Đánh giá độc tính của 3-monocloropropan-1,2-diol (3-MCPD) trên gan, máu và thần kinh của chuột nhắt (FULL TEXT)

MỞ ĐẦU Thực phẩm luôn là một phần thiết yếu của cuộc sống. Vì thế vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng, các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm và các nhà chức trách xã hội. Một số chất có thể gây độc cho cơ thể được cho vào thực phẩm nhằm mục đích bảo quản, tạo màu mùi thu hút, cũng có những chất khác được sinh ra ngay trong quá trình sản xuất. Việc làm rõ mức độ gây độc và kiểm soát những chất mới sinh này luôn là vấn đề nan giải. Năm 1999, lần đầu tiên ở Anh, nước tương nhập khẩu từ Trung Quốc được phát hiện có 3-MCPD với hàm lượng dao động từ 6 - 124mg/Kg [100]. Tuy nhiên, đây không phải là thời điểm đầu tiên 3-MCPD được biết đến mà ngay từ những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã biết rằng, những thực phẩm nào được chế biến bằng phương pháp thủy phân chất đạm thực vật bằng HCl đậm đặc đều có chứa 3–MCPD [99]. Năm 1991, sự có mặt của chất này trong thực phẩm đã bắt đầu được mô tả. Tuy nhiên, vào thời điểm đó, người ta ít để ý đến cho dù hàm lượng 3– MCPD được tìm thấy trong thực phẩm là rất cao, phổ biến ở mức 100mg/kg [100]. 3-MCPD là chữ viết tắt của một chất có danh pháp hóa học là 3-monocloropropan- 1,2-diol, một hóa chất thuộc nhóm cloropropanol. Trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm (như nước tương, dầu hào, các sản phẩm quay rán, nướng, bánh mì, bánh bích quy …) luôn luôn tồn tại một dư lượng 3-MCPD trong sản phẩm cuối cùng. Ngay cả những thức ăn được chế biến trong gia đình cũng tìm thấy có chứa 3-MCPD nhất là những món thịt được ướp muối và chiên, nướng …[100] Trước đây, nước tương hoặc sản phẩm nước chấm từ đậu nành được chế biến bằng phương pháp lên men truyền thống. Khi công nghệ phát triển, người ta thấy rằng nước tương hoặc sản phẩm đậu tương được sản xuất bằng phương pháp thủy phân bằng acid HCl đem lại hiệu năng rất cao về mặt chất lượng và hiệu suất thành phẩm. Vì thế, phương pháp này ngày càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến nước tương, dầu hào và các sản phẩm từ đậu tương có thông qua quá trình thủy phân. Tuy nhiên, quy trình này lại sinh ra hợp chất 3-MCPD với nồng độ quá mức và được cho là có hại cho sức khỏe [105]. Ở Việt Nam, tháng 11/2001, lần đầu tiên các kiểm nghiệm về chất 3-MCPD được tiến hành và cũng xác minh là nồng độ 3-MCPD có mặt trong một số sản phẩm nước tương bán ở thị trường Việt Nam là cao quá ngưỡng cho phép so với tiêu chuẩn châu Âu. Cho dù đã được nhà nước kiểm soát chặt chẽ hơn, thì cho đến nay cũng đã xảy ra vài vụ nước tương có chứa hàm lượng 3-MCPD bị phát hiện trên thị trường. Điều này cho thấy, 3-MCPD vẫn luôn là mối quan tâm của xã hội, người tiêu dùng vẫn còn tâm lý hoang mang, e ngại còn cơ quan quản lý và các doanh nghiệp thì vẫn băn khoăn chưa tìm ra lời giải cho vấn đề 3-MCPD. Từ 2002, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu, khảo sát và thiết lập ngưỡng tiếp xúc được cho là tương đối an toàn đối với hoá chất này, đặc biệt ở những sản phẩm nước tương hay các thực phẩm được chế biến bằng sự thủy phân đạm thực vật trong môi trường HCl [97]. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu xác định độc tính của 3-MCPD được thực hiện, ví dụ như các nghiên cứu đánh giá độc tính trên thận, hệ sinh dục, thần kinh, và khả năng gây ung thư,…Các nghiên cứu cho thấy rằng 3-MCPD gây thương tổn hệ sinh sản của chuột cống đực, thương tổn dạng tăng sinh và tạo khối u ở thận trên mô hình thực nghiệm động vật, đồng thời có sự gia tăng thương tổn khi liều lượng tiếp xúc gia tăng [97]. Một số nghiên cứu độc tính trên thần kinh trung ương cho thấy 3-MCPD gây nhiều tổn thương trên chất xám, trải dài từ vỏ não cho đến cột sống, làm tăng thể tích nước trong bào tương, gây phù các tế bào hình sao [17], [18], [20]. Dựa trên một số kết quả nghiên cứu được về độc tính của 3-MCPD, giới khoa học phải chấp nhận suy luận ngoại suy là 3-MCPD vẫn có thể có nguy cơ gây hại cho con người. Tuy nhiên để có cái nhìn toàn diện hơn về độc tính của chất này, ngoài các độc tính đã biết của 3-MCPD trên thận và cơ quan sinh dục với nhiều bằng chứng thuyết phục, thì các nghiên cứu về độc tính trên những cơ quan mục tiêu khác như máu, gan, não cũng cần được nghiên cứu nhiều hơn và tìm hiểu sâu hơn. Vì vậy trong luận án này, chúng tôi đặt trọng tâm nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên các cơ quan này nhằm cung cấp thêm các dữ liệu khoa học có ý nghĩa cho lĩnh vực an toàn thực phẩm. Đồng thời qua luận án này, chúng tôi cũng mong muốn đề xuất một số phương pháp nhằm có thể ứng dụng cho việc đánh giá độc tính của những hóa chất hay thuốc có nghi ngờ có thể gây ra độc tính trên các cơ quan đích. Cụ thể, mục tiêu của chúng tôi như sau: 1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học sau khi gây phơi nhiễm mạn tính trong 6 tháng và 12 tháng. 2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ở các pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính bằng phương pháp vi nhân trên hồng cầu. 3. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan thông qua các enzym chức năng gan và khảo sát mô học tế bào gan. 4. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột nhắt qua sự biểu hiện c-fos và thoái hóa tế bào thần kinh.

NGÔ KIẾN ĐỨC

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA 3-MONOCLORO PROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN GAN, MÁU

VÀ THẦN KINH CỦA CHUỘT NHẮT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh, Năm 2016

NGÔ KIẾN ĐỨC

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA 3-MONOCLORO PROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN GAN, MÁU

VÀ THẦN KINH CỦA CHUỘT NHẮT

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất

luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Ngô Kiến Đức

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đại cương về 3-Monocloropropan-1,2-diol (3-MCPD) 4

1.2 Các nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên thế giới 9

1.3 Xét nghiệm huyết học 19

1.4 Thử nghiệm về vi nhân (micronucleus) 24

1.5 Giải phẫu mô học – Dị sản tế bào gan 28

1.6 Gen tiền ung thư c-fos (proto-oncogen) 31

1.7 Phương pháp hóa mô miễn dịch 31

1.8 Thoái hóa tế bào thần kinh 35

1.9 Phương pháp nhuộm màu cresyl violet 36

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Đối tượng nghiên cứu 38

2.2 Thuốc thử – Trang thiết bị – Nơi thực hiện 38

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học 54

3.2 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể 78

3.3 Đánh giá độc tính mạn tính của 3-MCPD trên gan 89

3.4 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột nhắt 94

Trang Chương 4: BÀN LUẬN 106 KẾT LUẬN 123 KIẾN NGHỊ 125

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ALT Alanin aminotransferase

AST Aspartat aminotransferase

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình hồng cầu MCH Mean Corpuscular Hemoglobin Huyết sắc tố trung bình trong hồng

cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Nồng độ huyết sắc tố trung

TDI Tolerable daily intake Mức thu nạp cho phép hàng ngày PMTDI Provisional maximum tolerable Định mức tạm thời cho phép cơ thể

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Khảo sát hàm lượng 3-MCPD trong một số thực phẩm ở nước Anh 6

Bảng 1.2 Nồng độ tối đa 3-MCPD trong nước tương cho phép ở một số quốc gia 7

Bảng 1.3 Mức tiêu thụ 3-MCPD mỗi ngày của người dân ở một số quốc gia 8

Bảng 1.4 Một số kết quả về tổn thương về bệnh học, tăng sản và ung thư sau 2 năm nghiên cứu độc tính của 3-MCPD trên chuột cống 14

Bảng 1.5 Kết quả thử nghiệm in vitro khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD 17

Bảng 1.6 Kết quả thử nghiệm in vivo khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD 19

Bảng 1.7 Công thức bạch cầu bình thường 20

Bảng 1.8 Sự thay đổi số lượng các loại bạch cầu và ý nghĩa lâm sàng 20

Bảng 1.9 Các dạng bất thường về kích thước hồng cầu 23

Bảng 1.10 Các dạng bất thường về hình thái hồng cầu 23

Bảng 3.1 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng 55

Bảng 3.2 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng 57

Bảng 3.3 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng 59

Bảng 3.4 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng 60

Bảng 3.5 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng 62

Bảng 3.6 Tác động của 3-MCPD trên chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng 64

Bảng 3.7 Tổng kết sự thay đổi hình thái hồng cầu bằng phương pháp phết máu ngoại vi 71

Bảng 3.8 Kết quả xét nghiệm bất thường hồng cầu bằng máy huyết đồ ADVIA 2120i 72

Bảng 3.9 Kết quả lympho bất thường sau khi phơi nhiễm 3-MCPD mạn tính trong 12 tháng 73

Trang

Bảng 3.10 Tác động của 3-MCPD lên thời gian chảy máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng,

6 tháng và 12 tháng 75 Bảng 3.11 Tác động của 3-MCPD lên thời gian đông máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng,

6 tháng và 12 tháng 76 Bảng 3.12 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ 78 Bảng 3.13 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ 79 Bảng 3.14 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ 80 Bảng 3.15 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 2 tuần 81 Bảng 3.16 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 3 tháng 84 Bảng 3.17 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng 85 Bảng 3.18 Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi

phơi nhiễm 3-MCPD trong 12 tháng 87 Bảng 3.19 Hoạt tính AST và ALT trong huyết tương sau khi phơi nhiễm 3-MCPD

trong thời gian 6 tháng của các lô thử nghiệm 90 Bảng 3.20 Tỷ số khối lượng gan/thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm sau khi phơi

nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng 90 Bảng 3.21 Kết quả vi phẫu gan ở các lô chuột thí nghiệm sau 12 tháng phơi nhiễm 3-

MCPD 93 Bảng 3.22 Tổng kết sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi gây phơi nhiễm 3-

MCPD 99

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức hóa học của các dẫn xuất cloropropanol 4

Hình 1.2 Cơ chế tạo thành vi nhân và sự biểu hiện vi nhân trong hồng cầu 25

Hình 1.3 Vi thể dị sản gan với nhân đa hình, nhân đôi và màng nhân bất thường 29

Hình 1.4 Dẫn truyền và biểu hiện c-fos 32

Hình 1.5 Phương pháp hóa mô miễn dịch trực tiếp 34

Hình 1.6 Phương pháp hóa mô miễn dịch gián tiếp 34

Hình 1.7 Phương pháp nhuộm cresyl violet quan sát thân tế bào thần kinh và thể Nissl 36

Hình 2.1 Máy xét nghiệm huyết học ADVIA 2120i 39

Hình 2.2 Máy xét nghiệm huyết học EXCELL 2280 39

Hình 2.3 Máy xét nghiệm sinh hóa Tecno 168 39

Hình 2.4 Lấy máu từ tim chuột 43

Hình 2.5 Mẫu mô não được nhuộm hóa mô miễn dịch 52

Hình 3.1 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ 67

Hình 3.2 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ 67

Hình 3.3 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ 68

Hình 3.4 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 2 tuần 69

Hình 3.5 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 3 tháng 69

Hình 3.6 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng 70

Hình 3.7 Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 12 tháng 71

Hình 3.8 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 24 giờ phơi nhiễm 3-MCPD (x 1000) 79

Hình 3.9 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 48 giờ phơi nhiễm 3-MCPD (x 1000) 80

Hình 3.10 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD (x 1000) 81

Hình 3.11 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD (x 1000) 82

Hình 3.12 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 3 tháng phơi nhiễm 3-MCPD (x 1000) 84

Trang

Hình 3.13 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 6 tháng phơi nhiễm

3-MCPD (x 1000) 85 Hình 3.14 Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 12 tháng phơi nhiễm 3-

MCPD (x 1000) 88 Hình 3.15 Hình ảnh đại thể gan của các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD

trong 6 tháng 91 Hình 3.16 Hình ảnh sinh thiết gan ở các lô thí nghiệm (x 400) 92 Hình 3.17 Mô gan bình thường và các trường hợp viêm, nghịch sản 94 Hình 3.18 Sự biểu hiện c-fos ở độ pha loãng 1/100 (kháng thể sơ cấp kháng c-fos) và

1/20 (kháng thể thứ cấp-cơ chất tạo màu) 95 Hình 3.19 Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 10

mg/kg trong 24 giờ 96 Hình 3.20 Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 50

mg/kg trong 24 giờ 97 Hình 3.21 Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100

mg/kg trong 24 giờ 98 Hình 3.22 Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100

mg/kg trong 48 giờ 99 Hình 3.23 Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100

mg/kg trong 72 giờ 100 Hình 3.24 Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 24 giờ

phơi nhiễm 3-MCPD 101 Hình 3.25 Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 48 và

72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD 101 Hình 3.26 Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x

1000) sau 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD 103 Hình 3.27 Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 2 tuần

phơi nhiễm 3-MCPD 104 Hình 3.28 Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x

1000) sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD 105

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 3.1 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc

tính mạn 6 tháng 55 Biểu đồ 3.2 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc

tính mạn 6 tháng 58 Biểu đồ 3.3 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc

tính mạn 6 tháng 59 Biểu đồ 3.4 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc

tính mạn 12 tháng 61 Biểu đồ 3.5 Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc

tính mạn 12 tháng 63 Biểu đồ 3.6 Tác động của 3-MCPD trên tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12

tháng 64 Biểu đồ 3.7 Thời gian chảy máu ở các lô thử nghiệm sau 3, 6 và 12 tháng phơi nhiễm

3-MCPD 75 Biểu đồ 3.8 Thời gian đông máu ở các lô thử nghiệm sau 3, 6 và 12 tháng phơi nhiễm

3-MCPD 76 Biểu đồ 3.9 Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-

MCPD trong 24, 48, 72 giờ và 2 tuần 83 Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-

MCPD trong 3 tháng và 6 tháng 86 Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ % hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-

MCPD trong 12 tháng 87 Biểu đồ 3.12 Hoạt tính AST và ALT trong huyết tương sau khi phơi nhiễm 3-MCPD

trong thời gian 6 tháng của các lô thử nghiệm 90 Biểu đồ 3.13 Tỷ số khối lượng gan/thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm sau khi phơi

nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng 91

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Sự hình thành độc tố 3-MCPD 6

Sơ đồ 2.1 Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học 42

Sơ đồ 2.2 Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể 46

Sơ đồ 2.3 Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan 48

Sơ đồ 2.4 Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột 50

Sơ đồ 2.5 Quy trình nhuộm cresyl violet 53

Sơ đồ 3.1 Tổng kết độc tính của 3-MCPD trên công thức máu 65

MỞ ĐẦU

Thực phẩm luôn là một phần thiết yếu của cuộc sống Vì thế vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng, các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm và các nhà chức trách xã hội Một số chất có thể gây độc cho cơ thể được cho vào thực phẩm nhằm mục đích bảo quản, tạo màu mùi thu hút, cũng

có những chất khác được sinh ra ngay trong quá trình sản xuất Việc làm rõ mức độ gây độc và kiểm soát những chất mới sinh này luôn là vấn đề nan giải

Năm 1999, lần đầu tiên ở Anh, nước tương nhập khẩu từ Trung Quốc được phát hiện có 3-MCPD với hàm lượng dao động từ 6 - 124mg/Kg [100] Tuy nhiên, đây không phải là thời điểm đầu tiên 3-MCPD được biết đến mà ngay từ những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã biết rằng, những thực phẩm nào được chế biến bằng phương pháp thủy phân chất đạm thực vật bằng HCl đậm đặc đều có chứa 3–MCPD [99] Năm 1991, sự có mặt của chất này trong thực phẩm đã bắt đầu được mô tả Tuy nhiên, vào thời điểm đó, người ta ít để ý đến cho dù hàm lượng 3–MCPD được tìm thấy trong thực phẩm là rất cao, phổ biến ở mức 100mg/kg [100] 3-MCPD là chữ viết tắt của một chất có danh pháp hóa học là 3-monocloropropan-1,2-diol, một hóa chất thuộc nhóm cloropropanol Trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm (như nước tương, dầu hào, các sản phẩm quay rán, nướng, bánh mì, bánh bích quy …) luôn luôn tồn tại một dư lượng 3-MCPD trong sản phẩm cuối cùng Ngay cả những thức ăn được chế biến trong gia đình cũng tìm thấy có chứa 3-MCPD nhất là những món thịt được ướp muối và chiên, nướng …[100]

Trước đây, nước tương hoặc sản phẩm nước chấm từ đậu nành được chế biến bằng phương pháp lên men truyền thống Khi công nghệ phát triển, người ta thấy rằng nước tương hoặc sản phẩm đậu tương được sản xuất bằng phương pháp thủy phân bằng acid HCl đem lại hiệu năng rất cao về mặt chất lượng và hiệu suất thành phẩm

Vì thế, phương pháp này ngày càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến nước tương, dầu hào và các sản phẩm từ đậu tương có thông qua quá trình thủy

phân Tuy nhiên, quy trình này lại sinh ra hợp chất 3-MCPD với nồng độ quá mức

và được cho là có hại cho sức khỏe [105]

Ở Việt Nam, tháng 11/2001, lần đầu tiên các kiểm nghiệm về chất 3-MCPD được tiến hành và cũng xác minh là nồng độ 3-MCPD có mặt trong một số sản phẩm nước tương bán ở thị trường Việt Nam là cao quá ngưỡng cho phép so với tiêu chuẩn châu Âu Cho dù đã được nhà nước kiểm soát chặt chẽ hơn, thì cho đến nay cũng đã xảy ra vài vụ nước tương có chứa hàm lượng 3-MCPD bị phát hiện trên thị trường Điều này cho thấy, 3-MCPD vẫn luôn là mối quan tâm của xã hội, người tiêu dùng vẫn còn tâm lý hoang mang, e ngại còn cơ quan quản lý và các doanh nghiệp thì vẫn băn khoăn chưa tìm ra lời giải cho vấn đề 3-MCPD

Từ 2002, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu, khảo sát và thiết lập ngưỡng tiếp xúc được cho là tương đối an toàn đối với hoá chất này, đặc biệt ở những sản phẩm nước tương hay các thực phẩm được chế biến bằng sự thủy phân đạm thực vật trong môi trường HCl [97]

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu xác định độc tính của 3-MCPD được thực hiện, ví dụ như các nghiên cứu đánh giá độc tính trên thận, hệ sinh dục, thần kinh,

và khả năng gây ung thư,…Các nghiên cứu cho thấy rằng 3-MCPD gây thương tổn

hệ sinh sản của chuột cống đực, thương tổn dạng tăng sinh và tạo khối u ở thận trên

mô hình thực nghiệm động vật, đồng thời có sự gia tăng thương tổn khi liều lượng tiếp xúc gia tăng [97] Một số nghiên cứu độc tính trên thần kinh trung ương cho thấy 3-MCPD gây nhiều tổn thương trên chất xám, trải dài từ vỏ não cho đến cột sống, làm tăng thể tích nước trong bào tương, gây phù các tế bào hình sao [17],

[18], [20]

Dựa trên một số kết quả nghiên cứu được về độc tính của 3-MCPD, giới khoa học phải chấp nhận suy luận ngoại suy là 3-MCPD vẫn có thể có nguy cơ gây hại cho con người Tuy nhiên để có cái nhìn toàn diện hơn về độc tính của chất này, ngoài các độc tính đã biết của 3-MCPD trên thận và cơ quan sinh dục với nhiều bằng chứng thuyết phục, thì các nghiên cứu về độc tính trên những cơ quan mục tiêu khác như máu, gan, não cũng cần được nghiên cứu nhiều hơn và tìm hiểu sâu hơn

Vì vậy trong luận án này, chúng tôi đặt trọng tâm nghiên cứu đánh giá độc tính của 3-MCPD trên các cơ quan này nhằm cung cấp thêm các dữ liệu khoa học có ý nghĩa cho lĩnh vực an toàn thực phẩm Đồng thời qua luận án này, chúng tôi cũng mong muốn đề xuất một số phương pháp nhằm có thể ứng dụng cho việc đánh giá độc tính của những hóa chất hay thuốc có nghi ngờ có thể gây ra độc tính trên các cơ quan đích

Cụ thể, mục tiêu của chúng tôi như sau:

1 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học sau khi gây phơi nhiễm mạn tính trong 6 tháng và 12 tháng

2 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ở các pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính bằng phương pháp vi nhân trên hồng cầu

3 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan thông qua các enzym chức năng gan và khảo sát mô học tế bào gan

4 Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột nhắt qua sự biểu hiện c-fos và thoái hóa tế bào thần kinh

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ 3-MONOCLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD)

1.1.1 Tính chất lý hóa và cấu trúc hóa học của 3-MCPD

3-MCPD thuộc nhóm hóa chất gây độc có tên gọi chung là các cloropropanol, có công thức phân tử là C3H7ClO2, khối lượng phân tử là 110,5; khối lượng riêng d = 1,32 kg/l Nhóm cloropropanol gồm có 4 dẫn xuất thường gặp: 1,3-dicloro-2-propanol (1,3-DCP); 2-monocloropropan-1,3-diol (2-MCPD); 2,3-dicloro-2-propanol (2,3-DCP); và 3-monocloropropan-1,2-diol (3-MCPD) Trong đó, 3-MCPD còn có tên gọi khác là alpha-monoclorohydrin, đây là một phân tử không đối xứng, tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân dạng R và S (hàm lượng của hai đồng phân đối quang này là 50:50) [100]

Ở trạng thái tinh khiết, 3-MCPD là một chất lỏng hầu như không bay hơi, có điểm sôi từ 114 - 120oC ở điều kiện áp suất giảm (14 mmHg) 3-MCPD tan tốt trong nhiều loại dung môi hữu cơ như ethanol, ether và tan được trong nước [105]

Tính ổn định của 3-MCPD phụ thuộc vào pH và nhiệt độ môi trường, pH càng lớn (tính kiềm) và nhiệt độ càng cao (gia nhiệt) thì tỉ lệ 3-MCPD bị phân hủy càng nhiều Ngược lại, ở nhiệt độ thấp và môi trường acid thì chất này càng bền vững [100]

Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất cloropropanol được trình bày trong hình 1.1

Hình 1.1 Công thức hóa học của các dẫn xuất cloropropanol

2,3-dicloro-1-propanol (2,3-DCP)

1,3-dicloro-2-propanol (1,3-DCP)

1,2-diol (3-MCPD)

1.1.2 Hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ

Các nghiên cứu trên chuột cống và chuột nhắt cho thấy 3-MCPD được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa, phân bố trong nhiều mô của cơ thể và sau đó tích lũy trong các cơ quan đích, đặc biệt là tinh hoàn [24] Một nghiên cứu gần đây của Xiao và cộng sự (2003) trên chuột cống cũng cho thấy sau khi uống một liều duy nhất, 3-MCPD được hấp thu tốt vào máu và phân bố chủ yếu ở tinh hoàn và thận

Có khoảng 10% MCPD đào thải nguyên vẹn trong nước tiểu, như vậy có thể MCPD được chuyển hóa chủ yếu ở gan [108] Một nghiên cứu khác của Jones (1978) tiến hành trên chuột cống được tiêm phúc mạc 3-MCPD và nhận thấy có khoảng 30% 3-MCPD đào thải ở dạng chuyển hóa thành CO2 qua hô hấp và khoảng 8,5% đào thải nguyên vẹn trong nước tiểu, nhưng tác giả không nhận thấy có sự tích lũy có chọn lọc của 3-MCPD trên các mô [48]

3-3-MCPD được giải độc bởi sự liên kết với glutathion tạo ra sản phẩm dihydroxypropyl) cystein và N-acetyl-S-(2,3-dihydroxypropyl) cystein (Jones, 1975) [52] Ngoài ra, 3-MCPD cũng bị oxy hóa thành acid beta-clorolactic và acid oxalic [51],[65]

S-(2,3-1.1.3 Sự hình thành độc tố 3-MCPD

3-MCPD được hình thành do kết quả của quá trình phản ứng giữa chất béo (triglycerid) với một nguồn có chứa Cl- trong thực phẩm (ví dụ: muối ăn, hay acid hydrocloric) hoặc phản ứng với một thành phần nào đó trong thực phẩm dưới sự xúc tác của nhiệt độ (chiên, nướng, …) Tuy nhiên, tùy loại thực phẩm cũng như thời gian, nhiệt độ chế biến mà lượng 3-MCPD được tạo ra là nhiều hay ít Tóm lại,

về lý thuyết thì tất cả những chất nào hội tụ đủ 3 điều kiện: “có chứa thành phần Cl+ chất béo + nhiệt” đều có thể sản sinh ra 3-MCPD Ngoài ra, quá trình thủy phân protein thực vật bằng acid hydrocloric (HCl) trong sản xuất nước tương còn là nguồn phổ biến tạo ra độc tố 3-MCPD [99] Trong nguyên liệu sản xuất nước tương

-có hai thành phần chính là protein và chất béo từ bánh dầu đậu phộng (hoặc bã đậu nành) Khi nấu ở nhiệt độ trên 100oC, phản ứng thủy phân xảy ra làm phân giải các mạch protein thành các acid amin, đồng thời chất béo cũng được thủy phân thành

glycerol và acid béo Sau đó, glycerol tham gia phản ứng thế với gốc Cl- của HCl tạo thành 3-MCPD và 1,3-DCP.

Sơ đồ 1.1 Sự hình thành độc tố 3-MCPD 1.1.4 Các sản phẩm chứa 3-MCPD

Trong một nghiên cứu của Velisek (2000) trên các sản phẩm được chế biến trong môi trường acid kèm sự hiện diện của gốc Cl- (NaCl) ở nhiệt độ cao hoặc có hạn dùng dài trong điều kiện bình thường, cho thấy phần lớn đều có sự hình thành 3-MCPD (Bảng 1.1) Mặc dù hàm lượng 3-MCPD hiện diện ở mức thấp, tuy nhiên điều này giúp cảnh báo cho các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam, cần phải lưu tâm hơn đến công nghệ chế biến thực phẩm và theo dõi hàm lượng 3-MCPD trên những sản phẩm khác, không chỉ riêng nước tương [100]

Bảng 1.1 Khảo sát hàm lượng 3-MCPD trong một số thực phẩm ở nước Anh [100]

Thực phẩm Hàm lượng cao nhất (mg/kg) Số mẫu có 3-MCPD/số mẫu phân tích

CH2-OH CH-OH

CH2-Cl

CH2-Cl CH-OH

CH2-Cl

Cl-

Thực phẩm Hàm lượng cao nhất (mg/kg) Số mẫu có 3-MCPD/số mẫu phân tích

Xúc xích 0,069 9/20

Phô-mai 0,031 4/30

1.1.5 Giới hạn cho phép về nồng độ 3-MCPD

 Tiêu chuẩn về nồng độ 3-MCPD cho phép ở một số nước

Trước đây các chuyên gia về thực phẩm của liên minh Châu Âu gợi ý rằng MCPD phải ở mức không thể phát hiện được bằng phương pháp phân tích hiện đại nhất (có nghĩa là “3-MCPD không được tồn tại trong thực phẩm”) Tuy nhiên, sau khi những nghiên cứu mới nhất được công bố, các chuyên gia này đã khuyến cáo mức sử dụng tối đa hằng ngày là 0,002 mg/kg thể trọng [97]

3-Nhìn vào bảng 1.2, chúng ta có thể thấy quy định ở Anh quốc, liên minh Châu Âu

và kể cả Malaysia là chặt chẽ nhất, chỉ cho phép 3-MCPD tối đa 0,01 mg/kg và 0,02 mg/kg nước tương, trong khi đó một số nước khác con số này gấp 10 lần

Bảng 1.2 Nồng độ tối đa 3-MCPD/nước tương cho phép ở một số quốc gia [97]

Quốc gia Nồng độ tối đa 3-MCPD cho phép trong

Malaysia, Thụy Điển 0,02 mg/kg

 Cơ sở để đưa ra các số liệu trên

• Dựa vào liều tối đa cho phép cơ thể dung nạp trên một ngày: cho đến nay FAO/WHO khuyến cáo liều tối đa cho phép cơ thể có thể dung nạp 3-MCPD là 2 microgam/kg thể trọng (0,002 mg/kg), hay một người cân nặng 50kg có thể thu nạp tối đa 0,1 mg 3-MCPD/ngày Con số 0,002 mg/kg này là dựa trên kết quả nghiên

cứu ở chuột, cho thấy liều thấp nhất có thể gây độc cho chuột là 1,1 mg/kg [97] Sau

đó con số này được chia cho một hệ số chuyển đổi giữa các loài sinh vật khác nhau (chuột và người), và các nhà khoa học đã đưa ra hệ số 500 Mức 0,002 mg/kg thể trọng được gọi là mức thu nạp có thể chấp nhận được mỗi ngày (tolerable daily intake, TDI), chặt chẽ hơn phải gọi là định mức tạm thời cho phép cơ thể thu nạp mỗi ngày (provisional maximum tolerable daily intake, PMTDI), bởi vì chưa có số liệu nghiên cứu cụ thể trên người, chỉ là ước tính từ chuột

• Dựa trên tổng lượng nước tương tiêu thụ trung bình mỗi ngày: mỗi quốc gia cần phải tiến hành nghiên cứu khảo sát xem người dân của mình hiện đang thu nạp mức 3-MCPD và tiêu thụ sản phẩm nước tương trung bình bao nhiêu trên một ngày (dựa trên các sản phẩm nước tương hiện lưu hành); ngoài ra họ phải tính toán đến số lượng một người dùng tối đa trong một ngày là bao nhiêu (bảng 1.3) [97]

Bảng 1.3 Mức độ tiêu thụ 3-MCPD mỗi ngày của người dân ở một số quốc gia [97]

Quốc gia Mức tiêu thụ trung bình

(mg/người/ngày)

Mức tiêu thụ cao nhất (mg/người/ngày)

Úc 0,2 0,4 (khoảng 10% dân số)

9,3 (khoảng 5% dân số) Nhật 0,54 1,1 (khoảng 5% dân số)

Mỹ 0,1 0,29 (khoảng 10% dân số)

Bảng 1.3 cho thấy người Nhật thu nạp 3-MCPD mỗi ngày cao hơn so với Úc và

Mỹ, trong đó có khoảng 5% dân số Nhật tiêu thụ ở mức 1,1 mg 3-MCPD/ngày Như vậy, nếu tính trên mức cho phép thu nạp 3-MCPD mỗi ngày (0,002 mg/kg), và với một người trung bình (60kg) thì liều 3-MCPD tối đa cho phép mỗi ngày là 0,12 mg (60 x 0,002) Vậy người dân Nhật trung bình đã tiêu thụ vượt ngưỡng quy định khoảng 4,5 lần Con số này sẽ vượt mức rất nhiều lần nếu tính riêng cho từng cá thể, thí dụ như trẻ em, hoặc những người ăn chay trường, sử dụng nhiều nước tương

Ở Việt nam, quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đã giới hạn hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của 3-MCPD trong 1 kg nước tương là 1 mg/kg Quy định này được cho là an toàn sức khoẻ cho người tiêu dùng [9]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA 3-MCPD TRÊN THẾ GIỚI

 Bước 2: theo dõi đánh giá số lượng chuột sống chết ở các lô trong 14 ngày

 Bước 3: tính liều gây chết LD50 theo phương pháp Karber cải tiến

- Kết quả: LD50 trên chuột nhắt của 3-MCPD là 190 mg/kg [80]

1.2.2 Đánh giá độc tính trên thần kinh trung ương

Nghiên cứu đánh giá tác động của 3-MCPD trên thần kinh trung ương được thực hiện trên chuột cống

 Khi tiêm phúc mạc 3-MCPD (dạng racemic) trên chuột đực chủng BALB ở các liều 25, 50, hoặc 100 mg/kg mỗi ngày cho đến 5 ngày thì các chuột nhận ba liều hàng ngày 100 mg/kg đã chết và có tổn thương lan rộng riêng biệt ở vùng chất xám,

từ vỏ não đến tủy sống Không có dấu hiệu xuất huyết tổn thương trong não nào được quan sát thấy Ở nhóm dùng liều 50 mg/kg mỗi ngày trong 5 ngày không gây

ra tử vong, tuy nhiên, những con chuột bị giết vào ngày thứ 6 cho thấy có các tổn thương nhỏ ở vùng trung tâm thân não Một nhóm khác được cho dùng thêm 4 ngày cho thấy các tổn thương lan rộng và nghiêm trọng hơn Chỉ có một tổn thương cột sống phát triển được ghi nhận ở duy nhất một con chuột ở liều thấp nhất vào ngày 5 Tuy nhiên, với liều trung gian (25 mg/kg), sử dụng kéo dài đến tuần thứ hai thì sẽ dẫn đến những tổn thương nghiêm trọng Các tác giả cho rằng các tổn thương trên thần kinh trung ương gây ra là do 3-MCPD ức chế sự thủy phân glucid

Trên chuột cái Wistar được tiêm phúc mô liều duy nhất 3-MCPD 250-1000 mg/kg, tất cả chuột đều bị tử vong và nguyên nhân được ghi nhận là có liên quan với sự phát triển các tổn thương thần kinh trong vòng 24 giờ Về mô học, các tổn thương xuất hiện như sưng tế bào chất của tế bào hình sao, chủ yếu ở thân não Các liều thấp không gây ra tổn thương não Liều 100 mg/kg/ngày trong 2 ngày gây ra độc tính và dẫn đến tử vong, với sự hình thành của các tổn thương lớn ở nhiều vị trí trong não Ở nhóm dùng liều 50 mg/kg/ngày cho đến 5 ngày, kết quả cho thấy các tổn thương hệ thống thần kinh trung ương tích lũy dần Sau nhiều ngày ngưng sử dụng 3-MCPD, các tế bào hình sao bị xơ hóa nhiều hơn là được phục hồi [17-18]

1.2.3 Đánh giá độc tính trên gan và huyết học

Tác động của 3-MCPD trên gan và máu được đánh giá qua các thử nghiệm thực hiện trên chuột cống, chuột nhắt, và khỉ

chỉ số thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) ở chuột đực (liều 400 ppm) và chuột cái (liều 100 và 200 ppm) nhưng không làm thay đổi số lượng hồng cầu Số lượng bạch cầu đơn bào, lympho bào tăng ở chuột đực khi uống liều 100 ppm, nhưng nhìn chung, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm chứng và nhóm uống 3-MCPD trên chỉ số huyết học [20]

 3-MCPD liều 30 mg/kg trong 6 tuần trên khỉ gây thiếu máu, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu và suy tủy xương [56]

 3-MCPD gây tích tụ acid oxalic (hình thành từ sự chuyển hóa 3-MCPD) và gây

ra sự tạo sỏi calci oxalat, gây hiện tượng viêm cầu thận cấp, vô niệu và có thể gây tử vong ở liều cao ( 100 mg/kg) [54]

 3-MCPD liều 100 mg/kg gây ra hiện tượng protein niệu và glucose niệu trầm trọng [71]

 Sự thay đổi hình thái thận được ghi nhận sau 1 ngày dùng liều 75 mg/kg MCPD, quan sát sau 75 ngày còn thấy sự hoại tử, tái tạo và phình to ống thận [58]

3- Đồng phân (R) của 3-MCPD gây ra lợi niệu và tình trạng glucose niệu [29],[50],[79]

1.2.5 Đánh giá độc tính trên cơ quan sinh sản

Tác động của 3-MCPD trên khả năng sinh sản được đánh giá qua các thử nghiệm trên chuột, thỏ, chó, cừu, heo và khỉ

- Các bước tiến hành:

 Bước 1: thú vật thử nghiệm được cho phơi nhiễm 3-MCPD trong thời gian từ 1

đến 30 ngày với các liều khác nhau từ 1-150 mg/kg

 Bước 2: theo dõi tác động của 3-MCPD trên cơ quan sinh sản thông qua các chỉ tiêu đánh giá là khả năng sinh sản (ghi nhận sự mang thai sau giao phối), khả năng di chuyển và sự tạo tinh trùng, và quan sát mô học cơ quan sinh sản

 Trên chuột cống cái, 3-MCPD gây suy thoái tử cung, teo biểu mô âm đạo [63]

 3-MCPD cũng có ảnh hưởng đến nhiều enzym của các tế bào biểu mô tinh hoàn, dẫn đến kết quả là giảm ly giải glucose [37] Đồng phân S, được tổng hợp trong điều kiện thí nghiệm, ức chế đặc biệt sự ly giải glucose ở tinh dịch heo [90]

 3-MCPD làm giảm độ di động của tinh trùng do ức chế sự thủy giải đường thông qua tác động trên sự phosphoryl hóa protein [110]

 3-MCPD làm giảm sự sản sinh progesteron ở tế bào leydig của chuột cống, gây

ra sự biến đổi hình thái và phá hủy DNA ở tế bào leydig gây chết tế bào [93]

 3-MCPD gây ra sự thay đổi cấu trúc chức năng protein ở tế bào tinh hoàn chuột cống ở giai đoạn sớm của sự suy giảm chức năng cơ quan sinh sản [86]

 Sau khi tiêm phúc mạc 3-MCPD liều 75 mg/kg, 3-MCPD gây tắc nghẽn túi tinh hoặc gây tắc nghẽn ống dẫn tinhsau 5-7 ngày [21]

 Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, 3-MCPD liều 140 mg/kg cho thấy chất này ảnh hưởng đến lớp biểu mô trên mào tinh hoàn sau 2 giờ Các tổn thương tế bào được ghi nhận bởi các mảng biểu mô bong tróc, dẫn đến sự tắc nghẽn ống dẫn tinh [46]

 Khảo sát mô học tinh hoàn chuột cống đực sau khi tiêm 3-MCPD liều 40 mg/kg mỗi ngày trong 20 ngày cho thấy sự ức chế sinh tinh hoàn toàn do sự thoái hóa và biến mất của túi chứa tinh [84]

 Uống 3-MCPD liều 5-10 mg/kg mỗi ngày, tác động hướng đến tinh trùng trưởng

thành chứa trong tinh hoàn biểu hiện rất rõ Áp lực dội ngược của thể dịch tinh hoàn gây ra phù nề, ức chế sự sinh tinh, và gây teo tinh hoàn [49]

 Chuột cống đực được tiêm dưới da 15-40 mg/kg 3-MCPD mỗi ngày trở nên vô sinh sau 3-6 ngày Cho tiếp xúc với 3-MCPD trong 30 ngày với liều 15 mg/kg, sau

đó là 18 ngày để hồi phục, dẫn đến sự phục hồi khả năng thụ tinh [84]

 Liều uống 3-MCPD hàng ngày thấp nhất gây ra vô sinh ở chuột đực: 5 mg/kg trong 14 ngày [23]; 6,5 mg/kg trong 10 ngày [39]; 2,5 mg/kg sử dụng liên tục [33];

8 mg/kg trong 4 ngày [98]; và 8 mg/kg (tiêm dưới da) trong 3 ngày [12]

 Chuột cống đực được cho uống 3-MCPD liều 0,5; 1; 2; 4 hoặc 6 mg/kg thể trọng mỗi ngày trong khoảng 10-12 ngày cho thấy tỉ lệ vô sinh tương ứng là 2,5%, 20%,

45 %, 85%, và 100% (đánh giá dựa trên mức độ phát triển tinh trùng về mặt mô học) [44]

 3-MCPD cũng được báo cáo có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của chuột đồng đực (uống liều 30-100 mg/kg mỗi ngày trong 7 ngày), chuột nhảy (uống liều

20 mg/kg mỗi ngày trong 50 ngày), chuột lang (uống hoặc tiêm dưới da 50-70 mg/kg mỗi ngày trong 45 ngày), chó (8 mg/kg mỗi ngày tiêm dưới da trong 30 ngày), cừu đực (25 mg/kg mỗi ngày tiêm bắp trong 4 ngày), và khỉ nâu (30 mg/kg mỗi ngày uống trong 42 ngày) [48-50] Không có báo cáo nào cho thấy ảnh hưởng của 3-MCPD đến khả năng sinh sản ở chuột nhắt, chim cút, hoặc thỏ [48]

 Trên chuột cống đực chủng Wistar, 3-MCPD ở liều 20 mg/kg mỗi ngày, dùng ít nhất 5 ngày, đã gây ra thương tổn ở tinh hoàn và mào tinh hoàn Ở liều 5, 10, và 20 mg/kg mỗi ngày, độ di động của tinh trùng suy giảm có ý nghĩa và phụ thuộc vào liều Chuột cái được cho giao phối nhưng không có thai ở bất kỳ liều nào [107]

 Chuột cống đực được cho uống 3-MCPD với liều 1, 3, hoặc 10 mg/kg mỗi ngày trong 9 ngày và sau đó giao phối với con cái khỏe mạnh Ở liều cao nhất, không ghi nhận bất cứ sự mang thai nào xảy ra trên chuột cái Phân tích cho thấy có sự giảm tỷ

lệ tinh trùng có thể di động, giảm tốc độ và biên độ di chuyển của tinh trùng ở liều lượng cao nhất [13]

 Ở người, 3-MCPD và ion đồng làm giảm sự di động của tinh trùng in vitro [55]

- Trong một nghiên cứu độc tính của 3-MCPD trên chuột trong thời gian dài với liều uống 3-MCPD 2 lần/tuần với liều 30 hoặc 60 mg/kg trong 10 tuần, sau đó tăng lên 35 mg/kg hoặc 70 mg/kg trong 72 tuần, kết quả cho thấy có hiện tượng teo tinh hoàn và thoái hóa tinh hoàn trầm trọng ở tất cả chuột cống đực thử nghiệm [102]

1.2.6 Đánh giá độc tính dài hạn của 3-MCPD

Độc tính mạn tính của 3-MCPD được đánh giá trên một số cơ quan như: thận, tụy, tuyến vú, tinh hoàn, tuyến bao quy đầu với thú vật thử nghiệm là chuột cống

- Các bước tiến hành:

 Bước 1: cho chuột cống Fischer 344 khỏe mạnh uống 3-MCPD trong thời gian

104 tuần, với liều cho các nhóm chuột cống đực là 1,1 mg/kg; 5,2 mg/kg và 28 mg/kg; các nhóm chuột cái là 1,4 mg/kg; 7,0 mg/kg và 35 mg/kg mỗi ngày

 Bước 2: ghi nhận về tổn thương các cơ quan về mặt bệnh học, tăng sản và ung thư sau thời gian phơi nhiễm

- Kết quả:

 Trọng lượng của chuột dùng liều cao nhất giảm có ý nghĩa (p < 0,05) sau tuần đầu tiên Ở thời điểm kết thúc thử nghiệm, trọng lượng các vật thí nghiệm ở 2 nhóm dùng liều cao giảm có ý nghĩa (p < 0,05), với tỉ lệ giảm 33% ở nhóm chuột đực và 35% ở nhóm chuột cái dùng liều cao nhất Tuy nhiên, tỉ lệ chết không bị ảnh hưởng bởi sự phơi nhiễm 3-MCPD vì ở thời điểm kết thúc, hơn 42% nhóm sử dụng 3-MCPD vẫn còn sống Thức ăn và lượng nước uống hàng ngày ở lô sử dụng liều cao nhất giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

 Thông số về huyết học có thay đổi nhưng không đáng kể, không có ý nghĩa thống kê

Ghi nhận về tổn thương bệnh học, tăng sản và ung thư được liệt kê trong bảng 1.4.

Bảng 1.4 Một số kết quả tổn thương về bệnh học, tăng sản và ung thư sau 2 năm

nghiên cứu độc tính 3-MCPD trên chuột cống [94]

Cơ quan và tổn thương Liều (mg/kg mỗi ngày)

Tinh hoàn

Tăng sản tế bào Leydig 39/50 27/50* 4/50*** 0/50***

Cơ quan và tổn thương Liều (mg/kg mỗi ngày)

Thận

Bệnh thận 36/50 40/50 45/50* 49/50*** Tăng sản ở ống thận 3/50 6/50 15/50** 34/50***

U tuyến ở ống thận 0/50 0/50 1/50 5/50

Tụy

Tăng sản tế bào tiểu đảo 14/48 8/50 5/50* 1/48***

U tuyến tế bào tiểu đảo 16/48 9/50 7/50* 0/48*** Ung thư tế bào tiểu đảo 8/48 0/50** 2/50* 0/48**

nhiều hơn chuột đực Có mối quan hệ tương quan (p < 0,01) giữa mức độ trầm trọng của tổn thương và sự gia tăng tỉ lệ tăng sản tế bào ống thận hay u tuyến thận Bệnh thận là nguyên nhân gây tăng tỉ lệ chết non và có sự khác biệt giữa chuột đực

và chuột cái (p < 0,05 đối với chuột đực; p < 0,1 đối với chuột cái) Các biểu hiện bệnh thận ở các lô chuột đực và cái được ghi nhận khác biệt có ý nghĩa, thể hiện độc tính phụ thuộc liều trên các chỉ tiêu trọng lượng thận (p < 0,05), nồng độ creatinin huyết thanh (p < 0,01), và nồng độ BUN (p < 0,01) Tăng sản tế bào biểu

mô ống thận được ghi nhận ở hầu hết các thú vật thử nghiệm trong hai lô dùng liều cao Tỉ lệ mắc phải và mức độ trầm trọng của tổn thương đều gia tăng phụ thuộc liều Thoái hóa các tế bào ở tinh hoàn cũng lệ thuộc vào liều và tăng có ý nghĩa ở 2

lô sử dụng 3-MCPD liều cao (p < 0,001)

Tỉ lệ tăng sản và xuất hiện các khối u liên quan đến liều được ghi nhận ở tất cả các

lô, ở thận: tăng sản ống thận và các u tuyến, tinh hoàn: tăng sản tế bào Leydig, u tuyến hay ung thư, tuyến vú chuột đực: u sợi tuyến, u tuyến, và ung thư, tuyến bao quy đầu: u tuyến và ung thư Tỉ lệ tăng sản ở ống thận gia tăng ở cả hai giống đực

và cái và là yếu tố nhạy nhất, vì nó được ghi nhận ở cả lô dùng liều thấp nhất, mặc

dù chưa đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,073 ở chuột đực và 0,099 ở chuột cái)

Tóm lại, 3-MCPD gây tăng tỉ lệ u tế bào Leydig và thận Các u ở thận tiến triển phụ thuộc liều và được xem như là kết quả thứ phát từ sự gia tăng tỉ lệ bệnh thận tiến triển mạn tính Sự gia tăng tần suất và tỉ lệ u tế bào Leydig được xem như là kết quả của quá trình thúc đẩy hormon và được cho là có liên quan đến sự giảm nồng độ testosteron và tăng nồng độ estradiol, prolactin, progesteron và các hormon lutein hóa, kích thích nang 3-MCPD cũng gây tăng tỉ lệ xuất hiện u tuyến vú ở chuột đực,

và hậu quả này được xem như kết quả thứ phát từ hoạt động liên quan đến nội tiết của các u tế bào Leydig, gây giảm sản xuất androgen và tăng lượng estrogen hay progesteron Các hormon đề cập trên không được đo lường trong nghiên cứu Ngoài

ra, sự gia tăng tỉ lệ u tuyến bao quy đầu cũng như tuyến vú được cho là kết quả của rối loạn cân bằng nội tiết ở chuột thí nghiệm [94]

1.2.7 Đánh giá khả năng gây đột biến gen và tiềm năng gây ung thư của MCPD

3- Đánh giá in vitro

Khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD được đánh giá trên các đối tượng thử

nghiệm là các chủng vi khuẩn Samonella typhimurium, E Coli, nấm men và các tế

bào chuyên biệt

3 Kết quả:

Bảng 1.5 Kết quả thử nghiệm in vitro khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD

Thử nghiệm Đối tượng thử nghiệm Nồng độ Kết quả Tham khảo

Đột biến nghịch S typhimurium

TA1535

2-200 µmol/giếng 0,2-22 mg/giếng

Dương tínha

Silhankova & CS (1982) [89]

Đột biến nghịch

S typhimurium

TA1537, TA1538, TA98

2-200 µmol/giếng 0,2-22 mg/giếng Âm tính

a Silhankova & CS (1982) [89]

Đột biến nghịch S typhimurium TA100,

TA1535

10-103µmol/giếng 1,1-110 mg/giếng

Dương tínha

Stolzenberg & Hine (1979,1980) [91-92]

Đột biến nghịch S typhimurium TA98

100-103µmol/giếng 11-110 mg/giếng

Âm tínhb Nghi ngờc

Stolzenberg & Hine (1979) [91]

Đột biến nghịch S typhimurium TA100,

TA1535 0,1-10 mg/giếng

Dương tínha

Zeiger & CS (1988) [109] Đột biến nghịch S typhimurium TA97 0,1-10 mg/giếng Âm tính

b

Chưa thửc

Zeiger & CS (1988) [109] Đột biến nghịch S typhimurium TA98 0,1-10 mg/giếng Âm tính

b

Dương tínhc

Zeiger & CS (1988) [109]

Thử nghiệm Đối tượng thử nghiệm Nồng độ Kết quả Tham khảo

Đột biến nghịch S typhimurium TA100 Không rõ Âm tính

b

Chưa thửc

Majeska &

Matheson (1983) [66]

Đột biến nghịch S typhimurium TA100 0,01-1.25

mg/giếng

Dương tínha

Ohkubo & CS (1995) [74]

Đột biến nghịch S typhimurium TA677,

TA98

0,01-1.25 mg/giếng

Âm tínhb Dương tínhc

Ohkubo & CS (1995) [74]

Đột biến E coli WP2, TM930,

TM1080

2-200 µmol/giếng 0,2-22 mg/giếng Âm tính

a Silhankova & CS (1982) [89]

Đột biến E coli WP2, TM930,

TM1080

2-200 µmol/giếng 0,2-22 mg/giếng Âm tính

a Ohkubo & CS (1995) [74]

Tổn thương DNA

Tế bào CHO từ chuột lang– tế bào K1, định lượng Comet

0,5 – 5 mg/mL (4,5 – 45 mM)

Dương tínhc

El Ramy & CS (2007) [31]

o Tạo vi nhân: xem xét sự hình thành vi nhân trong tế bào tủy xương

o Tổng hợp DNA không theo lịch trình: chụp phóng xạ phát hiện sự gắn kết tritium thymidin vào phân tử DNA của tế bào gan

- Kết quả:

Bảng 1.6 Kết quả thử nghiệm in vivo khả năng gây đột biến gen của 3-MCPD

Thử nghiệm Đối tượng thử

nghiệm Nồng độ Kết quả Tham khảo

Đột biến trội

gây chết sớm

Chuột nhắt ICR/Ha Swiss

125 mg/kg tiêm phúc mạc hay 20 mg/kg uống mỗi ngày trong 5 ngày

Âm tính Epstein & CS

(1972) [32]

Đột biến mắc

phải

Ruồi giấm Drosophila melanogaster

0,005-1,1 mg/ml Âm tính Frei & Würgler

(1997) [36] Đột biến trội

gây chết sớm Chuột nhắt đực

5, 10 mg/kg mỗi ngày trong 5 ngày Âm tính

Jones & CS (1969) [53] Đột biến trội

gây chết sớm

Chuột cống đực chủng Wistar

5,10, 20 mg/kg uống mỗi ngày trong 5 ngày Âm tính

Jones & Jackson (1976) [54]

1.3 XÉT NGHIỆM HUYẾT HỌC

Xét nghiệm huyết học là một trong những xét nghiệm khá thường quy, bao gồm việc xác định công thức máu (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu…), định sức bền hồng cầu, định nhóm máu, thời gian chảy máu, thời gian đông máu, thời gian Quick,… Ý nghĩa của xét nghiệm máu là nhằm đánh giá số lượng, chất lượng các loại tế bào máu ngoại vi, nồng độ huyết sắc tố, và hình thái các loại tế bào

1.3.1 Giá trị các chỉ số bạch cầu

Công thức bạch cầu là tỷ lệ phần trăm trung bình giữa các loại bạch cầu trong máu ngoại vi Công thức này giúp định hướng xác định nguyên nhân bệnh Vì thế, sự thay đổi số lượng bạch cầu cho ta nhiều ý nghĩa quan trọng Ở người Việt Nam trưởng thành, bình thường công thức bạch cầu như sau [1],[3-4]:

Bảng 1.7 Công thức bạch cầu bình thường

Loại bạch cầu Số lượng (x 10 3 /mm 3 ) Tỷ lệ (%)

Bạch cầu trung tính 2,5-7,0 50-70

Bạch cầu ưa acid 0,05-0,4 1-4

Bạch cầu ưa kiềm 0,005-0,01 0,5-1

Bạch cầu lympho 1,0-3,0 20-25

Bạch cầu mono 0,1-0,3 5-7

Tổng lượng bạch cầu 5,0-10,0 100

Bảng 1.8 Sự thay đổi số lượng các loại bạch cầu và ý nghĩa lâm sàng

Loại bạch cầu Ý nghĩa của sự thay đổi số lượng bạch cầu

Bạch cầu trung

tính

Tăng sinh lý: gắng sức về thể lực, stress, có thai, hành kinh, hút thuốc lá

Tăng trong các trường hợp nhiễm trùng cấp như viêm ruột thừa, viêm phổi… Tăng do thuốc: corticoid, epinephrin,…

Giảm trong những trường hợp: nhiễm độc kim loại nặng như Pb, As, suy tủy, nhiễm siêu vi (quai bị, cúm, sởi…)

Giảm do bức xạ, thuốc gây độc tủy xương (thuốc chống ung thư, cloramphenicol, sulfamid, phenylbutazon, kháng giáp trạng,…), liệu pháp ức chế miễn dịch

Bạch cầu ưa acid

Tăng trong trường hợp dị ứng, bệnh ký sinh trùng, các bệnh ngoài da

Tăng do thuốc: rất nhiều thuốc có thể gây phản ứng dị ứng

Giảm trong trường hợp bị kích động, chấn thương tâm lý, ACTH, cortisol

Bạch cầu ưa

kiềm

(Basophil)

Tăng trong bệnh bạch cầu tủy

Giảm trong dị ứng cấp, dùng ACTH

Bạch cầu

Lympho

Tăng ở trẻ mới sinh, trẻ còn bú, trẻ thiếu máu do thiếu sắt, nhiễm trùng mạn tính, lao…

Giảm trong nhiễm trùng cấp, sốt phát ban, nhiễm tia xạ, nhiễm trùng hạch…

Bạch cầu Mono Tăng trong ung thư máu, nhiễm khuẩn máu, ho gà, sốt rét, Hodgin, lao…

Giảm trong thương hàn, sốt phát ban…

1.3.2 Giá trị các chỉ số hồng cầu

 Hemoglobin (Hb): là thành phần cơ bản chiếm khoảng 1/3 trọng lượng hồng cầu

và được biểu thị bằng nồng độ huyết sắc tố trung bình trong một hồng cầu (MCHC) Giá trị trung bình của Hb ở nam giới là 14,6 ± 0,6 (g/dl) và nữ giới 13,2 ± 0,5 (g/dl)

 Hematocrit (HCT - Thể tích khối hồng cầu) (%): Nam: 47 ± 5; Nữ: 42 ± 2

 MCV (Mean Corpuscular Volume - Thể tích trung bình hồng cầu), đơn vị: fL

MCV = Hematocrit / Số lượng hồng cầu (fL)

- Ý nghĩa: xác định loại hồng cầu là to, nhỏ hay trung bình:

MCH = Huyết sắc tố / Số lượng hồng cầu (pg)

- Ý nghĩa: phản ánh chính xác hơn tình trạng nhược sắc so với MCHC

- Ý nghĩa: phản ánh tình trạng thiếu máu đẳng sắc, nhược sắc hay ưu sắc

 Đẳng sắc: MCHC nằm trong giới hạn bình thường

 Nhược sắc: MCHC < 33 g/dL

 Ưu sắc: MCHC > 35 g/dL

 Thay đổi số lượng hồng cầu:

- Số lượng hồng cầu bình thường ở nam là 4.200.000-5.400.000/mm3, ở nữ là 4.000.000-4.900.000/mm3

- Tăng trong các trường hợp bệnh lý như bệnh đa hồng cầu, ngạt, tình trạng mất nước nhiều do tiêu chảy, nôn ói nhiều hoặc do bị phỏng gây mất huyết tương

- Giảm trong các bệnh thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng…[1]

1.3.3 Giá trị các chỉ số tiểu cầu

Số lượng tiểu cầu bình thường là 150.000-450.000/mm3 Sự thay đổi số lượng và chất lượng tiểu cầu xảy ra trong các trường hợp sau [1]:

- Thay đổi số lượng:

 Tăng tiểu cầu gặp trong các trường hợp: sau cơn xuất huyết đột ngột, sau cắt lách, hội chứng viêm nhiễm, ung thư đường tiêu hóa, thận, hạch, nhất là ung thư cuống phổi, thiếu máu nhược sắc, hội chứng tăng sinh tủy ác tính, tăng tiểu cầu nguyên phát

 Giảm tiểu cầu thường gặp trong nhiễm trùng (thương hàn), nhiễm virus (quai bị, viêm gan, nhiễm bạch cầu một phần), do tự miễn (lupus), do thuốc (quinin, phenylbutazon, meprobamat), do rượu, cường lách, thay tim, do hóa chất độc hại (thạch tín, benzen), bệnh lý ác tính, đông máu nội mạch, thiếu máu tiêu huyết và ure máu cao

- Giảm chất lượng tiểu cầu:

 Sự hình thành cục máu đông chậm hơn bình thường, dù số lượng tiểu cầu vẫn bình thường nhưng thời gian chảy máu kéo dài, gặp trong bệnh suy nhược tiểu cầu (bệnh Glanzmamn)

 Tiểu cầu to nhỏ không đều, độ ngưng kết tiểu cầu với ristocelin bị rối loạn, thời gian chảy máu kéo dài; thường gặp trong chảy máu do tiểu cầu to hay hội chứng Bernard- Soulier

Ngoài ra còn gặp tiểu cầu hình quả tạ, hình phẩy… là bệnh lý tiểu cầu do di truyền

 Rối loạn chức năng tiểu cầu và quá trình đông máu

Rối loạn tiểu cầu và quá trình đông máu sẽ đưa đến hai rối loạn [4],[8]:

 Tình trạng tăng đông máu: tạo cục máu đông không mong muốn trong hệ thống mạch máu, có thể do gia tăng chức năng tiểu cầu hoặc tăng hoạt động của hệ đông máu

 Tình trạng giảm đông máu: dễ gây chảy máu hay không cầm máu Nguyên nhân

có thể do giảm số lượng tiểu cầu lưu hành hoặc rối loạn chức năng tiểu cầu, rối loạn yếu tố đông máu hoặc rối loạn mạch máu

1.3.4 Các hình thái bất thường của hồng cầu

Hồng cầu là những tế bào không nhân, hình tròn dẹt như hình dĩa, lõm hai mặt, bao bọc bởi một màng bán thấm, và ở bên trong có chứa các sắc tố hô hấp (hemoglobin), có chức năng vận chuyển oxy từ phổi tới các tổ chức và mang khí carbonic ngược lại để thải ra ngoài

Kích thước hồng cầu: đường kính 7,5 μm, dày 2,3 μm, và bình thường, hình dạng

đa số hồng cầu giống nhau Hiện tượng hồng cầu dị hình là dấu hiệu chứng tỏ hồng cầu kém vững bền do tác dụng tan máu đối với hồng cầu hoặc do phát triển không

đầy đủ Dị hình thường kèm theo không đều nhau về kích thước [3],[5]

1.3.4.1 Bất thường về kích thước

Bất thường về kích thước hồng cầu và các bệnh lý được trình bày ở bảng 1.9

Bảng 1.9 Các dạng bất thường về kích thước hồng cầu [3],[5]

Thiếu máu hồng cầu to

Hồng cầu khổng

lồ

Những hồng cầu kích thước lớn bắt màu dễ dàng và luôn có hình bầu dục, với đường kính lớn: 10-16 μm, đường kính nhỏ: 7-9 μm

Thiếu máu hồng cầu khổng lồ

Hồng cầu nhỏ Hồng cầu nhỏ bất thường (đường kính dưới 5

μm, hoặc MCV dưới 80 fl)

Bệnh hồng cầu hình cầu và bệnh thiếu máu nhược sắc thiếu sắt

1.3.4.2 Bất thường về hình thái

Bất thường về hình thái hồng cầu và các bệnh lý được trình bày ở bảng 1.10

Bảng 1.10 Các dạng bất thường về hình thái hồng cầu [2-3],[5]

Hồng cầu hình cầu Hồng cầu bé, đậm đặc, hình khối cầu Bệnh thiếu máu tán huyết Hồng cầu hình cuộn Các hồng cầu kết dính lại với nhau theo

hình cuộn

Bệnh tăng protein huyết thanh

Hồng cầu ngưng kết Các hồng cầu ngưng kết lại với nhau (phân

biệt với hồng cầu hình cuộn)

Thiếu máu tán huyết do miễn dịch qua IgM

Hình dạng Mô tả Bệnh lý

Hồng cầu hình liềm Có những hồng cầu hình lưỡi liềm Bệnh hemoglobin S

Hồng cầu hình bia Tính bắt màu của hồng cầu tập trung ở phần

chu vi, và ở trung tâm, làm cho chúng giống hình một tấm bia

Bệnh thiếu máu thiếu sắt và những bệnh thiếu máu vùng biển

Hồng cầu phân mảnh Hồng cầu bị phân thành những mảnh nhỏ Thường gặp ở bệnh nhân mang

van tim nhân tạo Hồng cầu chứa thể

nước và có nhân

Hồng cầu có dạng hình giọt nước (có đuôi)

và có nhân lớn trong bào tương

Bệnh xơ hóa tủy và tạo máu ngoài tủy

1.4 THỬ NGHIỆM VỀ VI NHÂN (MICRONUCLEUS)

vào nhân mới mà chính nó có thể hình thành “vi nhân”, có thể dễ dàng nhìn thấy được dưới kính hiển vi Vì vậy, trong thử nghiệm vi nhân, vật thí nghiệm được cho

sử dụng một loại hóa chất và sau đó định lượng tần suất các tế bào có hình thành vi nhân ở một số thời điểm sau khi sử dụng Nếu nhóm thú vật có sử dụng hóa chất thể hiện tần suất các tế bào có vi nhân cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng thì hóa chất sử dụng được cho là có khả năng gây ra sự hủy hoại cấu trúc và/hoặc sự biến đổi số lượng nhiễm sắc thể, và có thể gây độc tính trên gen

Hình 1.2 Cơ chế tạo thành “vi nhân” do nhiễm sắc thể bị phá vỡ và không tích

hợp được vào nhân trong quá trình phân chia tế bào và sự biểu hiện

vi nhân trong hồng cầu “Nguồn: Fenech M và cộng sự (1999) [35].”

Việc định lượng khả năng hóa chất gây ra sự hủy hoại nhiễm sắc thể được quan tâm nhiều vì hầu hết các dạng ung thư được đặc trưng bởi sự thay đổi nhiễm sắc thể chuyên biệt cho từng loại bướu riêng biệt, và có thể là nguy cơ sinh ung thư, cũng

có thể là nguy cơ gây ra sự hủy hoại các tế bào phôi, dẫn đến những trở ngại bất thường trong sinh sản

Thử nghiệm vi nhân được thực hiện theo nhiều cách khác nhau, phụ thuộc vào các nhà nghiên cứu, sinh vật thử nghiệm, loại tế bào định lượng, và kiểu tác động của hóa chất Thử nghiệm vi nhân thường được hướng dẫn thực hiện trên chuột nhắt hoặc chuột cống, các mô được đánh giá tần suất vi nhân thường là tủy xương và máu ngoại vi Các xét nghiệm vi nhân phải được thực hiện trên các tế bào đang phân chia, trong đó hồng cầu là những tế bào thường được sử dụng để tìm sự hiện diện của vi nhân Những hồng cầu trưởng thành trong máu ngoại biên được tạo ra

trong tủy xương từ các tế bào tiền hồng cầu Tốc độ phân chia nhanh của các tế bào tiền hồng cầu khiến hồng cầu là loại tế bào lý tưởng cho thử nghiệm vi nhân Một điểm khác biệt nữa của hồng cầu là trong quá trình phân chia tế bào, nhân bị đẩy ra khỏi tế bào ngay trước khi hình thành hồng cầu biệt hóa hoàn chỉnh; và vì thế hồng cầu đã biệt hóa không thể phân chia thêm nữa Do đó, các tế bào gốc ở tủy xương liên tục tạo ra các tế bào hồng cầu mới để thay thế các tế bào chết đi Nếu một hóa chất phá hủy một tế bào gốc gây ra sự hình thành một vi nhân, vi nhân này vẫn còn lại trong tế bào hồng cầu sau khi nhân chính bị đẩy ra ngoài và vì thế có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi [106]

1.4.2 Cách tiến hành thử nghiệm vi nhân

1.4.2.1 Thử nghiệm vi nhân đánh giá trên tế bào tủy xương

Thử nghiệm điển hình vi nhân hình thành trong tế bào ở tủy xương được thực hiện trên chuột nhắt hay chuột cống Có từ 1 đến 3 nhóm được cho tiếp xúc với hóa chất,

và thường có 5 thú vật giống đực trong mỗi nhóm Liều sử dụng tăng dần cho đến khi đạt liều dung nạp tối đa Đường tiếp xúc với hóa chất trong những thử nghiệm ngắn hạn này thường là tiêm phúc mô hoặc đường uống Dựa trên chu kỳ tế bào và thời gian trưởng thành của các tế bào hồng cầu, tủy xương được lấy để xét nghiệm sau 24 giờ sau liều tiếp xúc cuối cùng; khoảng thời gian này gọi là thời gian lấy mẫu Thời điểm đó, khoảng 50% các tế bào hồng cầu ở tủy xương chưa trưởng thành, là các tế bào mới được hình thành, và đây là các tế bào được kiểm tra sự hiện diện của vi nhân Vật thử nghiệm được gây mê bằng CO2 để lấy ra mẫu xương đùi Tủy xương được lấy ra khỏi xương đùi và trải đều lên lam kính Lam kính phải sạch

và khô, cố định, và được nhuộm với chất gắn chuyên biệt DNA phát huỳnh quang

để dễ dàng phát hiện sự hiện diện của vi nhân [106]

1.4.2.2 Thử nghiệm vi nhân đánh giá trên máu ngoại vi

Thử nghiệm vi nhân được thực hiện trên chuột nhắt, mẫu máu được thu thập từ máu ngoại vi; lam kính được chuẩn bị, cố định và nhuộm giống như trong nghiên cứu ở tủy xương Quan sát trên 1000 đến 10000 hồng cầu trưởng thành để ghi nhận sự hình thành vi nhân ở mỗi vật thử nghiệm Những hồng cầu trưởng thành này chiếm

khoảng 95% hoặc hơn trong tổng số hồng cầu trong máu tuần hoàn Tỷ lệ hồng cầu

đa sắc được xác định để đo lường độc tính gây ra lên tủy xương bởi hóa chất Tất cả

dữ liệu được phân tích riêng biệt đối với chuột đực và chuột cái Quy trình nhuộm cam acridin cho phép phân biệt các tế bào hồng cầu non, nhỏ hơn 24 giờ tuổi (hồng cầu đa sắc) và hồng cầu trưởng thành 2-35 ngày tuổi dựa trên đặc tính bắt màu nhuộm Hồng cầu đa sắc có chứa phần RNA còn lại là điểm khác biệt với hồng cầu trưởng thành Vi nhân ở hồng cầu đa sắc bắt nguồn từ sự phá hủy trong khoảng thời gian 48 giờ, trong khi ở hồng cầu trưởng thành là sự tích lũy trong vòng một tháng với tổng số hồng cầu trưởng thành đạt trạng thái cân bằng trong máu ngoại biên (tỷ

lệ ngang nhau giữa số lượng hồng cầu mới bị phá hủy hay không bị phá hủy đi vào máu từ tủy xương và số lượng hồng cầu trưởng thành đi khỏi dòng máu) Vì vậy, đối với nghiên cứu vi nhân trong máu ngoại vi trong thời gian dài, việc ghi nhận tần suất vi nhân ở hồng cầu trưởng thành thường thích hợp hơn Lách của chuột nhắt thiếu khả năng loại bỏ các hồng cầu bị hủy hoại khỏi máu tuần hoàn, trong khi lách của chuột cống lại loại bỏ rất nhanh các hồng cầu có vi nhân khỏi tuần hoàn Vì thế, chỉ có chuột nhắt được chọn cho thử nghiệm vi nhân trong thời gian dài và việc đánh giá được dựa trên hồng cầu trưởng thành Trong nghiên cứu cấp tính, mẫu tủy xương được phân tích dựa trên các hồng cầu đa sắc [106]

Gần đây, người ta đã sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào để phân tích hồng cầu ngoại biên để ghi nhận tần suất xuất hiện vi nhân Trong nghiên cứu độc tính kéo dài 13 tuần sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào, mẫu máu được thu thập trong vòng 24 giờ sau liều cuối cùng Mẫu máu chống đông bằng heparin được cố định với methanol lạnh và phân tích tần suất hồng cầu có vi nhân bằng cách sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào, cả hồng cầu trưởng thành và hồng cầu non đều được phân tích riêng bằng cách sử dụng chất đánh dấu

bề mặt tế bào chuyên biệt để phân biệt 2 loại tế bào này Do kỹ thuật này đánh giá dựa trên các tế bào mục tiêu là hồng cầu non, nên mẫu máu dùng phân tích thu thập trong vòng 24-48 giờ, trước khi lách làm thay đổi tỉ lệ hồng cầu lưới có vi nhân trong máu tuần hoàn Vì vậy, việc sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào

cho phép đánh giá sự tạo thành vi nhân sử dụng mẫu máu thay vì phải tiến hành trên tủy xương[106]

1.5 GIẢI PHẪU MÔ HỌC - DỊ SẢN TẾ BÀO GAN

 Định nghĩa

Dị sản tế bào gan được định nghĩa như là sự tăng trưởng hay nhân rộng các tế bào, nhân đa hình, đa nhân, xảy ra ở từng vùng hoặc toàn bộ gan cùng với các nốt xơ gan Sự nhân rộng này bao gồm cả nhân và bào tương và thường tăng lên gấp 2-3 lần so với bình thường và sự gia tăng số lượng tế bào Kupffer Tỉ lệ nhân và bào tương thì bình thường Những chất bên trong nhân có thể được nhìn thấy và hạch nhân to lên (lồi ra) Tuy nhiên, ý nghĩa của sự xuất hiện những tế bào và nhân lớn trên tiêu bản mô nên được đánh giá cẩn thận vì tế bào lớn còn có thể gặp trong nhiều trường hợp khác, thậm chí đó là vấn đề sinh lý bình thường gặp trong hiện tượng lão hóa Mặt khác, sự kiểm tra cẩn thận đôi khi phát hiện sự tăng sản rõ rệt của những tế bào gan nhỏ thay vì là các tế bào gan lớn ở các gan bị xơ hóa kèm theo ung thư tế bào gan [30]

Sắc tố bào tương bình thường mặc dù thỉnh thoảng có sự tăng hoặc giảm glycogen

so với các vùng gan xung quanh không bị dị sản Những giọt dịch mật nhỏ bên trong tế bào chất đôi khi được nhìn thấy khi có dấu hiệu tắc nghẽn ống mật Những mảng tế bào gan không đều nhưng vẫn giữ nguyên mạng lưới và sự sắp xếp theo dạng hình sin bình thường Những thay đổi này xuất hiện, nhân rộng và xảy ra trong nhóm tế bào gan hoặc ảnh hưởng đến toàn bộ nốt xơ gan và sự xuất hiện đó đủ lớn

để có thể nhìn thấy khi phóng đại ở tỉ lệ thấp [11]

 Phân loại

Dị sản tế bào gan có thể chia thành hai dạng: dị sản tế bào gan nhỏ (SLCD – Small Liver Cell Dysplasia) và dị sản tế bào gan lớn (LLCD – Large Liver Cell Dysplasia) hay còn gọi là thay đổi tế bào gan lớn (LLCC – Large Liver Cell Change) [11],[61],[95]

 Dị sản tế bào gan nhỏ: hay còn gọi là thay đổi tế bào gan nhỏ, được đề cập lần đầu vào năm 1983 bởi Watanabe, là tổn thương được đặc trưng bởi những nhóm tế