BÁO CÁO KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ RỦI RO NGÔ GA21 ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG VÀ ĐA DẠNG SINH HỌC

nzyme m PSPS là enzyme được biến đổi với các đặc tính nhận biết là giống với enzyme gốc trong ngô tới 99,3% - Đặc tính biểu hiện: Ngô GA21 mang đặc tính có lợi là chống chịu được thuốc t

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ RỦI RO NGÔ GA21 ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG

VÀ ĐA DẠNG SINH HỌC

Số báo cáo: SYTVN-04-2012

Tên tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Syngenta Việt Nam

Địa chỉ liên hệ: Số 16 đường 3A, Khu Công nghiệp Biên Hoà 2 Đồng Nai, Việt Nam

Website: www.syngenta.com

Biên Hòa, ngày 09 tháng 5 năm 2012

MỤC LỤC

Phần I THÔNG TIN CHUNG

1.2 Giống cây trồng biến đổi gen đăng ký khảo nghiệm 1

Phần II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN GA21

2.1 Thông tin liên quan đến gen chuyển/gen cho 3

2.1.2 Nguồn gốc vectơ sử dụng và chức năng của chúng 3

2.1.3 Nguồn DNA nhận, kích thước và chức năng của mỗi đoạn trong

vùng gắn vào hệ gen ngô (T-DNA)

5

2.2 Thông tin liên quan đến cây ngô chuyển gen GA21 5

2.2.1 Các tính trạng và đặc tính trong ngô GA21 5

2.2.2 Trình tự đoạn gen chèn vào hoặc mất đi 5

2.3.1 Mô tả về cây ngô/bắp (sinh vật nhận gen): 8

2.4 Biểu hiện protein biến đổi trong cây ngô GA21 20

2.4.1 Tính trạng, điểm khác biệt giữa ngô GA21 và ngô không chuyển

gien

20

2.4.2 Biểu hiện protein biến đổi (mEPSPS) trong cây ngô GA21 20 2.4.3 Tình hình cấp phép, sử dụng ngô GA21 trên thế giới 23 Phần III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM Ở VIỆT NAM

3.1 Kết quả khảo nghiệm đánh giá rủi ro trên thế giới đối với ngô GA21 và

protein EPSPS bị biến đổi

26

3.2 Xác định các yêu cầu cần khảo nghiệm đánh giá rủi ro ngô GA21 đối

với môi trường và đa dạng sinh học tại Việt Nam

31

3.2.1 Tính an toàn của ngô chuyển gen GA21 hay enzyme mEPSPS 32 3.2.2 Nguyên lý chung đánh giá rủi ro đối với cây trồng chuyển gen 33

3.2.3 Cơ sở lý luận cho việc đề nghị các nghiên cứu đánh giá rủi ro

cho khảo nghiệm hạn chế và diện rộng của ngô GA21 đối với môi

tường và đa dạng sinh học ở Việt Nam

35

Phần IV MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP KHẢO

NGHIỆM

4.1.4 Địa điểm và thời gian tiến hành khảo nghiệm 51

4.1.6 Chỉ tiêu theo dõi, phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 54

4.2.4 Địa điểm và thời gian tiến hành khảo nghiệm 62

5.1.1.1 Đánh giá các đặc điểm nông sinh học, hình thái của ngô

GA21 trong điều kiện canh tác tại Việt Nam

5.1.2.1 Nguy cơ trở thành dịch hại, cỏ dại xâm lấn môi trường tự nhiên

của ngô GA21 và các nguy cơ trôi gen, phát tán gen

5.1.2.4 Các tác động bất lợi khác 99

5.2.1 Kết quả so sánh đặc tính nông sinh học/nguy cơ trở thành dịch hại,

cỏ dại của ngô GA21 kháng thuốc trừ cỏ glyphosate

101

5.2.2 Kết quả đánh giá nguy cơ ảnh hưởng đến sinh vật không chủ đích

của ngô GA21

Hình 2 Diễn biến mật độ Bọ rùa bắt mồi ăn thịt trong thí nghiệm ngô

GA21 (Vụ 1 Tân Thành, Bà Rịa, 2010)

Hình 5 Diễn biến chỉ số gây hại của Rệp ngô trong thí nghiệm ngô

chuyển gen GA21 tại Hưng Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C), Đăk Lăk (D)

108

Hình 6 Diễn biến mật độ bọ rùa BMAT trong thí nghiệm ngô chuyển gen

GA21 tại Hưng Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C), Đăk Lăk (D)

112

Hình 7 Diễn biến mật độ nhện lớn BMAT trong thí nghiệm ngô GA21

tại Hưng Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C) và Đăk Lăk (D)

113

Hình 8 Diễn biến mật độ nhện lớn BMAT trong thí nghiệm ngô GA21

tại Hưng Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C), Đăk Lăk (D)

115

dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trên thế giới

Bảng 12a Thành phần loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô GA21

theo hệ thống phân loại (BRVT, vụ Hè Thu 2010 và Thu Đông 2010)

81

Bảng 12b Số lượng các loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô GA21

theo nhóm đối tượng (BRVT, vụ Hè Thu 2010 và Thu Đông 2010)

82

Bảng 13 So sánh quần thể bọ đuôi bật (Collembola) trong đất trồng ngô

chuyển gen GA21 và ngô không chuyển gen (Tân Thành, Bà Rịa,

vụ Hè Thu 2010 và Thu Đông 2010)

86

Bảng 14 So sánh tỷ lệ loài ưu thế (bọ đuôi bật Collembola) trong đất trồng

ngô GA21 và không chuyển gen (Tân Thành, Bà Rịa, vụ Hè Thu

2010 và Thu Đông 2010)

87

Bảng 15 Thành phần bệnh hại và tần suất bắt gặp trong thí nghiệm ngô

GA21 (Tân Thành, Bà Rịa, vụ Hè Thu 2010 và Thu Đông 2010)

88

Bảng 16 Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô

GA21 tại 70-75 NSG (Tân Thành, Bà Rịa, vụ Hè Thu 2010 và Thu Đông 2010)

89

Bảng 17 Ảnh hưởng của phun Glyphosate đến sinh trưởng, phát triển của

cây ngô(Tân Thành, Bà Rịa, 2010)

90

Bảng 18 Hiệu lực quản lý cỏ dại của giống chuyển gen GA21 kháng thuốc

trừ cỏ

90

Bảng 19 Một số đặc tính nông học của các giống ngô GA21 và NK66 trong

khảo nghiệm diện rộng tại Hưng Yên, Sơn La, BRVT và Đăk Lăk

102

Bảng 20 Một số đặc điểm hình thái của các giống ngô GA21 và NK66 trong

khảo nghiệm diện rộng tại Hưng Yên, Sơn La, BRVT và Đăk Lăk

104

Bảng 21a Thành phần loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô chuyển

gen GA21 theo hệ thống phân loại

106

Bảng 21b Số lượng các loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô chuyển

gen NK66GA21 theo nhóm đối tượng

106

Bảng 22 So sánh một số chỉ số định lượng của Collembola trên đất trồng ngô

GA21 và NK66 trong khảo nghiệm diện rộng, 2011

117

Bảng 23 Thành phần loài Collembola ưu thế trên đất trồng ngô GA211 và

NK66

119

Bảng 24a Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô

chuyển gen NK66GA21 tại Hưng Yên và Sơn La

121

Bảng 24b Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô

chuyển gen GA21 tại BRVT và Đăk Lăk

122

Bảng 25 Khả năng kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate của ngô NK66GA21trong

khảo nghiệm diện rộng tại Hưng Yên, Sơn La, BRVT và Đăk Lăk

Phần I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tổ chức đăng ký khảo nghiệm

Tên Tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Syngenta Việt Nam

Địa chỉ liên hệ: Số 16 đường 3A, khu Công nghiệp Biên H a 2, Đồng Nai, Việt Nam Điện thoại: 0618826026 Fax: 0618826015

E-mail: Website: www.syngenta.com

Người và địa chỉ liên lạc tại Việt Nam:

Đại diện: Ông Shane Emms

Chức vụ: Tổng Giám đốc

Địa chỉ liên hệ: Văn ph ng đại diện Công ty TNHH Syngenta tại TP Hồ Chí Minh

Tầng 11 Toà nhà Đại Minh, 77 Hoàng Văn Thái, Phường Tân Phú, Quận 7, TP Hồ Chí Minh

Điện thoại: (08) 54318900 Fax: (08) 54318898

Email: shane.emms@syngenta.com Website: www.syngenta.com

1.2 Giống cây trồng biến đổi gen đăng ký khảo nghiệm

- Cây trồng chuyển gen khảo nghiệm: Ngô/Bắp (Zea May L.), thuộc chi Maydeae, họ

hoà thảo (Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm (Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia)

- Sự kiện chuyển gen: GA21, có gen biến đổi 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate

synthase (mepsps) là từ enzyme EPSPS từ ngô được biến đổi, enzyme này là

enzyme phổ biến có trong thực vật và vi sinh vật nhưng không xuất hiện ở động vật nzyme m PSPS là enzyme được biến đổi với các đặc tính nhận biết là giống với enzyme gốc trong ngô tới 99,3%

- Đặc tính biểu hiện: Ngô GA21 mang đặc tính có lợi là chống chịu được thuốc trừ

cỏ chứa hoạt chất glyphosate, với tính năng sử dụng linh hoạt khi chúng ta có thể phun thuốc trừ cỏ glyphosate trùm lên cây ngô GA21 trong khoảng 16 đến 40 ngày sau gieo hoặc trước khi khép tán (tùy vào mùa vụ và giống ngô) Sau khi phun cỏ

sẽ chết còn cây ngô mang sự kiện GA21 v n sống và sinh trưởng bình thường

- Giống nền sử dụng: NK66, là giống đã được thương mại hóa tại Việt Nam năm

2006

1.3 Đơn vị khảo nghiệm

Theo quyết định số 252/QĐ-BNN-KHCN, v/v Chỉ định Tổ chức khảo nghiệm đánh giá rủi

ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của giống cây trồng chuyển gen, Công ty Trách nhiệm Hữu Hạn Syngenta Việt Nam đã chọn Viện Di Truyền Nông nghiệp, Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Nam Bộ và Viện Bảo vệ Thực vật là các đơn vị thực hiện khảo nghiệm đánh giá tác động của ngô chuyển gen GA21 đối với môi trường và đa dạng sinh học ở Việt Nam

Viện Di truyền Nông nghiệp- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Đại diện: PGS.TS Lê Huy Hàm

Chức vụ: Viện trưởng, Viện Di truyền Nông nghiệp

Địa chỉ: Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam

Điện thoại: 84 4 8386734; Fax: 84 4 7543196

E-mail: LHHAM@agi.ac.vn Website: http:// www.agi.gov.vn

 Viện Bảo vệ thực vật

Đại diện: Tiến sĩ Ngô Vĩnh Viễn

Chức vụ: Viện Trưởng

Địa chỉ: Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội

Điện thoại: + 84 4 38389724 Fax: +84 4 38363563

Email: nipp-khkh@hn.vnn.vn

 Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Nam Bộ Đại diện: ThS Nguyễn Quốc Lý

Chức vụ: Giám đốc

Địa chỉ: 135A Paster, Quận 3, Hồ Chí Minh

Điện thoại: + 84 838229085 Fax: + 84 838229086

Email: lynguyen39@hotmail.com

1.4 Giấy phép khảo nghiệm

1.4.1 Khảo nghiệm hạn chế

Thực hiện theo quyết định số 773/QĐ/BNN-KHCN quyết định V/v “Khảo nghiệm hạn chế đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của cây ngô chuyển gen” do Bộ trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ký ngày 29 tháng 03 năm 2010

1.4.2 Khảo nghiệm diện rộng

Thực hiện theo quyết định số 403/QĐ/BNN-KHCN quyết định V/v “Công nhận kết quả khảo nghiệm hạn chế và cấp phép khảo nghiệm diện rộng đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của cây ngô chuyển gen” do Thứ trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ký ngày 07 tháng 03 năm 2011

Phần II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN GA21

2.1 Thông tin liên quan đến gen chuyển/gen cho

2.1.1 Phương pháp chuyển gen

Ngô GA21 được tạo ra qua phương pháp bắn gen, sử dụng các tế bào huyền phù làm

mô đích bắn Điều này được mô tả trong bằng sáng chế quốc tế PCT/VS98/06640 (trang 75-77, Spencer và cs., 1998a)

2.1.2 Nguồn gốc vectơ sử dụng và chức năng của chúng

Plasmid pDPG434 được sử dụng để tạo ra dòng ngô GA21 qua biến nạp bằng súng bắn gen (Spencer và CS., 1998a,b) Plasmid có nguồn gốc từ vectơ pSK, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và có nguồn gốc từ PUC19 (Short và CS., 1988) Bản đồ

vectơ của pDPG434 được chỉ ra trong Hình I Đoạn giới hạn NotI chứa cassette biểu

hiện được sử dụng để biến nạp gen Các thành phần được chỉ ra trong Bảng 1 và 2 dưới

đây nêu rõ nguồn gốc của chúng Đoạn giới hạn NotI chứa cassette biểu hiện gen 5’ -

enolpyruvylshikimate-3 Phosphate Synthase cải biến (mepsps) nhưng không chứa đoạn

cho khởi động sao mã, gen bla hoặc trình tự gen lacZ

Hình I: Bản đồ plasmid của vectơ biến nạp pDP434

Bảng 1 Các thành phần trong vùng backbone của vectơ

Thành phần

của vectơ

Mô tả

LacZ Trình tự gen mã hóa cho lacI, promoter plac và trình tự gen mã hóa cho

protein -galactosidase hoặc các protein LacZ (Yanisch - Perron và CS., 1985)

Bla Gen -lactamase dạng TEM từ Plasmid pBR322 của E.coli có tác dụng

kháng ampicillin và các penicillin khác (Sutcliffe, 1978) Gen được điều khiển bởi promoter của chính vi khuẩn

ColE1 ori Khởi đầu sao mã DNA từ plasmid PUC19 của E.coli (Yanisch - Perron và

intron của lúa

Vùng đầu 5’ của gen actin 1 của lúa chứa promoter, exon thứ nhất và intron (Mc Elroy và CS., 1990) Nó được mô tả là “Act promoter + intron” trong vector được chỉ ra ở Hình I

Đoạn peptide vận

chuyển tối ưu

Trình tự peptide vận chuyển tối ưu đầu N được xây dựng trên cơ

sở trình tự peptide từ gen ribulose -1,5- bis phosphate carboxylase oxygenase (Rubis co) từ ngô và hoa hướng dương (Le Brun và CS., 1996) Đoạn này được mô tả là “mSSU (CTP) và SSSU (CTP)” trong vectơ được chỉ ra trong Hình I

Gen epsps cải biến

của ngô GA21

Gen epsps của ngô dạng dại (ngân hàng gen số X63374) chứa các

trình tự đột biến tại vị trí axít amin thứ 102 (threonine tới isoleucine) và 106 (proline tới serine) Đoạn gen này được mô tả

là “m PSPdm” trong vectơ được chỉ ra ở Hình I

Đoạn kết thúc Nos 3’ Vùng không được dịch mã 3’ từ gen tổng hợp nopaline từ

Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984)

2.1.3 Nguồn DNA nhận, kích thước và chức năng của mỗi đoạn trong vùng gắn vào hệ gen ngô (T-DNA)

Các yếu tố dự tính để chèn vào hệ gen ngô được nằm trong vùng đoạn cắt giới hạn Not1

của plasmid pDPG434 được chỉ ra trong Hình I Đoạn giới hạn này được sử dụng trong quá trình biến nạp Nguồn và kích thước của mỗi vùng được chỉ ra trong Bảng 2 ở trên Kích thước và chức năng của mỗi vùng được nêu rõ trong Bảng 3

Bảng 3 Kích thước và chức năng của mỗi vùng trong đoạn T-DNA

intron của lúa

1,4 Tạo ra biểu hiện của gen mepsps ở ngô Đoạn này

được mô tả là “Act promoter + intron” trong vectơ pDPG434, Hình I

Peptide có chức

năng vận chuyển

(transit peptide)

0,4 Hướng protein mEPSPS chuyển tới lục lạp (Le Brun

và CS., 1996) Đoạn này được mô tả là “mssu (CTP)

và sssu (CTP)” trong vectơ pDPG434, Hình I

Gen epsps cải

biến (mepsps) của

cây ngô

1,3 Gen mã hóa cho protein EPSPS ở cây ngô biến đổi

gen, chống chịu glyphosate Đoạn này được mô tả là

2.2 Thông tin liên quan đến cây ngô chuyển gen GA21

2.2.1 Các tính trạng và đặc tính trong ngô GA21

Ngô GA21 là ngô biến đổi gen biểu thị enzym mEPSPS EPSPS là một enzym quan trọng trong con đường axit shikimic liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các axit amin thơm (phenylalamine, tyrosine, tryptophan) và được tìm thấy trong tự nhiên ở tất cả thực vật, nấm, vi khuẩn nhưng không có trong động vật EPSPS rất nhậy cảm với chế phẩm

thuốc diệt cỏ chứa glyphosate, cây ngô được biến nạp với gen biến đổi mepsps (GA21)

có khả năng tổng hợp protein mEPSPS để chống chịu sự gây hại của thuốc diệt cỏ chứa hoạt chất glyphosate (Spencer và CS., 2000; Le Brun và CS., 2003) Đột biến gen này được đưa vào cây, tạo ra khả năng chống chịu chế phẩm thuốc trừ cỏ chứa glyphosate,

vì có 2 vị trí thay đổi riêng biệt so với protein EPSPS của ngô dạng dại (ngô không biến đổi gen) Sự thay đổi này tại vị trí axit amin 102 (threonine thành isoleucine) và

106 (proline thành serine)

2.2.2 Trình tự đoạn gen chèn vào hoặc mất đi

a) Số bản sao của tất cả các đoạn T-DNA hợp nhất vào hệ gen ngô

Đoạn gen mepsps được chèn vào ngô GA21 dạng đầy đủ và các vùng xung quanh gen

mepsps hợp nhất vào hệ gen ngô được xác định trình tự Phân tích trình tự đoạn DNA

trong ngô GA21 cho thấy đoạn này gồm có 6 vùng liên tục có nguồn gốc từ đoạn cắt

giới hạn NotI dài 3,49kb từ plasmid pDPG343 có mặt trong các cây ngô GA21 (số bản

sao 1-6) Bản sao 1 chứa promoter actin của lúa (khuyết 696 bp), exon thứ nhất của gen

actin và intron, peptit vận chuyển tối ưu, gen mepsps và đoạn kết thúc NOS Bản sao 2,

3 và 4 là các bản sao nguyên vẹn của đoạn giới hạn NotI dài 3,49kb từ plasmid

pDPG434 Bản sao 5 chứa promoter actin nguyên vẹn của lúa, exon thứ nhất và intron

của gen actin, peptide vận chuyển tối ưu, đoạn 288 bp đầu tiên của gen mepsps, kết

thúc tại một codon dừng và không chứa đoạn kết thúc NOS Bản sao 6 chứa promoter actin của lúa và đoạn đầu exon thứ nhất của gen actin; nó không chứa các yếu tố nào khác từ plasmid pDPG434

Sự thay đổi tại cặp base đơn được thông báo trong đoạn kết thúc NOS ở Bản sao 1 và 2 Nucleotit tại vùng này trong Bản sao 1, 2 là “C” trong khi ở Bản sao 3 và 4 là “G” và đây là sự thay đổi mong muốn tại vùng này Một điểm khuyết ở cặp base đơn cũng được thông báo trong promoter actin ở Bản sao 6 Promoter actin ở bản sao 6 dài 842

bp Phân tích Northern và Western được thực hiện để phát hiện ra khả năng phiên mã

của gen mepsps và dịch mã sau đó, kết quả là không phát hiện thấy các bản phiên mã hoặc protein liên quan đến gen mepsps cải tiến này

b) Vị trí của nhiễm sắc thể của đoạn T-DNA (nhân, lục nạp, ty thể) và các phương pháp để xác định

Kiểu di truyền của đoạn T-DNA mang gen chuyển có nguồn gốc từ pDPG434 ở ngô chuyển gen GA21 được nhận điện bằng các phân tích, các kết quả đã chỉ ra rằng gen này gắn vào nhiễm sắc thể trong nhân

c) Tổ chức vật liệu di truyền đoạn T-DNA tại ví trị gắn, thông tin về trình tự của đoạn T-DNA và các vùng xung quanh đầu 3’ và 5’ đoạn T-DNA

Toàn bộ đoạn T-DNA và các vùng xung quanh đoạn T-DNA được gắn vào nhiễm sắc thể ở ngô GA21 đã được xác định trình tự, tổ chức của vật liệu di truyền đoạn T-DNA tại vị trí gắn được mô tả trong Mục 2.2.2/a phần II ở trên Trình tự DNA vùng xung quanh đoạn T-DNA hợp nhất vào hệ gen ngô cũng được nhận biết và được mô tả dưới đây:

Số liệu về trình tự vùng 5’: Đoạn gen chèn trong ngô GA21 nằm ở phần đầu 5’ đoạn

T-DNA được xác định trong trình tự DNA EcoRV dài 20,5 kb của hệ gen Phân tích

Blast đoạn chèn này cho thấy sự tương đồng của nó với DNA lục lạp ngô (số accession X86563.2) Sự hiện diện trình tự của bộ phận tế bào trong hệ gen nhân chỉ được phát hiện ở dòng ngô GA21 mà chưa được phát hiện ở các loài cây không biến đổi gen kể cả ngô (Figueroa và CS., 1999a, b; Fukuchi và CS., 1991; Goff và CS., 2002; Kemble và CS., 1983)

Sàng lọc in silico đối với đoạn khung đọc mở (ORFs) tại vị trí gắn giữa hệ gen ngô và

đoạn T-DNA đã được thực hiện Đánh giá này xác định đoạn ORF được bắt đầu với bộ

ba ATG và kết thúc với một trong các bộ ba dừng (TAG, TAA hoặc TGA) với kích thước nhỏ nhất của 50 axit amin Hai ORFs đã được nhận biết tại đầu 5’ của đoạn T-DNA trong hệ gen ngô Một ORF có nguồn gốc ở đoạn đầu 5’ của hệ gen ngô và tiếp tục vào trong đoạn T-DNA của ngô GA21 OFR thứ hai có 17 axit amin đầu tiên tương

ứng với protein phát sinh cytochrom C (số accession CAA60348) tìm thấy trong DNA lục lạp ngô Do đó đoạn T-DNA của ngô GA21 đã làm gián đoạn ORF được nhận biết

ở giữa DNA lục lạp ngô và tạo ra protein dung hợp Sự có mặt của gen có chức năng sinh tổng hợp cytochrom C trong hệ gen lục lạp ngô GA21 sẽ bổ sung cho giải thích gián đoạn được quan sát thấy trong hệ gen nhân Bằng chứng cho biện luận này được cung cấp bởi các số đo hình thái và thành phần, kết quả cho rằng dòng ngô GA21 là tương đương với ngô không biến đổi gen Cả 2 ORF đã được kiểm tra về tính tương đồng trình tự với độc tố và chất gây dị ứng Không có ORF nào ở ngô GA21 nằm ở đầu 5’ của đoạn T-DNA giống với các protein được biết là những độc tố hoặc chất gây dị ứng

Số liệu về trình tự vùng 3’: Phân tích BLAST đoạn DNA của ngô GA21 nằm ở đầu 3’

của đoạn T-DNA hợp nhất trong hệ gen ngô cho thấy có sự tương đồng về trình tự nucleotit của ngô trong ngân hàng gen của Trung tâm thông tin công nghệ sinh học

quốc gia (NCBI) Sàng lọc in silico đối với ORF tại vị trí gắn giữa hệ gen ngô và đoạn

T-DNA chèn được thực hiện như được mô tả đối với vùng đầu 5’ của ngô GA21 Theo

mô tả này, ba ORF được nhận biết tại đầu 3’ của đoạn T-DNA Hai ORF được chứa toàn bộ trình tự đầu 3’ của đoạn T-DNA ở ngô GA21 Trong khi các ORF này gồm toàn bộ trình tự của ngô do nằm gần promoter actin tại vị trí đầu 3’ của đoạn T-DNA của ngô GA21 Một ORF khác (ORF5) có nguồn gốc từ trình tự của hệ gen ngô GA21 nằm ở phần đầu 3’ của đoạn T-DNA và đoạn tiếp theo vào trong đoạn T-DNA Các ORF được kiểm tra về sự tương đồng trình tự với các độc tố và chất gây dị ứng được biết đến, không có ORF nào trong vùng trình tự ở hệ gen ngô nằm ở phần đầu 3’ của đoạn T-DNA tương đồng với các protein được biết là các độc tố hoặc chất gây dị ứng

2.3 Sinh vật nhận gen

2.3.1 Mô tả về cây ngô/bắp (sinh vật nhận gen):

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái, nông sinh học của ngô

Ngô hay còn gọi là bắp có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo (Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm (Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia)

a) Nguồn gốc và phân bố:

- Ngô, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật ngữ trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vương quốc Anh để chỉ cây ngô Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay được sử dụng là corn, là từ trước đây dùng để gọi cho một loại cây lương thực, hiện nay thuật ngữ này dùng để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lương thực của người Anh điêng” Lịch

sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đưa ra nhiều giả thuyết Có giả thuyết cho là nguồn gốc cây

ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên (TCN) Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần hóa ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ teosinte hoang dại gầngiống nhất với ngô ngày nay v n còn mọc trong lưu vực sông Balsas Liên quan đến khảo cổ học, người ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngô là lương thực chính của phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc

Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu vực Caribe Với người dân bản xứ tại đây, ngô được suy tôn như bậc thần thánh và có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hưởng lớn của

nó đối với đời sống của họ

- Việc gieo trồng ngô đã lan rộng từ Mexico vào tây nam Hoa Kỳ sau đó vào đông bắc nước này cũng như đông nam Canada, làm biến đổi cảnh quan các vùng đất này do thổ dân châu Mỹ đã dọn sạch nhiều diện tích rừng và đồng cỏ để trồng ngô Ngô lan truyền sang châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ

- Ngô được đưa vào châu Âu đầu tiên ở Tây Ban Nha trong chuyến thám hiểm thứ hai của Columbus vào khoảng năm 1494 Người châu Âu đã nhận biết được giá trị của nó

và nhanh chóng phổ biến rộng rãi Vào những năm đầu của thế kỷ XVI, bằng đường thủy các tầu của Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Italia đã đưa cây ngô ra hầu hết các lục địa của thế giới cũ Năm 1517, ngô xuất hiện ở Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, Đức sau đó

là nam châu Âu và Bắc Phi Năm 1521, ngô đến Đông Ấn Độ và quần đảo Indonesia Vào khoảng năm 1575 ngô đến Trung Quốc

- Ở Việt Nam, ngô là loại cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Ngô được trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá nhiều ở miền núi Có nhiều loại ngô, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và công dụng như ngô nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, ngô tẻ (hạt màu trắng hoặc vàng), cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc hai loại là ngô đường (hạt màu vàng không đều), vị ngọt và ngô rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để ăn

- Cây ngô ở Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc Theo Lê Quý Đôn trong “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi (1662-1762), Trần Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) sang sứ nhà Thanh lấy được giống ngô đem về nước Khắp

cả hạt Sơn Tây đã dùng ngô thay cho lúa gạo Từ đó ngô được phổ biến và phát triển ra khắp đất nước Nhà nông có câu: “Được mùa chớ phụ ngô khoai”, điều đó đủ để thấy rằng, mặc dù trong những năm tháng đã có đủ lúa gạo nhưng ngô v n giữ vai trò quan trọng đối với người nông dân

- Tuy nhiên, do là một nước có truyền thống sản xuất lúa gạo, trong một thời gian dài ngô ít được chú ý mà chỉ những năm gần đây mới phát triển Cuộc cách mạng về giống

ngô lai đã góp phần phần tăng nhanh diện tích, năng suất và sản lượng ngô toàn quốc, đưa nước ta đứng vào hàng ngũ những nước trồng ngô lai tiên tiến của vùng châu Á b) Đặc tính thực vật học của ngô

Ngô (Zea mays L.) là cây nông nghiệp một lá mầm thuộc chi Zea, họ hòa thảo (Poaceae hay còn gọi là Gramineae) Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với điều kiện ngoại cảnh khác nhau Song cây ngô đều có những dặc điểm chung về hình thái, giải ph u Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt

Rễ ngô: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo Độ sâu và sự mở

rộng của rễ phụ thuộc vào giống, độ phì nhiêu và độ ẩm của đất Ngô có 3 lọai rễ chính: Rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng

Rễ mầm (còn gọi là rễ mộng, rễ tạm thời, rễ hạt): gồm có: rễ mầm sơ sinh và rễ

mầm thứ sinh

- Rễ mầm sơ sinh (rễ phôi): là cơ quan đầu tiên xuất hiện sau khi hạt ngô nảy mầm Ngô có một rễ mầm sơ sinh duy nhất Sau một thời gian ngắn xuất hiện, rễ mầm sơ sinh có thể ra nhiều lông hút và nhánh Thường thì rễ mầm sơ sinh ngừng phát triển, khô đi và biến mất sau một thời gian ngắn (sau khi ngô được 3 lá) Tuy nhiên cũng có khi rễ này tồn tại lâu hơn, đạt tới độ sâu lớn để cung cấp nước cho cây (thường gặp ở những giống chịu hạn)

- Rễ mầm thứ sinh: Rễ mầm thứ sinh c n được gọi là rễ phụ hoặc rễ mầm phụ Rễ này xuất hiện từ sau sự xuất hiện của rễ chính và có số lượng khoảng từ 3 đến 7 Tuy nhiên, đôi khi ở một số cây không xuất hiện lọai rễ này Rễ mầm thứ sinh cùng với rễ mầm sơ sinh tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nước và các chất dinh dưỡng cho cây trong khoảng thời gian 2 - 3 tuần đầu Sau đó vai tr này nhường cho hệ rễ đốt

Rễ đốt (còn gọi là rễ phụ cố định): phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng

quanh các đốt dưới mặt đất bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá Số lượng rễ đốt ở mỗi đốt của ngô từ 8 - 16 Rễ đốt ăn sâu xuống đất và có thể đạt tới 2,5m, thậm chí tới 5m, nhưng khối lượng chính của rễ đốt v n là ở lớp đất phía trên Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây ngô

Rễ chân kiềng (còn gọi là là rễ neo hay rễ chống): mọc quanh các đốt sát mặt

đất Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt đất Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nước và thức ăn

c) Thân ngô

- Thân ngô đặc và khá chắc, có đường kính từ 2-4 cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc Chiều cao của thân ngô khoảng 1,5-4 m Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm Từ các đốt dưới đất của thân chính có thể phát sinh ra từ 1-10 nhánh (thân phụ) với hình dáng tương tự như thân chính

- Thân ngô trưởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Số lóng và chiều dài lóng là chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại các giống ngô Thường các giống ng8a1n ngày (thân cao 1,2-1,5 m) có khoàng 14-15 lóng; các giống trung ngày (thân cao 1,8-2,0 m) có 18-20 lóng; các giống dài ngày (thân cao từ 2,0-2,5 m) khoảng 20-22 lóng Nhưng không phải lóng nào cũng có bắp Lóng mang bắp có một sãnh dọc cho phép bắp bám và phát triển bình thường

d) Lá ngô

Căn cứ vào vị trí trên thân và hình thái có thể chia lá ngô làm 4 loại:

- Lá mầm: Là lá đầu tiên khi cây còn nhỏ, chưa phân biệt được phiến lá với vỏ bọc

đó chiều dài của lá lại giảm dần

- Thìa lìa: Là phần nằm giữa bẹ lá và phiến lá, gần sát với thân cây Tuy nhiên, không phải giống ngô nào cũng có thìa lìa; ở những giống không có thìa lìa, lá ngô gần như thẳng đứng, ôm lấy thân

Số lượng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau Số lá là đặc điểm khá ổn định ở ngô, có quan hệ chặt với số đốt

và thời gian sinh trưởng Những giống ngô ngắn ngày thường có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình: 18 - 20 lá, giống ngô dài ngày thường có trên 20 lá

e) Bông cờ và bắp ngô

Ngô là loài cây có hoa khác tính cùng gốc Hai cơ quan sinh sản: đực (bông cờ) và cái (bắp) nằm ở những vị trí khác nhau trên cùng một cây

Bông cờ (hoa đực): Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều

nhánh Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié Các gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh Mỗi bông nhỏ có cuống ngắn và hai vỏ nâu hình bầu dục trên vỏ trấu (mày ngoài và mày trong) có gân và lông tơ Trong mỗi bông nhỏ

có hai hoa: một hoa cuống dài và một hoa cuống ngắn Một bông nhỏ có thể có một hoặc

ba hoa Ở mỗi hoa có thể thấy dấu vết thoái hoá và vết tích của nhụy hoa cái, quanh đó có

ba chỉ đực mang ba nhị đực và hai mày cực nhỏ gọi là vẩy tương ứng với tràng hoa Bao quanh các bộ phận của một hoa có hai mày nhỏ - mày ngoài tương ứng với lá bắc hoa và mày trong tương ứng với lá đài hoa

Bắp ngô (hoa cái): Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi

khoảng giữa thân mới tạo thành bắp Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn, mỗi đốt trên cuống có một lá bi bao bọc Trên trục đính hoa cái (cùi, lõi ngô), hoa mọc từng đôi bông nhỏ Mỗi bông có hai hoa, nhưng chỉ có một hoa tạo thành hạt, còn một hoa thoái hóa Phía ngoài hoa có hai mày (mày ngoài và mày trong) Ngay sau mày ngoài là dấu vết của nhị đực và hoa cái thứ hai thoái hoá; chính giữa là bầu hoa, trên bầu hoa có núm và vòi nhụy vươn dài thành râu Râu ngô thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục

và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng Trên râu có nhiều lông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nảy mầm

f) Hạt ngô

Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt và bao lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng Nội nhũ có 2 phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy vào chủng ngô, giống ngô

Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ

và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm

Các hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm, chứa khoảng 200 - 400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng

2.3.1.2 Đặc tính sinh sản của ngô

a) Chu kỳ phát triển ngô

Thời gian sinh trưởng của cây ngô dài, ngắn khác nhau phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh Trung bình thời gian sinh trưởng từ khi gieo đến khi chín là 90 - 160 ngày Sự phát triển của cây ngô chia ra làm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng: Từ khi gieo đến khi xuất hiện nhị cái

- Giai đoạn sinh trưởng sinh thực: Bắt đầu với việc thụ tinh của hoa cái cho đến khi hạt chín hoàn toàn Có nhiều ý kiến khác nhau về thời gian sinh trưởng phát triể của cây ngô, song có thể chia ra các thời kỳ sau: Thời kỳ nảy mầm, thời kỳ 3 - 6 lá, thời kỳ 8 - 10 lá, thời kỳ xoáy nõn, thời kỳ nở hoa và thời kỳ chin

Thời kỳ xoáy nõn: Vào giai đoạn cây được 12 lá, số noãn (hạt thế năng) trên mỗi bắp và

độ lớn của bắp được xác định Số hàng trên bắp đã được thiết lập Các chồi bắp trên v n còn nhỏ hơn các chồi bắp dưới, nhưng đang tiến tới sát dần nhau về độ lớn Điều kiện quan trọng cần được đảm bảo ở giai đoạn này là độ ẩm và chất dinh dưỡng , sự thiếu hụt của các yếu tố này d n đến sự giảm sút nghiêm trọng số hạt tiềm năng và độ lớn của bắp Các giống ngô lai chín sớm thường có bắp nhỏ hơn nên cần được trồng với mật độ cây cao hơn giúp chúng đảm bảo được lượng hạt tương đương với các giống lai chín muộn trên cùng đơn vị diện tích

Giai đoạn cây được 15 lá là giai đoạn quyết định đến năng suất hạt Các chồi bắp phía trên vượt hơn các chồi bắp phía dưới Sau 1 - 2 ngày lại hình thành một lá mới Râu ngô bắt đầu mọc từ những bắp phía trên Ở đỉnh của bẹ lá bao quanh, một số chồi bắp trên cũng đã bắt đầu xuất hiện Đỉnh của bông cờ cũng có thể nhìn thấy (Nguồn: Viện nghiên cứu ngô) Trong giai đoạn này, sự đảm bảo đủ nước là điều kiện quan trọng nhất để có được năng suất hạt tốt Rễ chân kiềng bắt đầu mọc ra từ các đốt trên mặt đất khi cây được 18 lá Chúng giúp cây chống đổ và hút nước, chất dinh dưỡng ở những lớp đất bên trên trong giai đọan sinh thực Râu ngô mọc từ noãn đáy bắp rồi đến râu từ đỉnh bắp và tiếp tục phát triển Bắp ngô cũng phát triển nhanh chóng Cây ngô lúc này đang ở vào khoảng 1 tuần trước lúc phun râu

Thời kỳ nở hoa: Thời kỳ này bao gồm các giai đoạn: Trỗ cờ, tung phấn, phun râu, thụ tinh

và mẩy hạt

- Giai đoạn trổ cờ: Bắt đầu khi nhánh cuối cùng của bông cờ đã thấy hoàn toàn, còn râu thì chưa thấy Đây là giai đoạn trước khi cây phun râu khoảng 2 - 3 ngày Cây ngô hầu như đã đạt được độ cao nhất của nó và bắt đầu tung phấn Tùy thuộc vào giống và điều kiện bên

ngoài mà thời gian giữa tung phấn và phun râu có thể dao động khác nhau Ở điều kiện ngoài đồng, tung phấn thường xuyên xảy ra vào cuối buổi sáng và đầu buổi chiều Giai đoạn tung phấn thường kéo dài từ 1 đến 2 tuần Trong thời gian này từng sợi râu cá thể có thể phun ra để thụ tinh nếu như hạt đã phát triển Thời kỳ này bông cờ và toàn bộ lá đã hoàn thiện nên nếu gặp mưa đá thì lá sẽ rụng hết sẽ d n đến mất hoàn toàn năng suất hạt

- Giai đoạn phun râu: Giai đoạn này bắt đầu khi một vài râu ngô đã được nhìn thấy bên ngoài lá bi Khi những hạt phấn rơi được giữ lại trên những râu tươi, mới này thì quá trình thụ phấn xảy ra Hạt phấn được giữ lại cần khoảng 24 giờ để thâm nhập vào từ râu cho đến noãn - nới xảy ra thụ tinh và noãn trở thành hạt Thường thường, tất cả râu trên 1 bắp phun hết và thụ phấn hết trong khoảng 2 - 3 ngày Râu mọc khoảng 2,5 - 3,8 cm mỗi ngày và tiếp tục kéo dài đến khi được thụ tinh Noãn hay hạt ở giai đoạn phun râu hầu như hoàn toàn chìm trong các vật liệu cùi bao quanh (mày, mày dưới, lá bắc nhỏ) và ở bên ngoài có màu trắng Vật liệu bên trong của hạt biểu hiện trong và hơi lỏng Phôi hoặc mầm c n chưa thấy rõ Đây là thời gian quyết định số noãn sẽ được thụ tinh Những noãn không dược thụ tinh sẽ không cho hạt và bị thoái hóa Ở giai đoạn này cần theo dõi các loại sâu hại rễ ngô, sau ăn rau và xử lý kịp thời Nhu cầu về kali của cây đã đủ, c n đạm và lân được hút nhanh

- Quá trình thụ phấn, thụ tinh và hình thành hạt ngô: Ngô là cây giao phấn (thụ phấn chéo), sự giao phấn này được thực hiện chủ yếu nhờ gió và côn trùng Khi hoa đực chín, các mày của nó phồng lên, các chỉ nhị dài ra, bao phấn tách ra khỏi hoa và tung ra các hạt phấn hình trứng có đường kính khoảng 0,1mm Mỗi bông cờ có 2 hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có một bao phấn, mỗi bao phấn có 2 ô và trong mỗi ô có khoảng 1000 -

2500 hạt phấn Như vậy tổng cộng mỗi bông cờ cho 10 - 13 triệu hạt phấn Khi bắt đầu nở, các hoa ở 1/3 phía đỉnh trục chính tung phấn trước, sau đó theo thứ tự từ trên xuống và từ ngoài vào trong Một bông cờ trong mùa xuân, hè đủ ấm thường tung phấn trong 5 - 8 ngày; mùa lạnh, khô có thể kéo dài 10 - 12 ngày Thời gian phun râu của hoa cái thường sau tung phấn của hoa đực 1 - 5 ngày tuỳ thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, cũng có khi râu phun trước tung phấn Ở điều kiện Việt Nam, râu phun trong khoảng thời gian từ 5 - 12 ngày Trên một bắp hoa cái, gần cuống bắp phun râu trước rồi tiếp đến đỉnh bắp Trên một cây, bắp trên thường phun râu trước bắp dưới 2 - 3 ngày Hạt phấn từ bông cờ rơi trên râu ngô 5 - 6 giờ thì bắt đầu nảy mầm Ống phấn mọc dài và đi dọc theo chiều dài của râu ngô đến tận túi phôi Tế bào phát sinh trong hạt phấn phân chia nguyên nhiễm sinh ra hai tinh trùng di chuyển ra phía đầu ống phấn, khi noãn đầu ống vỡ

ra, phóng hai tinh trùng vào trong noãn, ở đây quá trình thụ tinh diễn ra

- Giai đoạn mẩy hạt (10 - 14 ngày sau phun râu): Hạt có dạng hình mẩy và bên ngoài có màu trắng Nội nhũ và chất lỏng bên trong có màu trong và có thể thấy phôi rất nhỏ Rễ mầm, bao lá mầm và lá phôi đầu tiên đã được hình thành mặc dù phôi còn phát triển chậm

Nhiều hạt đã mọc ra ngoài, các vật liệu bao quanh của cùi ở hạt và cùi đã gần như đạt tới kích thước cuối cùng Râu ngô đã hoàn thành chức năng ra hoa, đang thâm màu và bắt đầu khô Trong nội nhũ loãng của hạt bắt đầu tích luỹ tinh bột Hạt bắt đầu giai đoạn tích luỹ

chất khô nhanh, chắc và bắp đầy hạt dần Mặc dù tổng lượng đạm và lân trong cây đang

c n tích lũy nhanh, nhưng những chất dinh dưỡng này đang bắt dầu di chuyển từ các phần dinh dưỡng sang các bộ phận sinh thực Hạt có khoảng 85% độ ẩm, độ ẩm của hạt giảm dần cho đến thu hoạch

- Giai đoạn chín sáp (24 - 28 ngày sau phun râu): Tinh bột tiếp tục tích lũy bên trong nội nhũ làm chất sữa lỏng bên trong đặc lại thành bột hồ 4 lá phôi đã được hình thành Cùi tẽ hạt có màu hồng nhạt đến hồng do các vật liệu bao quanh hạt đổi màu Vào khoảng giữa giai đoạn này, bề ngang của phôi bằng quá nửa bề rộng của hạt Chất lỏng giảm dần và độ cứng của hạt tăng lên sinh ra trạng thái sáp của hạt Sau đó, những hạt dọc theo chiều dài của bắp bắt đầu có dạng răng ngựa hoặc khô ở đỉnh Lá phôi thứ 5 (cuối cùng) và các rễ mầm thứ sinh được hình thành

- Giai đoạn hình thành răng ngựa (35 - 42 ngày sau phun râu): Tuỳ theo chủng mà các hạt đang hình thành răng ngựa hoặc đã có dạng răng ngựa Cùi đã tẽ hạt có màu đỏ hoặc trắng tuỳ theo giống Hạt khô dần bắt đầu từ đỉnh và hình thành một lớp tinh bột nhỏ màu trắng cứng Lớp tinh bột này xuất hiện rất nhanh sau khi hình thành răng ngựa như một đường chạy ngang hạt Hạt càng già, lớp tinh bột càng cứng và đường vạch càng tiến về phía đáy hạt (phía cùi) Vào đầu giai đoạn này hạt có độ ẩm khoảng 55% Ở giai đoạn này, nếu gặp thời tiết lạnh, chất khô trong hạt có thể ngừng tích luỹ và lớp đen trên các hạt hình thành quá sớm Điều này d n đến sự giảm năng suất và trì hoãn công việc thu hoạch do ngô khô chậm khi gặp lạnh Để hạn chế thiệt hại do tác động của lạnh, nên chọn giống chín khoảng

3 tuần trước ngày lạnh gây tác hại đầu tiên ở mức trung bình

- Giai đoạn chín hoàn toàn - chín sinh lý (55 - 65 ngày sau phun râu): Sự tích luỹ chất khô trong hạt đạt mức tối đa và tất cả các hạt trên bắp cũng đã đạt trọng lượng khô tối đa của

nó Lớp tinh bột đã hoàn toàn tiến đến cùi và sẹo đen hoặc nâu đã hình thành Lớp đen này bắt đầu hình thành từ các hạt đỉnh bắp đến các hạt đáy bắp Hạt ngô lúc này ở thời điểm chính sinh lý và kết thúc sự phát triển Lá bi và nhiều lá không còn xanh nữa Độ ẩm của hạt ở thời gian này tuỳ thuộc vào giống và điều kiện môi trường, trung bình khoảng 30 - 35% Nếu thu hoạch ngô cho ủ chua (si-lô) thì đây là thời điểm thích hợp C n bình thường nên để ngô ở ngoài đồng một thời gian nữa, lúc cả cây ngô đã ngả màu vàng để hạt ngô đủ khô (ở ngô tẻ độ ẩm khoảng 13 - 15%) để hạt cất giữ được an toàn

2.3.1.3 Lịch sử sử dụng sinh vật nhận

a) Lịch sử được thuần hóa, trồng trọt

Ngô trồng hiện nay được tiến hóa từ chi Cỏ ngô là một nhóm các loài cỏ lớn với danh pháp khoa học Zea, được tìm thấy tại Mexico, Guatemala và Nicaragua Các loài trong chi Zea bị ấu trùng của một số loài côn trùng trong bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) phá hại,

như Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Diatraea và Chilo spp (tại châu Mỹ); còn tại Cựu thế giới là Gymnoscelis rufifasciata, Agrotis clavis, Agrotis exclamationis,

Hypercompe indecisa, Apamea sordens, Xestia c-nigrum, Agrotis segetum, Ostrinia nubilalis v.v

Các loài Cỏ ngô có thể kể ra như sau:

Zea diploperennis Zea luxurians Zea mays

Zea mays huehuetenangensis

Zea mays mays (ngô)

Zea mays mexicana Zea mays parviglumis

Zea nicaraguensis Zea perennis

Trong đó Zeamays chính là loài ngô được thuần hóa và sử dụng ngày nay

Quá trình tiến hóa của ngô: Cỏ ngô là thành phần cực kỳ quan trọng trong quá trình tiến hóa của ngô, nhưng các quan điểm về quá trình này lại rất khác nhau Theo một mô hình

tiến hóa thì ngô đã phát triển lên trực tiếp từ Zea mays parviglumis bằng chọn lựa với các đột biến quan trọng; tới 12% thành phần bộ gen của nó có từ Zea mays mexicana thông qua

trao đổi gen Mô hình khác lại cho rằng ngô dại với các tai nhỏ đã được thuần hóa, và sau

khi được phát tán từ miền đông Trung Mexico, dạng lai ghép giữa ngô dại này với Z

luxurians hoặc Z diploperennis đã tạo ra sự bùng nổ lớn trong sự đa dạng gen của ngô,

hình thái tai và lõi, khả năng thích nghi với các môi trường sống mới, cũng như năng suất cây trồng được gia tăng Mô hình thứ ba cho rằng ngô nguyên thủy là kết quả lai ghép chéo

giữa Z diploperennis và các loài cỏ trong chi Tripsacum; nhưng hỗ trợ cho giả thuyết này

là rất ít

Trong chi Zea này hiện tại người ta công nhận 5 loài cỏ ngô: Zea diploperennis, Zea

luxurians, Zea nicaraguensis, Zea perennis và Zea mays Loài cuối cùng này được chia

tiếp thành 4 phân loài là: huehuetenangensis, mexicana, parviglumis và mays, trong đó ba

phân loài đầu là cỏ ngô, c n phân loài cuối cùng là ngô, loại cây duy nhất trong chi này được con người gieo trồng làm lương thực hay thức ăn cho gia súc Chi này đôi khi cũng

được chia ra thành 2 nhánh (sectio), là nhánh Luxuriantes, bao gồm 4 loài đầu tiên, và nhánh Zea với loài duy nhất là Zea mays Nhánh thứ nhất có đặc trưng là các chỗ phồng

s m màu cấu thành từ heterochromatin ở cuối ở mỗi nhánh nhiễm sắc thể, trong khi phần

lớn các phân loài của nhánh Zea có thể có 0-3 chỗ phồng giữa mỗi đoạn cuối của nhiễm sắc thể và trung đoạn và rất ít chỗ phồng ở cuối (ngoại trừ phân loài huehuetenangensis có

nhiều chỗ phồng lớn ở cuối)

Các loài trong chi này có thể là cây một năm l n cây lâu năm Zea diploperennis và Z

perennis là cây lâu năm, trong khi các loài c n lại là cây một năm Gần như tất cả các loài

đều là lưỡng bội (n=10) với ngoại lệ là Z perennis (tứ bội (n=20)) Các loài và phân loài cỏ

ngô có thể dễ dàng phân biệt dựa trên các khác biệt về hình thái, di truyền học tế bào, protein và ADN cũng như trên cơ sở nguồn gốc địa lý, cho dù hai loài lâu năm là cùng khu

vực phân bổ và khá giống nhau Phân loài cỏ ngô khó xử nhất là Zea mays

huehuetenangensis, kết hợp các đặc trưng hình thái tương tự như của Zea mays parviglumis với nhiều chỗ phồng cuối của nhiễm sắc thể và vị trí trung gian giữa hai

nhánh Phân loài cỏ ngô khác biệt nhất về hình thái và bị đe dọa nhiều nhất là Zea mays

nicaraguensis, chỉ phát triển trong điều kiện ngập lụt dọc theo 200 mét cửa một con sông

nhỏ ở tây bắc Nicaragua

Như từ tên gọi có thể thấy, các loài/phân loài cỏ ngô tương tự như ngô ở nhiều điểm, đáng chú ý nhất là hình thái của cờ (cụm hoa đực) của chúng Điểm khác biệt đáng chú ý nhất giữa cỏ ngô và ngô là chúng có nhiều nhánh, mỗi nhánh mang các chùm hoa cái nhỏ và khác biệt Mỗi chùm hoa này khi phát triển thuần thục sẽ tạo ra một 'tai' hai cấp gồm 5-10 đoạn rời hình tam giác hay hình thang, màu đen hay nâu, mỗi đoạn chứa một hạt Mỗi hạt được che phủ bằng lớp vỏ quả rất cứng, bao gồm một quả đấu hay chỗ lõm xuống trong cuống và mày thấp và cứng Lớp vỏ này bảo vệ hạt không bị tiêu hóa trong ruột của các loài động vật nhai lại và giúp cho việc phát tán hạt khi chúng bị thải ra theo phân Hạt cỏ ngô khó nảy mầm nhưng sẽ nhanh chóng nảy mầm nếu được xử lý bằng dung dịch loãng của perôxít hiđrô

Tất cả các loài cỏ ngô Nicaragua có thể mọc trong hay rất gần với các cánh đồng trồng ngô, tạo cơ hội cho việc lai tạp giữa ngô và cỏ ngô Các thế hệ lai ghép đầu-cuối hay được tìm thấy trong các đồng ngô này, nhưng tỷ lệ trao đổi gen là khá thấp Một vài quần thể

Zea mays mexicana có hình dáng bề ngoài giống như ngô trong các cánh đồng trồng ngô,

có lẽ là kết quả của quá trình tiến hóa dưới áp lực từ việc diệt cỏ dại có chọn lọc từ phía người nông dân Tại một vài khu vực thuộc Mexico, cỏ ngô bị các nông dân chuyên trồng ngô coi là một loại cỏ dại khó tiêu diệt, trong khi tại một số khu vực khác thì người ta lại coi chúng như là cây đồng hành có ích, và khuyến khích việc chuyển gen từ cỏ ngô sang ngô của họ

Trên thực tế tất cả các quần thể cỏ ngô hiện đang ở tình trạng bị đe dọa hay nguy cấp: Zea

diploperennis tồn tại trong khu vực chỉ vài dặm vuông; Zea nicaraguensis hiện c n khoảng

6.000 cây trong khu vực 200 x 150 mét Trong những năm gần đây, chính quyền Mexico

và Nicaragua đã có một số hành động nhằm bảo vệ các quần thể cỏ ngô hoang dã, bằng

cách sử dụng các phương pháp bảo tồn in situ (tại chỗ) và ex situ (không tại chỗ) Hiện tại,

có một lượng lớn sự chú ý, quan tâm từ giới khoa học đối với các đặc trưng có ích của cỏ ngô, như khả năng kháng côn trùng, khả năng sống lâu năm và chịu ngập lụt, nhằm cải tạo các giống ngô, mặc dù điều này là cực kỳ khó khăn do nó cũng kèm theo các đặc trưng có hại của cỏ ngô

Ngô chỉ lan truyền gen tới các loài thực vật khác tương thích về sinh sản và điều này chỉ có thể xảy ra ở những nơi mà có các loài họ hàng hoang dại của ngô mọc tại đó như Mexico

và Guatemala (EEA, 2002)

Khả năng sống sót của ngô ngoài môi trường: Ngô ngày nay là một loại cây trồng đã

được thuần hóa cao và không thể tồn tại mà không có sự can thiệp của con người (Niebur, 1993) Ngô là loại cây trồng một năm, do cấu trúc đặc thù của bắp nên chúng không thể phát tán nếu như không có tác động cơ học để tách ra từ lõi và hầu như hạt ngô không có giai đoạn ngủ nghỉ Không tồn tại sự tái sinh từ các bộ phận khác của cây ở điều kiện môi trường tự nhiên

Sự sống của cây ngô phụ thuộc vào các điều kiện như nhiệt độ, độ ẩm hạt giống, kiểu gen,

sự bảo vệ của vỏ và giai đoạn phát triển Ngô không phải là loại cỏ dại tồn tại dai dẳng Hạt giống ngô chỉ có thể tồn tại dưới một phạm vi hẹp của điều kiện khí hậu Những cây tự mọc rễ ràng bị chết do lạnh, hoặc rễ ràng kiểm soát bằng các phương pháp nông học thông thường như canh tác đất và sử dụng các chất diệt cỏ chọn lọc (Niebur, 1993) Ngô không

có khả năng duy trì sinh sản nếu không có sự canh tác của con người và không xâm hại môi trường sống tự nhiên (OECD, 2003)

b) Lịch sử sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Tùy mỗi loại ngô khác nhau mà chúng được sử dụng cho các mục đích khác nhau Ngô có thể dùng trong chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, làm nguyên liệu chất đốt, nguyên liệu trong công nghiệp và làm thuốc chữa bệnh

Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người trong đó nhiều nước

sử dụng ngô là lương thực chính Khẩu phần ăn ở các nước châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống như các nước châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nước châu

Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa

Ở Việt Nam, ngô là loại lương thực quan trọng thứ 2 sau lúa gạo Hạt ngô có thể xay nhỏ nấu với gạo thành cơm hoặc chế biến thành các món ăn như xôi ngô, ngô bung, nhiều vùng miền núi thường bung ngô nếp với đậu đen ăn thay cơm, xay hạt ngô thành bột nấu bánh đúc ngô…Ngô sử dụng làm thực phẩm như ngô bao tử xào thịt, súp ngô, chè ngô, cháo ngô, ngô luộc, ngô hấp ngô rang, ngô nướng, kẹo ngô, bột dinh dưỡng ngô, rượu ngô… Ngô làm thức ăn chăn nuôi: Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành bột và chế biến làm thức ăn cho trâu b , lợn và gia cầm, chế biến

thức ăn cho cá Thân lá ngô có thể cho trâu b ăn tươi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc

Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngô: Ngô nghiền thành bột và có thể trộn theo thành phần

và tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo, khô dầu lạc, khô dầu đậu tương, bột

cá, vỏ tôm, vỏ s …để chế biến làm các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản… Giá trị dinh dưỡng của thân, lá ngô ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời vụ thu hoạch Trong 1 kg thân cây ngô có 600 - 700 g chất khô, 60 - 70 g protein, 280 - 300 g xơ

Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở nhiều vùng Giá trị dinh dưỡng thân, lá ngô c n tăng lên nếu được chế biến theo cách lên men ủ chua

2.3.2 Đặc điểm giống ngô nền (NK66)

Giống ngô NK66 là giống ngô lai đơn đã được cho phép thương mại hóa ở Việt Nam từ năm 2006 NK66 là giống quốc gia, thích nghi rộng và có thể trồng trên tất cả các vùng sinh thái và mùa vụ khác nhau Giống cho năng suất cao, ổn định và được nông dân và người tiêu dùng ưa chuộng với diện tích trồng năm 2010 vào khoảng 70000 ha/1.1 triệu ha ngô

Sau đây là một số đặc điểm nông sinh học và chế độ canh tác cho ngô NK66 ở Việt Nam:

- Thời gian sinh trưởng: 95-100 ngày

- Dạng hình cây gọn, bộ lá đứng

- Lá bi bao kín trái bắp

- Bắp to, hạt hình trụ có 14-16 hàng hạt/bắp

- Khả năng thích ứng rộng

- Cho năng suất 12-14 tấn/ha

- Sử dụng để chế biến thức ăn gia súc, gia cầm

Yêu cầu kỹ thuật trồng trọt:

- Thời vụ trồng: Trồng nhiều vụ trong năm: Vụ Xuân, Hè, vụ Đông ở Miền Bắc và các vụ ở phía nam

- Mật độ: Gieo mỗi hốc một hạt; khoảng cách trồng 70 x 25 cm hoặc 75 x 20 cm, mật

Phân chuồng 180-360 kg 250-500 kg 500-1000 kg 5000-10000 kg Đạm Urea 11-15 kg 15-20 kg 30-40 kg 300-400 kg Super Lân 15-18 kg 20-25 kg 40-50 kg 400-500 kg

- Cách bón: Bón lót toàn bộ phân chuồng và phân lân

 Thúc lần 1: lúc cây con có 3-4 lá, bón 1/3 lượng Urea +1/3 lượng kali

 Thúc lần 2: Lúc cây 7-9 lá, bón 1/3 lượng Urea + 1/3 lượng Kali

 Thúc lần 3: lúc cây xoắn ngọn, trước trổ cờ 3-5 ngày, bón hết lượng phân còn lại

- Phòng trừ sâu bệnh:

 Phòng sâu xám: xử lý hạt giống bằng Cruiser Plus 321.5 FS trước khi gieo

 Phòng trừ bệnh khô vằn: dùng thuốc Anvil 5 SC

Thu Hoạch: Thu hoạch như các giống ngô thông thường khác

2.4 Biểu hiện protein biến đổi trong cây ngô GA21

2.4.1 Tính trạng, điểm khác biệt giữa ngô GA21 và ngô không chuyển gien

Để đánh giá các tính trạng nông học, các giống ngô mang sự kiện GA21 được khảo nghiệm bởi Syngenta ở 8 vùng, 3 bang trong năm 2004 tại Hoa Kỳ Có tới 20 tính trạng khác nhau được đánh giá mặc dù không phải tất cả các tính trạng được ghi nhận trong tất cả các vùng Hai dòng ngô lai GA21 thương mại và các dòng ngô lai không biến đổi gen có kiểu gen tương đồng được so sánh Hầu hết các tính trạng nông học được đánh giá không có sự khác nhau đáng kể về thống kê giữa các dòng ngô lai có nguồn gốc GA21 và ngô lai đối chứng không biến đổi gen cùng dòng

Khảo nghiệm đánh giá các bệnh phổ biến trên ngô cũng được tiến hành năm 2004 tại Hoa Kỳ về khả năng nhạy cảm bệnh của các d ng ngô lai GA21 và d ng đối chứng

không biến đổi gen cùng dòng với tác nhân nấm gây tàn lụi lá ngô (Helminthosporiunm

maydis) và đốm lá nấm (Cercosspora zeae - maydis) được đánh giá Không có dấu hiệu

nào khác nhau về khả năng nhậy với bệnh hại giữa ngô lai truyền thống và ngô lai nguồn gốc GA21

Như vậy, trong lĩnh vực canh tác các đặc tính nông sinh học của ngô chuyển gen GA21

là tương tự như ngô không chuyển gen cùng dòng/giống, đặc điểm duy nhất có thể phân biệt là khi phun thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất Glyphosate thì ngô chuyển gen GA21

v n sinh trưởng và phát triển bình thường trong khi ngô không chuyển gen sẽ bị chết hoàn toàn sau khi phun Glyphosate từ 5 đến 7 ngày

2.4.2 Biểu hiện protein biến đổi (mEPSPS) trong cây ngô GA21

Như đã trình bày ở trên, sự khác biệt của ngô GA21 với ngô cùng dòng không chuyển gen

là sự có mặt của enzyme biến đổi mEPSPS là gen lấy từ ngân hàng gen của ngô dạng dại được công nhận là protein có đặc tính an toàn, khi ngô GA21 có mặt của gen này thì

protein này có khả năng sinh ra để chống lại sự gây hại từ thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất Glyphosate, do vậy sự biểu hiện tính trạng của gen được chuyển trong ngô GA21 chính là tính chống thuốc cỏ trừ cỏ không chọn lọc gốc glyphosate và là biểu hiện của enzyme hay protein mEPSPS

Bảng 4: Nồng độ m PSPS trên m u đo c n tươi trên c y nhận được từ ngô GA21

Mô

Nguyên

sinh chất 1

Giai đoạn phát triển

Ra lá Nở hoa Hạt chín Cây già

Phạm vi trung bình m PSPS μg/g gam chất tươi +/- S.D.2

Lá

115TT-189 11,98 +/- 1,70

(10,44 – 14,53)

14,94 +/- 2,42 (12,36 – 17,57)

< 0,46 (<LOQ – 0,87)

< 0,24 N-4(<LOQ)

47TT-593 10,44 +/- 1,75

(8,63 – 13,22)

12.73 +/- 2.07 (9,92 – 15,47)

< 0,29 (<LOQ – 0,41)

< 0,24 (<LOQ)

Rễ

115TT-189 6,71 +/- 1,11

(5,57 – 8,44)

6,72 +/- 0,65 (6,07 – 7,71)

3,05 +/- 1,22 (2,20 – 5,15)

2,21 +/- 1,99 (0,81 – 5,66) 47TT-593 5,98 +/- 1,01

(5,33 – 7,76)

5,73 +/- 1,63 (3,71 – 7,16)

3,61 +/- 1,66 (1,50 – 5,11)

< 2,36 (<LOQ – 4,04) Hạt

(4,93 – 8,60)

7,40 +/- 1,09 (5,86 – 8,65)

(5,37 – 8,54)

3,87 +/- 1,09 (2,53 – 5,39) Hạt phấn 4

5,31 +/- 0,71 (4,34 – 6,33)

5,17 +/- 1,89 (3,49 – 7,48) 47TT-593 7,07 +/- 0,77

(6,12 – 8,08)

7,70 +/- 1,06 (6,52 – 8,77)

3,36 +/- 0,44 (2,94 – 4,09)

4,96 +/- 0,98 (3,21 – 5,47)

1

Nồng độ EPSPS trong mẫu đối chứng âm là <LOQ hoặc <LOD ở thí nghiệm pha loãng tương tự mà mEPSPS đượ đ n ượng t ng mẫu gen chuyển đổi tương ứng và không có trong bảng

2 N=5 Những giá tr nhận đượ xá đ nh bằng ELISA và k ông được hiệu chỉnh cho hiệu suất phân tích Giá tr t ung bìn đi t ước bởi "<" (nhỏ ơn) ỉ ra rằng LOQ ướ ượng đượ dùng để tượng t ưng một hoặc nhiều mẫu khi tính giá tr trung bình

3 N/A = loại mô k ông được phân tích ở giai đ ạn này

4

Một mẫu dùng ung được phân tích n ư n ận đượ (p ơi k ô qua đêm)

Bảng 5a: Nồng độ mEPSPS trên một m u đo khô trong cây ngô GA21

Mô

Nguyên sinh chất 1

Giai đoạn phát triển

Ra lá Ra hoa Hạt chín Cây già

Phạm vi trung bình m PSPS μg/g gam chất khô +/- S.D.2

Lá

115TT-189 70,41 +/-

10,01 (58,03 – 80,53)

70,94 +/- 11,22 (58,37 – 81,93)

< 1,02 (<LOQ – 2,29)

< 0,30 N-4(<LOQ)

47TT-593 57,48 +/-

9,71 (47,89 – 72,42)

56,96 +/- 9,91 (43,68 – 69,95)

< 0,56 (<LOQ – 0,72)

< 0,30 (<LOQ)

Rễ

115TT-189 43,83 +/-

4,56 (39,22 – 50,30)

43,00 +/- 4,50 (35,65 – 46,50)

17,19 +/- 7,19 (11,72 – 28,93)

12,44 +/- 10,40 (4,47 – 30,44)

47TT-593 35,89 +/-

3,69 (30,54 – 40,16)

36,30 +/- 4,46 (30,65 – 44,16)

18,26 +/- 8,41 (8,60 – 26,27)

< 13,95 (<LOQ – 22,54)

Hạt

115TT-189 N/A3 N/A 9,54 +/- 2,05

(7,25 – 12,39)

9,50 +/- 1,41 (7,36 – 10,92)

1,89 (7,82 – 12,25)

4,80 +/- 1,33 (3,25 – 6,65)

Toàn bộ

cây

115TT-189 67,71 +/-

14,66 (52,66 – 92,26)

63,23 +/- 7,69 (54,47 – 75,39)

13,38 +/- 2,32 (10,49 – 16,39)

11,93 +/- 6,18 (6,02 – 19,28)

47TT-593 62,33 +/-

6,38 (54,18 – 71,63)

47,74 +/- 6,79 (39,23 – 55,10)

8,08 +/- 2,60 (5,48 – 12,24)

9,17 +/- 2,40 (7,07 – 13,12)

1

Nồng độ EPSPS trong mẫu đối chứng âm là <LOQ hoặc <LOD ở thí nghiệm pha loãng tương tự mà mEPSPS đ n ượng được trong mẫu gen chuyển đổi tương ứng và không có trong bảng

2

N=5 Những giá tr nhận đượ xá đ nh bằng ELISA và k ông được hiệu chỉnh cho hiệu suất phân tích Giá tr t ung bìn đi t ước bởi "<" (nhỏ ơn) ỉ ra rằng LOQ ướ ượng đượ dùng để tượng t ưng một hoặc nhiều mẫu khi tính giá tr trung bình

Để mô tả phạm vi biểu hiện của protein mEPSPS trong các cây ngô nhận mang event GA21, nồng độ protein m PSPS được xác định bằng cách xác định dựa vào phương pháp ELISA trên mô cây và trên toàn bộ cây ngô ở 4 giai đoạn sinh trưởng (ra lá, nở hoa, hạt chín, cây già) Nồng độ định lượng của protein m PSPS được xác định trong hầu hết các

mô ngô trong thí nghiệm Qua tất cả các giai đoạn tăng trưởng, lượng protein mEPSPS trung bình đo trên lá, rễ, và trên toàn bộ cây ở mức thấp hơn giới hạn lượng định (<0.2 μg/g gam chất tươi) tới 15 μg/g chất tươi (0.4-71 μg/gam chất khô) Nồng độ mEPSPS trung bình đo được trong hạt ở mức từ 4.7 μg/g gam chất tươi (5-10 μg/g gam chất khô) và trong hạt phấn trung bình là 168 μg/g gam chất tươi Nồng độ m PSPS là tương đương nhau giữa các dòng ngô GA21 và các dòng không chuyển gen cận dòng Số liệu nghiên cứu chi tiết của công ty Syngenta chỉ rõ hàm lượng protein biểu hiện trên các mô ngô ở các giai đoạn khác nhau khi được phân tích trọng lượng tươi và trọng lượng tươi của các mô ngô Số liệu chi tiết về biểu hiện protein m PSPS trong ngô được nêu rõ trong Bảng 4 và 5

ở trên

Nồng độ protein m PSPS trung bình trên lá đo được qua ba thế hệ lai hồi giao là 13-14 μg/g gam chất tươi (82-96 μg/g gam chất khô) Nói chung, nồng độ m PSPS tương tự nhau qua ba thế hệ phân tích, chứng minh sự biểu hiện ổn định của protein mEPSPS qua nhiều thế hệ (Bảng 6)

Bảng 6: Nồng độ mEPSPS trong lá ngô GA21 từ ba thế hệ lai hồi giao

Thế hệ lai hồi giao* Phạm vi trung bình mEPSPS

μg/g gam chất tươi +/- S.D

Phạm vi trung bình mEPSPS μg/g gam chất khô +/- S.D

(9,61 – 13,92)

82,25 +/- 11,34 (71,91 – 95,37)

(10,49 – 17,15)

95,71 +/- 20,65 (71,66 – 120,76)

(11,76 – 14,46)

83,93 +/- 6,67 (76,64 – 92,91)

N = 5 Số liệu đượ xá đ nh bởi ELISA và ưa được chỉnh sửa cho hiệu quả phân tích

* Nồng độ EPSPS trong mẫu đối chứng âm à <LOD (0,73 μg/g gam ất tươi; 4,94 μg/g gam chất khô) ở thí nghiệm p a ãng tương tự mà mEPSPS đ n ượng được trong mẫu gen chuyển đổi tương ứng và không có trong bảng

2.4.3 Tình hình cấp phép, sử dụng ngô GA21 trên thế giới

Trong v ng 15 năm từ năm 1996 tới năm 2009, công nghệ chuyển gen tạo tính trạng kháng thuốc diệt cỏ liên tục được tập trung phát triển, tiếp đến là tính trạng kháng sâu bệnh, sau

đó là các gen tích hợp vào cùng một giống để mang cả hai đặc tính kể trên Năm 2009, tính trạng kháng thuốc diệt cỏ đã được triển khai ở trên cây đậu tương, ngô, cải dầu và bông Diện tích trồng các loại cây trồng mang tính trạng kháng thuốc diệt cỏ chiếm 65% tương đương với 87 triệu héc-ta trong tổng số 134 triệu héc-ta diện tích trồng cây biến đổi gen trên toàn cầu Các cây trồng mang cả hai đặc tính trên là nhóm tăng trưởng nhanh nhất trong những năm vừa qua với mức tăng diện tích là 49% so với năm 2008

Việc sử dụng cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ đã làm thay đổi việc quản lý cỏ dại trên

đồng ruộng Các hoạt động canh tác trong sản xuất cây trồng có tác động to lớn đến thành

phần quần xã cỏ dại Những thay đổi về loại cỏ quan trọng mang tính địa phương được cho

là chuyển đổi thành phần cỏ dại Những chuyển đổi này đặc biệt phù hợp cho việc quản lý

cỏ dại trong hệ thống cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ, trong đó biện pháp vun xới và sử dụng thuốc trừ cỏ đều giữ vai trò lớn trong việc điều chỉnh quần xã cỏ dại Trong các tài liệu đã công bố, có các báo cáo về 14 loài cỏ dại hoặc các nhóm cỏ có quan hệ họ hàng gần gũi đã tăng mức độ phong phú ở nơi sử dụng các cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ (National Research Council, 2010) Một điều tra trên ngô, đậu tương và bông trồng ở 6 bang ở Hoa Kỳ, có khoảng 36 – 70% người trồng cho biết áp lực của cỏ dại đã giảm xuống sau khi sử dụng luân canh các loại cây chống chịu thuốc trừ cỏ (Kruger et al., 2009)

Sự thay đổi trong biện pháp vun xới khi sử dụng ngô chống chịu thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất glyphosate: Việc đưa vào sản xuất các cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ đã gắn

liền với việc chấp nhận và ứng dụng các biện pháp canh tác bảo tồn (không làm đất, không vun xới), giảm sự chảy tràn nước tưới, tăng thẩm thấu nước và giảm xói m n đất Các khuynh hướng chấp thuận biện pháp canh tác bảo tồn đã được nghiên cứu ở Hoa Kỳ và Ác-hen-tina là những nước có diện tích trồng cây chuyển gen chống chịu cỏ lớn nhất thế giới Ở Hoa Kỳ, người trồng đậu tương đã chấp thuận phương pháp canh tác bảo tồn trước khi thuốc trừ cỏ Glyphosate được đưa vào sản xuất ở 19 bang của Hoa Kỳ Kết quả điều tra cho thấy người trồng đậu tương chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ đã thực hiện biện pháp canh tác cũ ít hơn 25% so với người trồng đậu tương không chuyển gen (Marra và cs., 2004) Việc đưa vào sản xuất đậu tương kháng thuốc trừ cỏ cũng được trích d n là một yếu

tố đóng góp cho việc tăng lên nhanh chóng của việc không làm đất gieo đậu tương từ 1/3 diện tích trong năm 1996 lên 80% vào năm 2008 Các yếu tố khác góp phần làm tăng việc

áp dụng biện pháp không làm đất bao gồm các chính sách kinh tế vĩ mô, giảm giá thuốc trừ

cỏ và các nỗ lực trong nghiên cứu và khuyến mại (Trigo và cs., 2009) Một điều tra thực hiện trên 59 người trồng đậu tương ở Ác-hen-tina trong năm 2001 cho thấy hoạt động làm đất ít hơn 58% trên diện tích trồng cây chống chịu thuốc trừ cỏ so với diện tích không dùng giống chuyển gen này (Qaim & Traxler 2005) Cho dù việc đưa vào sản xuất cây chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ đã làm tăng sự chấp thuận biện pháp canh tác bảo tồn hay ngược lại thì đây cũng là mục tiêu của rất nhiều nghiên cứu Trong một phân tích về việc đưa ra quyết định của nông dân sử dụng số liệu điều tra quốc gia năm 1997, các nhà nghiên cứu đã thấy rằng việc chấp thuận biện pháp canh tác bảo tồn đã d n tới việc chấp thuận đậu tương kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate, nhưng việc chấp thuận dùng giống đậu tương kháng thuốc trừ cỏ không d n đến việc tăng việc chấp thuận phương pháp canh tác bảo tồn (Fernandez-Cornejo & McBride, 2002) Tuy nhiên, các điều tra gần đây nhất đã cho thấy

có 2 đường tương quan thuận Sử dụng các số liệu từ 1998 đến 2004, một quan hệ đồng thời đã được tìm thấy giữa việc chấp nhận phương thức canh tác bảo tồn và việc chấp thuận sử dụng giống bông chống chịu thuốc trừ cỏ ở bang Tennessee (9090 Roberts và cs., 2006) Một nghiên cứu rộng hơn về người sản xuất sử dụng giống bông chống chịu thuốc trừ cỏ với các dữ liệu ở mức bang từ 1997 đến 2002 cũng đã cho thấy mối quan hệ đồng thời giữa việc chấp thuận sử dụng giống bông chống chịu cỏ và kỹ thuật canh tác bảo tồn (Frisvold et al., 2009)

Bảng 7 Danh sách các nước chấp thuận ngô GA21 được sản xuất và sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trên thế giới

Nguồn: http//www.agbios.com

Tình hình cấp phép cho canh tác và an toàn làm thực phẩm, thức ăn gia súc: ngô

GA21 được chấp thuận cho canh tác ở Mỹ, Canada, Argentina, Brazil, Philippine và Nhật Bản và Uruguay Nó được chấp thuận cho sử dụng thức ăn gia súc tại Mỹ, Canada, Argentina, Nam Phi, Mexico, Nhật Bản, Philippines, Nga, EU, Thụy Sĩ , Đài Loan, Hàn Quốc và Trung Quốc, và cho sử dụng trong thực phẩm tại Mỹ, Canada, Argentina , Mexico, Nhật Bản, Nam Phi, Nga, EU, Úc, New Zealand, Hàn Quốc, Philippines, Đài Loan, Uruguay và Trung Quốc Không có báo cáo về ảnh hướng đến sức khỏe hay tác hại môi trường liên quan với việc sử dụng các giống ngô GA21

Tên nước Năm cấp giấy

chứng nhận an toàn về môi trường và đa dạng sinh học

Năm cấp giấy chứng nhận an toàn thực phẩm

và hoặc thức ăn gia súc

Năm cấp giấy chứng nhận an toàn thực phẩm

Năm cấp giấy chứng nhận an toàn thức ăn gia súc

Phần III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM Ở VIỆT NAM

3.1 Kết quả khảo nghiệm đánh giá rủi ro trên thế giới đối với ngô GA21 và protein EPSPS bị biến đổi

3.1.1 Các kết quả nghiên cứu về kiểu hình của ngô GA21

Một loạt các khảo nghiệm đánh giá kiểu hình và đặc tính nông học đối với ngô chuyển gen GA21 đã được tiến hành bới Syngenta ở rất nhiều vị trí đại diện cho các vùng trọng điểm ngô ở Hoa Kỳ, với 8 điểm trong năm 2004 và 10 điểm năm 2005 Ở Châu Âu, các khảo nghiệm cũng đã được tiến hành vào năm 2007 (3 điểm ở Cộng H a Sec, 3 điểm ở Tây Ban Nha, 2 điểm ở Rumani) và năm 2008 (3 điểm ở Tây Ban Nha, 3 điểm ở Rumani) nhằm mục đích so sánh biểu hiện các đặc tính nông học và biểu hiện ở ngoài đồng ruộng của ngô chuyển gen GA21 so với đối chứng không chuyển gien cùng dòng Thông tin về những đặc điểm về kiểu hình, đặc tính nông học của ngô GA21 và đối chứng được thu thập, đánh giá

về hình thức sinh trưởng, sinh trưởng sinh dưỡng, đặc tính sinh sản, năng suất và các đặc tính về hạt được tính toàn và so sánh

Những dữ liệu về đặc tính nông học và kiểu hình của các khảo nghiệm trên không cho thấy bất cứ sự thay đối chính nào về các đặc điểm của ngô GA21 điều này cho thấy ngô GA21 không có khả năng tồn tại dai dẳng hay có tính xâm lấn Mặc dù sinh khối của ngô GA21 lớn hơn khác biệt so với giống đối chứng cùng dòng khi áp dụng thuốc trừ cỏ glyphosate (EFSA, 2011)

Thông tin về kiểu hình của ngô chuyển gen GA21 mang gen emsps đã được thu thập từ các

nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và khảo nghiệm đồng ruộng Kết quả của những nghiên cứu này đã được trình bày chi tiết trong những những hồ sơ pháp lý với mục

đích chứng minh: i) nhận diện bất cứ t ay đổi về kiểu hình mà nó có thể ản ưởng đến

tính an toàn của môi t ường canh tác; ii) Nhận diện bất cứ t ay đổi không mong muốn tới

hệ sinh sinh vật của cây trồng mà có thể làm ản ưởng đến sự an toàn của môi t ường Số

liệu về kiểu hình của ngô chuyển gen GA21 và các công bố đã được thẩm định có giá trị tương đương đã tập trung vào các đặc tính của cây trồng mà chúng có thể đóng góp vào sự sống sót hay tồn tại dai dẳng (như tiềm năng trở thành cỏ dại), hoặc những biểu hiện bất lợi của các đặc tính nông học (như m n cảm với bệnh hay ảnh hưởng đến năng suất) đã được nêu rõ trong các bộ hồ sơ nộp lên chính phủ của các nước là: ANZFA 2000a, 2000b, 2001, 2002; CFIA 1995, 1998, 2005; FSANZ 2005; USDA APHIS 1993, 1995a, 1995c, 1996a, 1996b, 1997b, 1998a, 1998c, 2000a, 2001, 2003, 2004a, 2004c, 2004e, 2006)

Những số liệu bổ sung, đặc biệt là kết quả về năng suất đại diện cho điều kiện quản lý và môi trường khác nhau cũng đã được thu thập cho mục đích mô tả về sản phẩm (Delannay

và cs., 1995; Ellmore và cs., 2001; Light va cs., 2003) Số liệu về kiểu hình trong các nghiên cứu cũng được đánh giá định lượng cho các yếu tố như năng suất, số lượng hạt, thời gian sinh trưởng hoặc định tính cho các đặc điểm như số liệu điều tra về tính m n cảm về sâu và bệnh hại

Sự so sánh trực tiếp về những quan sát kiểu hình giữa các sự kiện mang gen epsps biến đổi

là không thể thực thực hiện bởi vì sự khác nhau về vi sinh vật của loài cây chủ và mỗi loài thì có những đặc điểm kiểu hình khác nhau như sự khác nhau giữa ngô, bông và đậu tương Các kết luận từ những hồ sơ báo cáo đã được đệ trình lên các chính phủ nơi đăng ký đều cho rằng sự biểu hiện của en enzyme EPSPS bị biến đổi trong cây ngô chuyển gen không làm thay đổi kiểu hình của ngô chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate

3.1.2 Các nghiên cứu về khả năng trở thành cỏ dại trong môi trường nông nghiệp của ngô GA21

Các đặc tính có thể tác động đến khả năng để một cây trồng biến thành cỏ dại thì cũng tương tự như loài cỏ dại, các đặc tính đó là tính ngủ nghỉ của hạt, tính rụng bắp và tính cạnh tranh (Baker 1974) Những số liệu nghiên cứu đã đệ trình và được phê chuẩn là USDA APHIS 1993, 1995a, 1995c, 1996a, 1996b, 1997b, 1998a, 1998c, 2000a, 2001,

2003, 2004a, 2004c, 2004e, 2006, chỉ ra rằng không có mối liên kết nào giữa sự biểu hiện của ngô GA21 với bất cứ tồn tại dai dẳng hay là khả năng sống qua mùa đông để có thể phát triển trong vụ gieo trồng kế tiếp dưới dạng cỏ dại

Những cây tự mọc từ hạt chuyển gen trong vụ sau sẽ bị loại bỏ vì các chương trình quản lý canh tác, đặc biệt là chế độ luân canh cây trồng liên tục Các lựa chọn thay thế cho kế hoạch quản lý như sự tự mọc của cây trồng chuyển gen như thay đổi các loại thuốc khác nhau hay kiểm soát cỏ dại bằng máy cũng đã được đề cập chi tiết trong các báo cáo của Beckie và cs., 2004, Deen và cs., 2006, OECD 1997, OECD 2000, OECD 2001, OECD 2003a, OECD 2008, OGTR 2008, USDA APHIS 2004d)

3.1.3 Khả năng trở thành cỏ dại của ngô GA21 trong môi trường phi nông nghiệp

Các số liệu trong các báo cáo được đệ trình lên chính phủ của các nước đã cho phép canh tác ngô GA21 đều đã xem xét đến có hay không khả năng ngô chuyển gen GA21 có thể trở thành cỏ dại trong môi trường phi nông nghiệp do các yếu tố như sự rơi vãi hạt giống trong quá trình vận chuyển hàng hóa hoặc là trôi gen từ cây chuyển gen đến quần thể thực vật cùng loài hoặc khác loài có liên quan Các nghiên cứu đã được chi tiết và đệ trình trong các báo cáo của các nước đã phê chuẩn (ANZFA 2000a, 2000b, 2001, 2002; CFIA 1995, 1998, 2005; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006a, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; FSANZ 2005; Japan BCH 2003, 2004; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1996b, 1997a, 1998b, 1999, 2000b, 2002, 2004b, 2004d, 2005a, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

Trong khi tất cả các cây có thể được coi là cỏ dại trong một số bối cảnh, không cây nào trong số các loại cây trồng chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ được coi là loài xâm lấn hoặc có vấn đề bên ngoài hệ thống nông nghiệp Hầu hết là chúng v n tồn tại trong các điều kiện thuận lợi và đôi khi chúng cần những biện pháp quản lý, đặc biệt là khi nó mọc lại trong mùa vụ kế tiếp, những vấn đề này được đề cập chi tiết trong các báo cáo OECD

1997, OECD 2000, OECD 2001, OECD 2003a, OECD 2008, OGTR 2008, USDA APHIS 2004d, EFSA, 2011

Dựa trên dữ liệu nông học, các nghiên cứu chỉ ra rằng sự có mặt của protein EPSPS biến đổi trong ngô GA21 không làm thay đổi đặc điểm nông học (bao gồm cả khả năng trở thành cỏ dại) Cho đến nay, không có bất cứ bằng chứng nào cho rằng sự biểu hiện của protein EPSPS biến đổi sẽ biến cây chuyển gen có tiềm năng trở thành cỏ dại Các kết quả này đều đã được chứng minh trước khi thương mại ở các nước đã cho phép phóng thích ra ngoài môi trường

Biểu hiện của protein EPSPS biến đổi chỉ ảnh hưởng đến khả năng cây trồng sống sót nếu được xử lý bằng thuốc diệt cỏ glyphosate Giống như trong môi trường nông nghiệp, các lựa chọn quản lý khác cho cây trồng chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ trong môi trường phi nông nghiệp đã được chỉ rõ trong các báo cáo Beckie và cs., 2004, Deen và cs., 2006, OECD 1997, OECD 2000, OECD 2001, OECD 2003a, OECD 2008, OGTR 2008, USDA APHIS 2004d, EFSA, 2011

3.1.4 Các tác động bất lợi của ngô GA21 đối với các sinh vật khác trong môi trường nhận

Khả năng để ngô mang gen EPSPS biến đổi có ảnh hưởng bất lợi đối với các sinh vật trong môi trường nhận chúng đã được xem xét trong các báo cáo đánh giá rủi ro với một số lượng bằng chứng rất lớn để chứng minh trong các báo cáo của CFIA 1995, 1998, OGTR 2003a, 2003b, 2006, USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011,

Dựa trên các protein độc hại được biết đến (Sjoblad và cs., 1992), và các thí nghiệm ở chuột cho thấy protein EPSPS biến đổi không có tác dụng phụ ảnh hưởng đến chuột (Harrison và cs., 1996, EFSA, 2011) Hơn nữa, Enzyme biến đổi này nhanh chóng bị phân hủy trong hệ thống tiêu hóa của động vật có vú, giảm phơi nhiễm, và không có trình tự có

ý nghĩa hoặc cấu trúc tương đồng với chất độc hoặc chất gây dị ứng (Harrison và cs., 1996; Nickson và Hammond, 2002, EFSA, 2011) Hơn nữa, protein EPSPS biến đổi không phải

là chất gây độc cho bất kỳ sinh vật nào (CFIA 1995, 1998; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; OGTR 2003a, 2003b, 2006; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

Sự cô lập của các gen mepsps được thay đổi từ gen epsps trong ngô không có phơi nhiễm

đáng kể trong đất, và người đánh giá rủi ro cũng kết luận rằng mEPSPS có cấu trúc và chức năng tương đồng với enzyme nội sinh EPSPS khác trong cây trồng cũng như môi trường (CFIA 1995, 1998; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; OGTR 2003a, 2003b, 2006; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

Các hoạt động enzym của mEPSPS là rất cụ thể và tương đương với các protein EPSPS khác trong thực vật và vi sinh vật, do vậy các sinh vật trong môi trường tiếp nhận nó sẽ không có phơi nhiễm với các sản phẩm trao đổi chất của mEPSPS (CFIA 1995, 1998; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; OGTR 2003a, 2003b, 2006; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b,

1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

Người đánh giá rủi ro đã cân nhắc việc chuyển nạp mEPSPS vào cây trồng sẽ d n đến thay đổi trong thực vật và có thể có tác động xấu đến các sinh vật khác Đặc tính kiểu hình của cây trồng (xem ở trên) cũng như phân tích thành phần dinh dưỡng (xem dưới đây) đã kết luận rằng chuyển nạp mEPSPS vào ngô không xuất hiện những ảnh hưởng không mong muốn đến đặc tính của cây trồng mà các đặc tính này nếu thay đổi thì có thể ảnh hưởng đến các sinh vật khác trong môi trường nhận chúng (CFIA 1995, 1998; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; Nickson và Hammond, 2002; Nida và cs., 1996; OGTR 2003a, 2003b, 2006; Padgette và cs., 1996; Ridley và cs., 2002; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

Quan sát cây trồng biểu m PSPS trong quá trình đánh giá thử nghiệm đồng ruộng cho thấy không có bất cứ tác động xấu nào của chúng đến các sinh vật khác (OGTR 2003a, 2003b, 2006; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b,

2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011) Những quan sát này, cùng với những thông tin

về việc không đủ bằng chứng về độc tính trực tiếp hoặc phơi nhiễm đáng kể với protein mEPSPS là cơ sở để cơ quan quản lý kết luận rằng ngô chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate mang protein EPSPS biến đổi không có tiềm năng gây ra ảnh hưởng bất lợi đến các sinh vật khác, các biểu hiện của ngô chuyển gen hoàn toàn tương tự như ngô truyền thống (CFIA 1995, 1998; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b, OGTR 2003a, 2003b, 2006, USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1997a, 1997c, 1998b, 1999, 2000a, 2000b, 2004b, 2004d, 2005b, 2007a, EFSA, 2011)

3.1.5 Phân tích thành phần dinh dưỡng của ngô mang gen mEPSPS

Phân tích chi tiết thành phần dinh dưỡng là yếu tố khoa học cần đánh giá nghiêm ngặt cho các đặc tính biểu hiện trong cây trồng chuyển gen và là yêu cầu pháp lý để phê chuẩn hay công nhận tính an toàn để làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đối với sản phẩm của cây trồng chuyển gen (OECD 1992; WHO 1995, FAO/WHO 1996; EFSA 2006A; Codex 2003a, 2003b) Việc lựa chọn phân tích tiến hành phụ thuộc vào mục đích sử dụng của phản phẩm đó

Cây trồng chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate đã trải qua tất cả các phân tích

về dinh dưỡng như protein thô, chất béo thô, chất xơ, độ ẩm và tro Phân tích chi tiết của axit béo và thành phần axit amin cũng đã được tiến hành, cũng như phân tích của các chất chuyển hóa quan trọng thứ cấp có tính chất độc hại hoặc phi dinh dưỡng (ví dụ như glucosinolate và axit eruxic trong cải dầu, các chất ức chế trypsin trong đậu tương) Các dữ liệu thu thập được là rất hữu ích để chỉ ra sự hiện diện hay vắng mặt của bất kỳ thay đổi

không mong muốn nào của cây trồng chuyển gen so với cây không chuyển gen (Codex 2003a, 2003b; Nickson and Hammond 2002; Nida và cs., 1996; Padgette và cs., 1996; Ridley và cs., 2002 và Taylor và cs., 1999)

Đối với ngô GA21: Các chất chuyển hóa phụ được định nghĩa như các sản phẩm tự nhiên không có chức năng trực tiếp trong những hoạt động hóa sinh chủ yếu hỗ trợ cho sự tăng trưởng, phát triển và tái sinh sản của cây trồng nơi mà chúng xuất hiện (EuropaBio, 2003) Một nhóm các chất chuyển hóa phụ, ức chế dinh dưỡng, tương ứng với những ảnh hưởng

có hại liên quan tới sự hấp thu dinh dưỡng và vi dưỡng từ thực phẩm (Shahidi, 1997) Thông thường, không có các chất ức chế dinh dưỡng được nhận biết trong ngô ở mức độ được xem như gây độc, nhưng vì mục đích đánh giá tính tương đương có trong ngô, dữ liệu phân tích sau đây được cung cấp đối với: furfural, axít phytic, inositol, raffinose, chất

ức chế trypsin, axít ferulic và axít p-coumaric Những chất chuyển hóa phụ được chọn này

và những chất ức chế dinh dưỡng bao gồm trong phân tích của Catherine Kramer and Justin De Fontes, 2005 (hồ sơ đã đệ trình và được phê chuẩn), kết luận của nghiên cứu được tóm tắt như sau:

- Furfural là một an-de-hit dị vòng xuất hiện trong nhiều loại rau, trái cây và ngũ cốc Nó được xem như là một chất gây ung thư độc tính qua miệng ở liều lượng thấp (OECD 2002) Furfural thấp hơn giới hạn định lượng trong tất cả các m u kiểm tra đối với ngô GA21;

- Axít Phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis [dihydrogen phosphate]) được phân bố rộng rãi trong các thực vật bậc cao (Boyer và cộng sự, 1987) và được xem như là một chất

ức chế dinh dưỡng bởi vì khả năng của nó kết hợp các khoáng, protein và tinh bột ở độ pH sinh lý (Rickard 1997) Axít phytic hiện diện trong mầm ngô và kết hợp 60-75% phốt pho, làm giảm tính lợi ích sinh học của phốt pho trong ngô đối với các động vật không nhai lại (OECD 2002), Inositol là một thành phần của axít phytic Không có sự khác biệt đáng kể đối với inositol hoặc axít phytic giữa ngô GA21 và ngô không chuyển gen;

- Alpha-galactosidase của đường mía, bao gồm raffinose, được phân bố rộng rãi trong các thực vật bậc cao (Naczk, 1997) Do bởi sự vắng mặt của hoạt tính alpha-galactosidase trong niêm mạc người và động vật, raffinose không thể bị bẻ gãy bởi những enzym trong

bộ tiêu hóa ruột-dạ dày và được xem như một chất kháng dinh dưỡng, mặc dù nó không độc Mức raffinose là thấp hơn giới hạn định lượng (LOQ) trong tất cả các m u kiểm tra;

- Chất ức chế Protease được tìm thấy dư thừa trong ngũ cốc thô và rau đậu, đặc biệt trong đậu nành Chất ức chế Trypsin trong đậu nành làm gia tăng sự khử hoạt tính và mất trypsin trong ruột non, làm kích thích sự dư thừa trypsin trong lá lách qua việc tiêu thụ sulfur có chứa trong các axít amin (Shahidi, 1997) Ngô có chất ức chế trypsin rất thấp (OECD 2002) Không có khác biệt đáng kể về chất ức chế trypsin giữa m u chuyển gen GA21 và không chuyển gen;

- Axít phenolic có thể có ảnh hưởng tốt đối với sức khỏe bởi vì các đặc tính chống oxi hóa của chúng Axít phenolic, ferulic và p-coumaric là thành phần cấu trúc và chức năng của tế

bào cây và được tìm thấy trong rau, quả và ngũ cốc (OECD 2002), sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa mức ferulic và axít p-coumatic trong giống ngô chuyển gen ký hiệu E1(+) và giống không chuyển gen E3(-) chỉ ra rằng sự khác biệt không cố định là có ở tất

cả các vị trí, điều này là tương tự khi so sánh giữa ngô chuyển gen E2(+TD) và E3(-) và sự thay đổi cũng lại biểu hiện ngay ở giống không chuyển gen, do vậy sự thay đổi này không liên quan đến sự có mặt của gen chuyển

Như vậy ngô mang gen chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate, GA21 không có sự khác biệt đáng kể về thành phần dinh dưỡng và chức năng của mỗi thành phần so với ngô không chuyển gen

3.1.6 Tác động của ngô chuyển gen GA21 đến sinh vật không chủ đích

Đối với cây ngô chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ nói chung và ngô GA21 nói riêng thì đều được coi là không có sinh vật không chủ đích và các enzyme chống chịu thuốc trừ cỏ thông thường v n có mặt ở thực vật và chưa phát hiện chúng có bất kỳ thuộc tính gây độc nào (APIS-USDA, 1994; Carpenter, 2001)

Tuy nhiên những lo ngại về tác động bất lợi có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp của những thay đổi mong muốn (đặc tính cải tiến, chống chịu thuốc trừ cỏ) và thay đổi không mong muốn cũng như biểu hiện của protein m PSPS trong ngô GA21 đến sinh vật không chủ đích, sinh vật trong hệ sinh thái, cơ chế hóa sinh trong đất và các tác động khác… đã được xem xét, đánh giá và kết luận bởi Hội đồng An toàn Thực phẩm Sinh vật biến đổi gen Châu Âu FSA đã kết luận rằng ngô GA21 không có bất cứ ảnh hưởng bất lợi nào đến môi trường và đa dạng sinh học, bản chất của ngô GA21 cũng như ngô truyền thống sự khác biệt duy nhất là khô GA21 có thể chống chịu được thuốc diệt cỏ chứa hoạt chất glyphosate khi chúng bị phun trùm lên cây (EFSA, 2011) Các phân tích chi tiết sẽ được đề

cập ở mục 3.2, phần III dưới đây

Kết luận: ăn ứ vào những kết luận từ những báo cáo/hồ sơ đã được phê chuẩn ở các nước cho phép phóng thích trên thế giới đối với ngô chuyển gen GA21 và những cây trồng chống ch u thuốc trừ cỏ glyphosate mang gen chuyển mepsps (EFSA, 2011) Chúng tôi kết luận ngô chuyển gen GA21 không có bất cứ sự khác biệt nào về kiểu hình, thành phần dinh dưỡng so với ngô không chuyển gen ùng dòng Ngô GA21 ũng không có bất cứ ảnh ưởng bất lợi nà đến các sinh vật khác Ngô chuyển gen GA21 k ông ó nguy ơ t ở thành cỏ dại, xâm lấn hay tồn tại dai dẳng t ng môi t ường nông nghiệp và phi nông nghiệp

3.2 Xác định các yêu cầu cần khảo nghiệm đánh giá rủi ro ngô GA21 đối với môi trường và đa dạng sinh học tại Việt Nam

Ngô GA21 đã được đánh giá và phê chuẩn là an toàn cho canh tác, sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và chế biến ở trên rất nhiều nước trên thế giới (xem mục 3.1, phần III ở trên), và ngô GA21 cũng đã có lịch sử sử dụng an toàn hơn 10 năm qua mà không có bất

cứ bằng chứng khoa học nào chỉ ra tính bất lợi hay những ảnh hưởng xấu tới môi trường,

đa dạng sinh học cũng như làm thực phẩm Với yêu cầu khảo nghiệm đánh giá rủi ro sinh vật biến đổi gen đối với môi trường và đa dạng sinh học ở Việt Nam, căn cứ vào điều 15 của nghị định 69 là:

- Nguy cơ trở thành dịch hại, cỏ dại;

- Nguy cơ ảnh hưởng xấu đến sinh vật không chủ đích;

- Nguy cơ làm thay đổi bất lợi đến hệ sinh thái xung quanh;

- Các tác động bất lợi khác

Những dữ liệu khoa học và những lý luận khoa học được trình bày dưới đây là cơ sở để xác định các vấn đề cần khảo nghiệm trong điều kiện Việt Nam cũng như những vấn đề đã được khẳng định chắc chắn ở trên thế giới mà không cần nhắc lại trong các khảo nghiệm tại Việt Nam Căn cứ vào những kế hoạch khảo nghiệm từ phía công ty (sau khi tham khảo

ý kiến của những nhà khoa học và Hội đồng An Toàn Sinh Học), các kế hoạch khảo nghiệm hạn chế và diện rộng ngô chuyển gen GA21 đối với môi trường và đa dạng sinh

học đã được phê chuẩn và cho thực hiện bởi bộ NN&PTNT trong năm 2010 và 2011 3.2.1 Tính an toàn của ngô chuyển gen GA21 hay enzyme mEPSPS

Việc phát triển cây trồng chống chịu thuốc trừ cỏ được dựa trên 3 cơ chế sau:

- Tạo ra các enzyme không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ: tạo ra những thay đổi

trong enzyme là mục tiêu của thuốc trừ cỏ nhằm mục đích ngăn cản sự tác động của thuốc trừ cỏ vào enzyme đó

- Tăng cường sự biểu hiện của enzyme bị hại so thuốc trừ cỏ: Tăng cường sự biểu

hiện của các protein (enzyme) mục tiêu bằng cách chuyển gen nhằm tăng số bản sao/tăng cường sự biểu hiện của enzyme mục tiêu Số lượng enzyme/protein mục tiêu của thuốc trừ cỏ sẽ nhiều hơn hơn với lượng mà thuốc trừ cỏ có thể tác động nhờ đó quá trình sinh tổng hợp các hợp chất của cây v n được thực hiện bình thường ngay cả khi có mặt thuốc trừ cỏ

- Tạo ra các enzyme làm mất độc tính của thuốc trừ cỏ: Chuyển gen tổng hợp

enzyme có khả năng phá vỡ cấu trúc hóa học của phân tử thuốc trừ cỏ d n đến thuốc trừ cỏ bị mất hoạt tính

Mức độ an toàn của cây trồng chuyển gen đã được chứng minh với 15 năm thương mại hóa Mặc dù được cho là có nguy cơ tiềm ẩn đối với môi trường, đa dạng sinh học và sức khỏe con người, nhưng cho đến nay chưa có ghi nhận nào về ảnh hưởng bất lợi của cây trồng chuyển gen Để được thương mại hóa và được chấp nhận tiêu dùng ở các quốc gia khác nhau trên thế giới, các cây trồng phải trải qua các quy trình quản lý an toàn sinh học được xây dựng đặc thù cho mỗi quốc gia

Ngô chuyển gen chống chịu thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất glyphosate GA21 được tạo ra bằng phương pháp bắn gen, sử dụng các tế bào huyền phù làm mô đích (bằng sáng chế quốc tế PCT/VS98/06640 (trang 75-77, Spencer và CS 1998a) Gen đột biến 5-enol

pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (mepsps) biểu hiện trong ngô GA21 mang đặc tính

ưu việt là cây ngô GA21 có thể chống chịu thuốc diệt cỏ có chứa hoạt chất Glyphosate, là

những loại thuốc trừ cỏ không chọn lọc (trừ cả cỏ lá rộng và lá hẹp) Gen mepsps có nguồn

gốc từ enzyme EPSPS, chúng có mặt phổ biến trong thực vật và vi sinh vật nhưng không xuất hiện ở động vật m PSPS là enzyme được biến đổi với các đặc tính nhận biết là giống với enzyme gốc trong ngô tới 99,3% Gen mã hóa cho enzyme này được chuyển vào thực vật để tạo thành cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate Glyphosate ức chế hoạt động của EPSPS nội sinh trong cây trồng, kết quả d n đến ức chế quá trình sinh tổng hợp các amino axit thơm và hậu quả là cây trồng bị chết Khác với PSPS được tổng hợp trong cây, mEPSPS bị bất hoạt bởi glyphosate Do đó, cây chuyển gen mã hóa EPSPS phân lập từ vi khuẩn có khả năng chống chịu với thuốc trừ cỏ loại này (Nida và cs., 1996; Padgette và cs., 1995; Stallings và cs., 1991)

Lịch sử sử dụng an toàn của protein enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase:

EPSPS là protein có trong cây ngô, thuộc nhóm protein PSPS được tìm thấy rộng rãi trong thực vật và vi sinh vật nhưng không có trong động vật (Padgette và cs., 1996) Các phân tích sử dụng các công cụ tin sinh học để so sánh sự tương đồng về trình tự axit amin cho thất protein này không tương đồng với bất cứ chất gây dị ứng hay chất độc nào đã biết (Harrison và cs., 1996)

Cơ chế tác động của mEPSPS (enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase): Protein

m PSPS được sản sinh và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các axit amin thơm trong các loài thực vật, vi sinh vật nhưng chúng lại không có mặt ở người và động vật có vú bởi các động vật có vú không có bộ máy đồng hóa để tổng hợp các axit amin có v ng thơm Điều này giải thích đặc tính hoạt động chọn lọc trên thực vật, vi sinh vật mà không gây độc đến động vật của protein mEPSPS

Các đánh giá in vitro về khả năng tiêu hóa: Các đánh giá in vitro đã được tiến hành trên

protein enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase cho thấy enzyme này phân hủy nhanh chóng trong các phản ứng kiểm tra trong hệ tiêu hóa (Harrison và cs., 1996)

Đánh giá tính độc cấp tính: Ngô GA21 hay enzyme biến đổi m PSPS không co tính độc

và dị ứng vì nó không có chuỗi đồng đẳng giống với các protein gây độc và gây dị ứng đã được biết đến Các nghiên cứu về tính độc, dị ứng đã được kết luận bởi EFSA, 2011 và được mô tả trong mục 2.3.e, phần III ở dưới

3.2.2 Nguyên lý chung đánh giá rủi ro đối với cây trồng chuyển gen

Công thức đánh giá rủi ro: Để xác định rủi ro có thể xảy ra đối với một sinh vật tới môi trường, con người và động vật thì chúng ta dựa trên các nguyên tắc sau:

Nguy cơ (Hazard) x điều kiện phơi nhiễm (Exposure) = Rủi ro (Risk)