Nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn

ALL : Bệnh bạch cầu cấp dòng lymphô AML : Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy anti HCV : Kháng thể viêm gan virút C BCHTT : Bạch cầu hạt trung tính BFU-E : Tế bào tạo khúm dòng hồng cầu CFC = CFU

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG

QUY TRÌNH XỬ LÝ

TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2007

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG

QUY TRÌNH XỬ LÝ TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN

CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA

Mã số: 3 01 31

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.PGS TRẦN VĂN BÉ 2.PGS TS TRẦN THỊ LIÊN MINH

TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2007

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả luận án

Huỳnh Nghĩa

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Lược sử phát triển ngân hàng và ghép tế bào gốc MCR 5

1.2 Tế bào gốc tạo máu - sự hình thành và phát triển 6

1.3 Máu cuống rốn 10

1.4 Thu thập, xử lý và lưu trữ MCR 16

1.5 Kỹ thuật xử lý mẫu MCR 22

1.6 Kỹ thuật tồn trữ lạnh mẫu MCR 27

1.7 Xét nghiệm đánh giá và kiểm tra chất lượng các sản phẩm MCR 31

1.8 Ứng dụng lâm sàng ghép tế bào gốc từ MCR 40

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48

2.1 Thiết kế nghiên cứu 48

2.2 Đối tượng nghiên cứu 48

2.3 Phương pháp nghiên cứu 50

2.4 Phân tích và xử lý số liệu thu thập 70

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 71

3.1 Kết quả tư vấn và sàng lọc trước thu thập MCR 71

3.2 Kết quả thu thập MCR 72

3.3 Kết quả xử lý MCR 84

3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR 86

3.5 Kết quả sàng lọc tế bào MCR thu thập 98

3.6 Kết quả MCR dự trữ đông lạnh (- 1960c) sau xử lý 99

3.7 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào MCR 101

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 104

4.1 Về sàng lọc người cho trước khi thu thập MCR 104

4.2 Về quy trình thu thập mẫu MCR 106

4.3 Quy trình kỹ thuật xử lý MCR 121

4.4 Kết quả nuôi cấy tế bào sau xử lý mẫu MCR 128

4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý ở -1960c 132

4.6 Về kết quả lây nhiễm do virus 136

4.7 Các xét nghiệm đánh giá chất lượng tế bào gốc từ MCR 137

4.8 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào gốc MCR 140

KẾT LUẬN 144

KIẾN NGHỊ 146

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phụ lục 3

Phụ lục 4

Phụ lục 5

Phụ lục 6

Phụ lục 7………

ALL : Bệnh bạch cầu cấp dòng lymphô

AML : Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

anti HCV : Kháng thể viêm gan virút C

BCHTT : Bạch cầu hạt trung tính

BFU-E : Tế bào tạo khúm dòng hồng cầu

CFC = CFU : Tế bào tạo khúm = Đơn vị tạo khúm

CFU – E : Đơn vị tạo khúm dòng hồng cầu

CFU – G : Đơn vị tạo khúm dòng hạt

CFU – GEMM : Đơn vị tạo khúm đa tiềm năng

CFU – GM : Đơn vị tạo khúm dòng bạch cầu hạt, đại thực bào CFU – L : Đơn vị tạo khúm dòng lymphô

CFU – M : Đơn vị tạo khúm dòng tủy

CFU – Meg : Đơn vị tạo khúm dòng mẫu tiểu cầu

CFU-Total : Đơn vị tạo khúm toàn bộ

CLL : Bệnh bạch cầu mãn dòng lymphô

CLP : Tế bào tiền thân chung dòng lymphô

CML : Bệnh bạch cầu mãn dòng tủy

CMP : Tế bào tiền thân chung dòng tủy

CR1 : Lui bệnh hoàn toàn lần thứ nhất

DMSO : Dimethylsulfoxide (chất bảo quản đông lạnh )

FLT3 – Ligand : Một trong các yếu tố phát triển ( danh từ riêng)

GMP : Tế bào tiền thân dòng đại thực bào-bạch cầu hạt

GVHD : Bệnh mảnh ghép chống ký chủ

GVL : phản ứng mảnh ghép chống ung thư

HPCs : Các tế bào gốc đa tiềm năng đầu tạo máu

HSXLMCR : Hồ sơ xử lý máu cuống rốn

ICBTR : Tổ chức đăng ký ghép máu cuống rốn quốc tế

LT – HSC : Tế bào gốc tạo máu dài hạn

LT-CIC : Tế bào đầu tiên nuôi cấy lâu dài

MCR : Máu cuống rốn

MEP : Tế bào tiền thân dòng hồng cầu-Mẫu tiểu cầu MMP : Tế bào tiền thân đa tiềm năng

Pro-B : Tiền tế bào Lympho B

Pro-DC : Tiền tế bào nhánh

Pro-NK : Tiền tế bào giết tự nhiên

Pro-T : Tiền tế bào T

RLCH : Rối loạn chuyển hóa

SL HC : Số lượng hồng cầu

SLBC : Số lượng bạch cầu

SLTB CD34+ : Số lượng tế bào CD34 dương tính

ST – HSC : Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn TBGMNV : Tế bào gốc máu ngoại vi TBGTM : Tế bào gốc tạo máu

TBN : Tế bào nhân

TBĐN : Tế bào đơn nhân

TLN : Trọng lượng nhau

TPMCR : Thành phần máu cuống rốn

YTSK : Yếu tố sản khoa

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần TBG tạo máu trong MCR và tủy xương 12

Bảng 1.2: Các kháng nguyên bộc lộ trên tế bào CD34+ 14

Bảng 1.3: So sánh kết quả loại bỏ hồng cầu và sự thu hồi tế bào nhân, 24

Bảng 1.4: Kết quả so sánh tỉ lệ % thu hồi giữa Sepax và HES 25

Bảng 1.5: Tỉ lệ nhiễm trùng của các sản phẩm tế bào gốc của MCR 33

Bảng 1.6 : Thống kê các đơn vị MCR đã được lưu trữ , sử dụng ở Châu Á 40

Bảng 1.7 : Thống kê các đơn vị MCR đã được lưu trữ, sử dụng trên thế giới 41

Bảng 1.8: Kết quả ghép MCR ở trẻ em 44

Bảng 1.9: Kết quả sau ghép MCR của bệnh nhân người lớn 46

Bảng 1.10: So sánh ghép MCR với ghép tế bào gốc khác 47

Bảng 2.11: Trang thiết bị, dụng cụ lưu trữ MCR 68

Bảng 3.12: Các lý do loại bỏ trước khi thu thập MCR 72

Bảng 3.13: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR 73

Bảng 3.14: Đặc điểm sản khoa của người cho MCR 74

Bảng 3.15: Đặc điểm mẫu MCR thu thập 74

Bảng 3.16: Tương quan giữa các YTSK và thể tích MCR thu thập 75

Bảng 3.17: Tương quan giữa YTSK và với số lượng TBNTB 76

Bảng 3.18: Aûnh hưởng của các YTSK với phân nhóm TBN 77

Bảng 3.19: Kết quả thể tích,TBN mẫu MCR thu thập với phân nhóm TBN 79

Bảng 3.20: Tương quan YTSK, thành phần MCR với SLTB CD34 + 80

Bảng 3.21: Kết quả SLTB CD34+ theo phân nhóm TBN 83

Bảng 3.22: Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý 84

Bảng 3.23: Kết quả giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu sau xử lý 84

Bảng 3.24: Khả năng tăng số lượng TBN và tế bào CD34 + sau xử lý 85

Bảng 3.27: Kết quả đếm tế bào sống trước và sau xử lý MCR 86

Bảng 3.28: Nguyên nhân mẫu MCR nuôi cấy khúm tế bào không thu hoạch 87

Bảng 3.29: Kết quả chung của nuôi cấy khúm tế bào của MCR sau xử lý 88

Bảng 3.30: Kết quả YTSK, TPMCR liên quan đến khúm BFU – E 89

Bảng 3.31: Kết quả YTSK và TPMCR sau xử lý liên quan 91

Bảng 3.32: Kết quả YTSK , thành phần MCR liên quan nuôi cấy khúm tế bào 93

Bảng 3.33: Kết quả yếu tố sản khoa, thành phần MCR thu thập sau xử lý 95

Bảng 3.34: Tương quan giữa SLTB CD34+ và nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý 97 Bảng 3.35: Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn, nhiễm vi nấm trước và sau xử lý MCR 98

Bảng 3.36: Kết quả sàng lọc bệnh lây lan qua mẫu MCR 98

Bảng 3.37: Kết quả sàng lọc bệnh hemoglobin (trước khi xử lý) 99

Bảng 3.38: Kết quả loại bỏ MCR dự trữ đông lạnh (- 1960C) 99

Bảng 3.39: Kết quả đếm tế bào sống theo thời gian lưu trữ 100

Bảng 3.40: Kết quả so sánh thành phần MCR trước và sau lưu trữ 100

Bảng 4.41: So sánh thể tích trung bình MCR thu thập 108

Bảng 4.42: Sự tương quan giữa thể tích MCR thu thập và các yếu tố sản khoa 111 Bảng 4.43: So sánh số lượng TBNTB của MCR thu thập 112

Bảng 4.44: So sánh yếu tố sản khoa của tác giả Solves P 114

Bảng 4.45: So sánh kết quả số lượng tế bào CD34+ túi MCR 115

Bảng 4.46: So sánh yếu tố sản khoa với tế bào CD34+ của các nghiên cứu 116

Bảng 4.47: So sánh tỉ lệ nhiễm trùng, nhiễm nấm sau khi thu thập MCR 118

Bảng 4.48: So sánh kết quả xử lý tế bào bằng kỹ thuật HES 123

Bảng 4.49: So sánh các thành phần MCR sau xử lý với các chất khác nhau 124

Bảng 4.50: So sánh nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý MCR 129

Bảng 4.51: So sánh nuôi cấy tế bào với ngưỡng TBN 80x 107 131

Bảng 4.52: Tỉ lệ % phục hồi phục hồi tế bào MCR sau lưu trữ 10 và 15 năm 135 Bảng 4.53: So sánh các nguyên nhân loại bỏ MCR sau dự trữ đông lạnh 135

Bảng 4.54: So sánh do lây nhiễm virus 136

Bảng 4.55: Các xét nghiệm được khảo sát theo các quy trình 138

Bảng 4.56: Các thành phần tế bào nhân, tế bào CD34+ và CFU của MCR 140

Bảng 4.57: So sánh các thành phần MCR, HLA và tuổi bệnh nhân 141

Bảng 4.58: Kết quả ghép tế bào gốc của MCR Tokyo cung cấp 141

Bảng 4.59: So sánh kết quả thời gian mọc mảnh ghép của 2 nguồn: 142

Bảng 4.60: Thời gian sống toàn bộ sau ghép của MCR Tokyo 143

Biểu đồ 3.1: Kết quả khảo sát tư vấn và sàng lọc trước khi thu thập 71

Biểu đồ 3.2: Kết quả số lượng mẫu MCR thu thập 72

Biểu đồ 3.3: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR 73

Biểu đồ 3.4: Sự tương quan giữa trọng lượng nhau và thể tích MCR 75

Biểu đồ 3.5: Sự tương quan giữa TLN và SLTBNTB trước xử lý 76

Biểu đồ 3.6: Sự tương quan giữa thể tích MCR và số lượng TBNTB trước xử lý 77 Biểu đồ 3.7: Biểu đồ hình hộp TLN và số lượng TBNTB theo phân nhóm 78

Biểu đồ 3.8: Biểu đồ trọng lượng thai nhi và lượng TBNTB theo phân nhóm 78

Biểu đồ 3.9: Biểu đồ hình hộp phân chia TBNTB theo nhóm 79

Biểu đồ 3.10: Biểu đồ hình hộp thể tích trung bình MCR thu thập 80

Biểu đồ 3.11: Sự tương quan giữa tuổi sản phụ và số lượng TBCD34+ 81

Biểu đồ 3.12: Sự tương quan giữa thể tích MCR và SLTB CD34+ 82

Biểu đồ 3.13: Sự tương quan giữa số lượng TBN trước xử lý 82

Biểu đồ 3.14: Biểu đồ hình hộp SLTB CD34+ trung bình của MCR thu thập 83

Biểu đồ 3.15: Biểu đồ kết quả nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý 87

Biểu đồ 3.16: Sự tương quan của BFU-E với số lượng TBNTB sau xử lý 90

Biểu đồ 3.17: Sự tương quan của BFU-E với trọng lượng em bé 90

Biểu đồ 3.18: Sự tương quan của CFU với trọng lượng thai nhi 92

Biểu đồ 3.19: Sự tương quan của CFU-GM với TBNTB sau xử lý 92

Biểu đồ 3.20: Sự tương quan của CFU-GEMM với trọng lượng thai nhi 94

Biểu đồ 3.21: Sự tương quan của CFU-GEMM Mvới số lượng TBN sau xử lý 94

Biểu đồ 3.22: Sự tương quan của CFU-total với trọng lượng thai nhi 96

Biểu đồ 3.23: Sự tương quan của CFU-total với số lượng TBNTB sau xử lý 96

Biểu đồ 3.24: Sự tương quan của CFU-total với số lượng TBN sau xử lý 97

Biểu đồ 3.25: Biểu đồ Kaplan Meier về thời gian sống toàn bộ sau ghép MCR102 Biểu đồ 4.26: Sự tương quan tế bào CD34+ và số lượng TBNTB (≥ 80 x 107 ) 117 Biểu đồ 4.27: Kết quả so sánh hiệu quả xử lý của các phương pháp 126 Biểu đồ 4.28: Kaplan Meier so sánh thời gian sống toàn bộ sau ghép của 143

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sự tạo máu của tế bào gốc 8

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tuyển chọn và sàng lọc người cho MCR khi thu thập 53

Sơ đồ 2.3: Tóm tắt quy trình xử lý chiết tách tế bào gốc từ MCR 57

Sơ đồ 2.4: Quy trình bảo quản đông lạnh – giải đông MCR 59

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ dị ghép tế bào máu gốc từ MCR 65

Sơ đồ 4.6: Đảm bảo chất lượng mẫu MCR trước xử lý và tránh lãng phí 120

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Máy tự động Sepax 25

Hình 1.2: Phương pháp có bộ lọc 26

Hình 1.3: Hệ thống xử lý tự động 26

Hình 2.4: Giai đoạn cắt dây máu cuống rốn 55

Hình 2.5: Thu thập MCR sau khi lấy bánh nhau ra ngoài tử cung 55

Hình 2.6: Phòng xử lý MCR sau khi thu thập 67

Hình 2.7: Máy ly tâm lạnh 67

Hình 2.8:Máy trộn, máy bơm tự động 67

Hình 2.9: Dụng cụ xử lý và lưu trữ lạnh MCR, hệ thống lưu trữ đông lạnh 68

Hình 2.10: Máy đếm tế bào tự động và hệ thống máy Flow Cytometry 69

Hình 3.11: Mẫu MCR sau xử lý 86

Hình 3.12: Lập hồ sơ MCR sau xử lý 86

Hình 3.13: Khúm BFU-E lớn 88

Hình 3.14: Bốn khúm CFU-GM 81

Hình 3.15: (A) Tế bào CD34 + nhuộm giem sa, (B) GFU- GEMM khổng lồ 88

Hình 3.16: Mẫu MCR được lưu trữ sau khi xử lý 101

Hình 3.17: Mẫu MCR được lấy từ túi vận chuyển 103

Hình 3.18: Mẫu MCR được rã đông ở 370C 103

Hình 3.19: Mẫu MCR được rút ra bằng ống chích 20cc 96

Hình 3.20: TBG MCR được truyền qua ống thông TMTƯ 103

Hình 3.21: MCR : đếm SLTBN; CD34; nuôi cấy khúm TB; đếm TB sống 103

Hình 3.22: Mẫu MCR được hoàn tất sau ghép 103

MỞ ĐẦU

Hơn 30 năm qua, phương pháp ghép tuỷ xương khác gien đã được sử dụng điều trị hàng ngàn bệnh nhân mắc bệnh ác tính và di truyền bẩm sinh của hệ tạo máu Hai yếu tố chính góp phần thành công trong ghép tuỷ xương khác gien là sự lựa chọn người cho phù hợp kháng nguyên hoà hợp tổ chức (Human Leucocyte Antigen : HLA ) và sự kiểm soát được bệnh mảnh ghép chống ký chủ (Graft vesus host disease: GVHD) [41] Người cho tủy là anh em ruột phù hợp HLA thường không đủ, do đó phải tìm nguồn cho tuỷ từ trong cộng đồng có HLA phù hợp Tuy nhiên vẫn có một số bất lợi [41], [42]:

- Mất thời gian dài để tìm người cho phù hợp HLA: 1- 6 tháng (trung bình 3.5 tháng);

- Số người cho bị giới hạn ở những cộng đồng dân thiểu số và các chủng tộc khác nhau;

- Người cho không có sẵn ở thời điểm cần ghép;

- Nguy cơ cao sự thải ghép, bệnh mảnh ghép chống ký chủ nặng, và nhiễm trùng cơ hội sau ghép nhiều;

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã và đang đánh giá những nguồn tế bào gốc tạo máu mới để ghép , bao gồm tế bào gốc máu ngoại

vi (Pheripheral Blood Stem Cells : PBSCs) và tế bào gốc MCR (máu cuống rốn) Cho đến nay nhiều nghiên cứu đã chứng minh MCR có thể thay thế cho tủy xương dùng để ghép, do có những ưu điểm sau:

- Dễ tiến hành thu thập;

- Tỉ lệ nhiễm virus lúc sanh thấp, đặt biệt là CMV (Cytomegalo virus);

- Có nhiều người cho, thời gian tìm người cho phù hợp HLA rút ngắn có khả năng ghép trên nhóm dân thiểu số;

- Không có nguy cơ cho mẹ và trẻ sơ sinh trong lúc thu thập tế bào gốc;

- Dung nạp miễn dịch tốt: khả năng mọc mô ghép tốt trong những trường hợp không phù hợp HLA (1 - 3 kháng nguyên);

- Tần xuất GVHD thấp và nhẹ, dễ dàng điều trị sau khi ghép;

- Được lưu trữ để ghép lại cho chính đứa trẻ hoặc cho người mẹ nếu bị bệnh sau này

Từ các lợi điểm trên mà hầu hết các nước tiên tiến trên thế giới cũng như trong khu vực đã tiến hành tổ chức thu thập, xử lý và lưu trữ tối đa các mẫu MCR bằng các công nghệ tiên tiến để sẵn sàng điều trị cho bệnh nhân

Từ năm 1988, Gluckman và cs đã sử dụng MCR ghép cho một bé trai mắc bệnh thiếu máu Fanconi có kết quả thành công rất tốt[58] Trong thập niên

90 các nước tiên tiến trên thế giới đều có các ngân hàng MCR, lưu trữ MCR lâu dài để cung cấp sản phẩm tế bào gốc cho ghép Ở châu Âu đã có 80 trung tâm với 20 quốc gia sử dụng MCR để ghép[42] Tại Hoa kỳ, Úc, mỗi nước đã lưu trữ được vài chục ngàn mẫu MCR và Châu Á đã và đang hình thành hệ thống MCR các khu vực nhằm trao đổi thông tin và các sản phẩm MCR

Tại Việt Nam, việc tìm hiểu các yếu tố trong MCR ở các sản phụ người Việt Nam đã được Trung tâm Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh thực hiện và kết quả cho thấy MCR của các sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn của một sản phẩm sử dụng trong ghép để thay thế cho các nguồn tế bào gốc từ tủy xương hoặc máu ngoại biên

Mặc khác tổng kết 10 năm điều trị bệnh về máu tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh cho kết quả [2],[6], [10]:

- Các bệnh lý ác tính chiếm: 50,24% trong tổng số bệnh nhân Trong số này có chỉ định điều trị bằng ghép: khoảng 20% (700 bệnh nhân) Nhưng vì không tìm được người cho phù hợp, do đó chỉ có dị ghép tuỷ xương cho 3 bệnh nhân và 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu ngoại vi , kết quả này mới chỉ bằng 3% số bệnh nhân có chỉ định điều trị bằng ghép

- Các bệnh Hemoglobin và bệnh Thalassemia chiếm 12% tổng số bệnh nhân [2],[6] Trong loại bệnh này chỉ có dị ghép mà không có tự ghép và tất cả các bệnh nhân thể nặng của bệnh Thalassemia đều có chỉ định ghép, nhưng chỉ mới dị ghép được 2 bệnh nhân Các loại bệnh này là gánh nặng cho xã hội vì phải thường xuyên truyền máu và “sống nhờ máu người khác”

Với khuynh hướng phát triển chung trên thế giới, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học áp dụng cho việc điều chế vật liệu sinh học mới để áp dụng cho điều trị, bên cạnh đó nhu cầu thiết thực của xã hội trong điều trị bệnh lý ác tính và bệnh lý di truyền bẩm sinh , cần thiết phải có một sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn để ghép, việc chọn lựa MCR để xử lý thành sản phẩm TBG được xem là giải pháp tối ưu hiện nay Do vậy, để tiến tới xây dựng một ngân hàng MCR tại TP Hồ Chí Minh đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và thật sự mang lại lợi ích cho cộng đồng, điều cần thiết phải có những nghiên cứu thử, các nghiên cứu triển khai kỹ thuật, các quy trình kỹ thuật, tổ chức ghép thực nghiệm trong điều kiện cụ thể của nước ta, nhằm tìm ra các giải pháp tốt nhất trong việc điều chế sản phẩm tế bào gốc từ MCR và áp dụng ghép lâm sàng

Xuất phát từ những điều trình bày trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn Thực hiện nghiên cứu này,

chúng tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây :

1 Xây dựng và hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người cho trước thu thập MCR

2 Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập MCR sau giai đoạn xổ nhau

3 Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình xử lý MCR bằng kỹ thuật có chất kết tủa HES (Hydroxy Ethyl-Starch)

4 Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào máu gốc MCR

ở nhiệt độ –1960C

5 Chuẩn hóa và hoàn thiện các xét nghiệm sinh học: đếm số lượng tế bào nhân , số lượng tế bào CD34 (+), nuôi cấy khúm tế bào , đếm tế bào sống và các xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, virus theo các giai đoạn để đánh giá chất lượng sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn

6 Đánh giá hiệu quả ứng dụng sản phẩm tế bào gốc MCR được xử lý trong thực hành ghép tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN NGÂN HÀNG VÀ GHÉP TẾ BÀO GỐC MCR

[ 59],[60]

- Năm 1974, có sự hiện diện tế bào gốc đa tiềm năng trong MCR ở người

đã được xác định bởi Knudtzon Gần 10 năm sau, Ogawa và cs đã có bằng chứng

về sự hiện diện của tế bào gốc tiền thân trong MCR Khả năng sử dụng tế bào MCR của người như là nguồn tế bào gốc để ghép được đề nghị lần đầu tiên vào cuối năm 1982 bởi tác giả Edward A Boyse trong một cuộc thảo luận riêng với Hal Broxmeyer và Judith Bard

- Từ năm 1984 – 1985, những giả thuyết cho rằng MCR có chứa nhiều tế bào có khả năng hồi phục sự tạo máu lần đầu tiên đã được chứng minh bởi Bosey và cs trong một mô hình trên chuột Tuy nhiên, vấn đề này không có tiến triển hơn cho mãi đến năm 1989, những thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng đã được chỉ định rộng rãi cho MCR có thể sử dụng trong trị liệu lâm sàng Broxmeyer và cs đã cho thấy những bằng chứng thực nghiệm chứng minh MCR là nguồn tế bào gốc tạo máu giàu có [42]ù Vài năm sau đó, năm 1989 Gluckman và cs đã báo cáo trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên bằng MCR thay

vì dùng bằng tủy xương Chúng có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu của trẻ

em bị bệnh thiếu máu Fanconie bằng MCR phù hợp HLA của người anh em [58]

- Năm 1991, ghép MCR thành công đầu tiên trên trẻ em bệnh máu ác tính: bệnh bạch cầu mãn dòng tủy (CML)

- Năm 1992, mẫu MCR của gia đình được thu thập đầu tiên tại ngân hàng MCR của trường Đại học Arizona

- Năm 1993, ghép MCR không liên hệ huyết thống được thực hiện tại Đại học Duke

- Năm 1994 - 1995, chương trình đăng ký MCR được thành lập trên thế giới

- Năm 1996, Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc (Foods and Drugs Adminitration : FDA) điều tra nghiên cứu đầu tiên về MCR Viện Tim - Phổi - Máu Quốc gia Hoa Kỳ tài trợ cho chương trình nghiên cứu ghép tế bào gốc MCR Cùng năm này, tổ chức đăng ký MCR bắt đầu thiết kế chương trình ghép để cung cấp mẫu MCR miễn phí cho các gia đình có yêu cầu ghép

- Năm 1997, ghép MCR được thực hiện thành công trên người lớn 46 tuổi với bệnh bạch cầu mãn dòng tủy,giai đoạn mãn, đây là thử nghiệm lâm sàng sử dụng MCR đã được tăng sinh ngoài cơ thể

- Năm 1998, Tổ chức đăng ký MCR trở thành ngân hàng MCR gia đình đầu tiên đã được công nhận bởi Ngân hàng hàng máu của hiệp hội Hoa Kỳ

- Từ năm 1998 - 2006 [41],[42],[114], người ta dùng MCR như là một nguồn thay thế cho tế bào gốc( TBG) và đã được áp dụng rộng rãi để ghép cho trẻ em cũng như người lớn Cho đến nay, hơn 4000 các trường hợp ghép đã được thực hiện trên toàn thế giới, trên 80 loại bệnh di truyền và bệnh máu ác tính với kết quả rất khả quan

1.2 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU - SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN

[1],[5],[63]

Các tế bào gốc tạo máu của người và chuột thì tương tự nhau, vì vậy chúng ta có thể nghiên cứu hệ thống tạo máu trên chuột để hiểu rõ hơn hệ thống tạo máu trên người [63] Sự hình thành tế bào máu bắt nguồn từ trung bì phôi thai Nơi tạo máu sơ khai ngoài phôi là túi noãn hoàng, còn vị trí tạo máu đầu tiên trong phôi là ở động mạch chủ tuyến sinh dục – trung thận (Aorta-gonad-

mesonephros: AGM) [5],[63} Những tế bào non sơ khai của dòng hồng cầu và những tế bào tạo máu mang CD34+ được tìm thấy đầu tiên ở túi noãn hoàng người sau 18.5 ngày hình thành và phát triển phôi Những tế bào tiềm năng của hai dòng lymphô và dòng tủy thì được tìm thấy ở vùng AGM vào khoảng ngày

24 đến ngày 34 của sự hình thành và phát triển phôi Màng nội mạc có khả năng tạo máu thì nằm ở mặt lưng của động mạch chủ và có nguồn gốc từ vùng AGM Có mối liên quan chặt chẽ giữa hệ thống tạo máu và hệ thống tạo mạch,

vì chúng đều xuất phát từ tế bào mầm có khả năng tạo máu và tạo mạch (haemangioblast) Những tế bào gốc di chuyển khắp cơ thể bằng cách chảy xuôi dòng theo dòng máu và nhờ thế những tế bào tạo máu từ túi noãn hoàng hay từ vùng AGM đến gan Vào tuần thứ 7 của thời kỳ thai nghén, gan là cơ quan chính của sự tạo máu Nhiệm kỳ của hệ thống tạo máu sơ khai kéo dài trong bao lâu thì chưa rõ, có lẽ nó tùy thuộc vào từng loại động vật Số lượng tế bào non bình thường tạo dòng hồng cầu chiếm hơn 90% so với quần thể hồng cầu trưởng thành trong tuần hoàn vào tuần thứ 10 của thời kỳ thai nghén Từ tháng thứ 3 của thời kỳ thai nghén đã có sự tạo máu ở lách, tuyến ức và hạch lymphô Sự tạo máu bắt nguồn từ tủy xương vào tháng thứ 4 hay tháng thứ 5 của thời kỳ thai nghén Kể từ tháng thứ 6 của thai kỳ, tủy xương sẽ nắm vai trò chủ lực trong sự tạo máu, mặc dù sự tạo máu vẫn còn hiện hữu ở các vị trí khác như gan lách cho đến hết tuần đầu sau sanh Về hình thái học, những tế bào gốc tạo máu là những tế bào đơn nhân, kích thước trung bình, nhân chiếm nhiều hơn tế bào chất, tế bào chất ưa kiềm và không hạt, còn hạt nhân thì rất nổi bật Tuy nhiên, chúng

ta không thể phân loại hình thái học của chúng bằng kính hiển vi quang học

 ĐẶC TÍNH TẠO HÌNH CÁC DÒNG CỦA CÁC TBGTM [63], [88]

Trong các mô hình cổ điển của tế bào gốc tạo máu (TBGTM) , các tế bào

đa năng dần dần tự thay thế để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao hơn và đồng

thời mất dần tính đa năng của chúng Gần đây, những mô hình tạo máu tân tiến được giới thiệu, như mô hình thống nhất về sự phát triển tế bào gốc và mô hình khoảng cách các giai đoạn phát triển tế bào gốc Những mô hình này cho thấy sự biệt hóa tế bào gốc tạo máu theo thứ bậc nhất định trong những tình huống cụ thể, thậm chí vượt qua ranh giới chuyên biệt dòng có nguồn gốc phôi thai

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sự tạo máu của tế bào gốc

“ Nguồn : Broxmeyer HE, 1998” [41]

Ghi chú : MMP : Multipotent progenitor , CMP: Common myeloid progenitor, MEP: Mega-Erythroid progenitor, GMP: Granulo-Macrophage progenitor, CLP : Common lymphoid progenitor, Pro-DC : Pro-Dendritic Cell, Pro-T : Pro- Lympho

T, Pro-NK : Pro-Natural Killer, Pro-B : Pro-Lympho B

Đặc tính tạo hình các dòng của các TBGTM còn liên quan đến các cơ chế hóa học, bao gồm các yếu tố hóa học của mạng lưới hệ thống cytokine và các yếu tố tăng trưởng trong môi trường vi mô, trong các hốc của tuỷ những tế bào gốc cũng như do sự điều chỉnh của các sợi chromatin và những thay đổi của biểu hiện gien trong chu trình của tế bào Tuy nhiên cho đến nay, tính tạo hình và sự biệt hóa tế bào vẫn còn đang nghiên cứu và tranh cãi Những tế bào gốc từ trung mô đa năng có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau từ ba lớp tế bào mầm, và chúng cũng được tìm thấy ở MCR Hơn nữa, người ta còn đang nghiên cứu khả năng biệt hóa của các tế bào trung mô của cuống rốn thành tế bào thần kinh hay cơ, tế bào mạch vành,tế bào tuyến tụy [97]

Qua các nghiên cứu cơ bản nuôi cấy tế bào, người ta thấy có 2 loại tế bào gốc tạo máu, nhưng thực chất chính là 2 giai đoạn biệt hóa khác nhau của tế bào gốc tạo máu [1],[5], [97]

Các tế bào gốc tạo máu dài hạn (Long term- Hematopoietic Stem Cell: LT-HSC) đây là các tế bào máu non, số lượng ít, chưa biệt hóa, có khả năng tự tái tạo và có tính đa năng cao, chúng có hoạt động men Tolomerase ở mức độ cao (hoạt động men Tolomerase là đặc tính của tế bào đang phân chia nhưng không biệt hóa và các tế bào ung thư) Các tế bào đã biệt hóa – trưởng thành thì không có hoạt động của men này Trong thực nghiệm tiền lâm sàng các tế bào này có thể khôi phục lại hoàn toàn chức năng tạo máu của chuột bị chiếu xạ ở liều chết sau vài tháng Tế bào gốc tạo máu dài hạn là các tế bào gốc tạo máu mang CD34 Thy Lin, các tế bào này có thể biệt hoá thành tất cả các loại tế bào máu khác nhau Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc dài hạn có khả năng tự tái tạo trong suốt đời cá thể

Các tế bào gốc tạo máu ngắn hạn (Short term – Hematopoietic: ST-HSC)

so với tế bào gốc dài hạn thì chúng tương đối trưởng thành hơn, được sinh ra từ

tế bào gốc dài hạn mà vẫn duy trì được bản chất tự tái tạo khoảng 8 tuần và chỉ tăng sinh­biệt hóa một thời gian thường là vài tháng Các tế bào gốc ngắn hạn sinh ra các tiền thân định hướng chung dòng tủy (CFU–GEMM) và các tiền thân định hướng chung dòng lymphô (CFU–L) Các tiền thân định hướng dòng lymphô tạo ra các tế bào đầu dòng và biệt hoá thành tế bào lymphô B hoặc tế bào lymphô T, tế bào giết tự nhiên Các tiền thân dòng tủy sinh ra các tế bào định hướng dòng hồng cầu (BFU–E), tế bào định hướng dòng hạt và đại thực bào (CFU–GM)â, tế bào định hướng dòng mẫu tiểu cầu (CFU–Meg)… và biệt hóa thành các tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu hạt đa nhân trung tính, bạch cầu ưa axít, ưa kiềm, tiểu cầu và hồng cầu Các tế bào gốc tạo máu ngắn hạn cũng có khả năng tăng sinh–biệt hóa thành các tế bào máu nhưng so với các tế bào gốc tạo máu dài hạn, tính đa năng của chúng bị giới hạn Thí dụ tế bào tiền thân hồng cầu chỉ có thể tạo thành tế bào hồng cầu (sơ đồ 1.1)

1.3 MÁU CUỐNG RỐN

MCR ( máu cuống rốn) [5],[97]hay còn gọi là máu dây rốn hay máu bánh nhau chảy trong tuần hoàn máu thai nhi và cung cấp chất dinh dưỡng cho bào thai đang phát triển trong tử cung người mẹ Phần máu còn lại trong dây rốn và bánh nhau khi sản phụ sinh em bé và dây rốn là chất thải sinh học trong các bệnh viện phụ sản Ngày nay, nhờ sự tiến bộ trong khoa học, người ta đã sử dụng chất thải sinh học này như một trong những nguồn cung cấp dồi dào tế bào gốc cho ghép tế bào để điều trị một số bệnh lý ác tính và di truyền bẩm sinh của hệ tạo máu

1.3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MIỄN DỊCH HỌC TẾ BÀO MCR

1.3.1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MCR

 Tần suất của tế bào gốc của MCR

Đã có nhiều nghiên cứu công bố thành phần các tế bào tạo thành khúm (Colony forming Cell : CFC) của MCR ở người Thật vậy, các nghiên cứu đã cho thấy trong 1ml MCR có khoảng 8x103 tế bào gốc dòng hồng cầu (BFU-E) và 13 –24 x103 tế bào gốc dòng tủy CFU-GM, và 1-10x103 tế bào gốc đa tiềm năng (CFU-GEMM) [60] Tuy nhiên cũng có một số các nghiên cứu đã công bố kết quả khác có lẽ do điều kiện nuôi cấy khác nhau Trong vấn đề này, Broxmeyer và cs [41],[42]đã chứng minh rằng sự nhận diện CFC phụ thuộc vào sự kết hợp của các cytokin sử dụng trong môi trường nuôi cấy Nhiều tác giả đã cho thấy rằng khi thêm vào các yếu tố tế bào gốc và dung dịch nuôi cấy bán lỏng làm gia tăng có ý nghĩa sự nhận diện của tế bào gốc dòng tủy và tế bào gốc đa tiềm năng Nghiên cứu so sánh toàn bộ các thành phần trong MCR và tủy xương cho thấy tỉ lệ những tế bào này thì tương tự như trong cả hai nguồn Tuy nhiên, sự khác nhau quan trọng là tỉ lệ của các thành phần dưới nhóm tế bào gốc

Lu và cs đã chứng minh số lượng các tế bào gốc tạo máu trong MCR cao hơn gấp 8 lần so với tủy xương người lớn [78] Surtherland [41], Verfailie và cs [42] đã phát hiện có một loại tế bào không có khả năng tạo khúm trong dung dịch bán canh cấy nhưng có khả năng phát triển đến CFC sau nhiều tuần lễ trong môi trường cấy kéo dài loại Dexter Những tế bào này, được gọi là tế bào đầu tiên trong cấy lâu dài (Long term culture-initiating cells: LT-CIC), là một trong tế bào gần nhất với tế bào gốc ở người Những nghiên cứu của Pettengell và cs đã cho thấy tần suất của LT-CIC trong MCR thì rất tương đồng với tủy xương người lớn [41] Họ đã tìm thấy LT-CIC phát triển thành CFC sau 5 tuần cấy hiện diện ở tỉ lệ 1/13.000 tế bào đơn nhân, trong khi LTC-IC hình thành CFC sau 8 tuần lễ cấy thì hiện diện ở một nồng độ 1/34.000 tế bào đơn nhân Do vậy, kết quả này gợi ý rằng sự tác động của tế bào gốc được giả định trong MCR có thể

so sánh được với tế bào gốc tủy xương

Bảng 1.1: Thành phần TBG tạo máu trong MCR và tủy xương

HPC/10 5 tế bào đơn nhân [25]

 Các dấu ấn miễn dịch của tế bào gốc tạo máu MCR

Kháng nguyên CD34, glycoprotein màng có trọng lượng phân tử 90-120

kD, là một tiêu chuẩn xác thực của TBG tạo máu [5],[41] Tần suất tế bào CD34+ trong tủy người lớn đã được đánh giá 1%-3% của tất cả tế bào đơn nhân [41], [42] Thành phần tế bào CD34+ trong MCR cũng đã được cho thấy xấp xỉ 1% của tế bào đơn nhân [5] Điều thú vị, tần suất của tế bào CD34+ trong MCR giảm với tuổi thai, lúc 17 tuần tuổi , tế bào CD34+ bao gồm 11% tất cả tế bào đơn nhân, nhưng ngược lại ở tuần thứ 38 chúng chỉ còn lại 1%[45]

Cũng như trong tủy xương người lớn, tế bào CD34+ trong MCR bao gồm một quần thể tế bào rất không đồng nhất Thay đổi chính yếu của tế bào CD34+ là biểu hiện của hai kháng nguyên HLA-DR và CD38 [41,[42] Vấn đề đáng chú

ý là tần suất của tế bào CD34+HLA-DR- và CD34+CD38- trong MCR thì cao hơn trong TX người lớn (tế bào CD34+CD38- trong MCR khoảng 4% trong nhóm CD34+ so với chỉ duy nhất 1% trong tủy xương) Những báo cáo này nêu

quan điểm MCR có khả năng tăng sinh quần thể TBG chưa trưởng thành cao hơn tủy xương người lớn Thú vị hơn nữa, Traycoff và cs [42]đã công bố gần đây, ngược lại với LT-CIC của tủy xương, LTC-IC của MCR đều bộc lộ cả hai CD34 và HLA-DR

Myani và Lansdop [42] đã báo cáo tế bào CD34+ MCR có thể được tách

ra dựa trên dấu ấn của hai CD45RA và CD71, và những kết quả này xác định ba quần thể lớn tế bào dưới nhóm giàu tiềm năng:

(1) tế bào CD34+CD45RAthấpCD71thấp rất giàu CFU-GEMM, tương ứng trên 47% của CFC;

(2) tế bào CD34+CD45RA+CD71 thấp giàu TBG dòng hạt và monocyte tương ứng 90% của CFC;

(3) tế bào CD34+CD45RAthấp CD71+ nhiều hơn 70% của CFC tương ứng với TBG dòng hồng cầu ( BFU-E và CFU-E)

Hầu hết các tế bào CD34+ (90%) đều đồng hiện diện FLT3 (CD115), là điểm tiếp nhận cho hoạt động sớm cytokine FLT3-ligand (FL), mà ở đó chỉ có một số nhỏ (5%) hiện diện điểm tiếp nhận các yếu kích thích dòng tủy (Myeloid- Colony Stimulating Factor: M-CSF [41],[69], 80% tế bào CD34+ MCR có một khả năng thu nhận rhodamine-123 (Rh cao) [42],[69], một chất nhuộm huỳnh quang kết định đến ty lạp thể của tế bào sống Những tế bào CD34+Thy-1+ c-kit thấp là Rh thấp [41] và dường như rằng tất cả LT- CIC thì hiện diện trong phạm vi tế bào dưới nhóm này[41] Do vậy, với tất cả các dữ liệu đã nêu trên, người ta có thể kết luận hầu hết các TBG nguyên thủy hiện diện trong MCR có tần suất xấp xỉ 1/30.000 tế bào đơn nhân với mang kiểu hình theo sau: CD34+CD38-CD45Rathấp CD71 thấp Thy-1+ c-kit thấp Rh thấp

Sự đồng hiện diện của kháng nguyên dòng lymphô và dòng tủy trên tế bào CD34+ MCR cũng đã được ghi nhận Khác với tủy xương người lớn , Salen

vaø cs [42] ñaõ tìm thaáy coù 25% teá baøo CD34+ mang daáu aán CD10 vaø 18% mang daáu aán CD19, teá baøo CD10+CD19+ raát hieám trong quaàn theå teá baøo CD34+ töø MCR [50] CD13 döôøng nhö ñeàu bieåu hieän treân phaàn lôùn teá baøo CD34+MCR, vaø CD33 cuõng bieåu hieän roäng khaép treân caùc teá baøo naøy, maëc duø CD33 thì vaéng maët treân haàu heát teá baøo nguyeân thuûy CD34+

Nhieàu taùc giaû cuõng ñaõ quan saùt thaáy raèng nhöõng phaân töû keát dính treân nhieàu loaïi teá baøo ñeàu hieän dieän treân teá baøo CD34+, töông töï nhö nhöõng quan saùt naøy trong teá baøo CD34+ tuûy xöông ngöôøi lôùn

Baûng 1.2: Khaùng nguyeân boäc loä treân teá baøo CD34+ [41],[42],[50]

Teá baøo döông tính

CD54 CD58 CD71 CD90 CD115 CD117 CD135 HLA-DR

1.3.1.2 ÑAËC ÑIEÅM MIEÃN DÒCH HOÏC CUÛA MCR

Teá baøo lymphoâ CD3+ trong MCR chöa tröôûng thaønh nhieàu hôn teá baøo CD3+ ôû ngöôøi lôùn do khoâng coù CD45 RA+RỢ Vì theá chuùng saûn xuaát ít cytokine hôn bao goàm -interferon, interleukine-4, interleukine-10 [41],[63] Chöùc naêng gieát teá baøo töï nhieân cuûa MCR suy giaûm do coù raát ít teá baøo CD57[41] Nhöõng chöùc naêng naày coù theå thaáy ñöôïc qua söï hoaït hoùa teá baøo trong cô theå hoaëc trong oáng nghieäm Haäu quaû laø hoaït tính gaây ñoäc cuûa teá baøo T vaø söï gieát teá baøo töï nhieân bò suy giaûm, nhöng söï hoaït hoùa thöù phaùt coù theå xaûy rạ GVHD caáp tính laø moät bieán chöùng sôùm xaûy ra sau gheùp tuûy khaùc gien vaø ñöôïc kích hoaït ban ñaàu

phần nào là do sự phóng thích các cytokine, điều nầy giải thích ghép MCR ít gây

ra biến chứng và mức độ nhẹ hơn của GVHD khi so với ghép tế bào gốc tạo máu của người trưởng thành Như vậy GVHD sẽ giảm trong ghép MCR phù hợp hoặc không phù hợp HLA, nhưng phản ứng mảnh ghép chống tế bào leukemia (Graft versus Leukemia :GVL) vẫn còn bởi vì có sự hiện diện của các tế bào T đầu dòng và tế bào giết tự nhiên [63] Những đặc điểm này làm cho tiêu chuẩn lựa chọn người cho phù hợp HLA trong ghép MCR dễ dàng hơn

Nhìn chung, những dữ liệu đã công bố có giá trị cho thấy các tế bào MCR có đặc tính miễn dịch khác biệt so với các tế bào cùng dạng của máu ngoại vi[5] Thành phần và tỉ lệ phần trăm của tế bào dưới nhóm thuộc lymphô và dòng tủy trong MCR khác biệt với các thành phần của chúng trong máu ngoại vi [41] Các thành phần tế bào đơn nhân của MCR chủ yếu các tế bào T nguyên sinh “naive” và một tỉ lệ đáng kể tế bào giết tự nhiên chưa trưởng thành, các tế bào này có khả năng tăng sinh đáp ứng khi tiếp xúc dị kháng nguyên, nhưng về tổng quát các tế bào này có hiệu lực gây độc tế bào thì rất yếu [5], [41] Do vậy, có thể giải thích việc giảm tần xuất và mức độ của GVHD sau ghép tế bào MCR Điều còn lại cần được xác định có phải chăng tần xuất thấp của GVHD thì thường đi kèm với giảm hoạt tính chống ung thư của mảnh ghép (GVL) nghĩa là có sự gia tăng nguy cơ tái phát của tế bào ung thư

Một câu hỏi khó giải quyết là có phải tế bào lymphô T MCR trở nên dung nạp với kháng nguyên HLA của ký chủ sau khi ghép và nếu thế vấn đề này là một trong đặc điểm miễn dịch chuyên biệt của tế bào MCR để tạo ra dung nạp mảnh ghép [11],[42] Do bởi số lượng toàn bộ tế bào CD4+ và và CD8+ trong MCR ít hơn trong tủy xương và máu ngoại vi, vì vậy số lượng khác nhau của tế bào T có thể ảnh hưởng mức độ nặng nhẹ của GVHD, nhưng không tạo ra sự

dung nạp của tế bào T[42] Mặc khác, các điểm tiếp nhận cytokin CCR5, bộc lộ bởi tế bào T giúp đở, thì ít phong phú hơn trong tế bào MCR so với tế bào T của người trưởng thành, sự giảm này làm suy yếu khả năng của các phân tử kích thích/hoặc các ligand của chúng[42], cùng với sự suy yếu trong tổng hợp của các cytokin với đặc tính giúp đở hoặc gia tăng bài tiết các cytokin ức chế, có thể tạo

ra tính không dị ứng do bởi dung nạp lâu dài của tế bào T Một vài nghiên cứu cho thấy rằng các tế bào MCR sản xuất một số lượng lớn của các cytokine chống viêm IL10 [42] Cytokin chống viêm IL10 ứng cử viên lý tưởng cho ức chế GVHD và thúc đẩy sự dung nạp của tế bào T IL10 ức chế sự sản suất các của các monokines khác nhau và điều hoà xuống nhóm II của HLA (Class II ) trên tế bào đơn nhân của người và ít bộ lộ các phân tử kích thích như là CD80 [5],[42] Mặc khác, với nồng độ cao nội sinh của IL-10 đã được quan sát trong vivo của những bệnh nhân ghép không phù hợp HLA dẫn đến sự dung nạp tế bào T Do đó, có thể khẳng định với sản xuất IL-10 cao bởi sự hoạt động tế bào lymphô T MCR hy vọng tạo ra tế bào T không cảm ứng trong vivo và vitro

IL-10 giữ vai trò là chìa khóa tạo ra sự biệt hóa của các tế bào T điều hòa mới dưới nhóm, điều này có thể điều hoà sự dung nạp trong vivo Có thể giải thuyết là MCR có một khả năng thu nhận dung nạp cao hơn tủy xương bởi vì khả năng tế bào T MCR sản xuất ra IL-10 nồng độ cao và biệt hoá để tạo thành các tế bào điều hoà/ức chế có khả năng ức chế chức năng của tế bào T từ người cho, chính những tế bào này nhận biết HLA của vật chủ Tế bào T điều hòa/ức chế có thể biến mất hoặc tần suất giảm đi trong kho dự trữ tế bào T của trẻ em và người lớn Những nghiên cứu trong tương lai về sự hồi phục miễn dịch của bệnh nhân những người tiếp nhận ghép MCR đã và đang được chứng minh

1.4 THU THẬP, XỬ LÝ VÀ LƯU TRỮ MCR

Với những hiểu biết ngày càng nhiều về thành phần cấu tạo MCR là nguồn tế bào gốc sống phong phú có thể thay thế cho tủy xương trong điều trị ghép, đã có nhiều ngân hàng MCR đã được thành lập trên toàn thế giới để cung cấp một số lượng lớn các mẫu MCR có chất lượng cao đến các trung tâm ghép Các ngân hàng MCR đầu tiên được thành lập vào năm 1990 ở New York, Milan, và Dusseldorf [27] Trung tâm ngân hàng máu New York, đứng đầu là tác giả Pablo Rubinstein [42], đã xây dựng các phương pháp chuẩn cho việc thu thập, xử lý và lưu trữ đông lạnh của các đơn vị MCR Hầu hết tất cả MCR đều có phân loại HLA A, B và DR; 76% các đơn vị có phân loại phân tử đối với lớp II, và 49% có phân loại phân tử lớp I [42] Vai trò chính yếu của ngân hàng MCR liên quan đến các quy trình sau:

(1) tổ chức tuyển mộ và chọn lựa các sản phụ đồng ý cho MCR;

(2) thu thập mẫu MCR;

(3) xử lý, đông lạnh;

(4) xét nghiệm và đánh giá chất lượng đơn vị sản phẩm MCR lưu trữ

1.4.1 TUYỂN MỘ VÀ CHỌN LỰA NGƯỜI CHO MCR

Bởi vì một đứa trẻ không thể viết bản cam kết, hầu hết những trung tâm yêu cầu người mẹ viết bản cam kết đồng ý cho thu thập và lưu trữ MCR [41], [42] Tuy nhiên, điều nầy vẫn chưa được thực hiện phổ biến rộng rãi Thực ra, nhau thai được xem là những chất thải, bình thường nó được vứt bỏ và như vậy nó là tài sản của bệnh viện, không thuộc về mẹ hoặc đứa trẻ Tiêu chuẩn hiệp hội ghép MCR của hoa kỳ (Foundation for the Accrediation of Cellular Therapy:

FAHCT) đòi hỏi phải có sự cam kết ưng thuận cho của người mẹ trong vòng 7 ngày sau khi sinh đứa trẻ [26],[42 ]û

Những tiêu chuẩn tầm soát người cho bao gồm: tình trạng sức khỏe tổng quát của người cho; đánh giá những yếu tố nguy cơ và sự tiếp xúc những tác nhân nhiễm trùng lan truyền theo đường máu, các chất dịch cơ thể và/hoặc các mô; bệnh sử nhận máu, các chất dịch cơ thể, các mô trước đó; sự hoàn thiện hệ miễn dịch và sự tiêm ngừa vaccine ở người cho Những tiến trình bổ sung để tầm soát người cho phải được áp dụng đối với người cho MCR, bởi vì sự truyền tác nhân nhiễm trùng qua nhau thai có thể xảy ra Đã có nhiều nghiên cứu về tuyển mộ và sàng lọc MCR trước khi thu thập với kết quả đáng quan tâm, một khảo sát tại Viện Trường Đại học LaFe (Valencia) của ngân hàng MCR cho thấy có 127 sản phụ (32.5%) loại bỏ trước khi thu thập, nguyên nhân chủ yếu là do yếu tố sản khoa và bệnh lý của mẹ [28 ]

Tiêu chuẩn NETCORD và FAHCT [83] đòi hỏi những mẫu xét nghiệm anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HTLV, HBsAg, anti-HBc, anti-HCV, anti-CMV và xét nghiệm huyết thanh giang mai phải được thực hiện ở người mẹ trước và trong 48 giờ thu thập MCR Phương pháp tiếp cận thích hợp để phát hiện sự hiện diện những bệnh bẩm sinh di truyền thì ít chắc chắn Việc theo dõi và đánh giá sức khỏe người cho (em bé) trưởng thành sau này (> 6 tháng) bình thường giúp cho phát hiện những bất thường về di truyền, bởi vì đã có đủ thời gian để cho những kiểu hình bất thường bẩm sinh biểu hiện ra [42] Mặc dù bệnh sử y khoa chi tiết của gia đình và cá nhân có thể biết được từ cha mẹ, nhưng sẽ không phát hiện được bất kỳ những đột biến ngẫu phát có thể xảy ra Xét nghiệm đơn vị MCR để phát hiện những bất thường về gien bệnh như thalassemia, bệnh hồng cầu hình liềm thì đơn giản và không đắt tiền Tuy nhiên, có thể sử dụng những

xét nghiệm đắt giá hơn như PCR để phát hiện các dấu ấn miễn dịch, nhiễm sắc thể nhằm phát hiện những bệnh nặng nhưng hiếm, như bệnh suy giảm miễn dịch và bệnh ứ đọng do rối loạn chuyển hóa vẫn còn đang tranh luận liên quan đáng kể đến giá cả, độ tin cậy và trách nhiệm trong những xét nhiệm nầy [41]

Việc lưu giữ hồ sơ người cho được xem là cách tiếp cận khá chắc chắn, đặc biệt là nếu MCR được giữ đông lạnh để sử dụng những năm sau đó Những xét nghiệm gien ở những người mẹ để phát hiện gien BRCA-1 và BRCA-2, là những gien được xem có liên quan đến bệnh ung thư vú, thì có nhiều vấn đề liên quan đến độ tin cậy của những xét nghiệm này cần phải có thêm sự tham khảo và sự ủng hộ Hồ sơ về sự thu thập MCR phải được giữ sao cho cập nhật, để người cho có thể được tiếp xúc và đánh giá lại trong từng trường hợp nếu có xảy ra sự truyền bệnh nhiễm trùng cho người nhận Cần phải có một chính sách thiết lập về sự liên hệ với người cho MCR và gia đình của họ là cần thiết để đảm bảo chắc chắn tính an toàn của đơn vị MCR ở tại thời điểm sử dụng để ghép Thí dụ, có thể đánh giá lại sức khỏe của đứa trẻ cho MCR ở thời điểm sử dụng đơn vị MCR đông lạnh Nếu đứa trẻ và gia đình không còn liên lạc theo dõi, khi đó một quyết định xem có nên sử dụng đơn vị máu đó hay không Một nghiên cứu khảo sát đánh giá trên 2.450 sản phụ và em bé 6 tháng sau khi cho MCR cho thấy những lý do mà người mẹ và em bé (131 trường hợp) không được đánh giá bao gồm: mất dấu 95 (70.4%), từ chối tham gia 26 (19.3%), không khả năng tham dự 14 (10.3%) và mẫu MCR của em bé thu được cho kết quả với tỉ lệ

4 trường hợp bất thường (0.17%): 1 trường hợp bẩm sinh đường tiết niệu; 1 trường hợp thiếu protein C; 1 trường hợp bệnh mucoviscidosic và 1 trường hợp bất thường nhiễm sắc thể 10q- [42 ]

 Các chống chỉ định lâm sàng lấy tế bào MCR [42]

- Tuổi thai dưới 37 tuần;

- Vỡ ối trên 24 giờ;

- Mẹ sốt cao trên 38oC;

- Cân nặng em bé lúc sanh ra dưới 2.600g

Người Bác sĩ có ý định thu thập MCR nên diễn giải đầy đủ cho người mẹ cho MCR về mục đích và tiến trình thu thập MCR, các yêu cầu xét nghiệm và thông báo kết quả xét nghiệm cho người mẹ, sau khi giải thích đầy đủ nên có giấy cam kết do người mẹ viết đồng ý cho MCR Giấy cam kết và nội dung cam kết được viết nên phù hợp theo những tiêu chuẩn thu thập MCR và theo đặc điểm riêng của mỗi địa phương, mỗi nước[42]

1.4.2 SỰ THU THẬP MCR

Một tổ chức ghép MCR quốc tế (International Cord Blood Transplantation Registry: ICBTR) đã được thành lập, vài trung tâm chuyên nghiệp cũng như một số các công ty tư nhân đã khai trương những ngân hàng MCR cho tự ghép hoặc

dị ghép Những phương pháp tối ưu để thu thập và điều chế MCR đã và đang được hoàn thiện và phát triển [5],[42]

Các phương pháp thu thập và chiết tách tế bào MCR thay đổi tùy theo các

Trung tâm và phương pháp tối ưu vẫn đang được nghiên cứu

1.4.2.1 HỆ THỐNG THU THẬP

Bao gồm 2 hệ thống chính:

- Hệ thống mở: cuống rốn được cắt và máu được chảy tự do vào bình chứa;

- Hệ thống kín: máu cuống được thu thập vào túi máu có chất chống đông Hệ thống kín được ưa thích hơn vì nguy cơ nhiễm trùng thấp hơn, theo Bertolini tỉ lệ nhiễm trùng ở hệ thống mở là 12,5% và hệ thống kín 3,3% [5],[41]

1.4.2.2 CÁC KỸ THUẬT THU THẬP MCR

MCR có thể thu thập hoặc trong tử cung, trước khi xổ nhau; hoặc ngoài tử cung, sau khi xổ nhau Thu thập trong tử cung thường được thực hiện bởi bác sĩ sản khoa hoặc do điều dưỡng hộ sinh trong lúc chuyển dạ, khi đã được huấn luyện bởi các nhân viên của ngân hàng MCR Thu thập sau khi xổ nhau được thực hiện bên ngoài phòng sanh và bởi kỹ thuật viên ngân hàng MCR Ngân hàng MCR Bệnh viện St Louis sử dụng mạng lưới thu thập MCR chủ yếu dựa trên các nhân viên sản khoa, điều này cũng tương tự ở ngân hàng MCR ở Tokyo, có trên 200 bác sĩ sản khoa tham dự và 40 đơn vị sản khoa khác nhau [42] Ngược lại, có 3 ngân hàng MCR được tài trợ bởi Viện Tim, Phổi và Máu quốc gia Hoa Kỳ và chương trình nghiên cứu ghép MCR sử dụng các kỹ thuật viên được huấn luyện để thu thập MCR sau khi xổ nhau [42] Nhìn chung, thu thập ngoài tử cung ít ảnh hưởng đến sản phụ và thai nhi, và có thể kiểm soát tốt hơn toàn bộ kỹ thuật, nhưng với phương này tốn nhiều chí phí hơn bởi vì cần phải có thêm người tham gia Cho đến nay chưa có báo cáo nào về những bất lợi trầm trọng trong cả hai phương pháp thu thập trong và ngoài tử cung Vì MCR được thu thập khi thai nhi đã được sanh ra và sau khi kẹp cuống nhau, nên việc thu thập MCR không ảnh hưởng tức thời nào lên trẻ sơ sinh Nhưng người ta đặt ra vấn đề giảm khối lượng máu đến trẻ sơ sinh, do kẹp mạch máu rốn sớm cần thiết để có đủ số lượng MCR thu thập Tuy nhiên người ta không nhận thấy một ảnh hưởng quan trọng nào trên trẻ em sanh đủ tháng Trong một công trình nghiên cứu, cuống rốn được kẹp trong vòng 30 giây sau khi sanh, trị số hemoglobin là 12g/dl thấp hơn là khi kẹp trễ, nhưng không ảnh hưởng lên nồng độ bilirubin, lên thời gian nằm viện Tuy nhiên nếu thai nhi chưa đủ tháng thì có nhu cầu tăng khối lượng máu bằng cách kẹp cuống rốn trễ hơn là cần thiết Trong một công trình khác, người ta kẹp cuống rốn trễ 30 giây và giữ vị trí thai nhi 20 cm thấp hơn xương chậu của mẹ thì nhận thấy khối lượng máu của trẻ sơ

sinh cao hơn, áp lực oxy ở động mạch phổi cao hơn, hai vấn đề này liên hệ đến cải thiện tương lai lâm sàng của trẻ, giảm nhu cầu hổ trợ bằng oxy và nhu cầu truyền máu

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước khảo sát về quy trình thu thập MCR với mục tiêu thu được thể tích MCR lớn nhất, không ảnh hưởng đến sản phụ, em bé và tránh lây nhiễm tối đa

Từ năm 1997 tại Trung Tâm Truyền máu Huyết học, Trần Văn Bé và cs [4], [5], [7],[9],[12] đã tiến hành thu thập MCR sau xổ nhau của sản phụ với kết quả đáng khích lệ: thể tích MCR trung bình 59 ml, không có tai biến xãy ra trên sản phụ , em bé và tỉ lệ lây nhiễm khuẩn sau thu thập thấp 5.9%

Ở nước ngoài đã có nhiều Trung tâm Ngân hàng MCR đã thiết lập hoàn chỉnh quy trình thu thập tùy theo điều kiện có được của từng đơn vị cơ sở thu thập Các báo cáo đáng tin cậy [27], [28], [30] ,[42] cho thấy có sự liên quan có

ý nghĩa thống kê giữa các yếu tố sản khoa bao gồm: tuổi sản phụ, tuổi thai, trọng lượng thai, trọng lượng nhau, chiều dài dây MCR,… Với thể tích mẫu MCR thu thập với các hệ số tương quan khác nhau Bên cạnh đó, một số các nghiên cứu đã chứng minh có sự khác biệt về thể tích MCR sau khi thu thập trước xổ nhau cao hơn sau khi xổ nhau (p<0,05), nhưng nguy cơ nhiễm trùng thì lại cao hơn (p<0.05) [53], [71]

1.5 KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU MCR

 Mẫu MCR được xử lý với các mục đích sau [5], [42]:

- Làm giảm thể tích MCR để việc giữ đông trong khoảng thời gian dài thuận lợi và giảm chi phí lưu trữ mà không làm mất đáng kể tế bào CD34+

- Ngăn ngừa sự tiêu huyết cấp hồng cầu của mẫu MCR trong trường hợp bất đồng nhóm máu giữa người nhận và hồng cầu mẫu MCR

- Để phục hồi tế bào sống tốt hơn sau khi giải đông

1.5.1 CÁC KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH

Có nhiều kỹ thuật chiết tách đã được mô tả để làm giảm thể tích thu thập và loại bỏ hồng cầu của mẫu MCR trước khi lưu trữ bao gồm 5 phương pháp sau:

- Phương pháp ly tâm theo sự khác biệt tỉ trọng đơn thuần “ Top and Bottom Method” [104] hoặc với Ficoll Hypaque [84], [99]

- Phương pháp tiêu hồng cầu với dung dịch Amonium chloride [111]

- Phương pháp bằng bộ lọc [47],[126]

- Phương pháp làm kết lắng hồng cầu với sự có mặt của Hydroxyethyl starch (HES) [99], Gelatin [105], Pentastarch [124],Dextran, Methylcellulose, Polygeline [52]

- Phương pháp chọn lọc dương tính cho những tế bào trình diện kháng nguyên CD 34+[5]

Broxmeyer và cs đã chứng minh sự mất tế bào gốc đáng kể trong phương pháp quay ly tâm theo tỉ trọng [41] Điều nầy phần nào liên hệ đến sự trì hoãn giữa quá trình thu thập và điều chế Theo Bertolini và cs [42] quan sát thấy rằng hiệu quả của kỹ thuật tách tế bào bằng ficoll và percoll làm giảm đáng kể khi MCR được lưu giữ hơn 12 giờ trước khi tách, điều này gợi ý rằng sự ly tâm theo

tỉ trọng có thể thích hợp chỉ khi được thực hiện sớm MCR (tươi) hãy còn chưa lưu trữ Sự chọn lọc dương tính đặc biệt hữu ích khi nó được xem là bước ban đầu trước khi nhân tế bào lên trong phòng thí nghiệm hoặc ghép gien [5]

Hầu hết các phòng xử lý MCR trên thế giới đều dựa trên phương pháp được xây dựng bởi Rubinstein và cs, nguyên tắc của phương pháp là loại bỏ hồng cầu bằng chất HES theo sau bởi bước tập trung bạch cầu Phương pháp này tối ưu hóa khoảng trống lưu trữ và hạn chế thấp nhất các biến chứng khi

truyền MCR với thể tích của DMSO và hồng cầu Kỹ thuật xử lý MCR bao gồm các bước sau :

- Thể tích MCR thu thập và chất HES theo tỉ lệ 1:5 (túi số 1)

- Quay ly tâm hổn hợp với tốc độ 90 x g trong 6 phút

- Ép lấy huyết tương giàu bạch cầu vào túi thứ 2

- Quay ly tâm túi huyết tương giàu bạch cầu với tốc độ 450 x g trong 10

phút

- Ép huyết tương nghèo bạch cầu vào túi thứ 3

- Dự trữ đông lạnh phần giàu bạch cầu còn lại ( thể tích xấp xỉ 20-23ml) với chất bảo quản 10% DMSO và 1% dextran 40)

Quy trình xử lý và chiết tách tế bào gốc từ MCR cần phải đảm bảo nguyên tắc vô trùng, người thực hiện công tác này phải lành nghề, thao tác từng bước, chính xác và cẩn thận để đạt hiệu quả cao nhất Mỗi trung tâm ghép, tùy theo hoàn cảnh và điều kiện để quyết định cho sự lựa chọn quy trình chiết tách tế bào gốc, quy trình này phải được tuân thủ chặt chẽ và có kiểm soát [5],[42]

Bảng 1.3: So sánh kết quả loại bỏ hồng cầu và sự thu hồi tế bào nhân, tế bào CD34+ sau xử lý của các các phương pháp khác nhau [26]

thu hồi

TB CD34+(%) thu hồi

Loại bỏ hồng cầu (%)

Bên cạnh đó một số tác giả đã nghiên cứu các phương pháp xử lý tế bào khác bằng kỹ thuật bán tự động hay tự động để thay thế cho kỹ thuật bằng tay và nhằm hạn chế sự lây nhiễm trong tiến trình xử lý

Chúng tôi xin trình bày một số các phương pháp mới đang sử dụng tại các ngân hàng MCR trên thế giới ở các nước tiên tiến [111]:

1.5.2 MỘT SỐ CÁC KỸTHUẬT MỚI CHIẾT TÁCH TẾ BÀO [111]:

(1) Máy tự động Sepax

Hình 1.1 : Máy tự động Sepax

“ Nguồn: Takahashi T (2006) “[111],[127]

Bảng 1.4: Kết quả so sánh tỉ lệ % phục hồi giữa Sepax và HES [111]

Phương pháp MNC CD34 CFU RBC Plt

Sepax 76.4 82.2 93.3 49.3 33.7

HES 75.9 89.7 100.4 46.4 22.3