Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ Ltyrosin

Con đường tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn keratin khác nhau như s ng

Công trình này đư c hoàn thành t i:

- B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i

- B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i

- Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

- Viện Hóa học, viện Hàn lâm khoa học Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

Vào hồi: giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án t i: Thư viện quốc gia Việt Nam

Thư viện trường Đ i học Dư c Hà N i

CÁC KÝ HI U, CH VI T T T

Ch vi t t t Ch đầy đ hoặc nghƿa ti ng Vi t

13C-NMR Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13

(Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance)

1H-NMR Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton

(Proton- Nuclear Magnetic Resonance)

Acac Acetyl acetonat

DMF Dimethylformamid [HCON(CH 3 ) 2 ]

eq Đương lư ng (equivalent)

EI Ion hóa va ch m điện tử (electron impact)

ESI Ion hóa phun mù điện tử (electrospray

ionization)

Et Ethyl (C2H5-)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

IR Phổ hồng ngo i (Infrared

Spectrophotometer)

LD50 Liều ch t trung bình

MS Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry)

OECD Tổ chức H p tác và Phát triển Kinh t

(Organization for Economic Co-operation and Development)

Rf Hệ số lưu giữ (retention factor)

1

M Ở Đ U Tính c p thi t c a lu n án

Kho ng 3 - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp B nh gặp ở nhiều

lứa tuổi và nhiều đ i tượng Trẻ em bị suy giáp sẽ chậm lớn và kém phát triển trí tu B nh cũng hay gặp ở phụ nữ có thai, gây hậu qu nghiêm trọng đến thai nhi Ngoài s ít trường hợp suy giáp do dùng thu c kháng giáp có thể hồi phục khi ngưng thu c, còn đa s các trường hợp khác đều ph i điều trị bằng hormon giáp tr ng c đời

Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin và liothyronin ở nước ta trong điều trị b nh là khá lớn mà vi c s n xuất nguyên li u trong nước chưa thực hi n được Con đường tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên

li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn keratin khác nhau như s ng, tóc… Nếu chúng ta tiến hành nghiên cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri thì sẽ chủ động được nguồn nguyên li u

Quyết định s 61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 07/05/2007 về vi c phê duy t “Chương trình nghiên cứu khoa học công ngh trọng điểm qu c gia phát triển công nghi p hóa dược đến năm 2020” đã đặt ra cho ngành dược Vi t Nam một mục tiêu quan

trọng là tăng cường tự s n xuất nguyên li u làm thu c, tiến tới chủ động s n xuất thu c trong nước

3 Đánh giá độ ổn định của 2 s n phẩm ở 2 điều ki n: lão hóa cấp t c

 Đã thực hi n thành công ph n ứng kh hóa hợp chất

3,5-dinitro-4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester ở điều ki n

áp suất thường

 Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin

và liothyronin bằng cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri carbonat bão hòa

2 Lần đầu tiên thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann trong tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester

t ph n ứng giữa dẫn chất L-tyrosin và 4-bromoanisol với xúc tác là

mu i đồng (I) iodid và ph i t sắt (III) acetylacetonat trong môi trường kali carbonat và dung môi dimethyl formamid

C u trúc c a lu n án

3

Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o B

cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m và

kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận và đề

xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục các công trình khoa học đã công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang), Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang)

Ch ng 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan v levothyroxin và liothyronin

1.1.1 Levothyroxin mononatri hydrat

Hình 1.2 Công thức cấu t o của levothyroxin mononatri hydrat 1.1.2 Liothyronin mononatri hydrat

Hình 1.4 Công thức cấu t o của liothyronin mononatri hydrat

1.1.3 Tác dụng dược lý của hormon tuyến giáp

Kích thích các ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá cơ b n, tăng

hấp thu glucose ở ruột và tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid và cholesterol, tăng tổng hợp protein Không đủ hormon tuyến giáp sẽ gây ra b nh

O I

4

suy giáp, trẻ chậm lớn và không phát triển trí tu , người lớn bị chứng

m ch chậm, gi m thân nhi t, gi m trao đổi chất cơ b n, gi m ho t động trí não, bướu cổ

1.2 Các ph ng pháp t ng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri

Trong đó giới thi u các phương pháp tổng hợp 6: Phương pháp của

các tác gi như: C R Harington và cộng sự, A David và cộng sự, W Siedel và cộng sự, G Hillmann, J R Chalmers và cộng sự (sau này

có c i tiến của P Bracco trong 1 s bước quan trọng), P Z Anthony

và R I Meltzer

Các phương pháp khác: Phương pháp của Salamonczyk, Phương

pháp oxy hóa của L G Ginger

1.3 Các ph ng pháp t o hợp ch t diaryl ether

Có 4 phương pháp: Phương pháp ghép đôi nhờ xúc tác Cu: Ph n ứng

Ullmann cổ điển; Ph n ứng ghép đôi Ullmann các dẫn chất có nhóm

O

O H

N H 2

O I

I

H O I

O

O N a

N H 2

O I

I

H O I

5

thế ortho; Ph n ứng ghép đôi của các acid arylboronic nhờ xúc tác Cu(OAc)2 Phản ứng thế ái nhân trong nhân thơm: Ph n ứng thế ái nhân chuẩn; Ph n ứng thế ái nhân để t o phức kim lo i-aren; Với

mu i diaryl iodo Ph ản ứng oxy hóa: Oxy hóa các phenol Các phương pháp khác

1.4 Phân tích, l a ch ọn h ớng nghiên c u

Qua tổng quan tài li u và dựa vào xu hướng nghiên cứu trên thế giới

đã tổng kết được có 4 phương pháp tổng hợp 2 nguyên li u t tyrosin: Phương pháp 1: Oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp của L G Ginger t o levothyroxin; Phương pháp 2:

L-Ngưng tụ với dẫn chất iodoni iodid của G Hillmann t o levothyroxin

và liothyronin; Phương pháp 3: Tổng hợp qua dẫn chất nitro của J

R Chalmers t o levothyroxin và liothyronin; Phương pháp 4: T o

cầu n i diaryl ether t dẫn chất của L-tyrosin với acid

4-methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo tác gi A David

t o levothyroxin và liothyronin

T các phương pháp trên chúng tôi dự định tiến hành kh o sát để tìm

ra phương pháp phù hợp nhất với điều ki n thiết bị hi n có và có thể triển khai tổng hợp ở quy mô lớn hơn Đồng thời nghiên cứu phương pháp t o ether Ullmann giữa một aryl halogenid và L-tyrosin để t o liên kết ether của hormon giáp tr ng với hy vọng sẽ có đóng góp mới

về mặt khoa học, sau đó tiến hành nghiên cứu tiếp kh năng ứng

dụng vào thực tế s n xuất

Ch ng 2: NGUYÊN LI U, TRANG THI T B VÀ PH NG

PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Nguyên li u

6

Nguyên li u, hóa chất, dung môi s dụng trong nghiên cứu đều là

lo i đ t tiêu chuẩn tổng hợp Các dung môi sắc ký đ t tiêu chuẩn dùng cho HPLC

2.2 Thi t b nghiên c u

S dụng các thiết bị tổng hợp hóa dược chuyên dụng, các thiết bị dùng để định tính, định lượng tin cậy của trường Đ i học Dược Hà

Nội, vi n Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Vi n Hàn lâm Khoa học

Vi t Nam, vi n Kiểm nghi m thu c trung ương

2.3 Ph ng pháp nghiên c u

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

Bằng các ph n ứng hữu cơ cơ b n: iodo hóa, acetyl hóa, ester hóa, oxy hóa, thủy phân, nitro hóa, ngưng tụ, kh hóa, diazo hóa và ph n

ứng t o mu i natri t phenol, t acid carboxylic

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Theo 2 phương pháp: Nhi t độ nóng ch y và Sắc ký lớp m ng

2.3.3 Phương pháp phân tích cấu trúc

Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, đề tài đã s dụng phương pháp phổ: IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR

Theo USP 34 đ i với T3Na và BP 2010 đ i với T4Na

- Đ i tượng th : 3 lô đóng lọ PE, tránh ánh sáng

- Điều ki n th nghi m: Điều ki n lão hóa cấp t c: Nhi t độ 40  2°C; độ ẩm: 75  5% Điều ki n thường: Nhi t độ thường 30  2°C;

độ ẩm: 75  5%

7

- Các chỉ tiêu kh o sát: tính chất, góc quay cực riêng, mất kh i lượng

do làm khô, giới h n t p chất liên quan và hàm lượng (theo USP 34

đ i với liothyronin mononatri và theo BP 2010 đ i với levothyroxin mononatri)

2.3.6 Phương pháp đánh giá độc tính cấp

Mô hình liều c định theo hướng dẫn của OECD

Các kết qu nghiên cứu được x lý bằng công cụ th ng kê thích hợp

Ch ng 3: TH C NGHI M VÀ K T QU NGHIÊN C U 3.1 T ng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl

ester

Đây là bước t o cấu trúc diaryl ether, là ph n ứng “chìa khóa” của quy trình Tổng hợp theo 3 phương pháp sau:

Hình 3.2 Ph n ứng t o 5 theo phương pháp Ullmann

3.1.2 Phương pháp c a J R Chalmers và P Bracco

H O

O H

N H 2 O

N H 2

OH-CH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu

mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR= 5,8 phút) Điều ki n sắc ký: Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid

H3PO4 trong 1000,0 mL T c độ dòng: 1,5 mL/phút Cột C18 - Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả

phân tích ph ổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3243 (OHphenol); 3080

(C-Hthơm); 1638 (C=Ocarboxylic); 2974 và 2885 (C-Hno); 2599 (N+-Hmu i nội phân t ); 1638 (C=Ocarboxylat mu i nội phân t );1559 (C=Cthơm); 1178 (C-Odiaryl ether); 526 (C-I) ESI-MS (m/z): 777,5 [M+H]+ (CTPT C15H11I4NO4,

M = 776,87) 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd,

O

O E t

N H A c O

3.3.3 So sánh và lựa chọn phương pháp tổng hợp levothyroxin

B ng 3.6 So sánh các phương pháp tổng hợp levothyroxin

Đặc điểm

Ph ng pháp G

suất thấp (12,2%)

Các ph n ứng không quá phức

t p, trang thiết bị phù hợp với điều

ki n hi n có Quy trình khá ổn định

ph n ứng đầu

11

Kh o sát 2 phương pháp t o mu i với 2 tác nhân là Na2CO3 bão hòa

và NaHCO3 bão hòa Hi u suất t o mu i của 2 phương pháp tương đương nhau (78,0 %)

T ạo muối với natri carbonat bão hòa:

K t qu : t o

nc: 206,5-208,9 (phân hủy); R f [CHCl3-MeOH-HCOOH

(70:15:15)] = 0,42; Góc quay c ực riêng: +18,5o (C = 2 trong HCl 0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết quả phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591 (C=Ocarboxylat); 1534 (C=C thơm); 1242 và 1137 (C-Odiaryl ether); 543 và

436 (C-I) ESI-MS (m/z): 799,4 [M+H]+ (CTPT C15H10I4NNaO4,M =

Tạo muối với natri bicarbonat bão hòa:

O

O H

N H 2

O I

I

H O I H

I

H O I

I 8 O

O H

N H 2

O I

Hình 3.9 Sơ đồ ph n ứng t o liothyronin natri (7)

phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3178 (OHphenol); 3035

(C-Hthơm); 2762 (N+-Hmu i nội phân t ); 1599 (C=Ocarboxylat mu i nội phân t ); 1570

và 1496 (C=Cthơm); 1246 và 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I) ESI-MS

I

H O I

O

O N a

N H 2

O I

I

N a O I

H C l 1 N O

O H

N H 2

O I

I

H O

I

N a O H 5 0 % 2

3 7 2

7

Liothyronin mononatri:

Kh o sát 2 phương pháp t o mu i mononatri với 2 tác nhân t o mu i

là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa Hi u suất t o mu i của 2 phương pháp tương đương nhau (71,1 %)

K t qu : t o

nc: 205-206°C (phân hủy); R f = 0,31 [CHCl3 - MeOH -

HCOOH (70:15:15)]; Hàm lượng: 98,2%; Kết quả phân tích phổ:

IR (KBr), υmax (cm-1): 3389 (NH2); 2963 (C-Hthơm); 1618 (C=Ocarboxylat); 1498,08 (C=Cthơm); 1246,27 (C-Odiaryl ether); 498,87 và

456,01 (C-I) ESI-MS (m/z): 673,64 [M+H]+ (CTPT C15H11I3NNaO4,

14

140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,8 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 170,0 (C=Ocarboxylat)

3.5 Tri ển khai quy trình t ng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri

Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và

15

Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g Hi u suất toàn chặng: levothyroxin mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 % Các ph n

ứng cho hi u suất tương đ i ổn định

3.6 Ki ểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển

Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn theo USP 34 và levothyroxin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn theo BP 2010

3.7 Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm

S li u độ ổn định ở điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy 2 s n phẩm không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi Dữ

li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng trong giới h n qui định

Tuổi thọ của levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri được

dự đoán lần lượt là 26 tháng và 30 tháng

3.8 Đánh giá độc tính c p

C hai nguyên li u không độc, không xác định được LD50

Ch ng 4: BÀN LU N 4.1 V t ng h ợp hóa học

tác gi A David

Đã kh o sát 3 phương pháp sau đây:

tổng hợp ether theo phương pháp t o ether Ullmann cổ điển được công b , nhưng đặc bi t chưa có công trình nào áp dụng trong tổng

hợp hormon giáp tr ng Trường hợp các aryl halogenid có nhóm thế

ortho t o phức với Cu như triazen hoặc trifluoroacetamid thì ph n ứng có thể x y ra ở nhi t độ thấp hơn các ph n ứng Ullmann cổ điển Trường hợp trong ph n ứng thay thế các aryl halogenid bằng các acid arylboronic thì ph n ứng có thể x y ra ở nhi t độ phòng với các xúc tác như Cu (II) acetat, triethylamin hoặc pyridin Phương pháp này đã được áp dụng trong tổng hợp levothyroxin với hi u suất t o ether là

81 % Không chỉ d ng ở đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung

Qu c là Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự đã tiếp tục c i

tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe đã làm

gi m đáng kể lượng chất xúc tác Các tác gi này đã tổng hợp thành công cấu trúc diaryl ether của hàng chục chất với quy mô lớn và hi u

suất tương đ i t t Nghiên cứu của Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự t o ý tưởng cho chúng tôi trong quá trình tìm kiếm phương pháp mới tổng hợp cấu trúc diaryl ether của hormon giáp

tr ng Chúng tôi th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa

3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester và 4-bromoanisol với xúc tác là các nguồn đồng và ph i t là các nguồn sắt Nghiên cứu bước đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích

17

hợp để nâng cấp quy trình Tuy nhiên cũng có một s vấn đề cần

khắc phục như khi tiến hành ph n ứng ph i đặc bi t tránh nước, tất c các chất tham gia ph n ứng cũng như dung môi ph i đ m b o khan

để hợp chất 4-brommoanisol không bị thủy phân t o ra hợp chất

phenol Đồng thời khi kết thúc ph i tiến hành x lý ngay để tránh

ph n ứng thủy phân s n phẩm trong môi trường kiềm

Về cơ chế của ph n ứng, theo Ying-Peng Zhang và cộng sự, có thể

gi i thích như sau:

Hình 4.1 Sơ đồ cơ chế ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa

phenol và aryl halogenid

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác tới hiệu suất phản ứng: xúc

tác CuI cho hi u suất ph n ứng cao nhất, điều đó có thể gi i thích

như sau: Trong hỗn hợp ph n ứng, đồng tồn t i dưới 2 d ng phức (d)

A r - X

( b )

H X

A r O P h ( c )

18

Cu (I) thường t o phức với s ph i trí 2, do đó nếu dùng xúc tác Cu

(I) thì ưu tiên phức (a) Cu (II) thường t o phức với s ph i trí 4, do

đó nếu dùng xúc tác Cu (II) thì ưu tiên phức (d) Phức (a) tham gia

vào chu trình ph n ứng theo cơ chế ph n ứng đã đề cập ở trên nên

hi u suất ph n ứng cao nhất khi dùng xúc tác CuI

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của phối tử: ph i t Fe(acac)3 cho

Ph ng pháp qua hợp ch t nitro c a tác gi J R Chalmers và P Bracco: Chúng tôi thực hi n các ph n ứng trên cơ sở kết hợp phương pháp của J R Chalmers và P Bracco Tuy quy trình có s bước ph n ứng nhiều nhất nhưng các ph n ứng không quá khó thực hi n, đặc

bi t đến ph n ứng cu i mới dùng iod là nguyên li u đắt tiền và hi u

suất tính t ph n ứng có dùng iod cao nhất Phương pháp được lựa

chọn để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri

V ề phản ứng “chìa khóa”- tạo ether của quy trình: Ph n ứng được

kh o sát với 2 phương pháp: phương pháp của J R Chalmers và phương pháp của P Bracco Phương pháp của P Bracco cho hi u

suất cao hơn phương pháp của J R Chalmers, vi c thu s n phẩm