TOÀN VĂN BÁO CÁO NÓI ORAL Tiểu ban SINH HỌC và CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khuếch đại vùng ITS1- 5,8S- ITS2 từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1, ITS4 và giải trình tự, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh loài của các mẫu Trinh nữ hoàng cung.. Giải trình tự và

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ISBN: 978-604-82-1375-6

TOÀN VĂN KỶ YẾU HỘI NGHỊ Conference Proceeding Fulltext

TP HCM – 21/11/2014 www.hcmus.edu.vn

TOÀN VĂN BÁO CÁO NÓI

ORAL Tiểu ban SINH HỌC và CÔNG NGHỆ SINH HỌC

IV-O-1.1

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN ALKALOID CỦA MỘT SỐ

CÂY THUỘC HỌ THỦY TIÊN (AMARYLLIDACEAE)

Trần Thị Thu Ngân, Văn Hồng Thiện, Trịnh Ngọc Nam

Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh

Email: tranthithungan.1905@gmail.com

TÓM TẮT

Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) là cây thuốc quý, được sử dụng phổ biến trong y học

để điều trị các bệnh u sơ Hiện nay ở Việt Nam, ngoài giống Trinh nữ hoàng cung dùng làm dược liệu thì còn nhiều loài khác cùng chi Crinum, rất giống về hình thái thực vật nhưng không có dược tính dễ gây nhầm lẫn, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tích tính đa dạng di truyền và thành phần hợp chất alkaloid của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung được thu thập tại 11 tỉnh thành miền Trung và miền Nam Khuếch đại vùng ITS1- 5,8S- ITS2 từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1, ITS4 và giải trình tự, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh loài của các mẫu Trinh nữ hoàng cung Kết quả phân tích cho thấy tất cả các mẫu đều thuộc họ Amaryllidaceae, trong đó có 9 mẫu Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), 1 mẫu Náng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) và 1 mẫu Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) Phân tích định tính alkaloid bằng thuốc thử và sắc ký bản mỏng với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate đã xác định được các alkaloid đặc trưng vincristine, vinblastine, vidoline và ajmalincine có trong một số mẫu Trinh nữ hoàng cung Tóm lại, những kết quả của nghiên cứu góp phần xây dựng một phương pháp chuẩn trong nhận diện, xác định cây thuốc ở Việt Nam

Từ khóa: alkaloid, cây thuốc, Crinum latifolium, ITS, sắc ký bản mỏng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Amaryllidaceae là một họ thực vật rất lớn với khoảng 90 chi và 1310 loài phân bố khắp mọi nơi [1] Ngoài

một số chi mọc hoang ở Châu Âu như Galanthus, Leucojum, Narcissus thì đa số các chi khác rất được trồng làm cảnh vì cho hoa đẹp, như các chi Amaryllis, Haemanthus, Clivia, Valotta, Crinum, Hymenocallis Theo Y học

cổ truyền thì Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc chi Crinum còn là một loại thuốc quý và ngày

càng được quan tâm chú ý nhiều hơn vì các dược tính của nó như kháng u, giảm đau, kháng virus, chống sốt rét, hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi trồng, thu hái và chứng minh các tác dụng của cây thuốc này [2, 3, 4] Hiện nay ở Việt Nam, ngoài giống Trinh nữ hoàng cung dùng làm dược

liệu thì còn nhiều loài khác cùng chi Crinum, rất giống về hình thái thực vật nhưng không có dược tính dễ gây

nhầm lẫn, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Sự phân loại, định danh thực vật thường được thực hiện dựa trên các đặc điểm hình thái và cấu trúc của mẫu thực vật Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều thời gian và kỹ thuật cao của chuyên gia định danh Bên cạnh đó, sự phân loại thường gặp khó khăn khi mẫu vật thu thập không có đầy đủ các giai đoạn của quá trình phát triển Do đó, một vài phương pháp phân tử dùng để định danh đã được phát triển dựa vào việc sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho một vài vùng trình tự chuyên biệt của bộ gen như các DNA vệ tinh gen mã hoá proten sốc nhiệt, gen topoisomerase I và vùng ITS (internal transcribed spacer) của DNA ribosome (rDNA) [5, 6] Vùng ITS nằm giữa chuỗi lặp lại 18S, 5.8S, and 28S của gen RNA ribosome trong nhân và có khoảng 100-

200 bản sao mỗi bộ gen Những vùng này tiến hoá nhanh và thường được sử dụng để xác định phát sinh loài của một số lượng lớn các loài sinh vật trong đó có các cây thuộc họ Amaryllidaceae Trong chi Crinum, sự đa dạng trong loài của vùng ITS được dùng để nghiên cứu cấu trúc di truyền của nhiều cây thu thập khắp nơi trên thến giới thông qua việc giải tình tự [7]

Trong nghiên cứu này, các mẫu cây thuộc họ Amaryllidaceae được phân tích tương quan di truyền thông qua việc khuếch đại và giải trình tự vùng gen ITS Bên cạnh đó, một số alkaloid có dược tính quan trọng trong cây Trinh nữ hoàng cung như vincristine, vinblastine, vidoline và ajmalincine cũng được xác định Những kết quả của nghiên cứu góp phần xây dựng một phương pháp chuẩn trong nhận diện, xác định các cây thuộc chi Trinh nữ hoàng cung

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Cây Trinh nữ hoàng cung thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) được thu tại 11 tỉnh: Quảng Nam, Đắk Lắk, Bình Thuận, Đồng Nai, Tây Ninh, TP Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu Mẫu được thu nhận cả cây, trồng tại TP.Hồ Chí Minh và sử dụng cho tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Khoảng 1 g mẫu lá non của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung được thu nhận và tách chiết DNA DNA tổng

số được tách chiết bằng bộ Kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo, Mỹ) Nồng độ và

độ tinh khiết của DNA được xác định bằng máy quang phổ Genesys 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ) Mẫu DNA có nồng độ >35 ng/μl, với OD260/280 1,8-2 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS

Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng cặp mồi ITS1 và ITS4 [8] để khuếch đại toàn bộ khu vực ITS1-5.8S

- ITS2 dao động từ 565-800 bp Thành phần phản ứng PCR gồm PCR Taq mastermix 2X 12,5 μl, mồi ITS1 10

μM 1,25 μl, mồi ITS4 10 μM 1,25 μl, nước khử ion 9,5 μl, DNA khuôn 0,5 μl với chu trình nhiệt theo trình tự biến tính mạch ban đầu tại : 96oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ nhiệt (94oC trong 1 phút, 44oC trong 1 phút,

72oC trong 2 phút); hoàn tất kéo dài mạch tại 72oC trong10 phút Kích thước sản phẩm của các phản ứng PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2% Sau phản ứng khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit column – pure PCR Clean – up (abm, Canada)

Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

Sản phẩm PCR của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) được giải trình

tự tại trung tâm đo đạc quốc gia về quản lí môi trường (NICEM) của Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) với

cặp mồi ITS1 (hoặc ITS4) theo phương pháp dideoxy của Sanger et al [9] Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh

trình tự bằng phần mềm Snapgene viewer Trình tự hoàn chỉnh được BLAST trên NCBI để đánh giá mức độ tương đồng của vùng ITS1-5.8S-ITS2 và từ đó tìm ra loài tương đồng nhất với trình tự cần nghiên cứu Cây phát sinh loài của 11 mẫu được xây dựng bằng các phần mềm Annhyb, Clustal X2 và được thể hiện bằng TreeView Mối tương quan di truyền được thể hiện bằng cây tiến hóa

Ly trích alkaloid tổng và định tính alkaloid

Alkaloid trong lá và củ được tách chiết theo quy trình của Mai Đình Trị và cộng sự [10] có hiệu chỉnh Alkaloid được định tính bằng ba loại thuốc thử: Dragendorf, Mayer và Wagner Thành phần alkaloid được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản silica gel 60 F254 (Merck millipore, Đức) trong hệ dung môi khai triển chloroform- methanol- amoniac (50:9:1 theo thể tích) [11] với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate, sấy 100oC trong 30 phút và quan sát dưới tia UV [12]

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả tách chiết DNA

Sau khi tách chiết, chất lượng DNA từ mẫu lá Trinh nữ hoàng cung được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% Hình 1 cho thấy DNA tổng số của các mẫu có độ đồng đều cao, các vạch DNA sắc nét, không bị phân mảnh

Hình 1 Điện di phân tích DNA tổng số của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung LD: DNA marker 25 kb

Kết quả phản ứng PCR khuếch đại

Sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% Sản phẩm PCR cho thấy các mẫu đều có 1 vạch sáng đậm, rõ nét, không có vạch phụ và có kích thước khoảng 700-800 bp (Hình 2) Theo Sahare [13], toàn bộ vùng ITS1-5.8S-ITS2 có kích thước dao động từ 600-1000 bp, tùy thuộc vào loài thực vật Trong hầu hết các thực vật hạt kín, kích thước dao động từ 565-700 bp Như vậy, kích thước vùng gen ITS được khuếch đại là phù hợp

Hình 2 PCR khuếch đại vùng ITS 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung LD: DNA marker 3 kb

Xây dựng cây phát sinh loài

Sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS của 11 mẫu Trinh nữ hoàng cung được giải trình tự theo phương pháp của Sanger và cộng sự [9] Cây phát sinh loài được xây dựng bằng các phần mềm Annhyb, ClustalX2, TreeView

với trình tự cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) (accession: AY139137) thu nhận từ NCBI (The

National Center for Biotechnology Information) được sử dụng làm trình tự chuẩn

Hình 3 Cây phát sinh loài của 11 mẫu nghiên cứu và mẫu cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

(accession: AY139137) thu nhận từ NCBI (National Center for Biotechnology Information)

Theo sơ đồ cây phát sinh loài (Hình 3) cho thấy có sự phân nhóm của các mẫu nghiên cứu thành 3 nhóm

riêng biệt Nhóm I có mẫu 2 gồm cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) cùng họ Amaryllidaceae nhưng

khác chi với các mẫu còn lại và có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,30 Nhóm II gồm hai mẫu là mẫu cây

Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) (accession: AY139137) thu nhận từ NCBI và mẫu 8 Từ kết quả này

có thể xác định rằng mẫu 8 là mẫu giống với mẫu chuẩn nhất vì hai mẫu này đứng rất gần nhau trên cây phát sinh loài, có độ tương đồng với nhau là 99% và đều cách gốc một khoảng gần bằng nhau (mẫu 8= 0,32; NCBI= 0,42) Nhóm III gồm 9 mẫu còn lại và được chia thành 2 phân nhóm: (1) Phân nhóm A gồm 3 mẫu 4, 1 và 3 Trong đó hai mẫu 1 và 3 nằm rất gần nhau có độ tương đồng với mẫu chuẩn là 99% và có khoảng cách di truyền

so với gốc là 0,32 Còn mẫu 4 thì nằm trên một nhánh riêng cách biệt vì mẫu 4 là cây Náng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) cùng chi Crinum với hai mẫu 1 và 3 và cũng có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,32; (2) Phân

nhóm B gồm 6 mẫu được chia thành 2 tiểu nhóm B1 và B2 Tiểu nhóm B1 gồm 3 mẫu 9, 5 và 10 Trong đó mẫu

9 nằm trên một nhánh riêng biệt có độ tương đồng so với mẫu chuẩn là 99% và khoảng cách di truyền so với gốc

là 0,32 Còn hai mẫu còn lại độ tương đồng từ 91-94% và cách gốc một khoảng bằng nhau là 0,32 Tiểu nhóm B2 gồm 3 mẫu 11, 6 và 7 Trong đó mẫu 11 nằm trên một nhánh riêng biệt có độ tương đồng của mẫu chuẩn là 97% và khoảng cách di truyền cách gốc là 0,32 Mẫu 6 và 7 cùng nằm trên cùng một nhánh có độ tương đồng so với mẫu chuẩn là 99% và có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,33

Bảng 1 Định danh 11 mẫu Trinh nữ hoàng cung bằng giải trình tự vùng ITS

Hình 4 Kết quả định tính alkaloid bằng 3 loại thuốc thử (a) Mẫu alkaloid, (b) Thử bằng thuốc thử Dragendorf,

(c) Thử bằng thuốc thử Mayer, (d) Thử bằng thuốc thử Wagner Thành phần alkaloid tiếp tục được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản gel silica với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate và quan sát dưới tia UV (Hình 5) Kết quả phân tích cho thấy đã xác định được 4 loại alkaloid vincristine, vinblastine, vidoline, ajmalincine trong dịch trích nhóm A và alkaloid ajmalincine trong dịch trích nhóm B

Hình 5 Kết quả định tính alkaloid mẫu lá 5 (pH=7,3) bằng sắc ký bản mỏng và phun thuốc hiện màu

ammonium cerium (VI) sulfate

Bảng 2 Thành phần alkaloid của 11 mẫu cây thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidacea)

Lời cám ơn: Nghiên cứu này nhận được sự tài trợ của ThS Văn Hồng Thiện và TS Trịnh Ngọc

Nam tại Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu này cũng nhận được sự

hỗ trợ về trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

STUDIES GENETIC VARIATION AND ALKALOID COMPONENTS OF SOME

MEDICINAL PLANTS IN AMARYLLIDACEA FAMILY

Tran Thi Thu Ngan, Van Hong Thien, Trinh Ngọc Nam

Institute of Biotechnology and Food technology, Industrial University of HoChiMinh City

Email: tranthithungan.1905@gmail.com

ABSTRACT

Crinum latifolium are widely used in folk medicine as an anticancer in different geographical regions around the world In Vietnam, many species of Amaryllidacea family have strong phenotypic similarities to Crinum latifolium but do not have pharmaceutical value for tumor treatment In this study,

we examined the genetic variation and analyzed alkaloid components of eleven medicinal plant samples, which was collected at eleven Provinces in Middle- and South Vietnam Amplification and sequencing of ITS1-5.8S-ITS2 region from total DNA extracted from the plant samples by using ITS1 and ITS4 primer, we built phylogenetic tree of the medicinal plant samples The result indicated all the plant samples are belong Amaryllidaceae family, in which nice samples are Crinum latiforlium, one sample is Crinum asiaticum and the other is Hymenocallis littoralis Qualitative analysis of alkaloid components by thin-layer chromatography with ammonium cerium (VI) sulfate reagent, we determined some specific alkaloids as vincristine, vinblastine, vidoline and ajmalincine in some medicinal plant

samples Taken together, these results may provide a method for determination medicinal plant in Vietnam

Key words: alkaloid, Crinum latifolium, ITS, medicinal plant, thin-layer chromatography

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] John Refaat, Mohamed S Kamel, Mahmoud A Ramadan and Ahmed A Ali 2012 Crinum; an endless

source of bioactive principles: review Part 1- Crinum alkaloid: lycorine-type alkaloid International journal of pharmaceutical sciences and research Vol 3 (07) P.1883-1890

[2] Ghosal S 1986 Chemical constituents of Amaryllidaceae Crinafoline and crinafolidine two antitumor

alkaloids from Crinum latifolium Journal of Chemical Research (S) Vol 24 P.312-313

[3] Ghosal S, Unnikrishnan SG and Singh SK 1989 Occurrence of two epimeric alkaloids and metabolism

compared with lycorine in Crinum latifolium, Phytochemistry Vol 28(9) P.2535–2537

[4] Nguyen Thi Ngoc Tram, E.Z., E Nikolova, E Katzarova, G Kostov, I Yanchev, O Baicheva 1999 A novel in vitro and invio T-lymphocyte activating factor in Crinum latifolium L aqueous extracts

Experimental Pathology and Parasitology 3: 21-26

[5] Cao AX, Liu XZ, Zhu SF and Lu BS 2005 Detection of the pinewood nematode, Bursaphelenchus

xylophilus, using a real-time polymerase chain reaction assay Phytopathology 95: 566-571

[6] Takeuchi Y, Kanzaki N and Futai K 2005 A nested PCR-based method for detecting the pine wood

nematode, Bursaphelenchus xylophilus, from pine wood Nematology 7: 775-782

[7] Yakandawala DMD and Samarakoon TM 2006 An empirical study on the taxonomy of Crinum zeylanicum (L.) L and Crinum latifolium l (Amaryllidaceae) cccurring in Sri Lanka.Cey J Sci (Bio Sci.) 35 (1): 53 -72

[8] White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR Protocols: a Guide

to methods and Applications, Academic Press, New York, USA P.315–322

[9] Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A R 1977 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463-5467

[10] Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Phạm thị Nhật Trinh, Nguyễn Công Hào 2001 Nghiên cứu thành phần Hóa học trong phân đọan không phân cực từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Tuyển tập các công trình Hội nghị Khoa học và công nghệ Hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 2 Tr 366-371

[11] Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh 2011 Nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong

dịch chiết từ lá Vông nem (Erythrina orientalis L Fabaceae) Thừa Thiên Huế Tạp chí khoa học Đại học Huế Số 65 Tr 225-230

[12] Magagula N.L., Mohanlall V and Odhav B 2012 Optimized Thin Layer Chromatographic Method for Screening Pharmaceutically Valuable Alkaloids of Catharanthus roseus (Madagascar Periwinkle)

International Journal of Sciences

[13] Sahare P 2013 Highly conserved nucleotide sequence in ITS-region of plants from family Fabaceae

International journal of innovative research and studies 2(6): 210-215

IV-O-1.4

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÂY CỎ LẠC (ARACHIS PINTOI KRABOV & W.C.GREGORY)

LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN RESVERATROL

Vũ Thị Bạch Phượng, Trần Quốc Tân, Phạm Công Thủy Tiên, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

TÓM TẮT

Resveratrol là hợp chất biến dưỡng thứ cấp thuộc nhóm phytoalexin, được biết đến với những hoạt tính sinh học nổi bật như kháng oxy hóa, kháng viêm, ngăn ngừa ung thư, các bệnh tim mạch và lão hóa Nhu cầu sử dụng và thương mại hóa resveratrol ngày càng tăng trong khi đó hàm lượng resveratrol trong tự nhiên lại rất thấp Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới có chứa resveratrol là một việc cần thiết và quan trọng Hiện nay, cây Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W

C Gregory) chỉ được trồng trang trí và tạo thảm ở công viên, đồng ruộng Cỏ lạc cũng cùng chi với cây Đậu phộng (Arachis hypogaea L.)-một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol đã được nghiên cứu bởi Chen và cộng sự (2001) Rễ của cây Cỏ lạc được chứng minh rõ ràng có sự hiện diện của resveratrol thông qua phương pháp sắc ký bản mỏng, đo độ hấp thu UV 308nm và HPLC-UV Với hàm lượng resveratrol ở rễ tương đối cao, cây Cỏ lạc có thể được sử dụng như một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol Ngoài ra, để chủ động tăng sinh nguồn nguyên liệu là rễ, kỹ thuật cảm ứng rễ tơ từ mẫu cấy lớp mỏng in vitro và từ cá thể in vivo kết hợp thủy canh đã được thực hiện thông qua khai thác khả năng tạo rễ tơ của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834

Từ khóa: Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W C Gregory), resveratrol, rễ tơ, Agrobacterium

từ các nguồn có sẵn thì việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới là việc làm cần thiết và quan trọng

Trước đây, Chen và các cộng sự (2001) đã đưa ra nhận định rằng rễ đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là

một nguồn nguyên liệu có thể sử dụng để thu nhận resveratrol Các nghiên cứu về cảm ứng, tăng sinh rễ tơ đậu phộng nhằm thu nhận resveratrol cũng đã được nghiên cứu trên thế giới Chúng tôi nhận thấy rằng cây Cỏ lạc cũng cùng chi với cây Đậu phộng, theo hóa-thực vật thì những cây cùng chi có thể có những hoạt chất giống

nhau Tuy nhiên, cây Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W C Gregory) hiện nay chỉ được sử dụng làm cây trang

trí ven đường, trong công viên, trồng xen phủ cây nông nghiệp mà chưa có các nghiên cứu về hoạt chất hay dược tính của nó Vì vậy, đề tài này đã ra đời với mục đích chứng minh sự hiện diện của resveratrol có trong rễ cây Cỏ

lạc Arachis pintoi và chủ động tăng sinh nguồn rễ loài cây này thông qua phương pháp chuyển gen cảm ứng tạo

rễ tơ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Cây cỏ lạc (Arachis pintoi Krapov and W.C Gregory) được thu hái tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên

(Thủ Đức, TP HCM), được sử dụng cho các thí nghiệm sinh hóa

Hạt Cỏ lạc (Arachis pintoi) giống PS144 được cung cấp bởi Đại học Florida thông qua trang web www.pintoyseeds.com

Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ tổ chức RIKEN-BRC thông qua dự

án MEXT, Nhật Bản

Phương pháp

Tạo cây con in vitro

Hạt cỏ lạc giống PS144 được tách vỏ, rửa bẳng xà phòng trong 5 phút sau đó được rửa sạch lại bằng nước cất cho sạch xà phòng Mẫu được chuyển vào tủ cấy, tiếp tục lắc với cồn 80% trong 30 giây Sau đó, hạt được ngâm và lắc trong Javel 10% (v/v) trong 10 phút Cuối cùng, hạt được rửa lại bằng nước cất vô trùng tối thiểu 5

lần Các hạt được cấy lên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung đường (30 g/l), agar (8 g/l) với

pH môi trường là 5,7 Hạt nảy mầm sau 10 ngày với điều kiện chiều sáng 16 giờ/ngày, cường độ sáng khoảng

1500 lux, nhiệu độ phòng 22-24oC

Điều chế cao chiết từ các bộ phận

Rễ, thân và lá của cây cỏ lạc được tách riêng và sấy khô ở nhiệt độ 50oC Sau đó, các mẫu khô được xay nhuyễn thành bột Ngâm dầm bột khô trong ethanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau mỗi 24 giờ đem lọc thu dịch lọc Dịch lọc tổng cộng sau nhiều lần ngâm chiết (cho đến khi dịch lọc trong gần như trong suốt) được cô quay chân không và để bay hơi tự nhiên để tạo thành cao ethanol 80%

Sắc ký bản mỏng kiểm tra sự hiện diện của resveratrol

Tiến hành định tính resveratrol bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản sắc ký silica gel (Merck) Hòa tan chất chuẩn resveratrol (Sigma, 99%), cao chiết của 3 loại bộ phận bằng dung môi ethanol 80% sao cho nồng

độ chất chuẩn là 50 µg/ml và nồng độ của cao chiết 5mg/ml Chấm chất chuẩn và dịch chiết cao lên bản sắc ký,

để bản khô, đặt bản vào bể sắc ký với hệ dung môi giải ly chloroform : ethyl acetate : acid formic (5:4:1) Vị trí các vết được quan sát dưới đèn UV 254 nm và so sánh với vệt của chất chuẩn

Bán định lượng stilbene bằng độ hấp thu UV 308nm

Các loại cao chiết được hòa tan vào ethanol 80% để được nồng độ là 5 mg/ml Dịch hòa tan cao được đem

đi đo hộ hấp thu UV 308nm Hàm lượng stilbene được nội suy dựa vào đường chuẩn

Định lượng resveratrol trong rễ Cỏ lạc bằng HPLC

Các mẫu rễ tươi, rễ khô và cao ethanol 80% của rễ được tiến hành phân tích HPLC ở phòng thí nghiệm phân tích trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Quy trình tiến hành HPLC của Nuno và cộng sự (2004) được sử dụng và thay đổi một số thông số: chất chuẩn resveratrol của Sigma có độ tinh sạch 99,9% , cột C18 (250 x 4,6 mm), pha động là hệ dung môi nước : methanol (65:35), tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút, đầu dò phát hiện ở bước sóng 308 nm, thời gian lưu là 25 phút, nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng

Cảm ứng tạo rễ tơ

Rễ tơ được tạo thành thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật Nuôi cấy dịch vi khuẩn A rhizogenes, sao cho dịch khuẩn đạt được giá trị OD600 = 0,5-0,6 Mẫu được tạo vết thương và được nhúng vào dịch khuẩn A rhizogenes trong thời gian là 15 phút Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để đồng nuôi cấy và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ Sau thời gian thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được

xử lý khử khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime (500mg/l) Sau 2-3 tuần, quan sát sự hình thành rễ ở vị trí vết thương so với đối chứng không xâm nhiễm khuẩn

Khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận cây Cỏ lạc in vitro

Trước đây, Hoàng Thị Thanh Minh và cộng sự (2011) đã từng khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận của cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) với kết quả là khả năng cảm ứng của từng bộ phận của cây là khác nhau Ngoài ra, Veena và Christopher (2007) cũng có kết luận rằng hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào

sự tương tác giữa vi khuẩn A rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm ra bộ phận nào thích hợp để cảm ứng rễ tơ Quy trình thực hiện giống với nghiên cứu trước đây của Karthikeyan (2007) và Kim (2008) cùng các cộng sự Lá, cuống lá, thân, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, tử diệp và

rễ của cây in vitro 20 ngày tuổi được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ phần trăm mẫu cảm ứng và số rễ tơ mỗi mẫu sau 21 ngày nuôi cấy

Kết hợp thủy canh trên mô hình cảm ứng rễ tơ cây Cỏ lạc in vivo

Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ từ cây con trong điều kiện nuôi thủy canh Hai phương pháp được thử nghiệm là:

(1) tiêm khuẩn: dùng kim tiêm tiêm trực tiếp khoảng 100 µl dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC

15834 vào trụ hạ diệp Sau đó, cây được chuyển sang môi trường thủy canh MS với nồng độ khoáng đa lượng giảm xuống còn 1/4

(2) tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy: sử dụng dao cấy rạch tạo vết thương ở trụ hạ diệp, rồi chuyển sang môi trường thủy canh MS như đối với phương pháp tiêm khuẩn có bổ sung thêm vi khuẩn A rhizogenes để bắt đầu quá trình đồng nuôi cấy Sau 7 ngày, chuyển cây sang môi trường thủy canh mới để loại bỏ khuẩn

Các hạt Cỏ lạc giống PS144 được gieo trên cát ẩm, cây con nảy mầm được 20 ngày tuổi sẽ được tiến hành cảm ứng rễ tơ theo hai phương pháp Mẫu đối chứng là cây con 20 ngày tuổi được chuyển sang nuôi thủy canh với MS 1/4 khoáng đa lượng như trên nhưng không xâm nhiễm vi khuẩn Môi trường thủy canh bổ sung 5 ngày

1 lần So sánh chiều dài rễ, khối lượng tươi và khô của bộ rễ sau 20 ngày nuôi thủy canh giữa hai phương pháp

Kiểm tra gen chuyển với các mẫu rễ tơ cảm ứng in vitro và in vivo

Phương pháp PCR được tiến hành nhằm xác định sự chuyển gen rolB từ vi khuẩn vào tế bào thực vật DNA bộ gen từ các mẫu rễ cảm ứng và đối chứng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via (1993) Khuẩn lạc của Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được sử dụng để thu nhận plasmid theo quy trình PCR khuẩn lạc nhằm làm chứng dương để so sánh với sản phẩm PCR bộ gen của các mẫu rễ Gen rolB sẽ được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu, rolBF (5‟-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3‟) và rolBR (5‟-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3‟) Mỗi mẫu phản ứng PCR DNA được thực hiện với tổng thể tích là 25 µl gồm các thành phần sau: 1 µl DNA bộ gen các mẫu rễ; 1,5 µl dNTPs 2 mM; 1,25 µl DreamTaq DNA polymerase (1 unit/µl); 1 µl mỗi mồi với nồng độ 10 µM; 1,5 µl DreamTaq buffer và bổ sung nước siêu sạch để

đủ thể tích Phản ứng PCR gen rolB được thiết lập với chương trình như sau: biến tính ban đầu ở 95oC trong 5 phút, 35 chu kỳ (95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây,và 72oC trong 60 giây) và 5 phút kéo dài ở 72oC Sản phẩm khuếch đại PCR được phân tích và kiểm tra kích thước với thang 100bp bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X Gel sau đó được ngâm vào dung dịch Ethidium bromide và quan sát dưới đèn

UV

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Điều chế cao chiết từ các bộ phận

Sau khi để khô tự nhiên, hút ẩm đến khi cao đạt khối lượng không đổi So sánh về phần trăm độ ẩm, thân là

bộ phận có lượng nước trong sinh khối cao nhất Xét về năng suất thu cao so với khối lượng khô thì rễ và lá là các bộ phận cho năng suất cao tương đương nhau, cao hơn thân

Bảng 1 Phần trăm độ ẩm và năng suất thu cao từ khối lượng khô của các bộ phận cây Cỏ lạc Arachis pintoi

Krapov and W.C Gregory

Bộ phận Khối lượng khô (g) Độ ẩm (%) Khối lượng cao (g) Năng suất thu cao so

với khối lượng khô (%)

Sắc ký bản mỏng kiểm tra sự hiện diện của resveratrol

Sau khi chấm bảng bằng chất chuẩn là resveratrol và các chất thử nghiệm là cao chiết ethanol 80% của 3

bộ phận, chúng tôi tiến hành giải ly trong bể sắc ký với hệ dung môi chloroform : ethyl acetate : acid acetic(5:4:1) Kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 1 cho thấy ở cả ba loại cao đều cho 1 vết tối nằm ngang hàng với nhau, có vị trí gần với vạch chất chuẩn, được nghi ngờ là vệt của resveratrol hiện diện trong 3 mẫu cao chiết Tuy nhiên, có sự chênh lệch nhỏ về Rf giữa các vệt này so với chất chuẩn nên chưa thể khẳng định sự hiện diện của resveratrol trong cây Cỏ lạc Chúng tôi tiến hành thêm các thí nghiệm bán định lượng bằng UV 308 nm và định lượng bằng HPLC để kiểm chứng sự hiện diện resveratrol có trong 3 loại cao chiết

Hình 1 Kết quả sắc ký bản mỏng (A) Resveratrol – chất chuẩn, (B) Cao rễ, (C) Cao thân, (D) Cao lá Thanh

dọc tương ướng với một cm

Bán định lượng stilbene bằng độ hấp thu UV 308nm

Kết quả xây dựng đường chuẩn được trình bày ở hình 2

Hình 2 Đường chuẩn của resveratrol

Đường chuẩn xây dựng có hệ số tương quan giữa nồng độ resveratrol với mật độ quang (OD = 308 nm) là

R2 ≈ 1, một giá trị đáng tin cây: cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ resveratrol (mg/ml) với độ hấp thu

UV 308 nm Mối quan hệ đó được thể hiện thông qua phương trình: y = 113,76x – 0,0678 Kết quả đo được thể hiện trong bảng 2 Trước khi tiến hành đo, khối lượng (M) các mẫu cao là 0,05 g, thể tích dung môi (V) pha loãng là 10 ml và độ pha loãng (ĐPL) là 5 lần

Bảng 2 Kết quả hàm lượng stilbene (mg/g) trong cao chiết thông qua độ hấp thu UV 308 nm

Các chỉ số theo dõi Cao rễ Cao thân Cao lá

Y: độ hấp thụ bước sóng 308nm 2,783± 0,027 2,409 ± 0,034 2,987 ± 0,077

Hàm lượng stilbene =

(mg/g) 24,947

b ± 0,234 21,645c ± 0,274 26,748 a ± 0,676

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, cả ba bộ phận của cây Cỏ lạc đều có sự hiện diện của nhóm hợp chất stilbene

Lá là bộ phận có hàm lượng stilbene cao nhất (26,748 ± 0,676) so với hai bộ phận còn lại Rễ là bộ phận chứa hàm lượng stilbene cao thứ hai sau lá (24,947 ± 0,234) nhưng vẫn đánh giá là một nguồn nguyên liệu có tiềm năng cao vì có thể áp dụng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ kết hợp kỹ thuật tăng sinh hợp chất đang được dùng rộng rãi trên thế giới Do đó, chúng tôi vẫn chọn rễ là nguồn nguyên liệu khai thác cho mục tiêu thu nhận resveratrol

Định lượng resveratrol trong rễ Cỏ lạc bằng HPLC

Với những nhận định trên, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng resveratrol bằng phương pháp

HPLC-UV đối với mẫu rễ tươi, rễ khô và mẫu cao chiết rễ của cây Cỏ lạc Kết quả được thể hiện ở bảng 3 và hình 3

Bảng 3 Kết quả định lượng Resveratrol của 3 mẫu rễ tươi, rễ khô và cao chiết bằng phương pháp HPLC-UV

Tên mẫu Đơn vị Kết quả phân tích

Kết quả ở bảng 3 đã chứng minh rõ ràng có sự hiện diện của resveratrol trong rễ cây Cỏ lạc A pintoi Ở kết

quả của mẫu rễ tươi và khô, chúng tôi so sánh hàm lượng của mẫu rễ với các số liệu báo cáo về hàm lượng resveratrol ở các nguồn thực vật chưa cải tao gene của Zhang và cộng sự (2011) Trong đó, sự dao động hàm lượng resveratrol ở mẫu tươi là 0,01 đến 9,30 µg/g (quy đổi tương ứng từ mg/kg mẫu thành µg/g mẫu) và ở mẫu khô là 0,83 đến 1.330 µg/g Đối với kết quả cao chiết, chúng tôi so sánh với kết quả của Chen và cộng sự (2001),

với hàm lượng resveratrol trong cao chiết rễ đậu phộng A hypogaea L được thu hái vào mùa xuân từ 15 đến

63µg/g Thông qua sự so sánh với các số liệu từ các báo cáo trên, chúng tôi thấy rằng rễ Cỏ lạc thực sự là một nguồn nguyên liệu có nhiều tiềm năng cho việc thu nhận resveratrol với hàm lượng khá cao

Khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận cây Cỏ lạc in vitro

Các bộ phận của cây Cỏ lạc in vitro 20 ngày tuổi bao gồm lá, cuống lá, thân, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp,

tử diệp, và rễ được cảm ứng tạo rễ tơ, sau 2-3 tuần, phần trăm mẫu tạo rễ tơ và số rễ tơ trên mỗi mẫu cấy được ghi nhận ở bảng số 4 Kết quả cho thấy mỗi bộ phận khác nhau thì khả năng cảm ứng cũng khác nhau Trong các

bộ phận thì chỉ có lá, cuống lá và trụ hạ diệp có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ Phần trăm cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ

tơ ở trụ hạ diệp là cao nhất Mẫu cuống lá tuy có tỷ lệ cảm ứng tạo rễ cao hơn mẫu lá nhưng số rễ tơ ở cả hai mẫu gần bằng nhau Tất cả các mẫu đối chứng không hình thành rễ

Hình thái rễ tơ quan sát được giống với mô tả của Mediana-Bolivar (2007), Hoàng Thị Thanh Minh và cộng sự (2011) Chiều dày rễ trung bình khoảng 1 mm, không có lông tơ rõ ràng, có nhiều nhánh, phát triển nhanh trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra rễ còn tiết nhiều phenol

Bảng 4 Tỉ lệ tạo rễ tơ và số rễ tơ cảm ứng được từ các bộ phận khác nhau

Bộ phận % tạo rễ tơ Số rễ tơ

Lá 26,30c ± 12,20 2,00b ± 0,00 Cuống lá 40,95b ± 1,64 2,00b ± 1,73 Trụ hạ diệp 100,00a ± 0,00 7,33a ± 0,57

Từ những kết quả thu được, chúng tôi thấy được rằng cây Cỏ lạc có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ với vi

khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 Trụ hạ diệp có khả năng cảm ứng là 100% với số rễ mỗi mẫu là 7,33, trong

khi đó Karthikeyan và cộng sự (2007) và Hoàng Thị Thanh Minh và cộng sự (2011) ghi nhận tỷ lệ cảm ứng và

số rễ từ mẫu trụ hạ diệp của cây lạc A hypogaea L cao nhất là 73.5%; 6,77 và 75,927%; 6,676 Dựa vào những kết quả trên, chúng tôi thấy rằng khả năng cảm ứng tạo rễ tơ bởi A rhizogenes ATCC 15834 lên cây Cỏ lạc A pintoi có hiệu quả và nhiềm tiềm năng cho ứng dụng khai thác sinh khối rễ sau này

Hình 4 Từ trái sang phải: Đối chứng, Mặt trước dĩa cảm ứng rễ tơ và Mặt sau dĩa cảm ứng rễ tơ Mỗi thanh

ngang tương ứng với 2 cm

Hình 5 Từ trái sang phải: Rễ tơ cảm ứng từ lá, cuống lá và trụ hạ diệp Mỗi thanh ngang tương ứng 1 cm

Kết hợp thủy canh trên mô hình cảm ứng rễ tơ cây Cỏ lạc in vivo

Sau khi nuôi thủy canh 20 ngày, chúng tôi tiến hành thu mẫu và ghi nhận các số liệu về chiều dài, khối lượng tươi và khối lượng khô của bộ rễ cây Cỏ lạc được xâm nhiễm khuẩn trong điều kiện nuôi cấy thủy canh Kết quả được trình bày ở bảng 5

Bảng 5 Số liệu chiều dài, khối lượng tươi và khô của mẫu rễ đối với từng phương pháp xâm nhiễm

Nghiệm thức Chiều dài rễ (cm) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)

Hình 6 Rễ của các nghiệm thức (A) Đối chứng, (B) Phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy, (C)

Phương pháp tiêm khuẩn Mỗi thanh dọc tương ứng 20 cm

Kết quả về ba chỉ tiêu theo dõi ở bảng 5 cho thấy, cả hai phương pháp cảm ứng rễ trên cây Cỏ lạc A pintoi

được nuôi cấy trong điều kiện thủy canh đều cho số liệu cao hơn hẳn đối chứng Cụ thể, xét về chiều dài thì phương pháp tiêm khuẩn cho chiều dài rễ cao nhất là 24,71 ± 3,50 cm Tuy xét về chiều dài thì phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy đứng sau phương pháp tiêm khuẩn nhưng ở chỉ tiêu khối lượng tươi và khối lượng khô ở phương pháp này lại cho hiệu quả cao nhất với các số liệu lần lượt là 0,072 ± 0,019 g; 0,694 ± 0,190

g Ngoài ra, quan sát ở hình số 6, ta có thể thấy hiệu quả tạo rễ từ hai phương pháp rất tốt, bộ rễ ở hai phương pháp sau 20 ngày nuôi cấy đều phát triển hơn bộ rễ ở mẫu đối chứng Ở vùng trụ hạ diệp của cây đồng nuôi cấy với dịch khuẩn sau khi tạo vết thương, rễ mọc ra nhiều hơn và dài hơn ở cây được tiêm khuẩn Các phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới Sanghamitra Khandual và

cộng sự (2014) đã cho thấy phương pháp xâm nhiễm Agrobacterium rhizogenes bằng dao ở vùng trụ hạ diệp cây Phaseolus vulgaris cho hiệu suất tạo rễ tơ là 100% và xác suất biểu hiện gen chuyển là 100% trong khi đó

phương pháp tiêm khuẩn cho hiệu suất cảm ứng từ 60 đến 80%, biểu hiện gen chuyển chỉ từ 20 đến 60% Từ đó,

ta có thể ứng dụng phương pháp xâm nhiễm tạo rễ tơ này với mục đích thu nhận một lượng lớn sinh khối rễ trong thủy canh, cũng như tạo ra các chế phẩm vi sinh phục vụ cho mục đích này

Hình 7 Bộ phận trụ hạ diệp của (A) Đối chứng, (B) Phương pháp xâm nhiễm kết hợp đồng nuôi cấy, (C)

Phương pháp tiêm khuẩn Mỗi thanh dọc tương ứng với 1 cm

Kiểm tra gen chuyển với các mẫu rễ tơ cảm ứng in vitro và trong điều kiện nuôi cấy thủy canh

Các mẫu DNA sau khi tách chiết được tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu rolBF và rolBR, nhằm khuếch đại trình tự 423bp của gen rolB Kết quả điện di trên bảng gel cho thấy ngoại trừ giếng của sản phẩm PCR từ rễ in vitro và rễ đối chứng in vivo, các giếng nạp mẫu các sản phẩm rễ cảm ứng đều xuất hiện 1 vạch phát quang ở vị trí 423bp cùng vị trí với mẫu chứng dương Rõ ràng, trình tự mục tiêu của gen rolB với chiều dài 423bp đã được khuếch đại ở mẫu chứng dương (Ri-plasmid của vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834) và các

mẫu rễ tơ từ trục hạ diệp (bộ phận cho tỷ lệ cảm ứng rễ tơ cao nhất), mẫu rễ cảm ứng từ phương pháp tiêm khuẩn

và phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy mà không khuếch đại ở các mẫu rễ không được biến nạp

Từ đó, ta có thể kết luận rằng gen rolB từ Ri-plasmid của vi khuẩn đã sáp nhập vào bộ gen của rễ tơ in vitro và

rễ nuôi thủy canh của cây Cỏ lạc A pintoi Krabov & W.C.Gregory

Hình 8 Kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi rolBF và rolBR Giếng 1: sản phẩm PCR bộ gen rễ tơ cảm

ứng từ trụ hạ diệp; Giếng 2: sản phẩm PCR của Ri-plasmid 15834; Giếng 3: sản phầm PCR của mẫu nước; Giếng 4: Thang 100bp; Giếng 5: sản phẩm PCR của mẫu rễ in vitro đối chứng; Giếng 6: sản phẩm PCR của mẫu

rễ in vivo thủy canh đối chứng; Giếng 7: sản phẩm PCR của mẫu rễ tơ từ phương pháp tạo vết thương kết hợp

đồng nuôi cấy; Giếng 8: sản phẩm PCR của mẫu rễ tờ từ phương pháp tiêm khuẩn

KẾT LUẬN

Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng cây Cỏ lạc Arachis pintoi Krabov & W.C.Gregory hoàn

toàn có thể sử dụng như một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol Cả ba bộ phận đều chứa stilbene, trong

đó lá là bộ phận chứa hàm lượng stilbene cao nhất Rễ của cây Cỏ lạc được chứng minh rõ ràng có sự hiện diện của resveratrol với hàm lượng khá cao Vì vậy ngoài những lợi ích về mặt mỹ quan và nông học, cây Cỏ lạc còn

có thể có ích đối với sức khỏe con người Chúng tôi cũng đã chứng minh được khả năng cảm ứng rễ tơ của cây

Cỏ lạc Cụ thể, đối với thí nghiệm cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận, lá, cuống lá và trụ hạ diệp đều có khả năng cảm ứng, trong đó trụ hạ diệp là bộ phận có tỷ lệ cảm ứng và số rễ tơ trên mỗi mẫu cao nhất Phương pháp xâm

nhiễm tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy với vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 trong thủy canh trên các

cá thể Cỏ lạc cho hiệu quả cao nhất, khối lượng tươi và khô của bộ rễ của phương pháp này cao hơn hẳn so với phương pháp tiêm khuẩn Rễ tơ cảm ứng từ các nguồn cho thấy tín hiệu khuếch đại dương tính khi thực hiện

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen rolB Các kết quả trên cho thấy, chúng tôi có thể chủ động tạo ra và

tăng sinh sinh khối rễ tơ Cỏ lạc và nguồn cây này lại có nhiều tiềm năng có thể được sử dụng để thu nhận resveratrol

RESEARCH OF USING PINTO PEANUT (ARACHIS PINTOI KRABOV & W.C.GREGORY)

AS A SOURCE FOR RESVERATROL PRODUCTION.

Vũ Thị Bạch Phượng, Trần Quốc Tân, Phạm Công Thủy Tiên, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

ABSTRACT

Resveratrol, a compound belonging to the group of secondary metabolites - phytoalexin, is best known for outstanding biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, cancer, heart disease and aging prevention The demand forresveratrol use and commercialization is increasing everyday, while the amount of natural resveratrol extract is extremely low Finding and developing new

sources containing resveratrol istherefore necessary and important Pinto peanut (Arachis pintoi Krabov & W.C Gregory) is currently only planted as decorative lawns in parks and fields Pinto peanut shares the same family with Groundnuts (Arachis hypogaea L.)-a source to obtain resveratrol that has been studied by Chen et al (2001) The presence of resveratrol in roots of Pinto peanut is demonstratedusing the Thin Chromatography, UV 308nm absorbance measurements and HPLC-UV

As resveratrol content is relatively high in roots, Pinto peanut can be used as a material to obtain resveratrol Also, to actively proliferate roots as materials, hairy roots induction technique from in vitro thin layer explantsand in vivo hydroponicsindividualsis conducted through the exploitation of the ability

to produce hairy roots of Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.

Key words: Pinto peanut (Arachis pintoi Krabov & W C Gregory), resveratrol, hairy roots,

Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1.] Hoàng Thị Thanh Minh, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ, Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ

tơ in vitro cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm thu nhận resveratrol Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4A), (2011): tr 665-672

[2.] Aggarwal B.B and Shishodia S., Resveratrol in Heath and Disease Taylor and Fancis Gourp, (2006),

USA

[3.] Aggarwal B.B., Bhardwaj A., Aggarwal R.S., Seeram N.P., Shishodia S and Takada Y, Role of

Resveratrol in Peventiion and Therapy of Cancer: Preclinical and Clinical Sttudies, Anticancer Research,

24(2004): pp 1-60

[4.] Chen R.S., Wu P.L and Chiou R Y Y, Peanut Roots as a Rourse of Resveratrol, Journal of Agricultural and Food chemistry, 50 (2002): pp 1665-1667

[5.] FurnernI.J., Huffman G.A, Amaasino R.M., Garfinkel D.J., Gordon M.P., And Nester E.W., An

Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana, Nature,319 (1986): pp 422-428

[6.] Karthikeyan A., Palanivel S., and Bhakyaraj R., Hairy root induction from hypocotyls segments of

groundnut (a = Arachis hypogaea L.), African Journal of Biotechnology 6 (2007): pp.1817-1820

[7.] Kim JS, Lee SY, Park SU, Resveratrol production in hairy root of peanut, Arachis hypogaea L transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains African Journal of Biotechnology 7 (2008):

[10.] Media-Bolivar F, Condori J, Rimando AM, Hubstenberger J, Shelton K, O‟Keefe SF, Benett S and Dolan

MC, Production and secretion of resveratrol in hairy root culturesof peanut, Phytochemistry, 68 (2007):

pp 1992-2003

[11.] Nuno Ratola, Joaquim Luís Faria and Arminda Alves, Analysis and Quantification of trans- Resveratrol

in Wines from Alentejo Region (Portugal), Food Technol, Biotechnol 42(2) (2004): pp 125-130

[12.] Sanghamitra Khandual, Pallavolu Maheswara Reddy, Rapid, Efficient and High-Performance Protocol for

Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation of the Common Bean Phaseolus vulgaris, Scientific research (2014): pp 332-339

[13.] Sinkar VP, White FF, Gordon MP, Molecular biology of Ri-plasmid, J Biosci – Indian Acad Sci 11

(1987): pp 47-57

[14.] Stewart C.n Jr and Via L.E., A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and

other PCR application, Biotechniques, 14 (1993): pp 748-751

[15.] Veena V and Christopher G T, Review.Agrobacterium Rhizogenes: recent developmens and promising applications, In vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, 43 (2007): pp 383-403

[16.] Zhang, A., et al, Occurrence and estimation of trans- resveratrol in one-year-old canes from seven major

Chinese grape producing regions, Molecules, 16(4) (2011): pp 2846-61

IV-O-1.8

ẢNH HƯỞNG CỦA N, P, K, CYTOKININ VÀ STRESS NƯỚC LÊN THỜI GIAN RA HOA

CỦA DENDROBIUM SONIA

Trần Hà Tường Vi, Nguyễn Du Sanh

Trường Đại học học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM

TÓM TẮT

Lan Dendrobium Sonia thường được sử dụng như hoa cắt cành và trồng trong chậu do màu sắc đẹp tuy nhiên quá trình tăng trưởng thường kéo dài 13 tháng sau khi được trồng ngoài vườn Các tỷ lệ N: P: K khác nhau , kết hợp với benzyladenin (BA) và ngưng tưới nước được khảo sát để rút ngắn thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia Những cây lan sau khi trồng 6 tháng với nền phân bón (PB) N,P,K theo nồng độ tăng P có thể rút ngắn thời gian ra hoa nhưng sớm hơn đối chứng không nhiều Với nền phân có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K kết hợp phun 100 mg/l BA cây lan cho chồi hoa sớm (sau 30 ngày xử lý) tuy nhiên tỷ lệ cây mang chồi hoa thấp (20%) Với nền phân có chứa 50 mg/l N,

100 mg/l P, 50 mg/l K, kết hợp xử lý ngưng tưới nước 2 tuần và phun 100 mg/l BA, cây ra hoa sớm (sau 30 ngày xử lý) và tỷ lệ cây mang chồi hoa cao (73,3%) Những cây đối chứng phun N, P, K theo nồng độ 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K chỉ cho 13,3% chồi hoa sau 120 ngày xử lý

Từ khóa: Dendrobium Sonia, BA, N,P,K, stress nước

MỞ ĐẦU

Dendrobium là một loại cây cảnh được nhiều người ưa chuộng do giá thành hợp lý, màu sắc và hình dạng

phong phú Hoa màu trắng, vàng, hồng hay tím và các màu sắc khác của cây lai Số lượng loài được phát hiện

của giống lan này đã hơn 1.200 loài Hiện nay Dendrobium Sonia được trồng như một loại cây cho hoa cắt cành theo quy mô công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao Tuy nhiên, Dendrobium Sonia có thời kỳ ấu niên kéo dài

thông thường đến 13 tháng Vì vậy, rút ngắn thời gian sinh trưởng của lan, kích thích cho cây lan ra hoa sớm và theo chủ đích của người trồng là một việc làm cần thiết

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Cây Dendrobium Sonia lấy ra từ chai nuôi cấy mô được bó trong các thanh xơ dừa dài khoảng 4 cm, đặt

trong chậu nhựa dài 4 cm, đường kính 4 cm Cây được trồng 6 tháng ngoài vườn có 3 lá, 2 thân được dùnglàm vật liệu thí nghiệm

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của N, P, K lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Thí nghiệm ảnh hưởng của N, P, K ở các nồng độ khác nhau Với công thức PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P,

100 mg/l K), PB2 (30 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB3 (30 mg/l N, 100 mg/l P, 100 mg/l K), PB4 (50 mg/l

N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được khảo sát

Từ thí nghiệm 1, công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp

theo

Thí nghiệm 2 Ảnh hưở ng của BA lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Thí nghiệm ảnh hưở ng v ới các nồng độ BA khác nhau (0, 100, 200, 300 mg/l) phối hợp với nền phân bón

của công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được khảo sát

Từ thí nghiệm 2, BA ở nồng độ 100 mg/l được dùng cho các thí nghiệm về sau

Thí nghiệm 3 Ảnh hưở ng của N , P, K, 100 mg/l BAvà stress nước lên th ời gian ra hoa của Dendrobium

Sonia

Thí nghiệm ảnh hưở ng của công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) hay công thức PB4 (50 mg/l

N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) phối hợp 100 mg/l BA; stress nước phối hợp với công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l

P, 50 mg/l K); stress nước phối hợp 100 mg/l BA và với các công thức phân bón khác nhau (PB1, PB2, PB3,

PB4)

Điều kiện xử lý: địa điểm thí nghiệm có cường độ ánh sáng 21.000 ± 200 lux, độ ẩm 70 ± 3%, nhiệt độ 30

± 2oC (đo lúc 11 giờ sáng)

Nước được tưới bằng hệ thống tự động 1 lần/ngày vào 4 giờ chiều

Tưới phân: tưới dung dịch phân vào 8-9 giờ sáng Sau khi mặt lá ráo nước (khoảng 15 phút), tưới lại bằng

nước sạch Tưới 2 lần/tuần trong 2 tuần liên tiếp theo các nghiê ̣m thức , sau đó tưới 100 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K các tuần tiếp theo

Xử lý BA: phun dung dịch BA vào lúc 5 giờ chiều, phun 1 lần/tuần, liên tiếp trong 4 tuần, phun 15 ml cho

mỗi chậu

Điều kiện stress nước: đặt cây vào nhà lưới có mái che với cường độ ánh sáng 20.000 lux, độ ẩm 65%,

không tưới hoàn toàn trong 2 tuần Sau đó, ngâm cây trong nước 10 phút và bố trí theo từng nghiệm thức

Quan sát thời gian xuất hiện phát hoa, ghi nhận % cây có chồi hoa nhú 2 mm

Giải phẫu mô học

Chồi cây trong giai đoạn sinh trưởng được dùng để giải phẫu mô phân sinh ngọn chồi (SAM) Chồi nhú ra khoảng 2 mm từ bề mặt giả hành được dùng làm mẫu giải phẫu mô phân sinh phát hoa

Cường độ quang hợp và hô hấp

Lá ở gần phát hoa khi phát hoa phát triển được 15 ngày và lá thứ nhất (tính từ trên xuống) ở những cây đối chứng được dùng để đo cường độ quang hợp và hô hấp

Cường độ quang hợp và hô hấp của mẫu được đo bằng áp kế Warburg, ở 25oC, ánh sáng 2.000 lux (đo quang hợp) hoặc trong tối (đo hô hấp) Cường độ quang hợp có đơn vị đo là µlO2/cm2/giờ, cường độ hô hấp có đơn vị đo là µlO2/g/giờ (Nguyễn Du Sanh và csv, 2013)

Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Lá thứ nhất tính t ừ trên xuống ở những cây đối chứng và lá ở gần phát hoa lúc cây xuất hiện phát hoa sau

15 ngày được dùng để xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh Sắc ký bản mỏng, diệp tiêu lúa,

tử diệp dưa leo và cây mầm xà lách được dùng làm sinh trắc nghiệm (Nguyễn Du Sanh và csv, 2013)

Hàm lượng đường và tinh bột

Lá thứ nhất tính từ trên xuống ở những cây đối chứng Lá ở gần phát hoa lúc cây xuất hiện phát hoa sau 15 ngày được dùng để xác định hàm lượng đường và tinh bột

Xác định đường chuẩn: các ống nghiệm chứa dung dịch đường saccharose ở các nồng độ khác nhau (10,

20, 30, 40, 50, 60, 70 µg/l) có chứa phenol 5% và acid sunfuric đậm đặc Dịch phản ứng được so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 490 nm (Phạm Thị Ánh Hồng và csv, 2004)

Hàm lượng đường và tinh bột được ly trích và đo theo Combs và csv, 1987

KẾT QUẢ

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của N, P, K ở các nồng độ khác nhau lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Sau 30 ngày kể từ ngày đầu tiên xử lý, cây thuộc các nghiệm thức không phát sinh chồi hoa Tuy nhiên, sau

120 ngày xử lý có 13,3% cây cho chồi hoa khi xử lý phân bón theo công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K), trong khi ở lô đối chứng PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K) thì sau 210 ngày mới có 13,3% cây

cho chồi hoa (bảng 1)

Bảng 1 N, P, K ảnh hưởng đến thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Nghiệm thức

% chồi hoa hình thành sau

30 ngày

% chồi hoa hình thành sau

120 ngày

% chồi hoa hình thành sau

150 ngày

% chồi hoa hình thành sau

N, P, K không có hiệu quả khi cảm ứng gợi chồi hoa sớm ở cây Dendrobium Sonia 6 tháng tuổi Cây xử lý

với công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) thì sau 120 ngày mới cho 13,3% cây mang chồi hoa Sự

ra hoa này sớm hơn so với cây đối chứng (công thức PB1) đến 90 ngày Vì vậy, công thức PB4 sẽ được sử dụng

cho các thí nghiệm tiếp theo

ISBN: 978-604-82-1375-6 19

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của BA lên th ời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

BA có tác dụng trong việc kích thích lan Dendrobium Sonia ra hoa sớm Với các nghiệm thức có sử dụng

BA, cây đều cảm ứng cho ra hoa sớm sau 30 ngày xử lý, trong khi ở lô đối chứng PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P,

50 mg/l K) sau 120 ngày xử lý mới xuất hiện chồi hoa ở tỷ lệ 13,3% Dù sử dụng BA ở những nồng độ khác nhau (100 mg/l, 200 mg/l hay 300 mg/l) đều cho tỷ lệ cây ra hoa tương tự nhau (20%) sau 30 ngày xử lý Sau

120 ngày, các nghiệm thức xử lý với BA đều đồng loạt cho thêm 13,3% cây ra hoa (bảng 2)

Bảng 2 Ảnh hưởng của BA lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Nghiệm thức

% chồi hoa hình thành sau

30 ngày

% chồi hoa hình thành sau

Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của N, P, K, BAvà stress nước lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Nghiệm thức stress nước kết hợp với phân bón công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) và BA ở

nồng độ 100 mg/l có hiệu quả tốt nhất khi cảm ứng cho ra 73,3% cây ra hoa sau 30 ngày xử lý Còn với nghiệm

thức phân bón PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) phối hợp với dung dịch 100 mg/l BA chỉ cho 20% cây ra hoa Trong khi đó những cây chỉ phun phân bón với công thức PB4 cho 13,3% cây ra hoa sau 120 ngày (bảng 3,

hình 1)

Bảng 3 Ảnh hưởng của N, P, K, BA và stress nước đến thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

Nghiệm thức

% chồi hoa hình thành sau

30 ngày

% chồi hoa hình thành sau

Như vậy, sự stress nước kết hợp với phân bón có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K và 100 mg/l BA

phù hợp để xử lý lan Dendrobium Sonia ra hoa sớm (sau 30 ngày xử lý) và cho tỷ lệ cây mang chồi hoa cao

(73,3%)

Giải phẫu mô học

Sự chuyển tiếp ra hoa bắt đầu bởi sự tăng kích thước của mô phân sinh ngọn chồi Đỉnh chồi trở nên dày, rộng hơn và kéo dài thành dạng hình vòm rộng, sinh ra các phác thể lá bắc ở vùng viền của đỉnh và các tế bào trong các mô có phân biệt rõ các vách tế bào trơn, nhỏ, chứa đầy tế bào chất (hình 2)

Cường độ quang hợp, hô hấp

Cường độ hô hấp ở cây trong giai đoạn sinh sản cao hơn so với cây vẫn trong thời kỳ sinh trưởng Cường

độ quang hợp giữa 2 giai đoạn này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 4)

Bảng 4 Sự thay đổi cường độ quang hợp và cường độ hô hấp trong giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản

(*): sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Khi chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang sinh sản, hàm lượng ABA giảm dần, GA3 tăng dần, hàm lượng IAA giảm nhẹ trong khi hàm lượng zeatin tăng nhẹ (bảng 5)

Bảng 5 Sự thay đổi các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản

Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05

Hàm lượng đường và tinh bột

Khi chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang sinh sản, hàm lượng đường và tinh bột đều tăng đáng kể (bảng 6)

Bảng 6 Hàm lượng đường và tinh bột trong 1 g trọng lượng tươi (TLT) lá giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản

(*): sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

THẢO LUẬN

Tác động của N, P, K lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: dinh dưỡng là một yếu tố thường được sử

dụng để kích thích ra hoa ở thực vật trưởng thành trên nguyên lý tỷ lệ C/N thích hợp Đối với những cây

Dendrobium Sonia còn trong giai đoạn ấu niên thì việc sử dụng N, P, K để cảm ứng ra hoa có hiệu quả chậm

Hình 2 Sự khác biệt của mô phân sinh ngọn chồi (SAM) (a)

và mô phân sinh hoa (b) lan Dendrobium Sonia

mới có khả năng phát sinh hoa (Pfeifer và csv, 2006) Tuy nhiên khi hàm lượng N cao (100 mg/l N), sự cạnh tranh giữa sinh dưỡng và sinh sản làm ức chế quá trình ra hoa cho nên sau 210 ngày xử lý mới có 13,3% cây mang chồi hoa Khi các cây đã thành thục, quá trình cảm ứng có lẽ không bị chi phối bởi sự cạnh tranh giữa giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản nhiều nữa mà chủ yếu phụ thuộc vào môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm ) Yếu

tố dinh dưỡng được xem là không có tác động nhiều lên quá trình ra hoa của thực vật so với các yếu tố môi trường khác (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm ) (Salisbury, 1955)

P giúp điều hòa hoạt động sinh lý thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển tiếp ra hoa Những nghiệm thức có nồng độ P cao (50 mg/l) hoặc cho cây ra hoa sớm (120 ngày sau ngày đầu tiên xử lý) hoặc cho tỷ lệ chồi hoa cao (26,7%) sau 150 ngày xử lý so với P thấp (bảng 1) Tuy nhiên, P cao lại không cần

thiết đối với những cây Dendrobium đã thành thục (Bichsel và Starman, 2008)

Tác động của BA lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: BA có hiệu quả khi cảm ứng gợi chồi hoa sớm trên Dendrobium Sonia Xử lý với BA (100 mg/l) có 20% cây ra hoa so với đối chứng (không phun BA) sau đó

90 ngày mới cho chồi hoa Các kết quả này cũng tương tự trên Dendrobium Angel White (Nambiar và csv, 2012) với 85% cây ra hoa sau 53 ngày, Dendrobium Louisae (Goh, 1979) với 80% cây ra hoa sau 7-9 ngày xử lý BA

ngoại sinh có thể đã làm tăng hoạt tính cytokinin nội sinh (bảng 5) để tác động lên đỉnh sinh trưởng của lan

Dendrobium Sonia, chính vì vậy mà khả năng cảm ứng chuyển tiếp từ SAM sang mô phân sinh hoa mới diễn ra

nhanh chóng Một mặt khác BA có thể làm kích thích hoạt động của các gen quang hợp, làm tăng cường độ quang hợp thông qua tăng cường tổng hợp diệp lục tố và làm mở rộng diện tích lá (Eng và Lian, 2001) Tuy nhiên cường độ quang hợp giữa 2 giai đoạn này lại không có sự khác biệt mang tính thống kê Điều này có thể

do quá trình stress nước trước đó đã ức chế phần nào khả năng quang hợp

Tác động của stress nước và BA lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: stress nước làm cản tăng trưởng thực vật (Bùi Trang Việt, 2002), làm chậm quá trình phát sinh chồi mới trên lan Dendrobium Sonia (kết quả không được nêu ra) Stress nước trên lan Dendrobium Sonia được xem như một tác nhân tương tự như mùa khô

tuyệt đối để cảm ứng ra hoa theo mong muốn có thể đã kích thích sinh ra prolin, một loại acid amin có liên quan đến việc ra hoa (Mattioli và csv, 2009)

Stress nước làm cho các cây phát triển chậm lại và “đón” đúng thời điểm phun BA nên hiện tượng gợi hoa diễn ra Nếu BA được xử lý khi đỉnh sinh trưởng đang phát triển mạnh hay lúc đỉnh sinh trưởng đã ngừng (khi này auxin trong giả hành giảm thì đều không thích hợp cho việc cảm ứng ra hoa (Goh, 1979)) Như vậy, quá trình phát triển của chồi hoa cũng phải được điều hòa bởi các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong đó có IAA IAA có thể di chuyển từ lá đến phát hoa nên trong phát hoa có hoạt tính IAA tăng dần qua các giai đoạn phát triển (Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt, 2006) ABA được biết đến như hormon ức chế tăng trưởng ở thực vật, điều khiển quá trình ngủ ở thực vật (Öpik và Rolfe, 2005) Có thể do đó mà ABA giảm ở những cây đang trong giai đoạn sinh sản Giberelin có vai trò kích thích sự tăng trưởng chồi được huy động về lá và sau đó được chuyển đến chồi hoa nên trong giai đoạn sinh sản có hoạt tính giberelin trong lá cao hơn trong giai đoạn sinh dưỡng Bên cạnh đó, hàm lượng đường và tinh bột trong lá tăng cũng phù hợp khi cường độ hô hấp tăng trong thời kỳ cây mang phát hoa Đường được xem như là nguyên liệu của quá trình hô hấp, thông qua quá trình hô hấp được chuyển hóa tạo nên năng lượng cần thiết cho quá trình sinh sản ở thực vật

Như vậy quá trình ra hoa được điều khiển bởi nhiều hormon khác nhau, BA là một trong số đó Stress nước

cũng có hiệu quả trong quá trình cảm ứng ra hoa trên Dendrobium Sonia Khi kết hợp stress nước với BA sẽ làm tăng hiệu quả ra hoa sớm trên Dendrobium Sonia

KẾT LUẬN

Dung dịch BA ở nồng độ 100 mg/l và stress nước có hiệu quả cảm ứng ra hoa sớm ở lan Dendrobium

Sonia khi được xử lý riêng lẽ (sau 30 ngày xử lý), tuy nhiên tỷ lệ cây mang chồi hoa thấp (20%)

Stress nước kết hợp với phân bón có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K và BA ở nồng độ 100 mg/l cho tỷ lệ cây có chồi hoa cao nhất, đạt 73,3% sau 30 ngày xử lý ở lan 6 tháng tuổi

Với việc xử lý P cao cũng hiệu quả cảm ứng ra hoa sớm trên lan Dendrobium Sonia tuy nhiên thời gian

sớm hơn so với đối chứng không đáng kể

EFFECT OF N, P, K, CYTOKININ AND WATER STRESS ON THE FLOWERING TIME

OF DENDROBIUM SONIA

Tran Ha Tuong Vi, Nguyen Du Sanh*

Faculty of Biology, University of Science, VNU-HCM

ABSTRACT

Dendrobium Sonia is commonly used as flowers cutting and planted in pots because of beautiful color, however the process of growth usually lasts 13 months after planting at garden Different ratio N: P: K, in combination with benzyl adenine (BA) and stress water were investigated to shorten flowering time of Dendrobium Sonia Dendrobium Sonia plants (planted at garden 6 months), which treated with N, P, K with high concentration of P, could shorten flowering time but not much earlier than control plants Dendrobium Sonia which sprayed N 50 mg/l + P 100 mg/l + K 50 mg/l and BA

100 mg/l had flower buds early (after 30 days), however the rate of flowering plant was low (20%) Orchids, which were stopped watering in 2 weeks, sprayed the N 50 mg/l + P 100 mg/l + K 50 mg/l and BA 100 mg/l, had flower buds early (after 30 days) and the rate of flowering plant was high (73,3%) Control plants which sprayed N, P, K at 50 mg/l N+ 100 mg/l P+ 50 mg/l K had 13,3% flowering plants after 120 days

Keywords: Dendrobium Sonia, BA, N,P,K, water stress

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Phạm Thị Ánh Hồng, Trần Mỹ Quan, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Quang Tâm (2004), Thực tập sinh hóa

cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh

[2] Nguyễn Du Sanh , Võ Thị Bạch Mai, Phan Ngô Hoang, Đỗ Thườ ng Kiê ̣t, Trịnh Cẩm Tú (2013), Thực tập chuyên ngành sinh lý thực vật, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh

[3] Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006), Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhằm làm tăng số

nụ hoa và chất lượng hoa lan Dendrobium sp., Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, Số 3 23-26

[4] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, phần I - Dinh dưỡng, Nxb Đại học Quốc gia Thành

phố Hồ Chí Minh, 349 trang

[5] Bichsel R.G., Starman T.W and Wang Y-T (2008), Nitrogen, phosphorus, and potassium requirements

for optimizing growth and flowering of the Nobile Dendrobium as a potted orchid, HortScience,

43:328-332

[6] Combs J., Hind G., Leegood R.C.,Tieszen L.L and Vonshak A (1987), Measurement of starch and

sucrose in leaves, Edited by J Combs, D.O hall S.P Long, J.M.O Scurlock, Pergamon Press, pp

219-228

[7] Goh C.J (1979), Hormonal regulation of flowering in a sympodial orchid hybrid Dendrobiun Louisae, The New Phytologist, 82: 375-380

[8] Öpik H and Rolfe S (2005), The physiology of flowering plants, Cambridge, 4th Edition, 404 pp

[9] Pfeifer M., Heinrich W and Jetschke G (2006), Climate, size and flowering history determine flowering

pattern of an orchid, Botanical Journal of the Linnean Society, 151:511-526

IV-O-1.9

VI NHÂN GIỐNG CÂY BẪY KẸP DIONAEA MUSCIPULA

Hồng Vũ Thúy Uyên (1) , Nguyễn Hữu Trọng (1) , Trần Hoàng Phúc (2) , Bùi Văn Lệ (1)

(1) Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM (2) Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ Sinh học Tiền Giang

TÓM TẮT

Quy trình vi nhân gi ống loài này được chúng tôi xây dựng hoàn thiện dựa trên các khảo sát trong

3 giai đoạn: nhân chồi, cảm ứng tạo rễ và ra vườn ươm Trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) với hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa bổ sung kinetin 0,5mg/l cho hiệu quả nhân chồi cao nhất (20,44 ± 2,14 chồi/mẫu); sử dụng NAA 0,5mg/l giúp tạo rễ tốt nhất (5,33 ± 0,44 rễ/chồi) Những cây con hoàn chỉnh đạt kích thước 4-5cm được chọn để bước vào giai đoạn chuyển tiếp trong

2 tuần: trồng trên giá thể gồm dớn và đá perlite tỉ lệ 1:1, đặt dưới điều kiện chiếu sáng nhân tạo, chế

độ tưới 3 ngày/lần, sử dụng bọc nilon có đục lỗ để giữ độ ẩm Sau đó, cây con được chuyển ra vườn ươm, giữ nguyên giá thể và chế độ tưới Tỉ lệ sống sót đạt gần 100%

Từ khóa: Dionaea muscipula, Venus Flytrap, cây bẫy kẹp, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vi

nhân giống, môi trường MS

Chữ viết tắt : BA Benzyladenine, IBA indole-3-butyric acid, NAA α-Naphthaleneacetic acid

MỞ ĐẦU

Dionaea muscipula thuô ̣c ho ̣ Droseracea nhưng vùng phân bố tự nhiên của chúng không rô ̣ng kh ắp trên

thế giới như m ột số loài cùng họ khác mà chúng ch ỉ xuất hiê ̣n duy nhất ở khu vực bang B ắc Carolina, Hoa Kỳ Chúng có hình dáng lá biến dạng thành bẫy kẹp có thể chuyển đô ̣ng, bắt đươ ̣c các loa ̣i côn trùng nhỏ nên thu hút được rất nhiều người chơi cây kiểng trên thế giới Hiê ̣n nay không chỉ ở Mỹ mà Úc mỗi năm sản xuất hàng triê ̣u cây và xuât khẩ u đi nhiều nơi với giá từ 5-20 Đô la Mỹ (100.000 – 400.000 đồng) Ngoài ra, nghiên cứu của Pakulski (1996) phát hiện trong loài cây này nhiều hợp chất thứ cấp như naphthoquinone , plumbagin, ellagic

acid, 3-O-methylellagic acid có giá trị dược tính Tuy nhiên, Dionaea khó nhân giống bằng cách truyền thống ,

vì vậy việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật vi nhân giống trong việc nhân nhanh cây vớ i số lươ ̣ng lớn cung cấp cho mu ̣c đích nghiên cứu và thương ma ̣i là vô cùng c ần thiết Các nghiên cứu trên đối tượng trên thế giới có Hutchinson và cộng sự (1984) đã hoàn thiện quy trình vi nhân giống từ hạt trên môi trường LS (Linsmaier & Skoog), nhân chồi tốt nhất với kinetin 10 μM + NAA 0.5 μM, không cần bổ sung auxin để tạo rễ, NAA ức chế hoàn toàn cảm ứng tạo rễ của chồi non; và gần nhất là Jang (2003) đã hoàn thiện quy trình vi nhân giống trên

môi trường 1/3MS, nhân chồi tốt nhất với kinetin 2.3 μM, tạo rễ tốt nhất với IBA 0.5 μM

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vâ ̣t liê ̣u

Lá non cây Dionaea muscipula ex vitro được khử trùng bằng cồn ethanol 70o và calcium hypochlorite 5% Chồi sau khi khử trùng được cảm ứng sau 8 tuần trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung

Kinetin là nguồn mẫu ban đầu cho các thí nghiệm Môi trường nuôi cấy được sử dụng là MS với nồng độ khoáng

đa lượng giảm đi một nửa (MS ½) bổ sung 30g/l sucrose, agar 8g/l, than hoạt tính 0,5g/l, pH 5.5 ± 0.1; nhiệt độ nuôi cấy 25 ± 2oC, quang kì 16 giờ/ngày Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1, phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan với p = 0,05

Phương pháp

Các chồi non in vitro được nuôi trong 6 tuần trên môi trường chứa cytokinin (Kinetin, BA, Adenine

sulfate) ở những nồng độ khác nhau, đồng thời có hoặc không kết hợp bổ sung NAA 0,1mg/l Các chồi dài 3cm ở thí nghiệm trước được chuyển lên môi trường chứa auxin (IBA, NAA) ở những nồng độ khác nhau để tạo

2-rễ, kết quả được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy Các cây non kích thước 4-5cm, có đủ chồi, lá, rễ được bước vào giai đoạn chuyển tiếp trong 2 tuần, sau đó chuyển ra vườn ươm, khảo sát các yếu tố về độ ẩm, giá thể để đảm bảo tỉ lệ cây con sống sót đạt cao nhất

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Kết quả khảo sát quá trình nhân chồi

Hình 1 Kết quả nhân chồi Dionaea muscipula sau 6 tuần Bảng 1 Sự nhân chồi của Dionaea muscipula trên các môi trường bổ sung cytokinin và auxin

Nồng độ hormone

(mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) Nồng độ

hormone (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm)

0,1

15,26 ± 1,60bc 24,99 ± 2,73

0,1

16,96 ± 3,42bb 22,47 ± 1,93

BA 1,0 + NAA

ee 27,32 ± 1,77abc

*Những chữ cái a, b, c… biểu thị mức phân hạng Duncan với p = 0,05

Sau 7 ngày nuôi cấy các mẫu có bổ sung hormone bắt đầu cảm ứng tạo chồi , sau 14 ngày các mẫu đều nảy chồi, chồi phát sinh từ gốc Với môi trường không bổ sung hormone cây nảy chồi châ ̣m hơn , cần khoảng 10 ngày Hê ̣ số nhân chồi cao nhất là 20,44 ± 2,14 và chiều dài chồi là 24,54 ± 1,64mm ở môi trư ờng sử dụng kinetin 0,5mg/l Trong thí nghiê ̣m này khi kết hơ ̣p kinetin , BA với NAA ở cùng nồng đô ̣ , BA không có tác du ̣ng kích thích ta ̣o chồi, kinentin cho kết quả ta ̣o chồi tốt nhất Adenine sulfate có tác dụng kích thích ta ̣o chồi nhưng yếu Kết quả nhân chồi có sự tương đồng tuy nhiên chiều dài chồi trong nghiệm thức tốt nhất chưa đạt được bằng với kết quả thí ngh iệm của Gi -Won Jang và cô ̣ng sự th ực hiện năm 2003 Điều này chứng tỏ kinetin là loại

cytokinin thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi của Dionaea muscipula và chồi từ nghiệm thức sử dụng kinetin 0,5mg/l không có sự hiện diện của NAA được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm tiếp theo

Kết quả khảo sát quá trình tạo rễ

Biểu đồ 1 Kết quả ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ Dionaea muscipula

Trên môi trường MS ½ đối chứng, chồi vẫn có thể tạo rễ nhưng số lượng rễ ít và có kích thước ngắn Môi trường có bổ sung IBA kích thích tạo nhiều rễ hơn nhưng chiều dài không tăng, giữa các nồng độ thí nghiệm không cho thấy sự khác biệt nhiều có thể được giải thích là do quá trình hấp khử trùng môi trường làm hormone

có độ bền nhiệt thấp như IBA giảm hoạt tính Với môi trường bổ sung NAA rễ to hơn , có nhiều lông tơ Ở nồng

đô ̣ NAA 0,5mg/l thu đươ ̣c số rễ cao nhất 5,33 ± 0,44 Kết quả này khác biệt với kết quả của Gi-Won Jang (2003)

và Hutchinson (1984) sự hình thành rễ tốt nhất trên môi trường bổ sung IBA còn NAA ức chế sự tạo rễ, điều này

có thể được giải thích là do một số khác biệt về điều kiện vật lý, hóa học trong quá trình thực hiện nội dung nghiên cứu giữa các nhóm tác giả Vì vậy, cần nhìn nhận trong điều kiện môi trường tại Việt Nam, có thể không

cần phải sử dụng IBA cho quá trình ra rễ của Dionaea muscipula như các nghiên cứu khác trên thế giới

Kết quả khảo sát giá thể và độ ẩm trong giai đoạn chuyển tiếp và vườn ươm

Các cây con đạt kích thước 4-5cm từ thí nghiệm tạo rễ được bước vào giai đoạn chuyển tiếp tại phòng sáng trong 2 tuần trước khi được chuyển ra điều kiện vườn ươm sử dụng ánh sáng trực tiếp Quá trình xử lý từ môi

trường in vitro sang môi trường ex vitro bao gồm: rửa sạch agar, trồng vào vỉ nhựa trên các loại giá thể khác

nhau (kết quả được ghi nhận trong biểu đồ 2) với chế độ tưới khác nhau bằng nước máy loại clo (kết quả ghi nhận trong biểu đồ 3)

Biểu đồ 2 Kết quả khảo sát loại giá thể trồng Dionaea muscipula ex vitro sau 4 tuần

0510

Biểu đồ 3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm lên Dionaea muscipula ex vitro sau 4 tuần

Nghiệm thức sử dụng dớn và đá perlite kết hợp dớn ở chế độ tưới 3 lần/ngày cho tỉ lệ cây sống sót cao trên

90% Điều này có thể được giải thích là do trong môi trường in vitro, độ ẩm rất cao nên lớp cutin của lá khá

mỏng, khí khổng thường xuyên mở, cây chủ yếu sinh trưởng qua phương thức dị dưỡng nhờ hấp thu dinh dưỡng

từ môi trường, quang hợp yếu Chính vì vậy, giai đoạn chuyển tiếp cho việc chuyển cây từ in vitro ra ex vitro với

sự thay đổi dần về độ ẩm, cường độ ánh sáng, loại giá thể mang ý nghĩa quan trọng trong việc giúp cây làm quen với môi trường tự nhiên có độ ẩm thấp hơn, đẩy mạnh dần bộ máy quang hợp để có thể tự dưỡng, đồng thời tăng kích thước bẫy để bắt đầu thực hiện chức năng bắt mồi Ở đây, chính hai loại vật liệu đá và dớn có tác dụng giữ

ẩm tốt cho cây, đồng thời có độ thoáng khí nhất định giúp rễ sinh trưởng và phát triển và chế độ tưới ướt 3 ngày/lần giúp cung cấp đủ nước cho cây, kết hợp với việc sử dụng bao nilon có đục lỗ là 2 nhân tố then chốt trong giai đoạn chuyển tiếp vừa giúp duy trì độ ẩm ở mức trung bình, vừa đảm bảo độ thoáng khí nhất định để cây hoàn thiện dần bộ máy quang hợp, tăng trưởng lá tốt giúp cây tăng cường khả năng sống sót và thích nghi

trong điều kiện ex vitro Điều này còn thể hiện rõ trong kết quả sử dụng giá thể là cát: vật liệu giữ ẩm tốt nhưng

độ thoáng khí kém và chế độ với mật độ tưới thấp 3 ngày/lần, không sử dụng bao nilon đã khiến cây bị mất nước mạnh, hoặc rễ bị úng không thoát khí làm nó không kịp thích nghi và sinh trưởng kém, thậm chí chết hoàn toàn nếu không cung cấp nước liên tục

Hình 2 Sự thay đổi kích thước và màu sắc bẫy kẹp sau 2 tháng trồng ex vitro

Tuy nhiên, do giá thành của dớn cao hơn đá perlite, lại không thể tái sử dụng sau một thời gian trồng cây nên chúng tôi đề xuất lựa chọn hỗn hợp 1 đá perlite : 1 dớn là giá thể trồng và chế độ tưới 3 lần/ngày hoặc tương

đương là phù hợp cho việc chuyển Dionaea muscipula ra điều kiện ex vitro Trong giai đoạn chuyển tiếp trong

phòng sáng có nhiệt độ trong khoảng 25oC, cây non nên được bao nilon có đục lỗ Sau 3 tháng ra vườn ươm, gần 100% các cây con phát triển tốt, mọc nhiều lá mới xanh mượt, bẫy to có màu hơi đỏ, rễ mọc chắc khoẻ, hoàn thiện đầy đủ chức năng tự nhiên (Hình 3)

Hình 3 Dionaea muscipula sau 3 tháng đưa ra nhà lưới

Tỉ lệ cây sống (/10)

Số lá mới

Chiều dài lá tăng trưởng (mm)

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thí nghiệm thu được chú ng tôi đề xu ất quy trình vi nhân giống cho Dionaea muscipula như

sau: nhân chồi trên môi trườ ng MS 1/2 bổ sung kinetin 0,5mg/l trong thời gian 6-8 tuần Khi các chồi con đủ lớn tách chúng thành các chồ i riêng lẽ chuyển sang môi trường ra rễ là MS 1/2 bổ sung NAA 0,5mg/l từ 6-8 tuần

Các cây con đạt kích thước 4-5cm được chuyển ra trồng ex vitro trên giá thể là 1 đá perlite : 1 dớn, chế độ tưới 3

ngày/lần Trong 2 tuần đầu sử dụng ánh sáng nhân tạo, dùng bao nilon đục lỗ để giữ ẩm cho cây Sau đó mang cây ra trồng ngoài vườn ươm, giữ nguyên giá thể và chế độ tưới Toàn bộ quy trình vi nhân giống kéo dài khoảng 6 tháng, từ một cây ban đầu có thể nhân lên hàng trăm cây, đáp ứng số lượng cho mục đích thương mại cũng như nghiên cứu sâu hơn về sinh hoá, cải tiến giống…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Hutchinson J.F., "In vitro propagation of Dionaea muscipula Ellis (Venus Fly Trap)", Scientia horticulturae 22(1) (2008) 189-194

[2] Jang G.W., Kim K.S., Park R.D., "Micropropagation of Venus fly trap by shoot culture", Plant cell, tissue and organ culture, 72(1) (2003) 95-98

[3] Pakulski G., Budzianowski J., "Ellagic acid derivatives and naphthoquinones of Dionaea muscipula from

in vitro cultures", Phytochemistry, 41(3) (1996):775-778

MICROPROPAGATION OF VENUS FLYTRAP DIONAEA MUSCIPULA

Hong Vu Thuy Uyen (1) , Nguyen Huu Trong (1) , Tran Hoang Phuc (2) , Bui Van Le (1)

(1) Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM (2) Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ Sinh học Tiền Giang

ABSTRACT

Dionaea muscipula, also known as Venus flytrap, is an endangered carnivorous plant which has origin from North and South Carolina, USA An efficient protocol for large-scale multiplication of this species has been set up through 3 stages: shoot multiplication, root induction and moving plant to the natural environment On the half-strength Murashige and Skoog (MS) medium, supplementing with 0.5mg/l kinetin gave the highest shoot proliferation of 20.44 ± 2.14 shoots/explant; adding 0.5mg/l α - naphthaleneacetic acid (NAA) induced the best rooting 5.33 ± 0.44 roots/shoot The 4-5cm plantlets were then transplanted on the rooting medium including 50% peat and 50% perlite In the first 14 days, they were placed in the light room with the application of an anti-transpirant film, irrigated 3 times/day and after that all moved to the garden The rate of successful transfer process reached nearly 100%

Keywords: Dionaea muscipula, Venus Flytrap, Plant growth regulator, micropropagation,

Murashige &Skoog Medium

IV-O-1.10

ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ RAPD ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT

SỐ LOÀI LAN RỪNG THUỘC CHI DENDROBIUM THU THẬP Ở TÂY NGUYÊN VÀ

51 mẫu lan nghiên cứu Tổng cộng có 167 băng được tạo ra, trong đó cả 167 băng đều đa hình chiếm tỉ lệ 100% Trung bình có 16,7 băng đa hình/primer Sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 160 – 3100 bp Phân tích dữ liệu RAPD cho thấy nếu xét mức độ tương đồng di truyền của 51 mẫu lan rừng thuộc chi Dendrobium ở 0,20 thì

sẽ chia thành hai nhóm với mức độ tương đồng di truyền biến thiên trong khoảng từ 0,00 – 0,78 Ngoài ra, các loài lan Thanh hạc (TH), Thủy tiên mỡ gà (TTmg), Trường sơn ngắn (TSng) không phân nhóm mà chúng đứng riêng lẻ trên cây phát sinh loài Điều này cho thấy các loài lan rừng thuộc chi Dendrobium khảo sát có sự đa dạng cao về di truyền

MỞ ĐẦU

Nguồn lan rừng của Việt nam vô cùng phong phú và đa dạng nhưng lại chưa được khai thác một cách có hiệu quả Vớ i khí hâ ̣u nhiệt đới, Việt Nam nói chung và khu vực Tây nguyên và Đông Nam bộnói riêng có nhiều điều kiện tự nhiên thích hợp cho việc phát triển nhiều loại phong lan, đă ̣c biê ̣t là nh ững loài lan thuộc chi

Dendrobium Lan Dendrobium không những đe ̣p mà còn có giá tri ̣ cao về mă ̣t kinh tế Bên ca ̣nh việc nhập nội, lai tạo, nhân giống các giống mớ i , chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo, mới lạ của giống lan

rừng Dendrobium Do hiê ̣n na y, các giống lan rừng vẫn chưa được quan tâm nhiều trong xã hội , nên tiềm năng phát triển của các loài lan rừng thuộc chi Dendrobium vẫn chưa được khai thác triê ̣t để.Vì vậy trước hết chúng ta

cần phải tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền các loài lan rừng thu thập ở Tây nguyên và vùng Đông Nam

bộ, trên cơ sở đó thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống mới chất lượng tốt, đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các loài lan rừng sẵn có trong nước

Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, SSR ) Tùy vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất Trong đề tài này chúng tôi

tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của một số loài lan thuộc chi Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD vì

đây là kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh, và đặc biệt là không cần phải biết trước trình tự bộ gen của đối tượng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 51 mẫu lan khảo sát thuộc chi Dendrobium gồm có 43 loài trong đó có 35 loài chỉ

có 1 mẫu và 8 loài mỗi loài có 2 mẫu thu thập từ 2 vườn sưu tập của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM và Khu Nộng nghiệp Công nghệ cao

Bảng 1: Danh sách các loài lan rừng thuộc chi Dendrobium được sử dụng trong nghiên cứu

STT Mã Tên thông thường Tên Khoa học Nơi thu mẫu Nguồn gốc

Dendrobium farmeri Paxton TTCNSH Lâm Đồng

Callista

TTti Brien Callista

Thủy tiên vàng- Hoàng

lạp Dendrobium chrysotoxum KNNCNC Lâm Đồng Callista

10

TQA

Trúc Quan Âm-Trúc Phật bà

Dendrobium pendulum Roxb TTCNSH Lâm Đồng

HPGH Hoàng phi giả hạc Dendrobium signatum Rchb f TTCNSH Lâm Đồng

Dendrobium capillipes Rchb f TTCNSH Lâm Đồng

30 KĐ2 Kim Điệp Dendrobium capillipes Rchb f KNNCNC Nam Cát Tiên

HTTH Hoàng thảo tiểu hộc Dendrobium podagraria Hook.F TTCNSH Lộc Ninh- Bình Phước

50

51 HC Hồng câu Dendrobium aduncum TTCNSH Lộc ninh-Bình Phước Callista

Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết và tinh sạch DNA từ lá của các loài lan thu thập trên

Li trích và tinh sạch DNA từ mẫu lá tươi được tham khảo và cải tiến từ các quy trình của Doyle & Doyle (1990), Stewart và Via(1993), Li và cs (1994), Lim và cs (1997), Poreski và cs (1997) Chất lượng DNA tổng số được kiểm tra trên gel agarose 1%được kiểm tra độ tinh sạch và ước lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật

độ quang OD (optical density) với bước sóng 260nm và 280nm bằng máy NanoDrop 1000 Spectrophotometer của hãng Thermo Fisher Scientific.Khi giá trị OD260/OD280 = 1.8 – 2.0 thì dịch trích DNA được coi là tinh sạch Các mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong các phản ứng RAPD: Bộ mồi OPA từ 1-20 của công ty Operon

Các số liệu thu được sẽ được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc Version 2.1 (Numercial Taxonomy SYStem) để tìm ra mối tương quan giữa các đối tượng nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây

Sau khi có cây phân nhóm di truyền, tiến hành kiểm tra độ tin cậy bằng cách dựng bootstrap bằng phần mềm Winboot Chọn hệ số DICE và lặp lại 1000 lần Phần mềm sẽ cho kết quả là độ lặp lại của các phân nhóm tương đương với độ chính xác của các phân nhóm đó

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong số 20 mồi sử dụng có 10 mồi không cho sản phẩm khuếch đại và chỉ có 10 mồi cho các sản phẩm

đa hình rõ là OPA1, OPA2, OPA3, OPA4, OPA5, OPA9, OPA11, OPA13, OPA17 và OPA18

Kết quả phân tích RAPD (Bảng 2) cho thấy tổng số phân đoạn DNA được khuếch đại từ 10 primer này là

167 và cả 167 băng này đều đa hình (100%)

Số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 45 đến 220 phân đoạn (Bảng 2) Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 160 bp đến 3100bp (Bảng 3)

Bảng 2: Kết quả PCR-RAPD của 51 mẫu lan khảo sát thuộc chi Dendrobium với 10 mồi

Số mẫu Số băng DNA thu được trên từng mồi

OPA1 OPA2 OPA3 OPA4 OPA5 OPA9 OPA11 OPA13 OPA17 OPA18 Tổng

Đối với từng mẫu lan thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau, dao động từ2 đến 38 phân đoạn Bảng 2 cho thấy mẫu Đơn Cam (ĐC) chỉ có 2 phân đoạn do mồi OPA3 khuếch đại, mẫu Thủy tiên râu (TTr) chỉ được 2 mồi OPA3 và OPA13 khuếch đại, mẫu Thủy tiên mỡ gà (TTmg) được 3 mồi OPA2, OPA9 và OPA13 khuếch đại Mẫu được cả 10 mồi khuếch đại là Giả Hạc (GH), Thập hoa trắng (THtr), Báo Hỉ 1 (BH1) và Thái Bình 2 (TB2).Mẫu có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản nhiều nhất là GH (38 phân đoạn) và HTTH (38 phân đoạn), mẫu được nhân bản ít nhất là ĐC (2 phân đoạn)

Trong 51 mẫu lan nghiên cứu mồi OPA3 cho kết quả khuếch đại trên 50 mẫu (trừ mẫu ĐC), trong khi mồi OPA11 cho sản phẩm khuếch đại chỉ ở 19 mẫu (ít nhất trong 10 mồi khảo sát)(Bảng 2)

Bảng 3: Tổng kết về số phân đoạn DNA, kích thước và số băng đa hình do các mồi khuếch đại

STT Primer đoạn DNA Số phân

Kích thước các phân đoạn

DNA Số băng đa

hình

Tỉ lệ % băng

đa hình Giới hạn

dưới (bp) Giới hạn trên (bp)

PIC = 1- 𝑛 𝑓

𝑖=1 i

Trong đó , fi là tần số của alen thứ i

Bảng 4: Thông tin tính đa hình (PIC) của 51 mẫu lan

Số liệu ở bảng 4 cho thấy hầu hết các mồi đều cho tính đa hình cao (PIC>0,5) Trong 10 mồi thể hiện tính

đa hình về phân đoạn DNA được nhân bản chỉ có OPA3, OPA4, OPA13, OPA18 là thể hiện tính đa hình thấp

(PIC<0,5) Điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các loài lan thuộc chi Dendrobium mà

chúng tôi khảo sát đều cao

Hình 3 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 51 mẫu lan thuộc chi Dendrobium đã khảo sát

Qua kết quả xử lý số liệu cho thấy ở mức tương đồng khoảng 20%có thể chia 51 mẫu nghiên cứu thành 2

nhóm lớn

Nhóm 1 gồm 2 mẫu: TTr và ĐC

Nhóm 2 gồm 46 mẫu được chia làm 5 nhóm phụ

Nhóm phụ 2.1 gồm 9 mẫu : TTtr1, TTti, TTv, TTtr2, TTc1, TTc2, ThTr, THtr, THti Trong đó hệ số tương

đồng di truyền giữa TTtr1 và TTti là 0,41(độ tin cậy của sơ đồ phân nhóm di truyền theo đánh giá của bootstrap

là 20,1%); Giữa TTc1 và TTc2 là 0,56 (99,8%), giữa THtr và THti là 0,36 (27,8%)

Hình 1

:

Hình 2:

Nhóm phụ 2.2 gồm 17 mẫu : NĐHo, BH2, KT, BH1, HPGH, LNKĐ, KĐ1, KĐ2, ĐYT, MT1, MT2, TBS,

LT, GH, HPH1, HPH2, HTLN Trong đó hệ số tương đồng di truyền giữa BH2 và NĐHo là 0,41 (34,2%), giữa HPGH và LNKĐ là 0,42 (23,5%), giữa KĐ1 và KĐ2 là 0,68 (97,1%), giữa HPH1 và HPH2 là 0,61 (96,3%), giữa MT1 và MT2 là 0,78 (99,8%), giữa TBS và LT là 0,49 (60,5%)

Nhóm phụ 2.3 gồm 8 mẫu: TQA, TLHN, XC2, YT3m, LV, HongPH, BC, TLĐ Trong đó hệ số tương đồng di truyền giữa HongPH và LV là 0,44 (31,5%), giữa TLĐ và BC là 0,38 (29,4%)

Nhóm phụ 2.4 gồm 7 mẫu : TTd, HC, HVH, TSd, TB1, TB2 và NĐHoa Trong đó hệ số tương đồng di truyền giữa TTd và HC là 0,37 (23%), giữa TB1 và TB2 là 0,51 (48,1%)

Nhóm phụ 2.5 gồm 5 mẫu: XC1, HTTM, HTTH, HTHX và ThHoc Trong đó giữa HTTM và HTTH là 0,53 (92,6%), giữa HTHX và ThHoc là 0,37 (42,7%)

-3 mẫu không phân nhóm là TH, TSng và TTmg do có hệ số tương đồng di truyền rất thấp so với các mẫu còn lại

Kết quả cho thấy loài lan Kim Điệp1 (TTCNSH-Lâm đồng) và Kim Điệp (KNNCNC- Nam cát Tiên) nằm cùng một nhánh trên cây phát sinh loài chứng tỏ sự khác nhau về địa lý không ảnh hưởng nhiều đến kiểu gen của loài lan này Tuy nhiên, do có mức độ tương đồng di truyền khá thấp (0,68) nên giữa chúng vẫn có sự khác biệt nhất định về di truyền, chứng tỏ sự đa dạng về nguồn gen đã xảy ra trong cùng một loài (trong phạm vi nghiên cứu này) Kết quả phân tích boostrap cho thấy mức độ liên kết giữa chúng trên cây phát sinh loài là 97,1% (hình 4.16), chứng tỏ kết quả phân nhóm của loài lan này là đáng tin cậy Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của những khảo sát trước đây Kết quả tương tự cũng quan sát thấy ở 2 mẫu Mành trúc1(TTCNSH-Lâm đồng) và Mành Trúc 2 (KNNCNC- Nam cát Tiên); Hoàng Phi hạc 1 và Hoàng Phi Hạc 2; Thái bình 1 và Thái Bình 2

Mẫu HPGH được xếp chung nhóm với HPH1 và HPH2 trong nhóm phụ 2.2 chứng tỏ nó cũng có mối quan

hệ di truyền gần dù hệ số tương đồng di truyền của HPGH với HPH1 là 0,31 và giữa HPGH với HPH2 là 0,36 Nhóm phụ 2.1 gồm đa số các mẫu Thủy tiên như TTtr1, TTtr2, TTti, TTv, TTc1, TTc2 cho thấy các mẫu này có hệ số tương đồng di truyền không cao từ 0,41 giữa TTtr1 và TTti đến 0,56 giữa TTc1 và TTc2 Mẫu Thủy tiên dẹt (TTd) được xếp vào nhóm phụ 2.4 và nó có quan hệ di truyền gần với mẫu HC ( hệ số tương đồng di truyền là 0,37) hơn so với các mẫu TT khác Mẫu TTr có mối quan hệ di truyền với các mẫu Thủy tiên còn lại rất

xa thể hiện ở hệ số tương đồng của nó với các mẫu TT này dao động trong khoảng từ 0,11 đến 0,28, vì vậy trong

sơ đồ hình cây nó được xếp vào nhóm 1 chung với mẫu ĐC Mẫu TTmg có hệ số tương đồng với các mẫu TT khác rất thấp từ 0 đến 0,2 nên nó được tách đứng riêng không chung nhóm với các mẫu TT còn lại

3 mẫu không phân nhóm là TTmg, TH, và TSng là 3 mẫu có mối quan hệ rất xa với các mẫu lan còn lại nên chúng ta có thể sử dụng 3 mẫu này với 2 mẫu TTr và ĐC của nhóm 1 để lai với các mẫu khác trong nhóm 2

của chi Dendrobium nhằm tạo ra các loài mới Đây sẽ là yếu tố quan trọng góp phần vào công tác chọn giống

nhằm hạn chế việc chọn những loài ít có sự khác biệt di truyền

KẾT LUẬN

Với 10 marker RAPD sử dụng, 51 mẫu lan rừng thuộc chi Dendrobium thu thập từ 2 vườn sưu tập của

TTCNSH và KNNCNC (mẫu lan được lấy từ tỉnh Bình Phước , Lâm đồng, Nam cát tiên ) được phân thành 2 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các loài lan có sự dao động lớnchứng tỏ có sự đa dạng cao về mặt di truyền Qua phân nhóm, các loài lan thuộc các nhóm khác nhau có thể được sử dụng để làm vật liệu lai tạo trong chọn giống nhằm tạo ra những quần thể đa dạng về nguồn gen bởi vì những nhóm có khoảng cách di truyền càng xa nhau thì khả năng tạo ra con lai có nhiều tính trạng càng cao

RAPD là kỹ thuật đã được sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu tính đa hình di truyền của các loài

lanError! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not

found Các số liệu thu được về các phân đoạn DNA của 51 mẫu lan với các mồi đã sàng lọc là những dữ liệu bổ

sung cho những sai khác trong hệ gen của các sinh vật cùng loài, cùng chi sống trong các điều kiện môi trường giống hay khác nhau Tuy nhiên những sai khác này có liên quan và liên quan như thế nào đến các yếu tố môi trường hay không là vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu Xác định trình tự của những đoạn DNA sai khác cũng như nghiên cứu những protein được biểu hiện có thể là cơ sở tốt nhất để trả lời cho câu hỏi trên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chen T C., Lin T J., Kuo Y L., and Wu W L., (2003), Genetic fingerprinting of orchids by molecular

markers The Eighteenth Joint Annual Conference of Biomedical Sciences 22-23 March, 2003 Taipei,

Taiwan Abstract book: 89

[2] Ding G., Ding X.Y., Shen J., Tang F., Liu D.Y., He J., Li X.X., Chu B.H., (2005), Genetic diversity and

molecular authentication of wild populations of Dendrobium officinale by RAPD Yao Xue Xue Bao

40(11):1028-32

[3] Doyle L J and Doyle J J., (1990), Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12: 13-14

[4] Khosravi A., Kadir M., Kadzemin S., Zaman F and De Silva A.E (2010), RAPD analysis of colchicine

induced variation of the Dendrobium Serdang beauty.African Journal of Biotechnology, 8(8): pp

1455-1465

[5] Li Q-B.,Cai Q., Guy C.L (1994), A DNA extraction method for RAPD analysis from plants rich in

soluble polysaccharides.-Plant mol Biol.Rep 12: 215-220

IV-O-1.11

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN BAR VÀO CÂY ARABIDOPSIS THALIANACOL-0 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHÚNG HOA

Trần Quang, Bùi Lan Anh, Cung Hoàng Phi Phượng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

TÓM TẮT

Quá trình chuyển gen bar vào cây Arabidopsis thaliana col-0 đã được thực hiện thành công bằng phương pháp nhúng phát hoa vào dung dịch chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sử dụng đường sucrose nồng độ 5% (w/v) và 0.02% chất hoạt động bề mặt Tween 20 (v/v) Sucrose và chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến tỷ lệ chuyển gen Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình chuyển gen thành công với cả 3 mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD 600 0.6, 0.8 và 1.0, tuy nhiên mật độ khuẩn càng tăng, tỷ lệ chuyển gen càng giảm Thời gian tiếp xúc của phát hoa với dịch khuẩn tốt nhất là từ 3 đến 5 giây.Phương pháp này có thể tạo ra thế hệ cây chuyển gen F1 với thể chuyển gen thuần, biểu hiện gen chuyển đồng nhất và ổn định

Từ khóa: Arabidopsis thaliana, sucrose, mật độ khuẩn, chất hoạt động bề mặt, phương pháp

nhúng hoa

MỞ ĐẦU

Phương pháp nhúng hoa (floral dip) là phương pháp đáng chú ý trong các kỹ thuật chuyển gen trên thực vật hiện nay vì nó không đòi hỏi cao về kỹ thuật cũng như không cần qua bước nuôi cấy mô Thực vật có hoa đơn

giản chỉ cần đem nhúng hoa vào dịch khuẩn Agrobacterium tumefaciens thích hợp, sau đó những hạt của dòng

T0 sẽ được gieo trên môi trường chọn lọc để chọn ra các cá thể T1 chứa gen chuyển Phương pháp này đã được thực hiện bởi rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, và tỉ lệ chuyển gen thành công của T1 là khoảng 1-3% [1]

Ở Arabidopsis thaliana, tất cả các cây chuyển gen T1 đều có sự đồng nhất về di truyền, tức là mọi tế bào

trong cây đều chứa gen chuyển Gen chuyển chỉ nằm trên 1 NST trong cặp NST tương đồng, vì T-DNA chỉ được chuyển sau khi quá trình hình thành các dòng tế bào giao tử được diễn ra (các tế bào hình thành nên hạt phấn hoặc noãn) Phần lớn các thể chuyển gen được phát triển từ các tế bào giao tử cái Vì vậy các thể chuyển gen T1

từ cùng 1 cây T0 thì có sự thêm vào T-DNA khác nhau Và vì các tế bào đã chuyển gen ở T0 thì giữ nguyên cấu trúc trong cây và không trải qua các quá trình nuôi cấy mô trước hoặc sau khi chuyển gen, cho nên sự phát sinh kiểu hình khác nhau của cây thì ít được phát hiện và cũng không phải là trở ngại cho người thực hiện Và các vị trí khác ngoài vùng T-DNA đặc thù đã được chuyển trên NST thì có thể tiếp tục gây đột biến, nhờ vào các quá trình thêm các T-DNA khác hoặc nhờ vào quá trình thêm/loại T-DNA Tuy nhiên tỉ lệ chuyển thành công nhiều

gen là khá thấp, và trong trường hợp chuyển thành công 2 gen khác nhau từ 2 dòng Agrobacterium tumefaciens

khác nhau, 2 gen này sẽ dính lại tại cùng 1 vị trí Ngoài ra đã có 1 số loại vi khuẩn khác được thực hiện thay thế

cho Agrobacterium để chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa [2]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Cây Arabidopsis thaliana Col-0: Cây Arabidopsis thaliana Col-0 ở giai đoạn ra hoa được trồng từ hạt

giống của phòng Công nghệ sinh học phân tử B (Lab B) trường Đại học khoa học tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh

Môi trường: Môi trường muối khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) (Phụ lục 1) có bổ sung đường nồng độ 30g.mL-1 và agar nồng độ 8g.mL-1 có pH = 5.8 ± 0.1 (được chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N).Môi trường YEP

để nuôi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ

121°C, 1atm, 20 phút

Đất trồng cây: Sử dụng đất trồng cây ECO N1 của công ty Nguồn Sinh Thái

Vi khuẩn sử dụng để chuyển gen: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumeficiens EHA101 mang plasmid

pGII0229 TRgus cp148 luc có khả năng kháng rifamycin và kanamycin của Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hóa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh được sử dụng để chuyển gen bar bằng phương pháp nhúng hoa.Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường YEP bổ sung rifamycin 50mg.L-1 và kanamycin 50mg.L-1

Cây con invitro sẽ được đem ra ngoài đất sau 2 tuần Cây Arabidopsis thaliana sẽ được trồng trong các

điều kiện thích hợp đến giai đoạn ra hoa.Cắt đi phát hoa đầu tiên để cây tạo ra nhiều phát hoa hơn.Sau đó đến lúc phát hoa cao khoảng 5-10 cm thì đem đi nhúng vào dịch khuẩn Agrobacterium tumeficiens

Chuẩn bị khuẩn

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid sẽ được đem đi tái hoạt hóa trong 5ml môi trường LB

hoặc YEP có chứa kháng sinh thích hợp từ khuẩn lạc đơn trên đĩa ở 28°C từ 1 đến 2 ngày

Sau đó nuôi cấy khuẩn trong bình chứa 200-500 ml môi trường LB hoặc YEP có chứa kháng sinh thích hợp đến khi dịch khuẩn đạt được pha ổn định (OD600 1-1.5)

Ly tâm thu sinh khối, sau đó pha vào 200-500 ml môi trường mới có chứa 0.02% (v/v) chất hoạt động bề mặt và sucrose đến khi đạt được độ OD mong muốn

Thực hiện nhúng hoa

Nhúng phát hoa vào dịch khuẩn từ 3-7s, sau đó lấy bao nylon bọc phần đã được nhúng khuẩn, ủ tối 1 ngày, sau đó gỡ bao nylon ra Tiếp tục trồng và chăm sóc, sau đó thu lại hạt

Kiểm tra gen chuyển

Khảo sát khả năng sống của Arabidopsis thaliana Col-0 trên môi trường chứa ppt ở các nồng độ khác nhau

Gieo hạt Arabidopsis thaliana Col-0 chưa chuyển gen đã được khử trùng lên môi trường MS chứa ppt với các nồng độ 6, 7, 8, 9, 10 mg.L-1

Khảo sát mật độ khuẩn tối ưu để thực hiện chuyển gen

Khảo sát các mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600 0,6; 0,8 và 1,0 trong dịch khuẩn dùng để chuyển

gen Sau khi nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid trong môi trường YEP lỏng lắc đến mật độ

tương ứng với giá trị OD600 1,0 thì ly tâm thu sinh khối và hòa vào dịch khuẩn dùng để chuyển gen

Khảo sát nồng độ đường sucrose tối ưu để thực hiện chuyển gen

Khảo sát các nồng độ đường sucrose 2,5% và 5% (m/v) trong dịch khuẩn dùng để chuyển gen Bổ sung đường vào môi trường YEP trước khi hòa khuẩn vào

Khảo sát chất hoạt động bề mặt tối ưu để thực hiện chuyển gen

Khảo sát các chất hoạt đồng bề mặt khác nhau là KOBE408, Tween 20 và Triton X-100 trong dịch khuẩn dùng để chuyển gen với nồng độ 0.02% (v/v) Bổ sung sau khi hòa khuẩn, vì đây là chất có khả năng gây độc

cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Khảo sát thời gian tiếp xúc với dịch khuẩn khi thực hiện chuyển gen

Khảo sát khoảng thời gian để phát hoa tiếp xúc với dịch khuẩn với các khoảng thời gian là 3 giây, 5 giây và

7 giây

Tách chiết DNA cây chuyển gen đã qua bước chọn lọc và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong bộ gen bằng phương pháp PCR

Các cây chuyển gen thành công giả định sẽ được tách DNA và PCR với cặp mồi BAR3 và BAR4 của gen

bar, sau đó đem sản phẩm đi điện di để phát hiện sự hiện diện của gen bar trong NST của thực vật

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Khảo sát khả năng sống của Arabidopsis thaliana Col-0 trên môi trường chứa ppt ở các nồng độ khác nhau

Hình 9 Cây con nảy mầm từ hạt chưa chuyển gen gieo trên các môi trường chứa ppt sau 18 ngày

A: Môi trường MS chứa ppt nồng độ 6 mg.L-1 B: Môi trường MS chứa ppt nồng độ 7 mg.L-1

C: Môi trường MS chứa ppt nồng độ 8 mg.L-1 D: Môi trường MS chứa ppt nồng độ 9 mg.L-1

E: Môi trường MS chứa ppt nồng độ 10 mg.L-1

Bảng 6 Tỷ lệ % sống sót của cây con nảy mầm từ hạt Arabidopsis thaliana Col-0 chưa chuyển gen trên các

khảo sát Đến ngày thứ 18, toàn bộ cây con chết ở nồng độ 9 mg.L-1 Dựa vào kết quả trên môi trường MS chứa ppt với nồng độ 9 mg.L-1được chọn làm môi trường chọn lọc các thể chuyển gen sau khoảng thời gian khảo sát

là 18 ngày

Khảo sát mật độ khuẩn tối ưu để thực hiện chuyển gene bằng phương pháp nhúng hoa

Bảng 7 Tỷ lệ cây chuyển gen giả định của các nghiệm thức mật độ khuẩn khác nhau

Kết quả cho thấy mật độ khuẩn với giá trị OD600 0.6 là mật độ khuẩn tốt nhất để thực hiện chuyển gen bằng

phương pháp nhúng hoa ở cây Arabidopsis thaliana Col-0 so với giá trị OD600 0,8 và 1,0 với nồng độ sucrose 5%, , có bổ sung 0.02% Tween 20 và thời gian tiếp xúc của phát hoa với dịch khuẩn là 3s

Khảo sát nồng độ đường sucrose tối ưu để thực hiện chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa

Bảng 8 Tỷ lệ cây chuyển gen giả định theo các nghiệm thức nồng độ sucrose khảo sát

Khảo sát loại chất hoạt động bề mặt tối ưu để thực hiện chuyển gen

Bảng 9 Tỷ lệ cây chuyển gen giả định với các nghiệm thức chất hoạt động bề mặt khác nhau

Chất hoạt động bề mặt (0.02% v/v) Tỷ lệ %

Kết quả cho thấy khi sử dụng chất hoạt động bề mặt Triton X-100, cây bị héo rồi chết sau 2 ngày Tween

20 cho kết quả chuyển gen tốt hơn khi sử dụng KOBE408 (đây là 1 loại chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm Silicon) với với mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600 0,8 có bổ sung sucrose 5% và thời gian tiếp xúc của phát hoa với dịch khuẩn là 3 giây

Khảo sát thời gian phát hoa tiếp xúc với dịch khuẩn khi thực hiện chuyển gen

Bảng 10 Tỷ lệ cây chuyển gen giả định theo khoảng thời gian tiếp xúc với dịch khuẩn được khảo sát

Kết quả cho thấy khoảng thời gian 3 giây và 5 giây cho ra kết quả chuyển gen tốt hơn là khoảng thời gian 7 giây với mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600 0,8 có bổ sung 0.02% Tween 20 và sucrose 5%