinh lý, dung dịch Ringer lactate với các nồng độ khác nhau Theo nhiều tác giả, tốt nhất là dung dịch Ringer hòa 50% với nước, các chất nhầy giảm đáng kể, làm cho việc đọc tiêu bản ở kính hiển vi quang học dễ dàng hơn, các chỉ số tế bào ưa eosine và tế bào bề mặt không bị thay đổi

3.1.3 Kỹ thuật cố định và làm khô tiêu bản

Các tế bào sau khi đã được phân tách khỏi nước tiểu sẽ được dàn đều trên lam kính Người ta có thể sử dụng 2 kỹ thuật sau:

3.1.3.2 Làm khô tiêu bản

Thay vì nhúng tiêu bản vào dung dịch cố định, người ta có thể làm khô nó một cách tự nhiên trong không khí Với phương pháp này, trên lam kính sẽ tạo thành một lớp tế bào kết dính tốt , và tránh làm hao hụt tế bào khi nhúng lam vào dung dịch cố định Cuối cùng, để ngăn ngừa hiện tượng các tế bào ngả màu vàng cam, trước khi nhuộm cần phải xử trí tiêu bản theo phương pháp đặc

acetic

3.1.4 Kỹ thuật nhuộm màu

3.1.4.1 Kỹ thuật nhuộm màu Shorr

Thuốc nhuộm Shorr được chọn lựa sử dụng trong kỹ thuật nhuộm màu niệu bào đồ Lencioni đã thực hiện hơn 30 000 tiêu bản trong 20 năm Với kỹ thuật này, các tế bào ưa eosine bắt màu đỏ, các tế bào ưa kiềm (cyanophile) có màu xanh da trời pha lẫn màu xanh lá cây nhạt Có thể phân biệt dễ dàng hồng cầu

và bạch cầu, các cấu trúc bào tương và hạt nhân nổi bật rõ Bào tương được nhuộm bởi chất Orange G và Fast Green, còn hạt nhân được nhuộm bởi Biebrich ecarlate Ngoài ra còn có các axit phosphotungstic và phosphomolybdic

3.1.4.2 Kỹ thuật Papanicoulaou

Kỹ thuật Papanicoulaou có thể dùng được trong niệu bào đồ, tuy nhiên nó

có giá trị đặc biệt trong chẩn đoán ung thư cổ tử cung vì cho phép quan sát thấy tốt nhất các chi tiết của hạt nhân, bào tương mà các phương pháp khác không

có Trong kỹ thuật Papanicolaou hạt nhân được nhuộm bởi Hematoxylin de Harris và bào tương bắt màu của Orange G và Fast Green

Đối với niệu bào đồ, Shorr là thuốc nhuộm lý tưởng trong chẩn đoán tế bào- hormon, chỉ có thuốc nhuộm Shorr mới đánh giá được mức độ hoạt động của estrogen Trái lại, Papanicolaou cho phép thực hiện các nghiên cứu tế bào tin cậy nhất

3.1.4.3 Kỹ thuật Hematoxyline de Harris

Hematoxyline de Harris là thuốc nhuộm được sử dụng trong phiến đồ âm đạo, cho phép thấy được các chi tiết của hạt nhân Gonzales Ramos (1956) là người đầu tiên đã dùng kỹ thuật này trong niệu bào đồ Bổ sung thuốc nhuộm này là một bước tiến trong kỹ thuật niệu bào đồ, cho phép nâng cao một cách

tốt nhất việc đánh giá chỉ số nhân đông, yếu tố quan trọng trong niệu bào

đồ

3.1.5 Sơ lược giới thiệu về tiến triển của kỹ thuật nhuộm niệu bào đồ

3.1.5.1 Phương pháp của de Del Castillo, Argonz và Galli Maini (1946- 1948) và Galli Mainini (1956)

Nhuộm với thuốc nhuộm Shorr trong 3 đến 4 phút Nhúng vào cồn 95 độ trong

2 phút Rửa trong cồn 100 độ trong 2 phút Cố định với xylol [30], [31], [36], [40], [49]

3.1.5.2 Kỹ thuật của Papanicolaou (1946)

Trộn 40 ml nước tiểu với một thể tích tương đương cồn 95 độ Sau đó quay li tâm và lấy cặn nước tiểu, sử dụng cồn để tránh làm biến chất nước tiểu.[13],[14], [19]

3.1.5.3 Kỹ thuật của MacCallin, Stewart, Taylot, Whintehead (1950)

Tương tự như kỹ thuật của Papanicolaou Mẫu nước tiểu được phủ bởi một lớp ovalbumine để đạt được độ kết dính tốt nhất các tế bào trên mặt lam kính Nước tiểu được trộn theo tỷ lệ 1 :1 với cồn 95 độ, 2- 3 giờ sau được quay

li tâm với tốc độ chậm, lấy mẫu cặn nước tiểu phết lên lam đã phủ chất gắn ovalbumine Người ta cố định trong 15 phút với cồn ête, rồi nhuộm màu [13], [14], [19]

3.1.5.4 Kỹ thuật của Gonzalez Ramos (1956)

Nhuộm màu với thuốc nhuộm hematoxylin Harris trong 2 phút Rửa với nước ngọt 2 lần Đây là bước tiến lớn trong kỹ thuật nhuộm màu, nhờ sử dụng thuốc nhuộm hematoxylin và các chất cố định đặc biệt, các nhân tế bào chưa bị teo đặc có màu tím nhạt trái lại các nhân tế bào đã teo đặc tụ thành dạng chấm (pycnose) có cấu trúc đồng nhất Các tế bào bề mặt ưa axit có màu hồng đậm hay nhạt, các tế bào ưa kiềm có màu xanh da trời [13]

3.1.5.5 Phương pháp của Feo Codecido ( 1961)

Nhuộm màu với thuốc nhuộm hematoxylin của Papamiltiades trong 2 phút Nhuộm màu với thuốc nhuộm Shorr trong 1 phút Rửa với cồn isopropilique và axit acetique Để khô tiêu bản và phủ một lớp chất cố định không màu Phương pháp này được áp dụng thành công tại Ac-hen-ti- na ( 1963) [30], [31], [36], [40], [49]

3.1.5.6 Phương pháp của Lencioni ( 1967)

Lencioni đã xây dựng phương pháp thực hiện niệu bào đồ hết sức chi tiết và đã thực hiện hơn 30 000 tiêu bản trong 20 năm [13] Các tác giả khác đã cải tiến một số phương cách khác dựa trên phương pháp này

Gồm các bước sau:

- Lấy nước tiểu đầu tiên vào buổi sáng, theo tác giả có giàu tế bào nhất, cần phải

sử dụng trong vòng 5 giờ sau khi đi tiểu Tuy nhiên nhiều tác giả sử dụng nước tiểu trong ngày và nhận thấy lượng tế bào thu được phụ thuộc vào vấn

đề kỹ thuật hơn là thời điểm lấy nước tiểu Cho nước tiểu vào ống ly tâm trong

- Quay ly tâm lần nữa như bước đầu tiên

- Đổ bỏ phần dịch ở trên và úp ngược ống cho đến khi phần lắng cặn hết nhỏ giọt

- Nhỏ 3 giọt dung dịch Rinhger vào ống, lắc nhẹ cho đến khi phần cặn tan đều

- Úp ngược ống ly tâm và cho dịch nhỏ giọt theo thành ống xuống lam kính Dàn đều tiêu bản về phía trung tâm lam kính Có thể dùng pipette Pasteur để lấy hết cặn dưới đáy ống

- Để tiêu bản khô tự nhiên theo nhiệt độ không khí

- Nhúng lại tiêu bản vào nước sạch trong 10 phút, thao tác này cần thực hiện nhẹ nhàng để tế bào không bong ra

Những nơi có độ ẩm cao, không cần làm khô tiêu bản hoàn toàn và có thể

bỏ qua công đoạn nhúng nước tiêu bản

- Nhúng tiêu bản vào Hematoxyline de Harris trong 10 phút

- Rửa nhẹ nhàng tiêu bản liên tiếp trong 2 bình nước sạch khác nhau

- Nhúng tiêu bản vào dung dịch acool tuyệt đối ammonium trong nửa phút

- Rửa tiêu bản liên tiếp trong 2 bình nước khác nhau

- Nhúng tiêu bản vào alcool 30o với 2% axit acetic trong 2 phút

- Phủ dung dịch nhuộm Shorr trong 4 phút

Thời gian này có thể thay đổi, và trước khi bắt đầu sử dụng dung dịch Shorr mới cần có các thử nghiệm để xác đinh thời gian tối ưu cho công đoạn này, đôi khi thời gian này có thể tăng gấp đôi

- Rửa tiêu bản trong nước

Nếu dùng xylol cần phải rửa lam trước bằng alcool tuyệt đối

- Để tiêu bản khô tự nhiên

3.1.7.7 Phương pháp của P Haour ( 1971)

Lấy 60 ml nước tiểu vào buổi sáng Bảo quản bằng cách cho nước tiểu vào chai sạch, đổ vào 10 ml borate diphenyl thủy ngân, có thể giữ các tế bào niệu trong 1 tháng ở nhiệt độ thường

Quay li tâm nước tiểu tốc độ 2500 vòng / phút trong 5 phút Rửa cặn nước tiểu trong nước tinh khiết để loại bỏ các tế bào nhầy Phết cặn nước tiểu lên lam kính phủ một lớp ê-te hoà với cồn 90 độ theo tỷ 1/1[19]

3.1.5.8 Phương pháp nhuộm màu Harris-Shorr

Được Lecionie chỉnh lý vào năm 1967 [27] và Haour và Conti [19], áp dụng tại Pháp từ năm 1971

Bệnh nhân tự lấy 60 ml nước tiểu, tốt nhất là nước tiểu vào buổi sáng giàu tế bào nhất bảo quản nước tiểu để tránh sự hư hại các tế bào bằng 3ml cyanua thủy ngân 10% Quay ly tâm mẫu nước tiểu tốc độ 3000 vòng /phút trong 10 phút Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm Harris-Shorr

3.2 Các nghiên cứu đánh giá thuốc nhuộm màu:

Nhóm nghiên cứu của Lencioni và cộng sự đã thực hiện 30 000 tiêu bản niệu bào đồ trong 20 năm và nhận thấy thuốc nhuộm Shorr và hematoxyline Harris

có tác dụng tốt hơn các thuốc nhuộm khác đã từng được sử dụng [27], [30] Khi dùng thuốc nhuộm Shorr, các tế bào ưa axit bắt màu đỏ, các tế bào ưa kiềm bắt màu xanh tím, các cấu trúc của bào tương và hạt nhân được nhuộm nổi rõ,

có thể phân biệt dễ dàng với các hồng cầu , bạch cầu trong nước tiểu Trong

kỹ thuật Shorr, bào tương được nhuộm màu của chất vàng da cam G (orange G),

và chất Fast Green, còn hạt nhân là của Bichrich ecarlate, hơn nữa trong công thức của nó còn có axit phosphotungstique và phosphomolybdique như là những chất ăn mòn

Hematoxyline Harris là chất nhuộm màu cổ điển sử dụng trong phiến đồ âm đạo

để là nổi rõ các chi tiết của hạt nhân Gonzales Ramos [27] là người đầu tiên

sử dụng chất này trong niệu bào đồ (1956) Nhờ bổ sung hematoxyline trong kỹ thuật niệu bào đồ các chi tiết của hạt nhân được nhuộm rõ ràng giúp nhận biết dễ dàng chỉ số nhân chấm tụ màu (index pycnotique), một chỉ số quan trọng

để đọc kết quả

3.3 Các phương pháp khác

Trong y văn chúng tôi tìm được rất nhiều phương pháp thực hiện niệu bào đồ khác nhau, chủ yếu ở phương pháp phân tách tế bào, cố định, nhuộm màu Nếu như cặn nước tiểu nghèo tế bào, áp dụng phương pháp của Flanagan và Miller ( 1978), Bales ( 1981), ly tâm tế bào lại cho phép tập trung tế bào trên diện tích nhỏ nhất để phân tách tốt nhất tế bào Bales đã dùng dung dịch

(1963), Bettman và Meyer ( 1970) dùng phin lọc “ Millipore” Baechler ( 1964) lấy nước tiểu bằng sonde và dùng phin “ Millipore” Các nghiên cứu của Beyer- Boon, Voor Den Hollander ( 1978) đã so sánh các phương pháp cố định khác nhau bằng: alcool, không khí; nhuộm màu May Gründwald Giemsa, Papanicolaou, Harris - Shorr … về chất lượng và số lượng

3.3.1 Một số điểm lưu ý trong kỹ thuật niệu bào đồ

Trong quá trình thực hiện niệu bào đồ, một số điểm bất lợi chủ yếu phải lưu

ý là mẫu nước tiểu nghèo tế bào; Cặn tinh thể và nước tiểu thối rửa Các phương pháp bảo quản nước tiểu [22],[23],[24], [25]

3.3.2 Mẫu nước tiểu nghèo tế bào

Hay gặp ở trẻ nhỏ tiền dậy thì, tỷ lệ tế bào có khi không quá 5% Trong trường hợp này sau khi li tâm lần đầu, đổ bỏ phần dịch lỏng ở trên và thay bằng một lượng nước tiểu khác để li tâm lại , nhằm tăng lượng tế bào trong cặn nước tiểu

3.3.3 Cặn tinh thể và lên men thối rửa nước tiểu

Trong thực hành, nước tiểu được li tâm và dựng tiêu bản trong vòng 5 giờ sau