Đồ án Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L.) sử dụng chỉ thị phân tử SSR

cho các nhà chọn giống tiếp cận nhanh chóng và chính xác để phối hợp với chọnlọc truyền thống, giúp khắc phục nhợc điểm của phơng pháp này.Chỉ thị phân tử là công cụ hữu hiệu, đợc áp dụn

Mở đầu

I Đặt vấn đề

Đợc trồng rộng rãi ở hơn 80 quốc gia trên thế giới, cây bông (Gossypium L.) là loại cây trồng lấy sợi tự nhiên hàng đầu và quan trọng nhất Hàng năm

ngành công nghiệp dệt đã đóng góp vào nền kinh tế khoảng 500 tỉ USD với việc

sử dụng khoảng 115 triệu kiện bông xơ [14] Cùng với nhận thức về vấn đề chămsóc sức khỏe và mức sống phát triển, con ngời quay trở lại sử dụng sợi bông thaycho sợi nhân tạo (sợi bông có những lợi thế nh vốn thấp, năng suất cao, độ thấm,

độ thoáng, giữ nhiệt tốt và không tĩnh điện) làm cho nhu cầu cung cấp sợi bôngngày càng tăng

Việt Nam là một trong những nớc có ngành công nghiệp dệt may pháttriển, sản phẩm dệt may chiếm tới 4,8% cơ cấu giá trị sản xuất công nghiệp [7].Năm 2007, dệt may vơn lên vị trí dẫn đầu trong danh mục các mặt hàng xuất

khẩu, vợt qua cả dầu thô [8], chính vì vậy cây bông (Gossypium L.) cũng là cây

trồng đợc chú trọng Nhng do nhiều khó khăn (sâu bệnh, chi phí sản xuất cao ),thực trạng sản xuất bông vải ở Việt Nam ngày càng giảm, năm 2005 diện tíchbông của cả nớc là 27.996 ha với tổng sản lợng 32.615 tấn, năm 2006 diện tíchgiảm xuống còn 20.900 ha với sản lợng 28.600 tấn [29] Năm 2007 trong tổng số220.000 tấn bông nguyên liệu, Việt Nam phải nhập trên 95% từ các nớc Mỹ, ấn

Độ, Tây Phi, Uzebekistan Theo quyết định phê duyệt chơng trình Phát triểncây bông vải Việt Nam của Thủ tớng Chính phủ, chỉ tiêu đến năm 2015 diện tíchtrồng bông nớc ta cần đạt 30.000 ha, năng suất bình quân 1.5 tấn/ha, sản lợngbông xơ đạt 20.000 tấn, định hớng đến năm 2020 diện tích đạt 76.000 ha, năngsuất bình quân 2 tấn/ha, sản lợng bông xơ đạt 60.000 tấn, để cung cấp nguyênliệu bông xơ cho sản xuất trong nớc, tạo điều kiện cho ngành dệt may phát triển

ổn định [9]

Muốn mở rộng đợc diện tích trồng bông cần phải có chính sách hỗ trợ, tạo

điều kiện cho ngời trồng và quan trọng nhất là phải có giống tốt Các giốngbông hiện nay ở Việt Nam chủ yếu chọn tạo bằng phơng pháp truyền thống (một

số giống bông do Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố chọn tạo đã đợc côngnhận là giống quốc gia và đa vào phổ biến trong sản xuất, gồm có các giốngbông lai: L18, VN20, VN15, VN01-2, VN01-4, GL03 và các giống bông Luồi:TH1, TH2, M45610, TM1, MCU9, LRA5166, D162, C118) Tuy nhiên phơngpháp chọn tạo giống truyền thống có hạn chế là rất khó đáp ứng đợc mục tiêu cảitiến đồng thời cả năng suất, chất lợng sợi và sức chống chịu với điều kiện khắcnghiệt của môi trờng [17] Sự phát triển gần đây của di truyền phân tử đã giúp

cho các nhà chọn giống tiếp cận nhanh chóng và chính xác để phối hợp với chọnlọc truyền thống, giúp khắc phục nhợc điểm của phơng pháp này.

Chỉ thị phân tử là công cụ hữu hiệu, đợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu

đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền Nghiên cứu tính đa dạng di truyền

đóng vai trò rất quan trọng, thông qua phân tích đa dạng có thể chọn tạo đợcnhững cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọn tạo giống cây trồng [3] Van Esbroeckand Bowman (1998) chỉ ra rằng đa dạng di truyền đảm bảo sản xuất chống lạibệnh cây và loài gây hại, do đó có thể thấy đợc lợi ích của gen di truyền trong t-

ơng lai [13] Cho đến nay chỉ thị ADN tiềm năng cho những chơng trình chọngiống bông nhờ chỉ thị phân tử (MAS) đã trợ giúp rất nhiều cho việc chọn tạo đ-

ợc những giống bông có năng suất cao, chất lợng tốt [27]

Đối với cây bông, hiện nay đã có số lợng rất lớn các chỉ thị SSR đợc pháthiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và đợc lu trữ trong cơ sở dữ liệu cácchỉ thị bông (Cotton Marker Database-CDM), cung cấp nguồn chỉ thị phong phúcho các nhà nghiên cứu [12] Đây chính là thuận lợi để chúng tôi thực hiện đềtài:

"Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L.)

sử dụng chỉ thị phân tử SSR"

Đề tài nghiên cứu này là một nội dung nghiên cứu của đề tài thuộc chơng

trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nớc "Nghiên cứu áp dụng chỉ thị phân tử

để chọn tạo giống bông có chất lợng xơ tốt".

II Mục tiêu của đề tài

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 21 giống bông chọn lọc từ tập

đoàn giống của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố, từ đó chọn lọc nhữngcặp giống có đa hình di truyền cao nhất phục vụ lai tạo, tạo quần thể con lai

Chơng I: Tổng quan tài liệu

I.1 Giới thiệu về cây bông

Cây bông là cây công nghiệp quan trọng, có giá trị kinh tế Sản phẩmchính của cây bông là xơ bông, cung cấp nguyên liệu cho dệt may Ngoài ra vỏ

rễ của cây bông còn có thể làm thuốc

I.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ cây bông

Cây bông (Gossypium L.) bao gồm khoảng 45 loài nhị bội và 5 loài tứ bội

với cách thức di truyền phức tạp Nhóm bông nhị bội chia làm 8 nhóm genome

từ A- G và k [15], cho đến nay các loài bông nhị bội có 3 nhóm bông chính:nhóm bông châu phi có kiểu gen a, b, e, f có xuất xứ từ châu phi và châu á;nhóm bông có kiểu genome d có nguồn gốc xuất xứ từ các nớc châu mỹ; nhómbông thứ 3 có kiểu gen c, g, k đợc tìm thấy ở châu úc [24] 52 loài bông kể cả

hai loài bông tứ bội tự nhiên Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, đều

có nguồn gốc từ các loài bông tổ tiên Châu Phi A genome và các loài bông D

genome Tổ tiên của các loài bông tứ bội còn tồn tại cho đến ngày nay là các loài

bông nhị bội Gossypium herbaceum(A1) và Gossypium arboreum (A2) và

Gossypium raimondii (D5) Ulbrich [11] Quá trình tứ bội hóa xẩy ra khoảng 1-2

triệu năm trớc đây [24] đã tạo ra 5 loài bông tứ bội

I.1.2 Đặc điểm hình thái cây bông

Rễ: bông có 1 rễ cọc đâm sâu xuống đất, từ rễ cọc phát triển rễ thứ cấp vàphân nhánh mạnh

Thân, cành: thân bông cao từ 0.7-1.5m tùy vào giống và điều kiện môi ờng, trên thân có các đốt, trung bình từ 20-30 đốt Cành có 2 loại là cành đực vàcành quả

tr-Lá: lá có màu xanh, một số giống có màu nâu đỏ Lá bông có từ 3-5 đến 7thùy

Hoa: hoa bông đợc hình thành từ nách của lá, thân hoặc cành Hoa lỡngtính có 3 lá đài, 5 cánh hoa có màu trắng, màu kem và màu vàng, bầu lớn nằmgiữa hoa, bầu hoa có 3-5 ô, mỗi ô phát triển thành một múi, mỗi múi có 6-11noãn Bông là cây tự thụ phấn nhng cũng có thụ phấn chéo nhờ côn trùng Cónhững giống bông thụ phấn kín do hoa không nở

Xơ: là biến dạng của lớp biểu bì của hạt Sau khi thụ tinh xơ bông trởngthành cùng quả, sau khi hoa nở 15-20 ngày xơ bông đạt chiều dài cao nhất khiquả chín Xơ khô có dạng sợi xoắn

Quả và hạt: mỗi cây có từ 100-300 quả, mỗi quả nặng 6g, mỗi quả có

4-5 múi, mỗi múi có 6-7 hạt

I.1.3 Điều kiện sinh thái của cây bông

Bông là cây có nguồn gốc nhiệt đới, a sáng nên đòi hỏi cao về nhiệt độ và

ánh sáng Nhiệt độ tối u cho bông nảy mầm, sinh trởng, phát triển là 25-30oC,

d-ới 25oC phát triển chậm lại, ở 37-40oC cây ngừng phát triển Bông là cây cần

‘đầu khô, chân ẩm’, nhng không chịu úng Do có bộ rễ khá phát triển nên bông

có khả năng chịu hạn tốt Hầu hết các loại đất trồng cạn đều có thể trồng bôngvải, có pH thích hợp pHKCl>5 và độ mặn < 0.4% [1]

Các vùng trồng bông truyền thống có điều kiện đất đai, khí hậu thích hợptại các tỉnh [9]:

Tây Nguyên: Đắc Lắk, Đắc Nông, Gia Lai

Duyên hải Nam Trung Bộ: Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Phớc, ĐồngNai, và Bà Rịa- Vũng Tàu

Các tỉnh vùng núi phía Bắc: Điện Biên, Sơn La, Thanh Hóa, Bắc Giang

Trong đó vùng trọng tâm là Tây Nguyên.

I.1.4 Đặc điểm genome cây bông

Kích thớc genome cây bông biến động tùy loài: kích thớc genome nhỏ

nhất đợc ghi nhận ở loài G.raimondii Ulbrich, đạt khoảng 880 Mb Genome đơn bội của G.arboreum có kích thớc khoảng 1,75 Gb và G.hirsutum có kích thớc 2,5

Gb [16] Biến động thành phần DNA ở các loài nhị bội phản ánh mức độ nhiềuhay ít của các bản sao các trình tự lặp lại khác nhau [28] Thành phần DNA củacác loài đa bội xấp xỉ bằng tổng số của genome bố mẹ A và D [18]

I.1.5 Giá trị sản xuất thơng mại của các loài bông

Trong các loài bông chỉ có 4 loài bông đợc trồng lấy sợi bao gồm hai dạng

nhị bội genome A (2n=2x=26) là G.herbaceum (A1) và G.arboreum (A2) và 2 dạng tứ bội (song lỡng bội khác nguồn A, D (2n=2x=52) là G.hirsutum,

G.barbadense.

Hiện nay các giống bông đợc trồng phổ biến trong sản xuất đều là bông tứbội có nguồn gốc lai giữa hai nhóm genome A và D Trong khi đó, chỉ có cácloài bông thuộc nhóm genome A cho bông lấy sợi còn nhóm genome D thì

không [14] Hai loài bông tứ bội G.hirsutum L, G.barbadense L chiếm tơng ứng

90% và 5% sản lợng bông trên toàn thế giới [25]

I.2 Đa dạng di truyền

I.2.1 Khái niệm [4]

Đa dạng di truyền: là tập hợp biến đổi của các gen và các kiểu gen trongnội bộ của một loài

Đa dạng di truyền là chìa khóa của một loài có thể tồn tại trong tự nhiên,vì nó có khả năng thích nghi với thay đổi bất lợi của thời tiết, khí hậu, môi trờng,phơng thức canh tác, sức đề kháng của các loài sâu bệnh Do đó nó là nguồncung cấp vật liệu cho mọi chơng trình chọn tạo và cải tiến giống, cho một nềnnông nghiệp phát triển bền vững

Đa dạng di truyền thể hiện sự tách biệt về tính kế thừa trong hay giữa cácquần thể sinh vật

I.2.2 Nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền

Trong suốt quá trình tồn tại và phát triển, một loài có thể tạo thành nhữngnhóm quần thể phân bố trong những điều kiện sinh thái khác nhau và luôn biến

đổi, nên sẽ có những chiều hớng biến đổi khác nhau gây ra do đột biến (đột biếngen, đột biến NST) Biến đổi đó trớc hết là trong kiểu gen và cuối cùng là kiểuhình thích nghi, điều đó tạo nên sự khác nhau giữa các nhóm loài Sự biến đổinày không chỉ xẩy ra giữa các quần thể của loài mà ngay giữa các cá thể trongmột quần thể, đã đợc biểu hiện ra bằng hình thái hoặc chỉ mới là sự thay đổi

trong genome Bên cạnh những biến đổi di truyền do áp lực chọn lọc tự nhiên thìbiến đổi do áp lực nhân tạo (gây đột biến nhân tạo) cũng góp phân rất lớn Dovật chất di truyền có thể sao chép chính xác từ thế hệ sinh vật này sang thế hệsinh vật khác qua sinh sản nên những biến đổi về mặt di truyền luôn đợc bảo tồn

và phát triển tạo nên tính đa dạng di truyền

I.2.3 Các mức độ đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền thể hiện ở mức độ phân tử và cá thể Mức độ phân tửbiểu hiện ở sự đa dạng các alen giữa các cá thể sinh ra do đột biến gen hoặc do

sự tách biệt về tính kế thừa các nguồn genome có trớc Nói xa hơn, tập hợp đadạng các alen giữa 2 cá thể sẽ tạo nên sự khác nhau về genome của 2 cá thể đó.Mức độ cá thể biểu hiện ở số lợng các NST của cá thể hay nhóm cá thể đó nh: cócác loài đơn bội, lỡng bội và đa bội

Trong sinh học phân tử, khi nói đến sự đa dạng ADN, nghĩa là sự khácnhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở mộtvùng địa lý nhất định Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nh-

ng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa 2 cá thể cùngloài [4]

I.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền

I.3.1 Chỉ thị hình thái [2]

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật đợc sử dụng từ rất sớm.Nguyên tắc cơ bản của phơng pháp này là: hai đơn vị phân loại (taxon) càng cónhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần gũinhau Ngời ta thờng kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kếtquả so sánh

Các chỉ thị hình thái có u điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, nhng việclựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trongnhững khâu khó khăn nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinhnghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học Bên cạnh đó phơng pháp nàynhiều khi không chính xác vì có hiện tợng đồng quy tính trạng và không phânbiệt đợc các loài đồng hình

I.3.2 Chỉ thị isozym

Các isozym đợc định nghĩa nh các dạng khác nhau của một enzym(protein), có chức năng giống hay gần gũi nhau ở cùng một cá thể [21] Sự khácnhau về cấu trúc bậc 1 của protein enzym do đột biến gen và quá trình chọn lọc

các quần thể cùng loại theo chiều hớng ngoại cảnh khác nhau, làm các enzymkhác nhau về trọng lợng, kích thớc.

Protein enzym là chất đa điện ly nên ở dạng dung dịch nó ở trạng tháiphân cực về điện tích Dới tác dụng của dung dịch đệm có pH khác nhau protein

sẽ mang điện tích (-) hoặc (+) Trong điện trờng của dòng một chiều các proteinkhác nhau di chuyển về phía anot hay catot theo tốc độ khác nhau Nếu phân tửprotein có kích thớc nhỏ, trọng lợng phân tử bé, lực hút tĩnh điện lớn thì sẽchuyển động nhanh và ngợc lại Do đó chúng sẽ nằm ở vị trí khác nhau trên bảngel khi chạy điện di hỗn hợp protein, sự khác nhau của các cấu tử điện di của cácisozym đợc dùng để so sánh, đánh giá sự khác nhau về bản chất di truyền củacác loài Sự khác nhau càng ít thì mối quan hệ họ hàng giữa chúng càng gần vàngợc lại

Việc phân tích isozym cho ta những allen đồng trội, là phơng pháp tơng

đối rẻ, dễ tiến hành hơn các phơng pháp phân tích ADN Tuy nhiên với số lợng ít

ỏi các isozym và chúng chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình pháttriển cá thể và là sản phẩm của gen nên cha phản ánh thật chính xác bản chất ditruyền của các cá thể Do vậy việc sử dụng chỉ thị isozym còn có những hạn chếnhất định

I.3.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Chỉ thị phân tử đợc ứng dụng rộng dãi trong phân tích di truyền, nghiêncứu lai giống, nghiên cứu đa dạng di truyền và họ hàng giữa các giống, loài và tổtiên hoang dại của chúng Chỉ thị phân tử có một vài u điểm khi so sánh với chỉthị hình thái nh: mức độ đa dạng cao và nhận ra đợc ảnh hởng của điều kiện môitrờng và phạm vi hoạt động sinh thái của thực vật [13]

Các chỉ thị phân tử rất phong phú do tính đa dạng của ADN Các chỉ thịphân tử chia làm 2 nhóm bao gồm: Chỉ thị dựa trên cở sở lai acid nucleic (RFLP

- Restriction Fragment Length Polymorphism) Các chỉ thị dựa trên cơ sở củaphản ứng PCR (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA, SSR - SimpleSequence Repeats…, và các loại chỉ thị phân tử khác nh SNP (Single NucleotidePolymorphism …) Các chỉ thị phân tử hiện nay đợc ứng dụng có hiệu quả trongnghiên cứu đa dạng di truyền thực vật

I.4 Một số LOạI chỉ thị phân tử

I.4.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai acid nucleic: RFLP (Restriction

Fragment Length Polymorphism)

Lai acid nucleic gồm 2 kiểu: lai ADN (ADN hibrization) hay còn gọi là laiSouthern và lai ARN (ARN hibrization) hay còn gọi là Northern [3]

RFLP có nghĩa là đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn Các đa hìnhRFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạntrong hệ gen.

Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN đặc hiệu trong cấu trúc, sự thay đổi,mất đi hay thêm vào các nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng củamỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể Vì vậy khi dùng enzym cắt giới hạn đểcắt phân tử ADN của hệ gen của các đối tợng khác nhau, nếu nh có đa hình các

đoạn cắt hạn chế thì các đoạn ADN cần kiểm tra đa hình (các đoạn ADN có

đoạn trình tự bổ sung với ADN mẫu dò) ở các đối tợng sau khi bị cắt sẽ có chiềudài khác nhau Sau đó dùng kỹ thuật lai Southern ngời ta có thể nhận biết đợcnhững đoạn ADN có chiều dài khác nhau này ADN mẫu dò đợc sử dụng để lai

sẽ có trình tự bổ sung với đoạn trình tự ADN bảo thủ của ADN đích

Chỉ thị RFLP đợc ứng dụng rộng rãi và có ý nghĩa quan trọng trong lậpbản đồ gen, phân lập gen, xác định số bản sao của gen, phân tích cấu trúc vàchức năng gen …[3] Chỉ thị RFLP đợc sử dụng lần đầu tiên bởi Bitstein và cs(1980) để xây dựng bản đồ liên kết di truyền ở ngời RFLP cũng đợc dùng đểnghiên cứu về di truyền của nhiều đối tợng thực vật khác nhau nh: lúa, cà chua,ngô, khoai tây, bắp cải, bông… Đối với đối tợng bông, công trình của Rong vàcộng sự 2004 sử dụng chỉ thị RFLP đã định vị đợc 2.584 locus phân bố thành 26nhóm liên kết cách nhau 1.72 cM (khoảng 600 Kb) [20]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội có nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cảcác allen của cùng một locus gen Do vậy, có thể phân biệt đợc các cá thể đồnghợp tử AA hoặc aa và các cá thể dị hợp tử Aa Do sử dụng mẫu dò mang tính đặchiệu nên chỉ thị này có độ chính xác rất cao, dùng để kiểm tra chỉ thị phân tửkhác

Hạn chế của chỉ thị RFLP: tiêu tốn nhiều thời gian, sức lực, khối lợngcông việc cồng kềnh

1

2n

 

Trong đó:

D: Là lợng ADN ban đầu

N: Tổng số ADN tổng hợp mới sau n chu kỳ.

Thành phần phản ứng PCR

Trong phản ứng PCR gồm có thành phân cơ bản sau: ADN khuôn, dNTP,mồi (primer), enzyme polymeraza (Taq), MgCl2, và đệm PCR Phản ứng PCR đ-

ợc thực hiện trong chu kỳ máy nhiệt (máy PCR)

ADN khuôn (DNA template): có thể là đoạn mạch đơn hoặc mạch đôi củachuỗi ADN hay ARN, thờng dài từ 300 bp trở lên, đã biết trớc trình tự hai đầu đểthiết kế mồi Thông thờng lợng ADN khuôn cho vào mỗi phản ứng nên sử dụng

khoảng dới 1 μgg đối với ADN hệ gen.

ADN mồi (primer): là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 6-100 bp(thờng có độ dài từ 20-30 bp), có trình tự bazơ nitơ bổ trợ với trình tự bazơ nitơhai đầu của đoạn ADN khuôn Nó đợc sử dụng làm mồi cho sự khởi đầu quátrình tổng hợp ADN Các đoạn mồi cần mang tính đặc thù để làm tăng tính đặchiệu của phản ứng Mồi càng dài, khả năng tổng hợp chính xác đoạn ADN đích

càng lớn Nồng độ mồi thờng dùng khoảng 1-2 μgM.

Các nucleotide (dNTP): là hỗn hợp của 4 loại dATP, dCTP, dGTP, dTTPlàm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN Nồng độ dNTP thờng dùng

khoảng 100 μgM.

Enzym ADN polymeraza chịu nhiệt: có nhiều loại enzym polymeraza chịu

nhiệt nh: Taq ADN polymeraza tách ra từ vi khuẩn Thermus aquatucus, Pfu ADN polymeraza đợc tổng hợp từ vi khuẩn Thermococcus litoralis, Tth ADN polymeraza tổng hợp từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus… Mỗi loại đều có đặc

điểm riêng nhng thông dụng nhất là Taq ADN polymeraza, có trọng lợng phân tử

94 kDa và hoạt động tốt nhất ở 70-80oC Enzym này có hoạt tính 5’-3’exonucleaza

Dung dịch đệm: thành phần chung nhất của dung dịch đệm gồm: KCl,MgCl2, và Tris [3] Trong đó quan trọng nhất là ion Mg++ Nó hình thành mộtphức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của ADN sợi đôi vàtăng khả năng gắn mồi vào khuôn Nồng độ cuối cùng của Mg++ trong phản ứng

biến đổi từ 0.5-5.0 mM, tối u là 1- 1.5 mM.

Diễn biến phản ứng PCR

Giai đoạn 1: Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 93-98 oC, thời gian từ 1-5 phút.ADN khuôn sợi đôi (ADN tổng số) đợc biến tính Khi đó các liên kết hydro giữahai mạch đơn sẽ bị phá vỡ và hai mạch đơn tách nhau ra Nếu G+C > A+T (liênkết bổ sung giữa hai sợi đơn bền hơn) hoặc khuôn ADN khá dài thì nhiệt độ biếntính càng phải cao hay thời gian biến tính lâu hơn.

Giai đoạn 2: Phản ứng diễn ra theo chu kỳ Thờng là 20-40 chu kỳ Mỗi

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

Đoạn ADN tổng hợp đợc ở chu kỳ 1 có chiều dài tùy thuộc vào thời gian tổng hợp Thời gian tổng hợp đợc cài đặt sao cho đoạn ADN này ít nhất phải bằng hoặc dài hơn đoạn ADN cần tổng hợp Kết thúc chu kỳ 1 Chu kỳ 2 … .n

Từ chu kỳ thứ 2….n có diễn biến tơng tự nh chu kỳ 1 Tuy nhiên thời gian biến tính là 30 giây -1 phút ADN khuôn trong các chu kỳ này ngoài ADN tổng số còn có các đoạn ADN đợc tổng hợp ở các chu kỳ trớc đó, lúc này sẽ cho sản phẩm là đoạn ADN cần tổng hợp do nó sẽ bị chặn 2 đầu bởi cặp mồi Số lợng các đoạn ADN cần tổng hợp sau mỗi chu kỳ ngày càng nhiều Do đó sau khi kết thúc phản ứng PCR ta sẽ khuếch đại đợc số lợng lớn ADN cần nhân lên Chu kỳ 2 3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

Kết thúc chu kỳ 2

Chu kỳ 3

3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

Sản phẩm ADN 5’ 3’

Kết thúc chu kỳ 3 Chu kỳ 4 đến chu kỳ n diễn ra giống chu kỳ 1, 2, 3 nhng ADN khuôn sử dụng chủ yếu là ADN sản phẩm

Giai đoạn 3: Sau khi kết thúc chu kỳ cuối cùng, Các đoạn ADN ở các chu

kỳ trớc cha tổng hợp xong sẽ đợc tổng hợp nốt ở nhiệt độ 70-75 oC, thời gian từ 5-10 phút

Chấm dứt phản ứng và cất giữ ở nhiệt độ lạnh

I.4.2.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplymorphic ADN).

RAPD nghĩa là kỹ thuật nhân ngẫu nhiên đa hình các đoạn ADN, đợc phát hiện bởi William và cs, 1990 RAPD là kỹ thuật dựa trên nguyên lý PCR, sử dụng những đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) đợc tổng hợp ngẫu nhiên Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí nào có trình tự bổ sung với nó Sản phẩm PCR đợc chạy điện di trên gel agarose 2% nhuộm cùng EtBr để phân tách các băng ADN và phát hiện các băng ADN

dới tia sáng của đèn cực tím [3].Do tính ngẫu nhiên nên có thể có rất nhiều đoạnADN đa hình có kích thớc khác nhau đợc nhân bản sau phản ứng PCR RAPD-trong đánh giá tính đa dạng di truyền chính là dựa vào việc phân tích, so sánhcác đoạn ADN đa hình của các đối tợng nghiên cứu để thấy đợc sự giống vàkhác nhau trong cấu trúc genome của nó.

Chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi nó biểu hiện sự có mặt hay vắng mặtnhững băng ADN đặc trng Vì vậy không phân biệt đợc thể dị hợp tử trong quầnthể F2

Chỉ thị RAPD có u điểm là không cần phải biết trớc thông tin về trình tựADN để thiết kế mồi, rẻ tiền, nhanh gọn Tuy nhiên do sử dụng mồi ngắn vànhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 34-37 oC) nên độ chính xác kém Vì thế cần tiếnhành thí nghiệm nhiều lần để có kết quả chính xác

RAPD rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ sử dụngquần thể RIL (Recombinant Inbred Line) [3]

I.4.2.3 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [3]

AFLP có nghĩa là đa hình độ dài các đoạn ADN đợc khuếch đại chọn lọc,

do Vos và cs phát hiện ra năm 1975

Kỹ thuật này đợc phát triển trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạnADN đã đợc cắt bằng enzym cắt giới hạn Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này là

sự thiết kế mồi PCR đặc trng

Quy trình thiết kế mồi đặc trng nh sau:

Bớc 1: ADN đợc cắt bằng enzym cắt giới hạn, thờng là enzym EcoRI(nhận biết 6 nucleotide) và MseI (nhận biết 4 nucleotide), tạo thành vô số mảnh

có kích thớc khác nhau, mỗi mảnh đều biết trớc trình tự nucleotide hai đầu cắt

Bớc 2: Dựa vào trình tự ở đầu cắt, thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắnchúng vào mỗi đầu

Bới 3: Dựa vào trình tự adapter, ngời ta thiết kế mồi PCR Mồi gồm 2phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần kia là nhữngnucleotide đợc thêm vào tùy ý, thông thờng từ 1-3 nucleotide

Với mồi đợc thiết kế nh vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự hai

đầu bổ sung với trình tự mồi mới đợc nhân bản

Nh vậy có thể nói kỹ thuật AFLP đợc phát triển bởi sự kết hợp các yếu tố

kỹ thuật RFLP và phản ứng PCR để nhân các đoạn giới hạn đặc trng Sản phẩmPCR của mỗi mồi ở mỗi mẫu nghiên cứu sẽ xuất hiện băng ADN đặc trng nếukhông có đột biến tại điểm cắt của enzym giới hạn tơng ứng với vị trí bắt cặp củamồi, ngợc lại sẽ không xuất hiện băng ADN đặc trng

Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội, và vị trí trên nhiễm sắc thể của chúng cha

đợc xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F2 thìcần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trớc vị trí trên NST nhRFLP và SSR

I.4.2.4 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)

SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn trình tự lặp lại đơn giản, còn gọi làphơng pháp vi vệ tinh (Microsatellite), do Lit và Luty giới thiệu và năm 1989 khinghiên cứu genome của một số sinh vật đã phát hiện ra những đoạn ADN cóchiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồmcác nhóm nucleotide lặp lại một cách có trình tự [5]

Các nhóm nucleotide lặp lại này thờng có trình tự không vợt quá 5nucleotide nh (TG)n hoặc (AAT)n ở lúa các nucleotide đã phát hiện đợc gồm

GA, GT, CAT, CTT Những đoạn ADN lặp lại nh vậy đợc gọi là Microsatelinehay còn có tên khác nh: SSLPs (single sequennce length polymorphisms), SSRs(simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats) Các đoạn ADN này cótrình tự hai đầu rất đặc trng cho mỗi đoạn, bởi vậy trình tự đặc trng cho mỗi đầucủa đoạn nhắc lại này đợc sử dụng để thiết kế mồi cho PCR [3]

Các ‘vi vệ tinh’ rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật Vùng cóADN lặp lại thờng kém ổn định hơn các vùng khác, nên ở các cá thể khác nhau,trình tự đó đợc lặp lại với số lần khác nhau Do đó vùng này thờng đa dạng hơncác vùng khác

Các đa hình SSR đợc sinh ra do mồi SSR khuếch đại vùng ADN lặp lại cótrình tự bổ sung với hai đầu của vùng này trong phản ứng PCR; dùng để so sánhgiữa các đối tợng cần nghiên cứu Nếu các vùng ADN lặp lại của các đối tợngnày (do cùng một mồi SSR khuếch đại) có đa hình, do có số lần lặp lại khácnhau thì khi sản phẩm PCR đợc điện di và chụp ảnh gel sẽ phát hiện đợc cácbăng đa hình

Kỹ thuật SSR đơn giản, tiện lợi và rất hữu ích trong nghiên cứu genome vìchúng đợc thiết kế dựa trên những vùng mã hóa có tính bảo thủ cao trong hệ gen[22] Hơn nữa chỉ thị ssr thờng chỉ khuếch đại các locus đặc trng cho sự đadạng của các loài trong 1 chi, đôi khi 1 họ [19] Tuy nhiên nhợc điểm của chỉ thịnày là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém

Trong số các chỉ thị đợc sử dụng để lập bản đồ, ssr là loại chỉ thị đặc biệt

đợc sử dụng nhiều bởi tính đồng trội và đa allen [22] Chỉ thị ssr có thể sử dụngcho các quần thể để lập bản đồ khác nhau, cho các nghiên cứu về tiến hóa củagenome, so sánh genome cũng nh sử dụng hiệu quả nguồn gen trong chọn tạogiống nhờ chỉ thị phân tử

Đối với đối tợng genome cây bông, nhiều lỗ lực phát triển chỉ thị ssr đã

đợc tiến hành và chỉ thị ssr đang đợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản

đồ di truyền cây bông [20], [23], [26]

Hàng nghìn chỉ thị ssr của bông đợc xác định tại các phòng thí nghiệmkhác nhau: Brookhaven National Laboratoy (BNL), Texas A&M University [23]nghiên cứu gần đây nhất của Wangzhen Guo và cs 2007 đã sử dụng chỉ thị ssr

định vị đợc 1790 locus ở 26 nhóm liên kết bao phủ một vùng 3425,8 cM vớikhoảng cách trung bình giữa các locus là 1,91 cM Trong đó bản đồ liên kếtgenome này bao gồm 71,96% các locus gen chức năng, 475 locus có liên kết với

3 loại gen chính quy định quá trình sinh học, thành tế bào, chức năng phân tử ởbông

Ngoài các chỉ thị phân tử đã đợc đề cập đến trong nội dung đề tài này còn

có rất nhiều các chỉ thị khác nữa: STS (sequennce tag site), SCAR (sequencecharacterized amplified region), CAPS (cleaved amplified polymorphicsequence)

I.5 tình hình Nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối tợng cây bông

I.5.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông trên thế giới

Là một cây trồng quan trọng nhng do có bộ gen lớn và phức tạp, nên côngtác nghiên cứu genome bông tiến chậm hơn so với các cây trồng khác nh lúa,ngô, đậu tơng [26]

Những thành tựu khoa học sử dụng chỉ thị phân tử nh sử dụng chỉ thịRFLP, chỉ thị SSR, hay RAPD (mục I.4) định vị đợc rất nhiều các locus trêngenome bông đã tạo điều kiện để việc nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối tợngbông sử dụng chỉ thị phân tử, trở nên thuận tiện hơn

Trong các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền chỉ thịRFLP, SSR có mức độ chính xác rất cao, nhng RFLP có khối lợng công việccồng kềnh nên ít đợc sử dụng hơn chỉ thị SSR

Cãndida H.C de Magalhães Bertini và cs (2006) đánh giá đa dạng di

truyền các giống bông (Gosypium hirsutum L) đang đợc trồng ở Brazil,

Argentine và Paraguay Sau khi tách chiết ADN của 53 giống bông và nghiêncứu tính đa dạng, sử dụng 31 cặp mồi SSR, khuếch đại 33 locus Kết quả thu đ -

ợc tổng số 66 allen, trung bình 2,13 allen/locus SSR và giá trị PIC khác nhau từ0,18 - 0,62 giá trị trung bình là 0.4, hệ số không tơng đồng từ 0 - 0,41 Cũng trên

đối tợng bông, Gutierrez và cs (2002) đã sử dụng 60 cặp mồi cho đa hình, kếtquả khuếch đại 69 locus với tổng số 139 allen và trung bình có 2 allen/locus Liu

và cs (2000b) đã sử dụng 56 cặp mồi cho đa hình, khuếch đại 62 locus bông vàthu đợc tổng số 325 allen, trung bình 5 allen/lucus, giá trị PIC tính đợc là từ0.05- 0.82 giá trị trung bình là 0.31 Các giống bông mà Liu và cs (2000b) sử

dụng có cả các giống G.hirsutum hoang dại Multani và Lyon (1995), khi phân

tích đa dạng di truyền giữa 9 giống bông của úc sử dụng chỉ thị RAPD cũng thu

đợc kết quả giá trị khoảng cách di truyền thấp (0.01-0.08) Iqbal và cs (1997)cũng sử dụng chỉ thị RADP tìm ra khoảng cách di truyền thấp (0.18-0.07) giữa

17 giống G.hirsutum [13].

A B Dongre* và cs, (2007) đã đánh giá đa dạng di truyền của 19 đối tợng

bông gồm: 11 kiểu gen của loài G hirsutum và 8 kiểu gen của loài G arboreum,

sử dụng 25 mồi SSR đợc lựa chọn ngẫu nhiên từ tập hợp mồi JESPR-307 dophòng thí nghiệm Brookhaven National Laboratories công bố và 19 mồi ISSR.Trong số 25 chỉ thị SSR có 17 chỉ thị cho tổng số 56 băng đa hình, 4 chỉ thị là

đơn hình và 4 chỉ thị còn lại là không ghi đợc kết quả và không cho băng đa

hình Hệ số tơng đồng giứa hai loài G.hirsutum và G.arboreum là 0.59, khi so sánh hệ số tơng đồng của các giống nhị bội G.arboreum (0.618) thấy nhỏ hơn của các giống tứ bội G.hirsutum (0.718) Trong số 19 chỉ thị ISSR tạo ra 72 băng

đa hình, một mồi là đơn hình, 3 mồi không ghi đợc kết quả và không cho đa

hình Hệ số tơng đồng giữa hai loài G.hirsutum và G.arboreum là 0.59 và cũng

cho kết quả hệ số tơng đồng của các loài tứ bội cao hơn các loài lỡng bội [10]

I.5.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông tại Việt Nam [6].

ở Việt Nam, Nguyễn thị Minh Nguyệt và cs (2009) đã nghiên cứu đadạng di truyền của 49 giống bông địa phơng và nhập nội, đại diện cho 3 nhóm

bông Luồi (G.hirsutum L.), bông Hải Đảo (G.babardense L.), bông Cỏ (G.arboreum L.) sử dụng 50 cặp mồi SSR Kết quả trong số 50 cặp mồi kiểm tra,

có 27 cặp mồi cho đa hình với tổng số allen thu đợc là 128, độ tơng đồng ditruyền giữa các giống bông nằm trong khoảng 0.48-0.97 trung bình là 0.8, cáccặp giống xa nhau nhất về di truyền (có hệ số tơng đồng 48%) chủ yếu là nhữngcặp bông Luồi-bông Hải Đảo Đa dạng di truyền quan sát đợc trong nhóm cácgiống bông Luồi cao hơn so với 2 nhóm bông Hải Đảo và bông Cỏ Cũng trongnghiên cứu này, 49 giống bông nghiên cứu đã chia làm 3 nhóm: nhóm 1 gồm 16giống bông Hải Đảo, nhóm 2 gồm 21 giống bông Luồi, nhóm 3 gồm 12 giốngbông Cỏ Độ tơng đồng di truyền của nhóm 1 với 2 nhóm bông còn lại thấp, chỉkhoảng 59% Nhóm bông Luồi và bông Cỏ gần nhau về mặt di truyền hơn, với

độ tơng đồng di truyền khoảng 67% Độ tơng đồng di truyền giữa các giốngbông trong cùng nhóm phân loại khá cao, trên 84%.

Chơng II: Vật liệu và phơng pháp

nghiên cứu

II.1 Vật liệu

II.1.1 Vật liệu thực vật

Chúng tôi nghiên cứu 21 giống bông bao gồm: 11 giống bông luồi

(G.hirsutum L.) và 10 giống bông Hải đảo (G.barbadense L.) chọn lọc từ tập

đoàn giống của Viện nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố

Bảng 1: Danh sách các giống bông Luồi

tt Tªn gièng Mst§ Nguån gèc N¨m thu thËp

II.1.2 Hãa chÊt, thiÕt bÞ

II.1.2.1 Hãa chÊt

C¸c hãa chÊt th«ng dông dïng trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö:

CTAB, NaCl, Taq polymeraza, dNTP, PVP, BSA, Tris- HCl, Na2-EDTA,

DIECA, β- mercaptoethanol, Ascorbic acid, Etanol 100%, NaOAc (sodium

acetat), isoamyl alcohol, chloroform, isopropanol, ethidium bromide (EtBr)

II.2 Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu

II.2.1 T¸ch chiÕt ADN tæng sè

ADN lá bông đợc tách chiết và tinh sạch theo phơng pháp CTAB và Doyle

và Doyle (1987) có cải tiến

II.2.1.1 Chuẩn bị vật liệu

-Chuẩn bị mẫu lá non của mỗi giống: các tế bào lá non có cấu trúc màng

tế bào dễ bị phá vỡ, sẽ thuận lợi khi tách chiết ADN

+Phá vỡ màng tế bào và màng nhân đồng thời giải phóng ADN ra ngoài

+Dung dịch Tris- HCl pH 8.0 làm ổn định pH dung dịch đệm chiết.

+Na2-EDTA pH 8.0 có tác dụng gắn chặt các ion Mg++ là yếu tố cần thiếtcho sự hoạt động của enzyme nucleaza, làm bất hoạt enzyme này

+NaCl làm tăng khả năng hòa tan nucleic acid trong dung dịch

-Dung dịch đệm rửa:

Hỗn hợp đệm rửa phải có nồng độ cồn cao, nồng độ muối cao để tránh cho ADN

đã kết tủa bị hòa tan trở lại gây tổn thất ADN.

-Các hóa chất và dụng cụ cần dùng khác

II.2.1.2 Quy trình tách chiết

-Mẫu lá non đợc nghiền trong nitơ lỏng (-196oC) trong ống eppendorf 2

ml Trong nitơ lỏng các mô bị đông cứng, dới tác dụng của cơ học chúng dễ

dàng bị phá vỡ Ngoài ra ở nhiệt độ thấp các enzyme đều bị bất hoạt, tránh choADN bị phân hủy bởi enzyme Dnase có trong tế bào khi nghiền

-Thêm 1 ml dung dịch đệm chiết

-ủ 65oC trong 90 phút , cứ 15 phút lắc đều 1 lần

-Cho 500 l chloroform: isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ trong 5 phút, sau

đó ly tâm 12.000 (vòng/phút) trong 15 phút Trong quá trình này protein,polysaccharide, lipid và các chất hữu cơ khác bị biến tính Khi ly tâm các chấtnày và xác tế bào tách ra khỏi hỗn hợp, còn lại phần dịch hòa tan ADN ở phíatrên

-Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới, cho 500l

isopropanol để tủa ADN Ly tâm 12.000 (vòng/phút) trong 15 phút để thu tủa

-Rửa tủa bằng 500 l Wash buffer I, sau đó ly tâm 12.000 (vòng/phút)

trong 5 phút để thu tủa

-Tiếp tục rửa bằng 500l Wash buffer II, sau đó ly tâm 12.000

(vòng/phút) trong 5 phút để thu tủa

-Để khô ADN sau đó cho 50 l TE

-Khử ARN bằng cách cho thêm 4 l RNAse/eppendorf trong tủ ấm 37oCtrong 3h

II.2.1.3 Kiểm tra ADN tổng số

Chất lợng và nồng độ ADN tổng số đợc kiểm tra trên gel agarose 0.8%.Nồng độ chính xác đợc đo trên máy quang phổ Nanodrop.

Nếu ADN tách chiết có chất lợng tốt, khi kiểm tra trên gel agarose 0.8%chỉ có 1 vạch ADN quan sát đợc Nếu ADN bị gãy vụn thành nhiều đoạn trongquá trình tách chiết thì trên gel agarose sẽ quan sát thấy có nhiều vạch ADN t-

ơng ứng với các đoạn có mức độ dài ngắn khác nhau

II.2.3 Điện di, phát hiện sản phẩm

Phơng pháp điện di tiến hành theo phơng pháp điện di trên gel agarose củaKhoa Genome thực vật, Trờng Đại học công nghệ Texas Mỹ 2004 có cải tiến

II.2.3.1 Nguyên tắc

Trong quá trình điện di do ADN tích điện (-) nên các băng ADN sẽ dichuyển từ phía cực (-) sang phía cực (+) của bể điện di Điện áp càng cao ADN

di chuyển càng nhanh Thời gian điện di tùy thuộc vào kích thớc sản phẩm PCR

Sau khi kết thúc điện di các băng ADN có kích thớc khác nhau sẽ đợcphân tách do chúng có tốc độ di chuyển khác nhau Có thể quan sát thấy khichụp ảnh gel

II.2.3.2 Chuẩn bị gel agarose

Gel agarose: là một loại polymer tách từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monomer

là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose

-Bột agarose đợc hòa tan trong dung dịch đệm theo đúng tỷ lệ (đối với

kiểm tra ADN tổng số, gel agarose đợc chuẩn bị với nồng độ 0.8%, đối với kiểm tra sản phẩm PCR, gel agarose đợc chuẩn bị với nồng độ 3.5%)

-Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng

-Hạ nhiệt độ sôi của gel xuống khoảng 50oC

-Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0.5 g/ ml Quan sát chất

này khi chiếu đèn cực tím nó phát huỳnh quang màu cam, khi EtBr liên kết với

ADN cờng độ màu có thể tăng lên gần 20 lần

-Chuẩn bị khay gel và lợc

-Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel, cắm lợc Thời gian chờ gel

đông là 45-60 phút

Gel trớc khi đổ vào khay phải không có bọt Nếu nh có bọt sẽ làm ảnh ởng đến kết quả của ảnh gel không đợc đẹp

h-II.2.3.3 Điện di sản phẩm PCR

Sau khi chuẩn bị gel xong tiến hành điện di theo các bớc sau:

-Tra mẫu ADN

-Chuẩn bị dung dich đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di

-Chạy điện di tại 100 mA

-Rửa gel trong nớc, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh

II.2.4 Phơng pháp phân tích số liệu: phơng pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS pc v.2.1 ( Biostatistics Inc, 2002)

Gel điện di sản phẩm của phản ứng PCR đợc soi trên máy UV và chụp

ảnh ảnh gel đợc dùng để nhận dạng ADN của từng các thể, sau đó so sánh nhậndạng ADN giữa các giống để phân tích đa dạng di truyền, thể hiện thông qua:

-Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) đợc coi là thớc đo tính đa dạng di truyền của các alen ở từng locus SSR Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC

có thể đợc coi nh là sự đa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu và tính theophơng trình [13]:

Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alen thứ j tơng ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều allen đợc sinh ra

-Hệ số tơng đồng di truyền S [3]: phản ánh mức độ giống nhau và khácnhau giữa các giống Cơ sở để tính toán hệ số này là mô hình toán Nei và Li(1979) nh sau:

2 xy

N S

Sau khi nhận dạng ADN, bảng dữ liệu nhị phân đợc chuẩn bị gồm các số 0

và 1, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí.Bảng dữ liệu nhị phân này sẽ đợc nhập vào chơng trình NTSYS để cho ra bảng

hệ số tơng đồng S và sơ đồ hình cây biểu thị mối liên kết di truyền giữa 21 giốngbông nghiên cứu

Ví dụ khi kiểm tra đa dạng di truyền của 5 đối tợng, sử dụng một cặp mồiSSR, có sơ đồ nhận dạng ADN nh sau:

A B C D E1

23

Chơng III : Kết quả nghiên cứu và

thảo luận

III.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

III.1.1 Mục đích