Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất vắc xin thương hàn vi polysaccharide ở việt nam

Từ những năm 1980, cùng với những tiến bộ trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide bề mặt của vi khuẩn có vỏ và đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B và T đã tạo cơ sở cho việc nghiên cứ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phản biện 3: TS Nguyễn Đức Hoàng

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Đinh Nga

Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Đăng Quân

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS ĐÀO XUÂN VINH

2 PGS TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Thành phố

Hồ Chí Minh và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến

PGS TS Đào Xuân Vinh, Giám đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt

PGS TS Phạm Thị Ánh Hồng, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cám ơn

GS TS Trần Linh Thước, Hiệu trưởng

PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, Trưởng phòng Đào tạo sau đại học

Chị Trần Thị Phượng Giang, Phòng Đào tạo sau đại học

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Thành phố Hồ Chí Minh

là những người thầy đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án và mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cám ơn

Cố GS TSKH Đặng Đức Trạch, nguyên Chủ nhiệm Chương trình Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia, Viện phó Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội

Dr John B Robbins và Dr Shousun C Szu, Viện Y tế Quốc gia Mỹ

TS Lê Văn Bé, Viện trưởng

GS TS Nguyễn Thị Kê, nguyên Viện trưởng Viện Vắc xin và Sinh phẩm

Đà Lạt; các anh chị đồng nghiệp thuộc Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang

đã nhiệt tình giúp tôi hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu

Tôi biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn động viên, hỗ trợ, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho tôi được yên tâm học tập và nghiên cứu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do chính tôi thực hiện Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong công trình nghiên cứu khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Tác giả

Đào Thị Vi Hòa

1.1 Tình hình dịch tễ bệnh Thương hàn trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.4.2.1 Các gen mã hóa độc lực ở S Typhi (đảo gây bệnh 7 (SPI-7), locus

viaA và locus viaB)

18

1.4.3 Đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên Vi PS 21 1.4.3.1 Bản chất khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên Vi PS 21 1.4.3.2 Cơ chế đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên PS 22

1.5.2.2 Vắc xin Thương hàn sống giảm độc lực 25

1.6.1 Tình hình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS trên thế giới 29 1.6.1.1 Phương pháp điều chế kháng nguyên Thương hàn Vi PS trong

điều kiện làm biến tính

29

1.6.1.2 Phương pháp điều chế kháng nguyên Thương hàn Vi PS trong

điều kiện không biến tính

31

1.6.2 Sản xuất vắc xin Thương hàn tại Việt Nam 34

2.2.2 Kiểm tra chủng giống Thương hàn S Typhi Ty2 44 2.2.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít và 75 lít 44 2.2.3.1 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít 44

2.2.3.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 75 lít 45 2.2.4 Đánh giá vắc xin Thương hàn Vi PS trên thực địa 45 2.2.5 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất ở quy mô nồi lên men

300 lít

47

2.2.5.1 Khảo sát các thông số nuôi cấy vi khuẩn Thương hàn S Typhi Ty2

ở nồi lên men 300 lít

2.5 Hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS ở

quy mô nồi lên men 300 lít

59

2.6 Sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS theo thông số đã chọn và

khảo sát tính ổn định của quy trình sản xuất

2.10 Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS ở

quy mô nồi lên men 300 lít

62

3.1 Kết quả kiểm tra chủng giống Thương hàn S Typhi Ty2 65

3.1.1 Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn và tính chất nuôi cấy 65

3.1.3 Kết quả kiểm tra khả năng ngưng kết với huyết thanh 68

3.2 Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít và 75 lít 70

3.2.1 Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít 70 3.2.2 Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 75 lít 70

3.4 Kết quả khảo sát các thông số nuôi cấy vi khuẩn Thương hàn

S Typhi Ty2 ở nồi lên men 300 lít

76

3.4.5 Kết quả khảo sát các thông số bất hoạt 85 3.4.6 Hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS ở nồi lên

men 300 lít

88

3.5 Kết quả sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS ở nồi lên men

3.5.3 Kết quả đánh giá chất lượng vắc xin Thương hàn Vi PS 91 3.5.4 Kết quả số lượng kháng nguyên Vi PS và sản lượng vắc xin 94 3.5.5 Khảo sát tính ổn định của quy trình sản xuất 94

3.7 Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thương hàn Vi PS 101 3.7.1 Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thương hàn Vi PS ở nhiệt độ

3.8.1 Cung cấp vắc xin Thương hàn Vi PS cho Chương trình TCMR

PHỤ LỤC

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

CD Cluster of differentiation Cụm biệt hóa

CDC Center for Disease Control and

DOMI Diseases of the Most Impoverished Chương trình phòng bệnh

cho những nước nghèo nhất

MLNs Mesenteric lymph nodes Hạch bạch huyết mạc treo

ruột NAD+ -nicotinamide adenine dinucleotide

NADP -nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate NIH National Institute of Heath - USA Viện y tế quốc gia Mỹ NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PS Polysaccharide

SAGE Strategic Advisory Group of Experts Nhóm chuyên gia tư vấn

chiến lược SPI-7 Salmonella pathogenicity island 7 Đảo gây bệnh 7

TFF Tangential Flow Filtration Hệ thống lọc dòng chảy

tiếp tuyến TAB Typhoid – paratyphoid A and B Thương hàn – phó thương

hàn A và B TACI Transmembrane activator and calcium

modulating cyclophilin ligand interactor

Phối tử cyclophilin điều chỉnh canxi

WHO World Health Organizationn Tổ chức y tế thế giới

(TCYTTG)

TNF- Tumour-necrosis factor- Yếu tố u bướu – hoại tử

cytokine tiền viêm tviB UDP-N-acetylglucosamine 6-

dehydrogenase tviC UDP-N-acetylglucosaminuronic acid

viaA

viaB

Gen điều hòa tổng hợp kháng nguyên Vi PS Gen sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS

vvm Volume/volume/minute Thể tích/thể tích/phút WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

(TCYTTG)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang

1.1 Tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003) 7

1.3 Hiệu quả bảo vệ của vắc xin Thương hàn Vi PS 28

2.2 Số lượng người lớn và trẻ em được tiêm vắc xin Thương hàn Vi PS 45

2.5 Khảo sát tính ổn định của vắc xin Thương hàn Vi PS 60

3.1 Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn và tính chất nuôi cấy 65

3.3 Kết quả xác định khả năng ngưng kết với kháng huyết thanh 69

3.8 Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin Thương hàn Vi PS sản xuất từ

nồi lên men 75 lít

3.11 Biến đổi nồng độ kháng thể và tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm

3.14 Kết quả khảo sát mức độ oxy hòa tan khác nhau 80

3.16 Giá trị OD trung bình theo thời gian nuôi cấy 84

3.17 Kết quả khảo sát bất hoạt vi khuẩn Thương hàn S Typhi Ty2 84 3.18 Thông số nuôi cấy ở nồi lên men 300 lít đã chọn 87

3.19 Thông số bất hoạt vi khuẩn Thương hàn S Typhi Ty2 đã chọn 88

3.21 Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên Vi PS 90

3.22 Kết quả bất hoạt vi khuẩn Thương hàn S Typhi Ty2 91 3.23 Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin Thương hàn Vi PS 92 3.24 So sánh chất lượng vắc xin Thương hàn Vi PS của DAVAC và Sanofi

Aventis

93

3.25 Số lượng kháng nguyên Vi PS và sản lượng liều vắc xin 94

3.26 Kết quả kiểm tra tính ổn định của vắc xin Thương hàn Vi PS ở nhiệt

1.4 Quá trình nhiễm vi khuẩn Thương hàn S Typhi ở người 9

1.6 Các kháng nguyên của vi khuẩn Thương hàn S Typhi 12 1.7 Cấu trúc kháng nguyên O của vi khuẩn Thương hàn S Typhi 12

1.12 Các gen mã hóa độc lực ở S Typhi (đảo gây bệnh 7 của Salmonella

(SPI-7) và locus viaB ở S Typhi)

19

1.13 Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS ở vi khuẩn Thương hàn S Typhi 21 1.14 Kháng nguyên PS không phụ thuộc tế bào T typ 2 (TI-2) 22 1.15 Đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên polysaccharide 23 2.1 Hệ thống nồi lên men 300 lít (Chemap – Thụy Sĩ) 49 2.2 Sơ đồ tách lọc canh khuẩn và cô đặc kháng nguyên Vi PS thô bằng

TFF

52

2.3 Sơ đồ phản ứng tủa giữa Cetavlon và kháng nguyên Vi PS thô 53 2.4 Hệ thống lọc tiếp tuyến TFF – Sartorius (Đức) 54 2.5 Sơ đồ phản ứng tách kháng nguyên Vi PS khỏi tủa Vi PS thô-Cetavlon

3.1 Vi khuẩn thương hàn S Typhi Ty2 66

3.2 Khuẩn lạc của vi khuẩn S Typhi Ty2 trên môi trường thạch TSB 66

3.3 Thử nghiệm đặc tính sinh hóa của chủng S Typhi Ty2 68

3.4 Halo bao quanh khuẩn lạc của vi khuẩn S Typhi Ty2 trên thạch TSB –

kháng huyết thanh Vi

69

3.5 Nuôi cấy S Typhi Ty2 với các tỷ lệ giống khác nhau 77

3.6 Kết quả nuôi cấy S Typhi Ty2 ở 3 mức oxy hòa tan khác nhau 80

3.7 Mối liên quan giữa pH, đậm độ vi khuẩn và hàm lượng Vi PS 83

3.8 Đồ thị biểu diễn tương quan giá trị OD theo thời gian nuôi cấy 85

3.9 So sánh chất lượng kháng nguyên Vi PS của DAVAC và Sanofi

3.19 Tính ổn định của sản lượng vắc xin Thương hàn Vi PS 98

3.21 Số lượng vắc xin Thương hàn Vi PS được cung cấp cho Chương trình

Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia

104

MỞ ĐẦU

Thương hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi khuẩn Salmonella enterica

serotype Typhi gây ra Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh Thương hàn ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết đáng kể ở nhiều quốc gia đang phát triển, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê, bệnh Thương hàn xảy ra ở một số tỉnh miền núi phía Bắc và phần lớn ở các tỉnh phía Nam Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn Thương hàn đề kháng ngay cả kháng sinh thuộc thế hệ thứ ba như fluoroquinolones và cephalosporins dẫn đến việc điều trị và kiểm soát bệnh Thương hàn ngày càng trở nên khó khăn [32,41,44,64]

Từ những năm 1980, cùng với những tiến bộ trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide bề mặt của vi khuẩn có vỏ và đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho

B và T đã tạo cơ sở cho việc nghiên cứu polysaccharide làm vắc xin, chống lại các tác nhân gây bệnh có thành phần polysaccharide vỏ [56,103 Vắc xin Thương hàn

Vi polysaccharide (PS) với một mũi tiêm duy nhất chứa 25 g kháng nguyên Vi PS,

là loại vắc xin chỉ sử dụng kháng nguyên vỏ - polysaccharide của vi khuẩn để tạo đáp ứng miễn dịch, không chứa toàn bộ tế bào của vi khuẩn và do vậy không tái sinh sản trong cơ thể nhận Vắc xin dễ dung nạp, tính an toàn cao và không có phản ứng phụ nghiêm trọng, cho hiệu quả bảo vệ 64% đến 72% [32,48]

Tại Việt Nam, vắc xin thế hệ cũ như vắc xin Thương hàn bất hoạt toàn tế bào cho bảo vệ 51 – 67% nhưng có tỷ lệ phản ứng phụ cao từ 9 – 34% ở người nhận và phải dùng nhiều liều Vắc xin Thương hàn sống, giảm độc lực Ty21a có hiệu quả bảo vệ 65% nhưng khó áp dụng rộng rãi do phải dùng nhiều liều, thiếu kháng nguyên Vi PS và vi khuẩn có khả năng hồi biến gây ảnh hưởng đến chất lượng vắc xin [9,10,48,109]

Việc phát triển vắc xin Thương hàn Vi PS - một vắc xin phòng bệnh Thương hàn thế hệ mới phù hợp với điều kiện của Việt Nam là cần thiết Hơn nữa, sử dụng vắc xin sẽ mang lại lợi ích trong việc bảo vệ sức khỏe cho người dân đối với bệnh Thương hàn, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cũng như gánh nặng về kinh tế

do bệnh Thương hàn gây ra ở những vùng dịch lưu hành [44,50] Từ năm 1997, Bộ

Y tế phải nhập vắc xin Thương hàn Vi PS (TYPHIM Vi) của Pháp để cung cấp cho Chương trình Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia Để đáp ứng nhu cầu sử dụng và giảm giá thành vắc xin Thương hàn, Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt – DAVAC (trước đây là Viện vắc xin cơ sở 2 Đà Lạt thuộc Viện vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang – IVAC) tiếp nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS từ Viện Y tế Quốc gia Mỹ Từ đó, chúng tôi nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mới để sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS tại Việt Nam

Xuất phát từ ý nghĩa và yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi

polysaccharide ở Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài:

- Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi polysaccharide bằng phương pháp lên men đạt tiêu chuẩn chất lượng của Dược điển châu Âu và quy định của TCYTTG

Nội dung nghiên cứu:

- Sản xuất thử nghiệm vắc xin Thương hàn Vi PS ở nồi lên men 7 lít và 75 lít

- Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi PS:

+ Xác định các thông số kỹ thuật thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Thương

hàn Salmonella Typhi Ty2 ở nồi lên men 300 lít: Tốc độ khuấy, tốc độ sục khí,

nhiệt độ, tỷ lệ giống, OD, pH, oxy hòa tan, thời gian gặt

+ Xác định các thông số bất hoạt thích hợp cho vi khuẩn Thương hàn khi nuôi cấy ở nồi lên men 300 lít

+ Đánh giá chất lượng vắc xin Thương hàn Vi PS được sản xuất theo quy trình sản xuất đã xây dựng

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình dịch tễ bệnh Thương hàn trên thế giới và ở Việt Nam

Theo thống kê của TCYTTG, hàng năm có 21,6 triệu người mắc và 216.500 người chết do bệnh Thương hàn ở tất cả lứa tuổi trên toàn cầu, chủ yếu ở các nước đang phát triển thuộc châu Á, Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ Trong đó, 75%

số người mắc Thương hàn ở các nước thuộc châu Á và có 90% trường hợp tử vong, chủ yếu ở vùng Nam và Đông Nam Á (Hình 1.1) [43,44,110] Hầu hết tỷ lệ mắc Thương hàn cao nhất ở lứa tuổi trước khi đến trường và thanh thiếu niên, phổ biến

từ 5 – 19 tuổi [40,86]

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc Thương hàn hàng năm trên thế giới và ở Việt Nam

từ 1999 – 2003 (WHO) [43,44]

Ở các nước châu Á, theo số liệu của chương trình DOMI dưới sự tài trợ của

“Quỹ Bill & Melinda Gates” tại 5 nước Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Inđonesia,

Pakistan tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn từ 180 trường hợp/100.000 dân đến 494 trường hợp/100.000 dân ở lứa tuổi 5 – 15 [44,71] Ở lứa tuổi 1 đến 5 và người trung niên

có tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn nhất định và trẻ dưới 1 tuổi thì thường có triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng hơn (Hình 1.2) [64,81]

Hình 1.2 Sự phân bố mắc bệnh Thương hàn theo lứa tuổi [41]

Ở Việt Nam, bệnh Thương hàn thường gặp ở các tỉnh phía Nam đặc biệt là ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long như Sóc Trăng, Đồng Tháp, An Giang, Kiên Giang và ở một số tỉnh ở miền núi phía Bắc như Sơn La, Lai Châu, Điện Biên Việt Nam thuộc khu vực có tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn 100/100.000 dân (Hình 1.1 và Bảng 1.1) Từ những năm 90, bệnh dịch có chiều hướng gia tăng thành ổ dịch lan rộng toàn quốc, đặc biệt ở các tỉnh phía Nam tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn năm 1990

là 4.859 trường hợp và đến năm 1995 là 30.901 trường hợp (tăng 6 lần), với lứa tuổi mắc bệnh Thương hàn chủ yếu từ 5 đến 9 tuổi [38,64] Theo số liệu thống kê từ

1999 – 2003, tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn ở lứa tuổi từ 5 – 14 ở 7 tỉnh với tỷ lệ mắc cao  100 trường hợp/100.000 dân và 23 tỉnh có tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn trung bình là 10 – 100 trường hợp/100.000 dân (Hình 1.2 và Bảng 1.1) [43,73]

Bảng 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh Thương hàn ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003) [33]

Các tỉnh có tỷ lệ mắc trung bình hàng năm 100 trường hợp

/100000 dân ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003)

Số lượng mắc (trường hợp)

Ở Việt Nam, khoảng 89% đến 93% chủng Thương hàn đề kháng với kháng sinh thế hệ thứ nhất như chloramphenicol, trimethoprim, ampicillin và tetracycline, 4% chủng đề kháng với acid nalidixic (1 quinolone) Hơn 80% chủng Thương hàn phân lập từ các vụ dịch ở đồng bằng sông Cửu Long đề kháng với ampicillin, chloramphenicol, nalidixic hoặc ciprofloxacin Năm 1995, hơn 90% chủng phân lập

từ máu đề kháng kháng sinh và những chủng này ngày càng trở nên độc hơn (Hình 1.3) [32,51,73]

Bên cạnh đó, trẻ em chiếm gần một nửa tổng số các trường hợp bị đa kháng thuốc, dễ bị sốt Thương hàn và đa số bị các biến chứng Do sự đề kháng với kháng sinh phổ biến nên việc tiêm chủng là lựa chọn duy nhất và khả thi để phòng bệnh và kiểm soát bệnh Thương hàn [32]

Hình 1.3 Việt Nam trong phân bố toàn cầu về đề kháng kháng sinh của

Salmonella enterica Serotype Typhi từ 1990 đến 2004 [32,73]

Vi khuẩn Thương hàn S Typhi xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa qua

thức ăn và nước uống bị nhiễm Trong vòng 1 hoặc 2 tuần đầu tiên chưa có triệu chứng Giai đoạn đầu, phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt bởi môi trường axit của dịch vị

dạ dày ( 1,5) Những vi khuẩn sống sót xuống ruột non, xâm nhập tế bào M (tế bào biểu mô chuyên biệt), tế bào ruột qua mảng Peyer, tế bào có tua tại bề mặt niêm

mạc ruột, hạch bạch huyết mạc treo ruột (MLNs) và máu đến tế bào lưới nội mô của gan, lách, tủy xương và túi mật Vi khuẩn tồn tại và nhân lên ở đây rồi lan tỏa, gây nhiễm trùng toàn thân (số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh là từ 105 đến 107)

[4,5,26,34,69]

Hình 1.4 Quá trình nhiễm vi khuẩn Thương hàn S Typhi ở người [69]

Sau khi gây nhiễm, vi khuẩn định vị ở những bạch cầu bị viêm và mạc treo ruột Vi khuẩn theo đường gan, mật tiếp tục xâm nhập ruột non, nhân lên ở các mảng Peyer Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác để sinh trưởng và phát tán vào những tế bào không nhiễm, tạo thương tổn mới Tại ruột, vi khuẩn chết và giải phóng nội độc tố Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây hoại tử, thủng ruột, tổn thương mảng Peyer và theo máu kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba gây phát bệnh toàn thân Bệnh Thương hàn gây nhiễm trùng máu cùng với sốt và nhiều biến chứng dẫn đến tử vong với tỷ lệ 7 – 14% (Hình 1.4) [4,5,26,34,69]

1.3 Vi khuẩn Thương hàn

Vi khuẩn Thương hàn thuộc họ đường ruột Enterobacteriaceae,

Salmonella enterica subspecies Enterica serotype Typhi (trước đây được gọi là

Bacillus typhosus, Ebethella typhosa và Salmonella typhosa) Ngày nay, vi khuẩn

Thương hàn có tên khoa học là Salmonella enterica serovar Typhi (S Typhi)

[50,82]

1.3.1 Hình thái vi khuẩn

Vi khuẩn Thương hàn S Typhi là trực khuẩn Gram âm, bắt màu 2 đầu đậm,

có kích thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 – 1 µm và di động nhờ có tiên mao bao

quanh thân Có thể phân biệt với loài Salmonella khác bằng sự lên men và những

phản ứng trao đổi chất khác cũng như dựa trên 3 loại cấu trúc kháng nguyên bề mặt

(Hình 1.5) [19,49]

Hình 1.5 Vi khuẩn Thương hàn S Typhi (Độ phóng đại 2450 lần) [114]

1.3.2 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn Thương hàn S Typhi là vi khuẩn hiếu khí tùy ý, mọc dễ dàng trên

các môi trường thông thường có pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 đến

9 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, có thể phát triển được ở nhiệt độ

6oC – 42oC Trên môi trường thích hợp, sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung

bình 2 – 4 mm [5,19,22]

Trong môi trường lỏng, sau 5 – 6 giờ nuôi cấy vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làm đục đều môi trường [26]

Trên môi trường thạch: Vi khuẩn mọc và có thể tạo thành 3 loại khuẩn lạc:

- Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Là những khuẩn lạc nhẵn, tròn, lồi, trong, bóng và

ẩm, ở giữa thường đục hơn xung quanh và khuẩn lạc tan đều trong nước muối sinh

lý Khuẩn lạc dạng S được giữ lâu trong phòng thí nghiệm sẽ chuyển thành dạng R [5,26]

- Khuẩn lạc dạng R (Rough): Là những khuẩn lạc xù xì, không đều, mặt dẹp, khô Trong môi trường mọc thành từng tảng và rơi dần xuống đáy ống nghiệm với nước trong ở phía trên Khuẩn lạc dạng R không tan đều trong nước muối sinh lý mà kết dính thành từng cụm, tảng và không dùng trong ngưng kết huyết thanh [19,26]

- Khuẩn lạc dạng M (Mucin): Là dạng khuẩn lạc trung gian giữa dạng S và dạng R Khuẩn lạc nhầy, có bờ ít đều và ít bóng Khi hòa tan vào nước muối sinh lý cho kết tủa dẻo, quánh [19,26]

Vi khuẩn có khuẩn lạc dạng R, M thường xuất hiện trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy không thích hợp [19,26]

1.3.3 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn Thương hàn S Typhi lên men đường glucose nhưng không sinh

hơi, lên men đường mantose, manitol, sorbitol…Không lên men đường lactose, salicin, saccharose, arabinose, sucrose… Không sinh indol từ tryphtophan, urease

âm tính, oxydase âm tính, sinh H2S không nhiều, không sử dụng citrate [22,26]

1.3.4 Kháng nguyên

Vi khuẩn Thương hàn S Typhi có 3 loại kháng nguyên là kháng nguyên O

(kháng nguyên thân), kháng nguyên H (kháng nguyên lông) và kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt) (Hình 1.6 và Bảng 1.2) [49,50]

Hình 1.6 Các kháng nguyên của vi khuẩn Thương hàn S Typhi [49]

1.3.4.1 Kháng nguyên O (Ohne)

Kháng nguyên O là kháng nguyên thân có bản chất lipopolysaccharide và mang tính chất đặc hiệu nhóm Tính chất chuyên hóa dựa trên cấu trúc của đường trong thành phần PS của lipopolysaccharide thành tế bào Phần lipid có tính độc, phần đa đường có tính kháng nguyên cao (Hình 1.7)

Hình 1.7 Kháng nguyên O [105]

Kháng nguyên O là nội độc tố của S Typhi và chỉ có ở những chủng có

khuẩn lạc dạng S, chủng có khuẩn lạc dạng R thiếu kháng nguyên này nên tính độc kém hơn Kháng nguyên O chịu nhiệt ở 100o

C/2 giờ, không bị cồn và phenol phá hỏng Điều chế kháng nguyên O bằng cách dùng nhiệt hay cồn để phá hủy kháng nguyên H Khi ngưng kết với kháng huyết thanh O tạo ngưng kết là những cụm kết dính nhỏ li ti, khó tan, khó rời ra khi lắc mạnh Kháng nguyên O tạo kháng thể O

thuộc lớp IgM và ức chế sự thực bào của vi khuẩn Có gần 70 yếu tố kháng nguyên

O khác nhau Mỗi nhóm mang một yếu tố kháng nguyên đặc hiệu nhóm Mỗi typ

huyết thanh mang một số đặc tính cấu trúc PS khác nhau [2,4,47,49]

1.3.4.2 Kháng nguyên H [Hauch]

Kháng nguyên H là kháng nguyên lông (flagella), bản chất là protein Kháng nguyên H cấu tạo bởi 14 loại acid amin khác nhau (không chứa tryptophan, histidin, cystein) và một loại axit amin mới là N – metyl-lysine Kháng nguyên H dễ bị hủy bởi nhiệt và cồn, chịu được formol 5% Kháng nguyên H chia làm 2 pha: pha 1 đặc

hiệu, pha 2 không đặc hiệu Thông thường chủng Salmonella có 2 pha này nhưng riêng S Typhi và Paratyphi A chỉ có 1 pha Kháng nguyên H tạo kháng thể H thuộc

lớp IgG Sự ngưng kết dưới dạng bong, dễ rã khi lắc mạnh Kháng nguyên H không liên quan đến tính độc nên không có tác dụng gây bệnh, nhưng đặc hiệu cho mỗi typ

vi khuẩn [2,19,26,49]

Dựa vào sự khác nhau của kháng nguyên O và H, Kaufman và White chia

Salmonella thành gần 50 nhóm và 1.200 typ huyết thanh Kháng nguyên O và H

được sử dụng trong chẩn đoán xét nghiệm huyết thanh theo phương pháp Widal

[2,19,22]

1.3.4.3 Kháng nguyên Vi (Virulence)

Kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bản chất là polysaccharide (PS), ở

ngoài cùng tế bào, bao xung quanh kháng nguyên O Kháng nguyên Vi PS là một

chuỗi chất đồng trùng hợp, mạch thẳng 1-4 N-acetyl –α-D acid galactosaminuronic (Hình 1.8) Muốn ngưng kết kháng nguyên O phải hủy kháng nguyên Vi PS bằng đun nóng 100o

C/20 phút Hiện tượng ngưng kết xuất hiện chậm và hạt nhỏ

Tùy mức độ kháng nguyên Vi PS nhiều hay ít mà vi khuẩn có kháng nguyên

O và kháng nguyên Vi PS ở dạng sau:

- Dạng V: Khi vi khuẩn có nhiều kháng nguyên Vi PS, chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh Vi

- Dạng W: Khi vi khuẩn không có kháng nguyên Vi PS, chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O

- Dạng VW: Khi vi khuẩn có ít kháng nguyên Vi PS, ngưng kết với cả 2 loại kháng huyết thanh [19,49]

Hình 1.8 Kháng nguyên Vi PS [105]

Chủng Thương hàn S Typhi mới phân lập thường có tỷ lệ kháng nguyên Vi

PS dương tính với hàm lượng cao nhưng không ổn định Theo Felex (1984), 84

trong số 86 mẫu S Typhi phân lập từ máu bệnh nhân đều có kháng nguyên Vi PS

Những chủng phân lập từ máu và tủy xương của những bệnh nhân Thương hàn cấp tính đều có kháng nguyên Vi PS [3,10,78] Những chủng không có kháng nguyên

Vi PS thì sự nhiễm bệnh thấp hơn chủng có kháng nguyên Vi PS, do kháng nguyên này là yếu tố độc và số lượng cần để gây bệnh không nhiều [34,78]

Bảng 1.2 Các chủng vi khuẩn có kháng nguyên Vi PS [19,22]

Vi khuẩn Kháng nguyên O

Kháng nguyên H Pha 1 Pha 2

Salmonella Dublin 1,9,12,Vi g,p

Đối với S Typhi, lượng kháng nguyên Vi PS bị giảm khi cấy chuyền nhiều

lần trên môi trường thạch: Một mẫu phân lập từ máu cấy truyền từ 7 – 8 lần trước khi thí nghiệm cho biểu hiện kháng nguyên Vi PS âm tính [34,78]

Kháng nguyên Vi PS hiện diện ở một vài vi khuẩn như S Typhi, S Paratyphi

C, S Dublin, Citrobacter freundii (Bảng 1.2) [22]

1.4 Kháng nguyên vỏ Vi polysaccharide (PS)

1.4.1 Cấu tạo kháng nguyên Vi PS của vi khuẩn Thương hàn S Typhi

Bên ngoài cùng thành tế bào vi khuẩn S Typhi (là vi khuẩn Gram âm) có lớp

bao nhầy gọi là vỏ Lớp vỏ nhầy này sền sệt dạng keo có độ dày bất định và được tiết trên bề mặt tế bào trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nó dễ tróc ra như chất nhớt với thành phần chủ yếu là PS Bao nhầy PS chiếm tỷ lệ lớn ở các loài vi khuẩn Gram âm có vỏ nên còn gọi là PS vỏ (Hình 1.9) [77,115]

Hình 1.9 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm [115]

Kháng nguyên Vi PS là carbohydrate có trọng lượng phân tử cao và hydrat hóa cao với trên 95% là nước được cấu tạo từ những đơn vị monosaccharide (MS) lặp lại nối với nhau bởi liên kết glycoside (1 4) mạch thẳng Hai MS nối với nhau bằng liên kết glycoside tạo bởi nhóm -OH trên MS này tại nguyên tử carbon

anomer của MS kia với việc loại nước giữa nhóm -OH tại C-1 của một MS và nhóm -OH của MS khác Khi nguyên tử carbon tham gia liên kết glycoside thì không có khả năng oxi hóa nên đầu tận cùng của PS chứa nguyên tử carbon anomer tự do gọi

là đầu khử Liên kết glycoside dễ bị thủy giải bởi acid nhưng không bị thủy giải bởi kiềm (Hình 1.10) [77,113]

Hình 1.10 Liên kết glycoside [113]

Kháng nguyên Vi PS là chất đồng trùng hợp, mạch thẳng α(1 4)-D- acid galactopyranosyluronic (2 deoxy-2 N-acetyl acid galacturonic) N-acetyl hóa ở C-2, O-acetyl hóa tại vị trí C-3 và có thể thay đổi 60% – 70% với những đơn vị lặp lại có trọng lượng phân tử trên 200 kDa [60,74,92] Kháng nguyên Vi PS có cấu trúc xoắn

ốc cân đối 2 lần hoặc 3 lần với vòng đường và carboxyl của nó tạo dãy sắp xếp ngay

ngắn xen kẽ quanh liên kết glycoside PS vỏ có đặc tính anion (ion mang điện tích âm) do các phân tử MS có tính acid (acid uronic) Kháng nguyên Vi PS hòa tan

trong nước muối và không tạo gel khi có ion đa trị hiện diện Kháng nguyên Vi PS

có ít nhất 2 quyết định kháng nguyên (epitop), một là nhóm O-acetyl có vai trò là quyết định kháng nguyên, hai là nhóm N-acetyl và carboxyl cần thiết cho phản ứng kháng nguyên – kháng thể ở vùng ưu thế miễn dịch Tuy nhiên, nhóm carboxyl có hiệu quả miễn dịch ít hơn (Hình 1.9 và 1.10) [37,67,81]

Nhóm O-acetyl là quyết định kháng nguyên trong liên kết kháng nguyên Vi

PS với kháng thể và cần cho kháng nguyên Vi PS trong sự khởi đầu hoạt hóa tế bào lympho B và tổng hợp kháng thể [81] Nhóm O-acetyl phủ hầu hết bề mặt kháng nguyên Vi PS và nhô ra một nửa không cực ở hàng hai bên kháng nguyên Vi PS Khả năng sinh miễn dịch liên quan mức độ O-acetyl hóa và hàm lượng nhóm O-acetyl của cấu trúc kháng nguyên Vi PS Kháng nguyên Vi PS được O-acetyl hóa không hoàn toàn tại C-3 (có 60% đến 90% nhóm OH được O-acetyl hóa) Nếu O-acetyl hóa một phần làm tăng khả năng sinh miễn dịch, nhưng O-acetyl hóa hoàn toàn hoặc loại bỏ nhóm O-acetyl tạo những nhóm có cực ở dưới làm mất khả năng sinh miễn dịch và mất tính kháng nguyên Khi giảm hàm lượng O-acetyl đến ~ 1% thì không kích thích tạo kháng thể (Hình 1.11) [70,74,91,92]

Hình 1.11 Cấu trúc kháng nguyên Vi PS của vi khuẩn Thương hàn S Typhi [92]

Nhóm carboxyl bị khử thì đặc tính sinh miễn dịch thay đổi rất nhỏ hoặc không thay đổi do nhóm O-acetyl và N-acetyl hiện diện trên bề mặt kháng nguyên

Vi PS che nhóm carboxyl tương tác với những phân tử khác như ion trung hòa trong dung môi hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào Nhóm O-acetyl và N-acetyl làm ổn định kháng nguyên Vi PS về hướng thủy phân acid và phần quyết định ưu thế miễn dịch

[106] Cấu trúc kháng nguyên ở S Typhi Ty2 có mức O-acetyl hóa thấp hơn so với

chủng khác trong họ vi khuẩn đường ruột N- và O-acetyl tạo phần chủ yếu của bề mặt, nhóm COOH gần với trục của PS và không xa hơn từ trục phân tử như nhóm O-acetyl N-acetyl liền kề với nhóm COOH của đường bên cạnh Khoảng cách

mạch thẳng giữa các nhóm COOH là 0,43 nm PS được dùng như yếu tố gel và quá trình tạo thành gel bởi PS là đơn trị, hai hóa trị hoặc ba hóa trị [78,92,95,99]

Kháng nguyên Vi PS làm trung gian tương tác giữa vi khuẩn và môi trường, ngăn kháng thể liên kết với kháng nguyên O qua liên kết cộng hóa trị với phospholipid hoặc phân tử lipit A, đó là liên kết phosphodiester giữa PS và màng phospholipid Kháng nguyên Vi PS ức chế sự hoạt hóa bổ thể cũng như đề kháng sự

ly giải và thực bào qua trung gian bổ thể Kháng nguyên Vi PS giúp cho S Typhi

sống sót trong máu dẫn đến nhiễm trùng máu Kháng thể Vi đặc hiệu cần cho sự

hoạt hóa bổ thể chống lại S Typhi [49,77,85]

1.4.2 Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS của S Typhi

1.4.2.1 Các gen mã hóa độc lực ở S Typhi (đảo gây bệnh 7 (SPI-7), locus viaA

có thể bị mất và sự đột biến ở locus viaA và ViaB sau bảo quản và cấy truyền nhiều

lần trong phòng thí nghiệm Chủng mất hoàn toàn SPI-7 thì không có khả năng sản sinh kháng nguyên Vi PS và xâm nhập vào các tế bào biểu mô nhanh hơn [36,60,84, 105]

Việc biểu hiện kháng nguyên Vi PS ở S Typhi được kiểm soát bởi 2 locus nhiễm sắc thể là locus viaA và locus viaB Locus viaA và gen viaA chức năng định

vị tại 43 min trên nhiễm sắc thể của S Typhi Locus viaB ở các chủng có sản sinh kháng nguyên Vi PS (S Typhi, S Dublin, S Paratyphi C và C freundi)i Locus viaB định vị tại 92 min trên nhiễm sắc thể quyết định cấu trúc của kháng nguyên và

mã hóa cho gen kháng nguyên Vi PS của S Typhi Ty2 được dòng hóa trên mảnh

40,6 kilobase thành vector cosmid pHC79 (Hình 1.12) [60,92]

Locus viaB là vùng ADN 14 kb, gồm 11 gen là tviABCDE, vexABCDE

và ORF11 tviA là gen cần cho sự điều hòa, tviBCDE là gen cần cho sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS và vexABCDE là gen cần cho tiết kháng nguyên Vi PS, thành

phần G + C chiếm đến 52% ORF11 không cần cho sự tổng hợp và di chuyển kháng

nguyên Vi PS đến bề mặt tế bào (Hình 1.12) [36,75,84]

Hình 1.12 Các gen mã hóa độc lực ở S Typhi (đảo gây bệnh 7 (SPI-7),

locus viaA và locus viaB) [81]

1.4.2.2 Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS

Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS bên trong tế bào đƣợc kiểm soát bởi

locus viaB và protein TviA hoạt hóa sự sinh tổng hợp Từ UDP-N-acetyl

glucosamine (UDP-GlcNAc) đƣợc xúc tác bởi polypeptide TviB, TviC, TviD và sự

tham gia của những gen cấu trúc tviB (mã hóa enzyme dehydrogenase), tviC (mã hóa enzyme pimerase), tviD và tviE (mã hóa enzyme glycosyltransferase) Khởi đầu

là sinh tổng hợp monomer kháng nguyên Vi PS bằng cách oxi hóa UDP-GlcNAc nhờ enzyme TviB xúc tác thành UDP-N- acid acetylglucosamic (UDP-GalNAcA) TviC xúc tác phản ứng epimerase hóa tại C4 giữa UDP-GlcNAcA và UDP-GalNAcA cũng như UDP-GalNAc và UDP-GlcNAc tạo UDP-GalNAcA để xây dựng khối trùng hợp kháng nguyên Vi PS TviB là UDP-GlcNAc 6-dehydrogenase

và TviC là UDP-GlcNAcA 4-epimerase tviB và tviC mã hóa men phụ thuộc NAD+

hoặc NADP cần để tổng hợp đường nucleotide, RNA tổng hợp các enzyme cần thiết cho tổng hợp kháng nguyên Vi PS Polypeptide TviD và TviE (enzyme transferase)

xúc tác cho sự trùng hợp kháng nguyên Vi PS Vai trò của tviD chưa rõ nhưng mã

hóa cytochrome enzyme P-450 (Hình 1.13) [29,80, 99,100, 111,104]

Việc sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS còn được điều hòa bởi hệ thống điều

hòa hai thành phần rcsB-rcsC và ompR-envZ nằm ngoài vùng gây bệnh 7 (SPI-7)

cùng với sự thay đổi nồng độ mol khác nhau của NaCl trong những môi trường

khác nhau tviA cũng liên quan đến điều hòa và biểu hiện kháng nguyên Vi PS Việc điều chỉnh sao chép gen tviA và hoạt tính sao chép tối đa ở điều kiện nồng độ mol

NaCl thấp Nồng độ mol điều chỉnh sự sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS (Hình 1.13) [29, 80, 81,97]

Sự biểu hiện kháng nguyên Vi PS được kiểm soát bởi hệ thống điều hòa 2

thành phần rcsB-rcsC và ompR-envZ và liên quan đến 3 locus viaA, viaB và ompB

[29,67] Sự biểu hiện Vi PS được điều hòa bởi nồng độ mol NaCl của môi trường

Tại nồng độ mol thấp hoặc trung bình khoảng 150 mM NaCl (310 mosmol) thì biểu

hiện Vi PS cao S Typhi Ty2 sinh trưởng trong môi trường có nồng độ mol trung

bình ( 170 mM NaCl, 446 mosmol) cho biểu hiện sản sinh kháng nguyên Vi PS ở

mức cao (Hình 1.13) [31,52,102]

Protein VexA, VexB và VexC giúp tích lũy kháng nguyên Vi PS ở tế bào chất, trực tiếp di chuyển, biểu hiện và định vị kháng nguyên Vi PS đến bề mặt tế bào vi khuẩn cũng như tham gia vào việc chuyển kháng nguyên Vi PS qua màng ngoài Protein VexE giúp biểu hiện và neo kháng nguyên Vi PS tại bề mặt vi khuẩn

Sự tổng hợp chuỗi kháng nguyên Vi PS xảy ra độc lập với sự di chuyển chuỗi kháng nguyên Vi PS (Hình 1.13) [99,106,111]

Hình 1.13 Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS [104]

1.4.3 Đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên Vi PS

1.4.3.1 Khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên Vi PS

Khả năng sinh miễn dịch cho bảo vệ của kháng nguyên Vi PS đối với bệnh Thương hàn gây ra bởi vi khuẩn có vỏ liên quan đến cấu trúc hóa học, quyết định đặc hiệu, cấu hình trung tâm anomer, vị trí liên kết glycoside, epitope lặp lại đều đặn qua phân tử và sự thay đổi thành phần đơn vị lặp lại (RU) Kích thước phân tử của kháng nguyên Vi PS góp phần vào sự khác nhau trong đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên Vi PS Trọng lượng phân tử tương đối lớn liên quan đến tính sinh miễn dịch cao và là cơ sở để tiêu chuẩn hóa vắc xin PS - trọng lượng phân tử của kháng nguyên Vi PS ở trong khoảng 1x105 – 5x106 Da [81,96, 97]

Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể chia kháng nguyên thành 2 nhóm là

kháng nguyên phụ thuộc tế bào T (TD) và kháng nguyên không phụ thuộc tế bào T (TI) Kháng nguyên TI lại được chia làm 2 loại dựa trên sự tương tác của chúng với

tế bào B: kháng nguyên typ 1 (TI-1) và kháng nguyên typ 2 (TI-2) (Hình 1.14)

29,91]

Hình 1.14 Kháng nguyên PS không phụ thuộc tế bào T typ 2 (TI-2)

PS là kháng nguyên TI typ 2: Có khả năng hoạt hóa và liên kết chéo với thụ thể globulin miễn dịch trên bề mặt tế bào lympho B trưởng thành, đặc hiệu cho sản xuất kháng thể bởi kháng nguyên có epitope lặp lại, không có khả năng hoạt hóa tế bào B chưa chín, không phản ứng với tế bào T Kháng nguyên Vi PS trực tiếp kích thích tế bào B dẫn đến tạo kháng thể, nhưng ở trẻ nhỏ dưới 2 tuổi không tạo được kháng thể bằng con đường này [29,98]

1.4.3.2 Cơ chế đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên PS

Kháng nguyên PS tới vùng rìa (MZ) của cơ quan lympho, gắn với tế bào B ở

vùng mầm của lách tạo đáp ứng nhanh đối với mầm bệnh ở máu và tủy xương qua

lách Kháng nguyên PS được nhận diện bởi thụ thể tế bào B (BCR) đặc hiệu và kích thích đáp ứng tế bào B bằng liên kết chéo với nhiều globulin miễn dịch dẫn đến biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma sản sinh globulin miễn dịch không có sự hỗ trợ

của tế bào T Tế bào B không xử lý và trình diện epitope từ kháng nguyên PS đến tế

bào T Kháng nguyên PS không kích thích tế bào B trí nhớ ái lực cao để nhắc lại vì

trung tâm mầm là vị trí cấu thành tế bào B trí nhớ không đáp ứng đối với kháng nguyên PS và tạo thành trước khi tế bào trí nhớ được tạo ra nên không có sự chuyển

đổi isotype liên quan đến thụ thể tế bào B hoặc sản sinh tế bào B trí nhớ Tế bào B

nhận biết tế bào B1 và tế bào B vùng rìa (MZ) tuần hoàn khép kín ở nhiều vị trí tổ chức khác của lách và cần lách cho sự sinh ra và sống sót của chúng Trong quá trình tồn tại, số lượng tế bào B vùng rìa bị giảm và giảm mức biểu hiện CD21, kích hoạt màng vận chuyển và tương tác phối tử cyclophilin điều chỉnh canxi (TACI) nhưng giới hạn dung lượng hoạt hóa tế bào B Kết quả, thế hệ tế bào B ít hơn tế bào plasma dẫn đến thiếu và làm suy yếu tế bào B trí nhớ do đó đáp ứng miễn dịch bị giảm và không tạo được trí nhớ miễn dịch (Hình 1.15) [62,66,85,97,98]

Hình 1.15 Đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên PS [85]

Ở người lớn, kháng thể kháng PS thuộc lớp IgM và IgG Kháng nguyên PS tạo mức đáp ứng IgA và IgG thấp IgG được tạo bởi tế bào B tiết IgM luôn cần sự tương tác với tế bào T hỗ trợ đặc hiệu kháng nguyên đã hoạt hóa Trẻ em dưới 2 tuổi thiếu hụt số lượng isotype IgG2 và IgG4 và kháng thể kháng PS là IgG Sự thay đổi kháng thể IgG tăng dần theo tuổi Kháng thể kháng PS thể hiện phân tử kappa chuỗi nhẹ, kích thích kháng thể chủ yếu là IgM ( 90%) và số lượng ít phân lớp

IgG2 IgG2 là globulin miễn dịch hiệu quả nhất chống lại một vài PS và thiếu hụt IgG2 liên quan gây bệnh bởi vi khuẩn có vỏ Tuy nhiên, kháng nguyên PS không phù hợp làm vắc xin cho trẻ em dưới 2 tuổi và người lớn trên 65 tuổi do quần thể này không có đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên PS [35,61]

1.5 Vắc xin Thương hàn

1.5.1 Lịch sử vắc xin Thương hàn

Năm 1659, Willis lần đầu tiên mô tả bệnh Thương hàn [40]

Năm 1883 – 1984, Georg Theodor August Gaffky (Đức) đã nuôi cấy và xác

định tính chất sinh học của S Typhi và đặt tên là Eberth's bacillus, Eberthella typhi

và Gaffky-Eberth bacillus [5,88] Năm 1885, tên của bác sĩ thú y người Mỹ Daniel Elmer Salmon được đặt tên cho vi khuẩn Thương hàn là Salmonella và sau đó được

sử dụng chính thức cho đến ngày nay [4,5]

Năm 1888 – 1892, Chantemess và Widal nghiên cứu thực nghiệm áp dụng

có hiệu quả việc tiêm chủng Thương hàn lần đầu tiên ở người [2,82]

Năm 1896, R Pfeiffer và W Kolle ở Đức và Almroth Edward Wright ở Anh điều chế vắc xin Thương hàn toàn tế bào bất hoạt bằng nhiệt đầu tiên dùng cho người và chứng minh kháng thể bảo vệ thụ động [47,48] Năm 1917, Felix mô tả

kháng nguyên thân và kháng nguyên lông của Salmonella [22]

Năm 1948, Theodore Woodward và Smadel điều trị thành công một bệnh nhân người Malaysia bị bệnh Thương hàn bằng chloramphenicol, mở ra thời kỳ sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh Thương hàn [4,19]

Vào những năm 1960 và 1970, thực địa đầu tiên đối với vắc xin Thương hàn

tế bào bất hoạt bằng nhiệt, phenol hoặc acetone với sự phối hợp của WHO ở Yugoslavia và Guyana [48,50]

Vào cuối những năm 1980, thực địa vắc xin Thương hàn Vi PS ở vùng dịch lưu hành tại Nêpan và Nam Phi [48]

Năm 1989, vắc xin Thương hàn uống, sống, giảm độc lực Ty21a (Vivotif) do