Nghiên cứu tuyển chọn và nâng cao khả năng tổng hợp lipid của vi tảo làm cơ sở để sản xuất biodiesel

Nhiên liệu sinh học từ vi tảo tảo dầu - nhiên liệu sinh học thế hệ 3 - nổi lên như một nguyên liệu có triển vọng nhất để sản xuất nhiên liệu sinh học do có một số ưu điểm nổi trội như: c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ MỸ LAN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP LIPID CỦA VI TẢO LÀM CƠ SỞ ĐỂ SẢN XUẤT BIODIESEL

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: HÓA SINH

Mã số: 62 42 30 15

Phản biện 1: PGS.TS Trương Vĩnh

Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Thanh Xuân

Phản biện 3: TS Nguyễn Hữu Phúc

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Trương Vĩnh

Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Thị Thanh Xuân

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS PHẠM THÀNH HỔ

2 PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả Luận án

NCS Nguyễn Thị Mỹ Lan

Xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến hai Thầy PGS.TS Phạm Thành Hổ – PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá

trình nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận án

Xin chân thành cám ơn cô PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu, PGS.TS Phạm Thị Ánh Hồng, TS Lê Phi Nga đã luôn động viên và hỗ trợ tôi rất nhiều về mặt tinh

thần và học thuật

Xin trân trọng cám ơn TS Trần Ngọc Đức, TS Lưu Thị Thanh Nhàn, Thầy TS Nguyễn Thanh Tùng đã cung cấp nhiều tài liệu có giá trị cho luận án và hỗ trợ cho

tôi rất nhiều trong lĩnh vực nghiên cứu còn khá mới này

Xin chân thành cảm ơn Th.S Lê Thị Mỹ Phước, TS Lương Thị Mỹ Ngân, GV Lê Thị Thanh Loan, Th.S Huỳnh Hiệp Hùng, Th.S Nguyễn Hoàng Ngọc Phương đã

cùng tôi sát cánh trong quá trình thực hiện luận án

Chân thành cám ơn Quỹ khoa học và công nghệ ĐHQG TP HCM cho đề tài

trọng điểm (B2010-18-01-TĐ) do Th.S Lê Thị Mỹ Phước làm chủ nhiệm đề tài

Xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô trong hội đồng đã dành nhiều thời gian đóng góp ý kiến quý báu để tôi hoàn thành tốt luận án

Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô và các bạn Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật và Chuyển hóa sinh học, Bộ môn Sinh hóa đã tạo mọi điều kiện thuận lợi tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận án

Chân thành cảm ơn các em Đoàn Thị Mộng Thắm, Lương Công Khôi, Trương Huy Hồng, Nguyễn Thanh Vũ và các em sinh viên CNSH các khóa CS05, CS07, CS08, CS09 đã hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung nghiên cứu của luận án

Chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn đang làm công tác nghiên cứu và giảng dạy tại Khoa sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi không biết bày tỏ như thế nào về lòng biết ơn của mình cho xứng đáng với những hy sinh, tận tụy của gia đình, người thân, bạn bè… đã dành cho tôi

trong suốt những năm qua

NCS Nguyễn Thị Mỹ Lan

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 NHIÊN LIỆU SINH HỌC 4

1.1.1 Nhiên liệu sinh học 4

1.1.2 Những ưu điểm của nhiên liệu sinh học: 9

1.1.3 Tình hình nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ vi tảo trên Thế Giới và ở Việt Nam 12

1.1.4 Sự phát triển của Biodiesel trên Thế Giới và ở Việt Nam 16

1.2 TẢO DẦU 18

1.2.1 Tảo dầu 18

1.2.2 Quy trình tạo biodiesel từ vi tảo dầu 20

1.3 THÀNH PHẦN VÀ QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP LIPID Ở VI TẢO 21

1.3.1 Thành phần lipid trong vi tảo 21

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp lipid ở vi tảo 23

1.4 CÁC KỸ THUẬT ĐIỀU KHIỂN CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA LIPID TRONG VI TẢO 25

1.4.1 Kỹ thuật sinh hóa (BE) 26

1.4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất dinh dưỡng đến lượng lipid tích lũy ở vi tảo dầu 27

1.4.1.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đến tích lũy lipid ở vi tảo dầu 29

1.4.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tích lũy lipid ở vi tảo dầu 29

1.4.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến tích lũy lipid ở vi tảo dầu 29

1.4.1.5 Phương pháp nuôi cấy 2 giai đoạn 30

1.4.2 Kỹ thuật di truyền (GE) 31

1.4.3 Kỹ thuật điều khiển yếu tố phiên mã (TFE) 32

1.5 MÔ HÌNH NHÂN SINH KHỐI VI TẢO 33

1.5.1 Mô hình nhân sinh khối vi tảo trong phòng thí nghiệm 33

1.5.2 Mô hình nhân sinh khối vi tảo ở quy mô pilot 35

1.5.2.1 Hệ thống nuôi vi tảo trong ao mở ngoài trời (Race way) 35

1.5.2.2 Mô hình nhân sinh khối vi tảo trong hệ thống kín (Photobioreactor) 37

CHƯƠNG 2 39

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 39

2.1 NGUỒN PHÂN LẬP 39

2.2 DỤNG CỤ - HÓA CHẤT – VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM : 40

2.2.1 Dụng cụ 40

2.2.2 Hóa chất – vật liệu 40

2.3 MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 40

2.3.1 Môi trường phân lập tảo nước ngọt [103] 40

2.3.2 Môi trường phân lập tảo nước mặn [103] 41

2.3.3 Phương pháp phân lập 41

2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH LIPID TRONG TẾ BÀO VI TẢO 42

2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI TẢO 43

2.5.1 Định danh vi tảo theo phương pháp truyền thống 43

2.5.2 Định danh vi tảo theo phương pháp giải trình tự gen 18S rDNA và tra cứu trên Blast Search (Thực hiện tại Công ty Nam Khoa) 43

2.6 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC NHANH CÁC CHỦNG VI TẢO CÓ CHỨA LIPID 45

2.7 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ THIẾU NITROGEN, PHOSPHOR ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY LIPID CỦA VI TẢO 47

2.8 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LIPID VÀ TAG TRONG VI TẢO 49

2.8.1 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet [46], [58], [61], [81] 49

2.8.2 Định lượng lipid bằng phương pháp Bligh và Dyer [18] 50

2.8.3 Định lượng nhanh TAG bằng phương pháp đo OD huỳnh quang với thuốc

nhuộm Nile Red [31], [55] 50

2.9 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC ACID BÉO CÓ TRONG CÁC CHỦNG VI TẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ (GC-FID) THEO TIÊU CHUẨN EN 14103:2003 52

2.10 PHÂN TÍCH MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DẦU TẢO 53

2.11 QUY TRÌNH NUÔI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG 53

2.11.1 Nuôi cấy 53

2.11.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tích tũy lipid của vi tảo 54

2.11.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của Pediastrum theo mật độ tế bào 55

2.11.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng của Pediastrum theo mật độ sinh khối56 2.11.5 Phương pháp nuôi cấy vi tảo 2 giai đoạn 56

2.12 QUY TRÌNH NUÔI CẤY, THU SINH KHỐI Pediastrum duplex Meyen TRÊN GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI KHUẨN 57

2.12.1 Phương pháp hoạt hóa, nhân giống Acetobacter xylinum và lên men thu sinh khối cellulose vi khuẩn (BC) [2] 58

2.12.2 Chuẩn bị miếng BC chứa môi trường tạo stress 58

2.12.3 Phương pháp nuôi cấy 2 giai đoạn trên giá đỡ BC 58

2.12.4 Đánh giá khả năng tái sử dụng giá đỡ BC 59

2.13 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 59

CHƯƠNG 3 60

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO CHỨA LIPID 60

3.1.1 Phân lập và sơ tuyển 60

3.1.1.1 Vi tảo nước ngọt 60

3.1.1.2 Vi tảo nước mặn 60

3.1.2 Định tính lipid bằng phẩm nhuộm huỳnh quang Nile Red và định danh vi tảo bằng hình thái 60

3.1.3 Định danh đại diện một số chủng vi tảo bằng phương pháp sinh học phân

tử 70

3.1.4 Tuyển chọn các chủng vi tảo có chứa lipid ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên 71

3.1.4.1 Khảo sát khả năng tích lũy lipid nội bào của các chủng vi tảo nước ngọt ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên 72

3.1.4.2 Khảo sát khả năng tích lũy lipid nội bào của các chủng vi tảo nước mặn ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên 76

3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ THIẾU NITROGEN, PHOSPHOR ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY LIPID CỦA 4 CHỦNG VI TẢO TUYỂN CHỌN 80 3.2.1 Chủng N12: Pediastrum duplex Meyen 80

3.2.2 Chủng N17: Scenedesmus accuminatus (Lag.) Chodat 82

3.2.3 Chủng M5: Chlamydomonas sp 83

3.2.4 Chủng M16: Tetraselmis sp 84

3.3 XÁC ĐỊNH LIPID TỔNG, THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC ACID BÉO CÓ TRONG CÁC CHỦNG VI TẢO KHẢO SÁT 85

3.3.1 Định lượng lipid tổng 85

3.3.1.1 Khảo sát dung môi ly trích lipid từ vi tảo 85

3.3.1.2 Định lượng lipid tổng trong vi tảo bằng phương pháp Soxhlet – phương pháp Bligh and Dyer 87

3.3.2 Thành phần và hàm lượng các acid béo, lipid tổng có trong các chủng vi tảo khảo sát 90

3.4 QUY TRÌNH NUÔI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO Pediastrum duplex Meyen TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG 93

3.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tích lũy lipid ở vi tảo Pediastrum duplex Meyen (N12) 93

3.4.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 93

3.4.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng - nhiệt độ 94

3.4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 95

3.4.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ CO2 96

3.4.2 Khảo sát động học tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen ở các

cường độ chiếu sáng khác nhau 97

3.4.3 Nuôi cấy Pediastrum duplex Meyen hai giai đoạn trong môi trường lỏng100 3.4.3.1 Ảnh hưởng của sự thiếu nitrogen và phosphor lên sự tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen 101

3.4.3.2 Ảnh hưởng của sự thiếu nitrogen và phosphor lên hàm lượng TAG và lipid tổng ở Pediastrum duplex Meyen 103

3.5 QUY TRÌNH NUÔI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO Pediastrum duplex Meyen TRÊN GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI KHUẨN (BC) 110

3.5.1 Hoạt hóa, nhân giống và lên men Acetobacter xylinum: 111

3.5.2 Ứng dụng nuôi cấy Pediastrum duplex Meyen trên giá đỡ BC theo phương pháp 2 giai đoạn 112

3.5.3 Đánh giá khả năng tái sử dụng giá thể BC 114

3.5.4 So sánh hiệu suất sinh khối vi tảo Pediastrum duplex Meyen trên môi trường lỏng và giá đỡ BC 115

3.5.5 Định lượng lipid tổng trong Pediastrum duplex Meyen nuôi cấy 2 giai đoạn trong môi trường lỏng và trên giá đỡ BC 116

3.5.6 Thành phần và hàm lượng các acid béo có trong Pediastrum duplex Meyen nuôi cấy 2 giai đoạn trên giá đỡ cellulose vi khuẩn (BC) 117

3.5.7 Tính chất lý hóa của lipid trong vi tảo Pediastrum duplex Meyen 120

3.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI VI TẢO CÓ HÀM LƯỢNG LIPID CAO121 3.6.1 Xây dựng quy trình nuôi vi tảo 2 giai đoạn trong môi trường lỏng 121

3.6.2 Xây dựng quy trình nuôi vi tảo 2 giai đoạn trên giá đỡ cellulose vi khuẩn123 3.6.3 Đánh giá ưu và nhược điểm của vi tảo Pediastrum duplex Meyen nuôi cấy trong môi trường lỏng và trên giá đỡ cellulose vi khuẩn 124

CHƯƠNG 4 125

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125

4.1 KẾT LUẬN 125

4.2 KIẾN NGHỊ 126

DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO 128

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DMSO – Dimethyl sulfoxide

MUFA – MonoUnsaturated Fatty Acid (Acid béo không bão hòa có một nối đôi)

NT – Nghiệm thức

PUFA – PolyUnsaturated Fatty Acid (Acid béo không bão hòa có nhiều nối đôi) PC: Plant Cellulose (Cellulose thực vật)

SFA – Saturated Fatty Acid (Acid béo bão hòa)

USFA – Unsaturated Fatty Acid (Acid béo không bão hòa)

TAG – Triacylglyceride

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Bảng so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo và các nguồn nguyên liệu khác để

sản xuất biodiesel [10] 9

Bảng 1.2: Một số loại vi tảo dầu điển hình [32], [55] 19

Bảng 1.3: So sánh hiệu quả tạo biodiesel của vi tảo dầu với các nguồn sinh khối khác 20

Bảng 1.4: Các gene (mã hóa enzyme) tăng cường sinh tổng hợp lipid [22] 32

Bảng 1.5: Các yếu tố phiên mã chịu trách nhiệm cho việc tăng cường sản xuất các sản phẩm có giá trị cao [22] 33

Bảng 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm vị trí nạp các mẫu vi tảo vào đĩa số 1 và đĩa số 2 47 Bảng 2.2: Các nghiệm thức gây strees thiếu N và P trong môi trường nuôi cấy 48

Bảng 2.3: Sơ đồ vị trí nạp mẫu vi tảo khảo sát ảnh hưởng nitrogen và phosphor 48

Bảng 2.4: Thành phần các chất trong 1 giếng đo OD huỳnh quang 50

Bảng 2.5: Thể tích các chất cho vào giếng đo OD huỳnh quang 51

Bảng 2.6: Các nghiệm thức nuôi cấy 54

Bảng 2.7: Nghiệm thức khảo sát ánh sáng - nhiệt độ 55

Bảng 3.1: Kết quả định danh và định tính lipid 7 chủng vi tảo nước ngọt được tuyển chọn và Scenedesmus dimorphus (N18) 62

Bảng 3.2: Kết quả định danh và định tính lipid 12 chủng vi tảo nước mặn được tuyển chọn và Chlorella sp1 (M17) 65

Bảng 3.3: Kết quả định danh theo phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử 70

Bảng 3.4: Ký hiệu các chủng vi tảo trong bộ sưu tập giống 71

Bảng 3.5: Hiệu suất ly trích dịch chiết chứa lipid từ vi tảo Pediastrum bằng phương pháp Soxhlet với các hệ dung môi khác nhau 86

Bảng 3.6: Hiệu suất ly trích dịch chiết chứa lipid từ các chủng vi tảo khảo sát 87

Bảng 3.7: Thành phần và hàm lượng các acid béo, lipid tổng có trong các chủng vi tảo khảo sát 90Bảng 3.8: Hiệu suất tổng hợpTAG (%) ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau của

Pediastrum duplex Meyen theo ngày 104 Bảng 3.9: So sánh nồng độ TAG (μg/ml) của các vi tảo Pediastrum 107 Bảng 3.10: So sánh năng suất TAG (μg/ml/ngày) của các vi tảo Pediastrum 107 Bảng 3.11: Định lượng lipid tổng trong Pediastrum bằng phương pháp Soxhlet 109 Bảng 3.12: Năng suất sinh khối khô Pediastrum ở các lần tái sử dụng BC 114 Bảng 3.13: Định lượng lipid tổng trong Pediastrum nuôi cấy 2 giai đoạn trong môi

trường lỏng và trên giá đỡ BC 117

Bảng 3.14: Thành phần acid béo (%) của chủng tảo Pediastrum nuôi cấy 2 giai đoạn trên giá đỡ BC ở các điều kiện stress và so sánh với chủng Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardtii [3] 117 Bảng 3.15: Các tính chất lý hóa của lipid trong vi tảo Pediastrum (1/4N-1/2P) 120

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các thế hệ nhiên liệu sinh học [98] 6

Hình 1.2: Sự phát triển về quá trình sản xuất biodiesel trên Thế Giới [69] 17

Hình 1.3: Quy trình tổng quát tạo biodiesel từ vi tảo dầu [98] 21

Hình 1.4: Tổng quan cơ bản về con đường chuyển hóa cố định carbon 24

và sinh tổng hợp TAG trong vi tảo [82] 24

Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp acid béo và hình thành TAG ở vi tảo 25

Hình 1.6: Sơ đồ hệ thống nuôi cấy theo mẻ (Lee C.S và cộng sự, 1993) 34

Hình 1.7: Hệ thống nuôi vi tảo trong ao mở ngoài trời [102] 35

Hình 1.8: Hệ thống photobioreactor dạng ống [102] 38

Hình 1.9: Hệ thống photobioreactor dạng tấm 38

Hình 2.1: Một số địa điểm thu mẫu 39

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của thuốc nhuộm Nile Red 42

Hình 2.3: Chlamydomonas reinhardtii nhuộm với Nile Red [93] 42

Hình 3.1: Biểu đồ sàng lọc các chủng vi tảo nước ngọt ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên bằng tín hiệu phát quang Nile Red OD485/535 /200 µl dịch tảo) theo thời gian nuôi cấy 73

Hình 3.2: Biểu đồ khả năng tăng trưởng của các chủng vi tảo nước ngọt ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên thông qua giá trị OD750nm theo thời gian nuôi cấy 74

Hình 3.3: Biểu đồ sàng lọc các chủng vi tảo nước ngọt ở điều kiện nuôi cấy 75

ngoài tự nhiên theo thời gian nuôi cấy 75

Hình 3.4: Biểu đồ sàng lọc các chủng vi tảo nước mặn ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên bằng tín hiệu phát quang Nile Red (OD485/535 /200 µl dịch tảo) theo thời gian nuôi cấy 76

Hình 3.5: Biểu đồ khả năng tăng trưởng của các chủng vi tảo nước mặn ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên theo thời gian nuôi cấy thông qua giá trị độ hấp thu OD750nm

77

Hình 3.6: Biểu đồ sàng lọc các chủng vi tảo nước mặn ở điều kiện nuôi cấy ngoài tự nhiên theo thời gian nuôi cấy 78

Hình 3.7: Biểu đồ ảnh hưởng của sự thiếu N và P đến khả năng tích lũy lipid của Pediastrum duplex Meyen theo thời gian nuôi cấy 81

Hình 3.8: Sự tích lũy lipid của Pediastrum duplex Meyen ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 81

Hình 3.9: Biểu đồ ảnh hưởng của sự thiếu N và P đến khả năng tích lũy lipid của Scenedesmus accuminatus theo thời gian nuôi cấy 82

Hình 3.10: Sự tích lũy lipid của Scenedesmus accuminatus ở điều kiện nuôi cấy khác nhau 82

Hình 3.11: Biểu đồ ảnh hưởng của sự thiếu N và P đến khả năng tích lũy lipid của Chlamydomonas sp theo thời gian nuôi cấy 83

Hình 3.12: Sự tích lũy lipid của Chlamydomonas sp ở điều kiện nuôi cấy khác nhau 83

Hình 3.13: Biểu đồ ảnh hưởng của sự thiếu N và P đến khả năng tích lũy lipid của của Tetraselmis sp theo thời gian nuôi cấy 84

Hình 3.14: Sự tích lũy lipid của Tetraselmis sp ở điều kiện nuôi cấy khác nhau 84

Hình 3.15 Biểu đồ so sánh hiệu suất ly trích dịch chiết lipid từ các 88

chủng vi tảo bằng 2 phương pháp Soxhlet và Bligh & Dyer 88

Hình 3.16: Biểu đồ so sánh hiệu suất ly trích dịch chiết chứa acid béo tổng, lipid tổng từ các chủng vi tảo khảo sát bằng phương GC-FID và Soxhlet 91

Hình 3.17: Đồ thị ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng tích lũy lipid của Pediastrum duplex Meyen (N12) 93

Hình 3.18: Đồ thị ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tới khả năng tích lũy

lipid của Pediastrum duplex Meyen 94

Hình 3.19: Biểu đồ ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy tới khả năng tích lũy lipid của vi tảo Pediastrum duplex Meyen 95

Hình 3.20: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ CO2 nuôi tới khả năng tích lũy của vi tảo Pediastrum duplex Meyen 96

Hình 3.21: Đường cong tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen 97

ở các cường độ chiếu sáng khác nhau 97

Hình 3.22: Các điều kiện nuôi cấy Pediastrum duplex Meyen 98

Hình 3.23: Màu sắc dịch nuôi cấy Pediastrum duplex Meyen ở các cường độ chiếu sáng khác nhau 98

Hình 3.24: Đường cong tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen ở các điều kiện khác nhau theo mật độ sinh khối khô 100

Hình 3.25: Đồ thị ảnh hưởng của sự thiếu nitrogen và phosphor lên sự tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen theo log mật độ tế bào 102

Hình 3.26: Đồ thị ảnh hưởng của sự thiếu nitrogen và phosphor lên sự tăng trưởng của Pediastrum duplex Meyen theo mật độ sinh khối 102

Hình 3.27: Ảnh hưởng của sự thiếu nitrogen và phosphor lên hiệu suất tổng hợp TAG của Pediastrum duplex Meyen theo thời gian nuôi cấy 104

Hình 3.28: Sinh khối và hàm lượng TAG (%) của Pediastrum duplex Meyen nuôi cấy trong môi trường MWC đầy đủ (1N-1P) theo thời gian 106

Hình 3.29: Sinh khối và hàm lượng TAG (%) của Pediastrum nuôi cấy trong môi trường MWC thiếu hụt nitrogen và phosphor (1/4N-1/2P) theo thời gian 106

Hình 3.30: Sự thay đổi kích thước của tập đoàn vi tảo Pediastrum duplex Meyen theo điều kiện nuôi cấy 108

Hình 3.31: Năng suất sinh khối (mg/l/ngày) và năng suất lipid (g/ml/ngày) của Pediastrum duplex Meyen trong các nghiệm thức 110

Hình 3.32: Vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy trên thạch nghiêng, ống nghiệm

và chai thủy tinh 111Hình 3.33: Sản phẩm cellulose vi khuẩn 112

Hình 3.34: Nuôi cấy Pediastrum duplex Meyen trên giá đỡ BC và đối chứng trên

môi trường lỏng 113

Hình 3.35: Đồ thị sinh khối khô Pediastrum duplex Meyen thu trên giá đỡ BC ở các

điều kiện nuôi cấy 113

Hình 3.36: Biểu đồ lượng sinh khối khô Pediastrum duplex Meyen ở các lần tái sử

dụng BC 114

Hình 3.37: Biểu đồ lượng sinh khối khô Pediastrum duplex Meyen ở điều kiện nuôi

cấy lỏng và trên giá đỡ BC 115

Hình 3.38: Thành phần acid béo (%) của chủng vi tảo Pediastrum duplex Meyen nuôi cấy ở các điều kiện stress và so sánh với chủng Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardtii 118

Hình 3.39: Thành phần các acid béo SFA, MUFA, PUFA (%) của chủng tảo

Pediastrum nuôi cấy ở các điều kiện stress và so sánh với chủng Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardtii 119

Đồ thị 3.40: Thành phần các acid béo SFA, USFA (%) của chủng tảo Pediastrum nuôi cấy ở các điều kiện stress và so sánh với chủng Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardtii 119

Hình 3.41 : Quy trình nuôi cấy vi tảo 2 giai đoạn trong môi trường lỏng 122

Hình 3.42: Quy trình nuôi cấy vi tảo Pediastrum duplex Meyen 2 giai đoạn trong

môi trường lỏng 123Hình 3.43: Quy trình nuôi cấy vi tảo 2 giai đoạn trên giá đỡ cellulose vi khuẩn 123

Hình 3.44: Quy trình nuôi cấy vi tảo Pediastrum duplex Meyen 2 giai đoạn trên giá

đỡ cellulose vi khuẩn 124

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu sử dụng các nguồn năng lượng đang gia tăng nhanh chóng do sự bùng nổ dân số và công nghiệp hóa toàn cầu Hơn 80% [30], [70] năng lượng sử dụng hiện nay trên thế giới là từ nhiên liệu hóa thạch (dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên, …) Đây là những nguồn năng lượng không tái sinh được và

có giới hạn Do đó, yêu cầu cấp thiết được đặt ra là tìm những nguồn nhiên liệu mới

để thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt An ninh năng lượng, lương thực và nước sạch là vấn đề phải đối mặt của nhiều quốc gia Bên cạnh đó, việc khai thác và sử dụng nguồn nhiên liệu hóa thạch dẫn đến nhiều thiệt hại lớn cho môi trường, đã tạo ra lượng lớn khí nhà kính và hiện tượng biến đổi khí hậu là một thách thức lớn trong thế kỷ này [26], [50], [51], [52] Những nguồn năng lượng tái sinh như năng lượng mặt trời, năng lượng gió, năng lượng nước, năng lượng hạt nhân, … nhận được sự quan tâm đặc biệt của con người và được tăng cường khai thác Nhưng những nguồn năng lượng này có một số ưu và nhược điểm nhất định và vẫn chưa thể đáp ứng nổi nhu cầu về năng lượng của loài người

Từ những yêu cầu như vậy, các nhà khoa học đã hướng sự chú ý đến một nguồn nhiên liệu mới có khả năng thay thế một phần vai trò của nhiên liệu hóa thạch,

có khả năng tái tạo, đồng thời là nguồn năng lượng “sạch”, không độc, dễ phân giải trong tự nhiên và khả năng khép kín chu trình carbon Không nguồn nhiên liệu nào thích hợp hơn nhiên liệu từ sinh khối sinh vật Từ đó, thuật ngữ nhiên liệu sinh học -biofuel- ra đời và cho đến nay đã trải qua 3 thế hệ

Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên được sản xuất chủ yếu từ các loại cây lương thực, thực phẩm như ngô, sắn, mía; từ dầu thực vật như đậu nành, dầu mè, dầu

cọ hoặc mỡ động vật như mỡ bò, mỡ heo, mỡ cá … [32], [95], [98], [99] Nguồn

bền vững và còn những tranh cãi về những tác động tiêu cực Phát triển nhiên liệu sinh học dựa trên nguồn nguyên liệu từ nông nghiệp cần một diện tích đất trồng khổng lồ và cạnh tranh nguồn lương thực cho người và gia súc Nhiên liệu sinh học

thế hệ 2 được phát triển chủ yếu là các phụ phẩm hoặc phế liệu nông lâm nghiệp giàu cellulose như rơm rạ, tro trấu, bã mía và sinh khối thực vật, ligno-cellulose sau khi

đã dùng cho thực phẩm, hoặc phế phẩm công nghiệp như dầu thải, rác thải sinh hoạt, nước thải đô thị thành phố hoặc từ các loại dầu đã qua sử dụng, dầu không dùng cho thực phẩm như jatropha [32], [65], [76], [98] Tuy nguồn nguyên liệu này không ảnh hưởng đến an ninh lương thực nhưng nguồn cung ứng không ổn định, khó đáp ứng đầy đủ cho sản xuất và hiệu quả kinh tế không cao

Nhiên liệu sinh học từ vi tảo (tảo dầu) - nhiên liệu sinh học thế hệ 3 - nổi lên như một nguyên liệu có triển vọng nhất để sản xuất nhiên liệu sinh học do có một số

ưu điểm nổi trội như: chứa hàm lượng dầu cao lên đến khoảng 50% sinh khối khô, hiệu suất lipid từ tảo thì cao hơn nhiều (7 – 30 lần) so với những cây trồng năng lượng cạnh tranh [30], [66], gấp 50 -100 lần so với biodiesel từ đậu nành [38], không ảnh hưởng đến an ninh lương thực, hấp thu CO2,hiệu suất quang hợp cao, tốc độ tăng trưởng nhanh, có thể phát triển ở khắp mọi nơi (nước ngọt, nước mặn, nước lợ, nước thải…) [26], phần sinh khối sau khi chiết lấy lipid còn là nguồn lợi kinh tế rất lớn Từ những thuận lợi trên, vi tảo đã cho thấy đây là nguồn nguyên liệu thích hợp

để sản xuất ra nguồn “ năng lượng xanh”, thay thế cho năng lượng từ nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt

Đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn và nâng cao khả năng tổng hợp lipid của vi

tảo, làm cơ sở để sản xuất biodiesel” là một hướng nghiên cứu rất mới ở Việt Nam

và phù hợp với tình hình nghiên cứu chung của Thế Giới Từ những luận giải trên, việc thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài là cần thiết, có ý nghĩa về mặt khoa học

và thực tiễn

2 Mục tiêu nghiên cứu:

Thu thập, tuyển chọn bộ giống vi tảo giàu lipid và xây dựng quy trình nuôi cấy vi tảo nhằm gia tăng hàm lượng lipid tảo

3 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm của luận án:

 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi tảo có khả năng tạo lipid ở miền Nam Việt Nam với hàm lượng ≥ 10% so với trọng lượng khô

 Nghiên cứu điều kiện để nâng cao khả năng tổng hợp lipid của chủng vi tảo tuyển chọn ≥ 20% so với trọng lượng khô

 Nghiên cứu nuôi cấy, thu sinh khối vi tảo trên giá đỡ cellulose vi khuẩn trong điều kiện ánh sáng tự nhiên

 Nghiên cứu nuôi cấy ở quy mô sản xuất nhỏ (bình nhựa trong suốt 20L, hồ kiếng 200L)

 Thu sinh khối và ly trích thu lipid từ sinh khối các loài vi tảo tuyển chọn

 Xác định thành phần và hàm lượng các acid béo có trong lipid từ một số chủng vi tảo tuyển chọn

 Đánh giá chất lượng lipid từ dầu tảo thông qua các chỉ tiêu lý hóa

 Xây dựng quy trình nuôi vi tảo có hàm lượng lipid cao ≥ 20% so với trọng lượng khô, làm cơ sở để sản xuất biodiesel

4 Đóng góp mới của luận án

 Đã sàng lọc và tuyển chọn được 20 chủng vi tảo ở Việt Nam có hàm lượng lipid cao, trong đó có 5 chủng đạt hiệu suất ly trích lipid ≥ 20%, là cơ sở tạo nguồn nguyên liệu bền vững cho việc sản xuất biodiesel tại Việt Nam

 Xây dựng quy trình nuôi cấy hai giai đoạn vi tảo Pediastrum duplex Meyen

trên cellulose vi khuẩn ở điều kiện stress thiếu nitrogen và phosphor đạt hàm lượng lipid cao 36,43% so với trọng lượng khô với thành phần acid béo có C16 và C18:1 chiếm 46,08% và 21,69% tương ứng, và có các tính chất lý hóa phù hợp để sản xuất biodiesel

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

– Tuyển chọn được bộ giống vi tảo (5 chủng) có hàm lượng lipid ≥ 20% so với trọng lượng khô phân lập được tại Việt Nam

– Xây dựng quy trình nhân sinh khối vi tảo dầu nuôi cấy trong môi trường lỏng và trên giá đỡ cellulose vi khuẩn trong điều kiện ánh sáng tự nhiên nhằm gia tăng hàm lượng dầu tảo trong điều kiện ánh sáng tự nhiên

– Các kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác giảng dạy và nghiên cứu

CHƯƠNG 1

1.1 NHIÊN LIỆU SINH HỌC

Các loại nhiên liệu hóa thạch phải mất hàng triệu năm để được hình thành trong lòng đất, trong khi chỉ sau hơn hai trăm năm sử dụng con người đã làm trữ lượng của chúng giảm đi đáng kể Con người sử dụng nhiên liệu hóa thạch với tốc độ nhanh gấp hàng ngàn lần tốc độ chúng hình thành Do đó, lượng nhiên liệu tạo ra không thể thay thế nhanh chóng cho lượng đã sử dụng Trữ lượng nhiên liệu hóa thạch trên thế giới đang giảm mạnh, đặc biệt sau chiến tranh Vùng vịnh năm 1991 Giá nhiên liệu đang tăng cao (tính đến tháng 6/2014 giá dầu thô vẫn đang ở mức trên

100 USD/ thùng) Nguyên nhân là sự gia tăng về nhu cầu sử dụng, cũng như do các cuộc khủng hoảng dầu mỏ và những bất ổn vùng Trung Đông và Bắc Phi Thêm vào

đó, sản phẩm của quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch cũng gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường: ô nhiễm không khí, mưa acid, biến đổi khí hậu, sự nóng lên toàn cầu, dầu tràn ảnh hưởng đến sinh vật, ô nhiễm nguồn nước ảnh hưởng sức khỏe con người…[92]

Những giới hạn trên của nhiên liệu hóa thạch đã thúc đẩy việc nghiên cứu và phát triển nguồn nhiên liệu mới – nhiên liệu tái tạo, mà trong đó phát triển nhiên liệu sinh học được xem là hướng đi mang lại nhiều hứa hẹn

1.1.1 Nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học (tiếng Anh: biofuel, tiếng Pháp: biocarburant) là loại nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn gốc động thực vật (sinh học)như nhiên liệu chiết xuất từ chất béo của động thực vật (mỡ động vật, dầu dừa, ), ngũ cốc (lúa mì, ngô, đậu tương, ), chất thải trong nông nghiệp (rơm rạ, phân, ), sản phẩm thải trong công nghiệp (mùn cưa, sản phẩm gỗ thải ), [99] Vì vậy, nhiên liệu sinh học là nguồn năng lượng thay thế có thể tồn tại, tái sinh và điều chỉnh theo ý muốn của con người [94]

Nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối gồm cả 3 dạng rắn, lỏng, khí trong đó phổ biến là biogas, bioethanol và biodiesel, có thể được phân loại thành các nhóm chính như sau:

 Diesel sinh học (Biodiesel) là một loại nhiên liệu lỏng có tính năng tương tự

và có thể sử dụng thay thế cho loại dầu diesel truyền thống Biodiesel được điều chế bằng cách tạo dẫn xuất từ một số loại dầu mỡ sinh học (dầu thực vật, mỡ động vật), thường được thực hiện thông qua quá trình transester hóa bằng cách cho phản ứng với các loại rượu, phổ biến nhất là methanol và ethanol [100]

 Xăng sinh học (Biogasoline) là một loại nhiên liệu lỏng, trong đó có sử dụng

ethanol như là một loại phụ gia nhiên liệu pha trộn vào xăng thay phụ gia chì Ethanol được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose Ethanol được pha chế với xăng ở tỷ lệ thích hợp tạo thành xăng sinh học có thể thay thế hoàn toàn cho loại xăng sử dụng phụ gia chì truyền thống [100]

 Khí sinh học (Biogas) là một loại khí hữu cơ gồm methane (50-60%), CO2

(>30%), còn lại là các chất khác như hơi nước, N2, O2, H2S, CO … được thủy phân trong môi trường yếm khí Biogas được tạo ra sau quá trình ủ lên men các sinh khối hữu cơ phế thải nông nghiệp, chủ yếu là cellulose, tạo thành sản phẩm

ở dạng khí Biogas có thể dùng làm nhiên liệu khí thay cho sản phẩm khí gas từ sản phẩm dầu mỏ [100]

Năm 2009, theo Bộ Năng lượng Mỹ và Ủy ban năng lượng thế giới dự báo nguồn năng lượng hóa thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiên nhiên

60 năm, than đá 111 năm Theo Bộ Năng lượng Mỹ nhu cầu dầu mỏ thế giới ngày càng tăng Theo Trung tâm năng lượng ASEAN nhu cầu tiêu thụ năng lượng của khu vực này năm 2002 là 280 triệu tấn và sẽ tăng lên 583 triệu tấn vào năm 2020 Indonesia là nước có nguồn năng lượng hoá thạch lớn nhất trong các nước ASEAN, tuy nhiên hiện nay dầu mỏ dự trữ của họ chỉ còn trong 25 năm, khí đốt 60 năm và than đá 150 năm [95]

Chính vì thế, các nhà khoa học cũng đã lên tiếng cảnh báo cộng đồng quốc tế rằng thời điểm khủng hoảng năng lượng thế giới đang đến gần khi mà các nguồn

cung cấp dầu mỏ và khí đốt trên thế giới đang cạn kiệt nhanh với tốc độ 4-5% hàng năm Do vậy việc tìm kiếm các nguồn nhiên liệu thay thế, đặc biệt là nhiên liệu tái tạo, là nhu cầu thiết yếu hiện nay

Bên cạnh năng lượng mặt trời, năng lượng gió, năng lượng nước và địa nhiệt, năng lượng tái tạo từ sinh khối, còn gọi là nhiên liệu sinh học – biofuel nhận được sự quan tâm đặc biệt trở lại của con người và được tăng cường khai thác Nhiên liệu sinh học được phân theo 3 thế hệ:

Hình 1.1: Các thế hệ nhiên liệu sinh học [98]

http://www.oilgae.com/ref/report/venture_capital/venture_capital.html

- Nhiên liệu sinh học thế hệ 1: được làm từ các loại cây trồng có hàm lượng

đường và tinh bột cao (mía, ngô, khoai, sắn,…), dầu thực vật (dầu mè, dầu cọ, dầu

lạc) hoặc mỡ động vật (mỡ bò, mỡ heo, mỡ cá,…) Tinh bột từ các loại ngũ cốc được

chuyển hóa thành đường rồi lên men thành bioethanol Trong khi đó, dầu thực vật (được ép từ các loại cây có dầu) hoặc mỡ động vật được trộn với ethanol (hoặc methanol) có sự hiện diện của chất xúc tác sẽ sinh ra biodiesel và glycerine bằng phản ứng chuyển hóa ester [27], [28], [32], [68], [95], [98]

Nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên này tuy giúp thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch nhưng nguồn tài nguyên sinh khối này liên quan đến an ninh lương thực, thực phẩm của mọi quốc gia Hiện tại, hơn 95% biodiesel được sản xuất từ nhiên liệu

Năng lượng sinh học Ethanol

Biodiesel

Thế hệ 1

Dầu cọ Đậu nành Cải dầu

Thế hệ 2

Jatrophar Biogas

Thế hệ 3

TẢO

sinh học thế hệ 1 [76] Trong khi đó, thế giới đang đối mặt với tình trạng thiếu lương thực nghiêm trọng [28] Chính vì thế, gia tăng sử dụng nguồn nguyên liệu này cho nhiên liệu sinh học sẽ dẫn đến mất an ninh lương thực trên thế giới và nhiều hậu quả nghiêm trọng khác như nạn đói kém do giá lương thực tăng cao, nạn phá rừng, nạn thu hẹp đất canh tác lương thực, nạn thiếu nước, … [11], [28], [94]

Biodiesel bắt đầu được sản xuất khoảng giữa năm 1800 ở dạng methyl hoặc ethyl ester từ dầu thực vật Thế nhưng mãi đến năm 1900 việc dùng biodiesel từ dầu thực vật như là một nhiên liệu động cơ mới chính thức được công nhận Sự kiện quan trọng đánh dấu cột mốc đó là ngày 10/08/1893 lần đầu tiên Rudolf Diesel (Đức) đã sử dụng biodiesel do ông sáng chế từ dầu lạc để chạy máy, và được ông trình diễn ở cuộc triển lãm quốc tế - World Exhibition ở Paris vào năm 1900 [101]

Hiện nay, nhiên liệu sinh học thế hệ 1 bị hạn chế do khả năng mở rộng diện tích đất trồng trọt để trồng các loại cây thích hợp là có hạn và các công nghệ truyền thống sử dụng để chuyển đổi các nguồn nguyên liệu này thành nhiên liệu sinh học còn bị hạn chế bởi hiệu quả và phương pháp xử lý

- Nhiên liệu sinh học thế hệ 2: được phát triển chủ yếu là các phụ phẩm từ

quá trình chế biến thực phẩm hoặc phế liệu nông lâm nghiệp giàu cellulose như rơm

rạ, tro trấu, bã mía và sinh khối thực vật hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh như cỏ switchgrass [44], [95], [98], ligno-cellulose sau khi đã dùng cho thực phẩm, hoặc phế phẩm công nghiệp như dầu thải, rác thải sinh hoạt, nước thải đô thị thành phố hoặc

từ các loại dầu đã qua sử dụng, dầu không dùng cho thực phẩm như jatropha [32], [65], [76], [98] Ưu điểm nổi bật của nhiên liệu sinh học thế hệ 2 là sử dụng nguồn sinh khối không ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lương thực, bên cạnh việc chuyển hóa sinh học hiện đại còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường Tuy nguồn nguyên liệu này không ảnh hưởng đến an ninh lương thực nhưng nguồn cung ứng không ổn định, khó đáp ứng đầy đủ cho sản xuất và hiệu quả kinh tế không cao do tiêu hao năng lượng nhiều trong quá trình chuyển hóa các phế thải có hàm lượng năng lượng thấp Ngoài ra, các loại cây trồng thường thu hoạch sau 1 – 2 năm chăm sóc, một số loại cây cho hạt như Jatropha và Pongamia phải cần từ 4 – 5 năm [84]

- Nhiên liệu sinh học thế hệ 3: được chế tạo từ các loài vi tảo trong nước,

trên đất ẩm, sinh ra nhiều năng lượng (7-30 lần) hơn nhiên liệu sinh học thế hệ trước

trên cùng diện tích trồng [30] Thuật ngữ nhiên liệu sinh học thế hệ 3 chỉ mới có gần đây và chủ yếu là đề cập đến nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ tảo Trước đó, tảo được gộp vào với nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai Tuy nhiên, do tảo có khả năng tạo năng suất cao hơn nhiều so với các nguồn nguyên liệu khác nên được tách riêng

ra [95] Sản lượng dầu trên một diện tích 0,4 ha tảo là từ 20.000 lít/năm đến 80.000 lít/năm Ngoài ra, loài tảo bị thoái hóa sinh học không làm hư hại môi trường xung quanh Theo ước tính của Bộ Năng Lượng Mỹ, nước này cần một diện tích đất đai lớn độ 38.849 km2 để trồng vi tảo thay thế tất cả nhu cầu dầu hỏa hiện nay trong nước [94] Hiện vi tảo đã được nghiên cứu rất nhiều để sản xuất hydrogen (H2), methane, dầu (các triglyceride và hydrocarbon để chuyển hóa thành biodiesel, năng lượng máy bay,…) và bioethanol [15]

 Chi phí sản xuất biodiesel vẫn là một trở ngại lớn cho việc thương mại hóa với quy mô lớn, chủ yếu là do chi phí nguyên liệu dầu thực vật cao Một mối quan tâm đáng kể khác là sự không bền vững và hiệu quả của nguyên liệu biodiesel thế hệ

1 và 2 Mặc dù biodiesel từ cây lấy dầu đã được sản xuất với số lượng ngày càng tăng, nhưng việc sản xuất chúng với số lượng lớn là không bền vững

 Thực tế khai thác cho thấy mỗi hecta đất trồng cải dầu chỉ sản xuất được 1.190 lít biodiesel, đậu cọc rào được 1.892 lít, dừa được 2.670 lít và cây cọ được 5.950 lít [26] Rõ ràng không thể dựa vào nhóm cây trồng trên cạn để đạt đến các chỉ tiêu thay thế dầu mỏ, cho dù nhu cầu tiêu thụ cũng đã tăng mạnh trong mấy năm gần đây, mà chủ yếu để pha trộn vào dầu mỏ nhằm làm giảm ô nhiễm môi trường Nhiều bang của Mỹ đã có luật quy định pha trộn tối thiểu ở mức 2%, tại 25 nước châu Âu

là 5,75% trong năm 2010 và ở Ấn Độ dự kiến thay thế 50% nhiên liệu dầu mỏ vào năm 2030 [100]

 Với một số ưu điểm nổi trội như: hàm lượng dầu cao, tốc độ tăng trưởng nhanh, không cạnh tranh đất trồng lương thực, phần sinh khối sau khi chiết lấy dầu cũng là nguồn lợi kinh tế rất lớn, vi tảo hoàn toàn xứng đáng trở thành nguồn

biodiesel đầy hứa hẹn trong tương lai không xa [10], [22]

 Ngoài việc sinh sản nhanh chóng, vi tảo cũng dễ nuôi hơn nhiều loại cây trồng khác và có thể đạt năng suất dầu cao hơn Như được thể hiện trong bảng 1.1, vi tảo phát triển nhanh, dẫn đến năng suất sinh khối cao và sản lượng dầu cao hơn 25

lần so với dầu thu được từ cây trồng lấy dầu sản xuất biodiesel truyền thống, chẳng hạn như dầu cọ Ví dụ, vi tảo có sản lượng dầu 70% trọng lượng sinh khối khô, chỉ cần diện tích đất là 0,1m2/năm/kg biodiesel để sản xuất 121.104 kg biodiesel/ha/năm Giá trị sản xuất lớn là một trong những nguyên nhân vi tảo được công nhận là một

nguồn tiềm năng tốt cho việc sản xuất biodiesel [12]

Bảng 1.1: Bảng so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo và các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất biodiesel [12]

Nguồn nguyên

liệu

Lượng dầu (% dầu trong sinh khối)

Sản lượng dầu (l/ha/năm)

Diện tích đất sử dụng (m2/năm/kg biodiesel)

Năng suất biodiesel (kg biodiesel/ha/năm)

 Với những yêu cầu xử lý đáng kể của nhiên liệu hóa thạch và chi phí cao của dầu thực vật, các nhà nghiên cứu và hàng loạt các công ty lớn trên thế giới đã có

nhiều sự quan tâm trong việc nuôi trồng vi tảo

1.1.2 Những ưu điểm của nhiên liệu sinh học:

Nhiên liệu sinh học pha trộn với nhiên liệu hóa thạch ở một tỷ lệ thích hợp sẽ

sử dụng được cho các động cơ hiện nay mà không gây bất kỳ tổn hại nào cho động

cơ Nhiên liệu sinh học được sử dụng ở dạng nguyên chất 100% khi các động cơ được chuyển đổi phù hợp

Là nhiên liệu tái tạo được trong một chu trình carbon khép kín Không gây ô nhiễm môi trường góp phần giảm thiểu hiệu ứng nhà kính Về mặt kỹ thuật, biodiesel có chỉ số cetane (là chỉ tiêu đo lường chất lượng cháy của nhiên liệu) cao hơn so với diesel [39], [57]

Hai loại nhiên liệu sinh học lỏng quan trọng nhất hiện nay đó là bioethanol và biodiesel Bioethanol được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu

cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose Nguồn nguyên liệu có thể là mía, củ cải đường, ngũ cốc, khoai tây, sắn… Biodiesel thường được sản xuất từ dầu mỡ động -thực vật nhờ quá trình chuyển ester hóa Cả hai loại này đều có thể được trộn chung hay thay thế hoàn toàn nhiên liệu hóa thạch Chúng an toàn và có khả năng phân hủy sinh học nên rất thân thiện với môi trường [27]

Trên thị trường hiện nay, người ta thường sử dụng hỗn hợp xăng – rượu (ethanol, methanol) và nếu hỗn hợp chứa ít hơn 20% rượu (theo thể tích) thì không cần phải thay thế động cơ của máy nhờ đặc tính hút ẩm của ethanol và methanol (trên thực tế hỗn hợp xăng – rượu gồm có ba thành phần đó là xăng, rượu và nước) Còn biodiesel có thể thay thế trực tiếp cho diesel có nguồn gốc từ dầu mỏ mà không cần phải thay đổi động cơ [27]

Nhiên liệu sinh học gần đây đã thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì chúng có khả năng tái tạo, tính bền vững, nguồn nguyên liệu sẵn có, phân hủy sinh học cũng như mang lại nhiều lợi ích trong việc phát triển kinh tế, nâng cao thu nhập cho nông dân và đặc biệt là giảm hiệu ứng nhà kính

Việc sản xuất các loại nhiên liệu sinh học từ thực vật ngày càng phát triển, và trở thành cuộc chạy đua giữa các quốc gia Do đó nhiều nước trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu và trồng các loài cây nông, lâm nghiệp để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học Đến nay đã có khoảng 50 quốc gia sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học ở mức độ khác nhau, trong đó có Việt Nam

Với ưu thế về diện tích canh tác, Mỹ sử dụng ngô để sản xuất ethanol và đậu nành để sản xuất biodiesel [38] Thống kê trong năm 2003, Mỹ đã sản xuất 80.000 tấn biodiesel từ dầu hạt đậu nành [101] Hiện nay ở Mỹ đã cho phép sử dụng và bán rộng rãi một số nhiên liệu sinh học bên cạnh các nhiên liệu truyền thống như: B20 (diesel có pha 20% biodiesel), E10 (xăng có pha 10% ethanol), E85 (xăng có pha

85% ethanol) [11] Ấn Độ dùng cây cọ dầu (Elaeis guineennsis) và cây Jatropha curcas L để sản xuất diesel sinh học Ủy ban phát triển nhiên liệu sinh học của Ấn

Độ đề nghị trồng cọ dầu trên diện tích 11,2 triệu ha đất thoái hóa, đất bỏ hoang và các loại đất khác [94]

Brazil là nước tiên phong trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học từ cây mía

Từ năm 1975, Brazil đã có kế hoạch dùng mía làm nguyên liệu sản xuất cồn thay thế xăng và khuyến khích sử dụng nhiên liệu sinh học bằng các biện pháp như: sử dụng xăng để chạy xe phải pha một tỷ lệ ethanol nhiên liệu, đầu tư trồng và cải tạo giống mía để sản xuất nhiên liệu sinh học, cải tiến công nghệ sản xuất ethanol, nghiên cứu sản xuất ôtô chạy bằng ethanol, miễn giảm thuế sản xuất và tiêu thụ ethanol Hiện nay, Brazil đã sản xuất 14 tỷ lít cồn (tương đương 20 vạn thùng) từ cây mía và có kế hoạch trong vòng 20 năm tới sẽ sản xuất lượng cồn thay thế 10% nhu cầu xăng dầu của thế giới, với lượng xuất khẩu khoảng 200 tỷ lít, so với hiện tại là 3 tỷ lít [94]

Các nước EU sử dụng đậu tương, hạt cải dầu (Brassica napus) và dầu mỡ phế

thải từ động, thực vật để sản xuất nhiên liệu sinh học [94]

Thụy Điển dự kiến sau 2020 ethanol sinh học từ cellulose sẽ thay thế toàn bộ nhiên liệu hóa thạch nhằm chấm dứt phụ thuộc vào dầu mỏ [94]

Indonesia và Malaysia chủ yếu dựa vào cây Jatropha để sản xuất biodiesel [94]

Trung Quốc đang triển khai sản xuất ethanol sinh học và biodiesel từ cây

Jatropha, Hoàng liên mộc (Pistacia chinensis Bunge), Văn quan (Xanthoceras sorbifolia Bunge) Hiện nay, Trung Quốc đã trồng được 40 ngàn ha cây Jatropha

Thái Lan đã có chính sách khuyến khích nông dân trồng sắn để sản xuất ethanol [94]

Ở Việt Nam, hiện tại cây trồng chính và triển vọng nhất dùng để sản xuất biodiesel là Jatropha Gần đây các doanh nghiệp Nhật Bản đang thúc đẩy một dự án hợp tác với các doanh nghiệp Việt Nam ở tỉnh Bình Định sản xuất biodiesel từ cây dừa (dầu dừa)

Bên cạnh các xu hướng sử dụng nguồn năng lượng từ sinh khối nêu trên, xu hướng nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo cũng rất được chú ý

1.1.3 Tình hình nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ vi tảo trên Thế Giới và

ở Việt Nam

 Thế Giới:

Những năm gần đây, hướng nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ sinh khối vi tảo

đã thu hút được nhiều sự quan tâm và đầu tư của nhiều nhà nghiên cứu, các trường Đại học, các tổ chức và các công ty lớn của nhiều quốc gia trên thế giới Tổng đầu tư của thế giới là 32 triệu USD trong năm 2007, đã tăng đột phá 300 triệu USD trong năm 2008, với hơn 50 công ty tại Mỹ đặt hàng tập trung nghiên cứu nhiên liệu từ tảo Theo thống kê, năm 2010 đã có khoảng 100 công ty tại Mỹ và hơn 200 công ty trên thế giới cạnh tranh các nguồn đầu tư từ chính phủ và phi chính phủ với tổng mức đầu

tư hàng chục tỉ USD cho nghiên cứu phát triển và thương mại hóa nguồn năng lượng sinh học này Hiện tại, vi tảo đang được xem như là một nguồn năng lượng cho tương lai vì từ tảo và vi khuẩn có thể sản xuất dầu, hydro và điện [13], [98]

Ưu điểm chính của vi tảo là dễ nuôi, có thể phát triển trong các bồn nước mặn

ở ven biển hoặc nuôi trong hệ thống ống ở vùng bán sa mạc nhiều nắng gió Khác với các loại cây trồng như ngô, mía, cải dầu hay cọ dầu, vi tảo không cạnh tranh với bất cứ loại cây trồng nào, mà hàm lượng dầu thu được từ vi tảo lại cao hơn nhiều so với các loại cây có dầu truyền thống khác Theo Thomas Renaud thì một ha đất trồng canh tác trong 1 năm sản xuất được 170 lít dầu ngô, 1200 lít cải dầu và gần

6000 lít cọ dầu Còn 1 ha vi tảo có thể tạo từ 47.000 đến 140.000 lít dầu Thị trường dầu tảo trên thế giới đến năm 2020 sẽ đạt doanh số 970 triệu Euro Vi tảo thuộc diện

được giải phóng khi nhiên liệu tảo đốt động cơ hay turbin [98]

Năm 1978, Bộ Năng lượng Mỹ đã trích quỹ 21 triệu USD cho chương trình Aquatic Species Program tại Roswell-New Mehico trong 20 năm Nghiên cứu này đã giúp định hướng khả năng khai thác sinh khối vi tảo trong lên men tạo ethanol, trong phân hủy yếm khí tạo metan, làm nguồn sản xuất hydro, nhưng tiềm năng nhất là chuyển hóa tạo biodiesel từ nguồn lipid vi tảo [96], [98]

Mỹ đã có rất nhiều dự án và kế hoạch đầu tư từ nhà nước lẫn các doanh nghiệp Năm 2008, Bộ Quốc Phòng Mỹ đã đầu tư 42,6 triệu USD thông qua văn phòng Nghiên cứu Khoa học Không quân (AFOSR) cho mục tiêu nghiên cứu và tăng cường cơ sở hạ tầng phục vụ nghiên cứu khai thác các chủng loại vi tảo dùng trong sản xuất nhiên liệu phản lực [96], [98]

Năm 2009, Bộ Năng lượng Mỹ tuyên bố chọn 19 dự án nghiên cứu chế biến nhiên liệu sinh học từ vi tảo để giao 564 triệu USD kinh phí từ nguồn Tái đầu tư và Phục hồi (The American Recovery and Reinvestment) nhằm đẩy mạnh việc xây dựng và vận hành các quy trình công nghệ, thử nghiệm, trình diễn và thương mại hóa Trong số đó, 4 dự án liên quan đến khía cạnh phát triển nhiên liệu vi tảo được giao cho các tập đoàn uy tín như Algenol Biofuel, Sapphire Energy, Solazyme và UOP Tập đoàn Algenol Biofuel (Florida) nuôi vi tảo sinh ethanol trong những hệ thống ống khổng lồ chứa nước biển Công ty Sapphire Energy (San Diego) nuôi vi tảo tạo ra dầu trong những bể mở cỡ lớn ở vùng sa mạc để ép lấy dầu chế biến thành xăng thông thường hay nhiên liệu cho máy bay Vào 2009, Sapphire đã dùng nhiên liệu vi tảo của mình cho chiếc xe Toyota Prius chạy xuyên Mỹ Đây cũng là một trong những nhà máy sản xuất hàng đầu về nhiên liệu vi tảo đã đầu tư 300 triệu USD với mục tiêu sản xuất 1,5 triệu gallon nhiên liệu vi tảo vào năm 2014 Solazyme (San Francisco) đã nghiên cứu và nắm giữ hơn chục giống vi tảo có năng suất cho dầu cao

và đã sản xuất hàng nghìn lít dầu tảo Công ty Imperium (Seatle) đã dành riêng một nhà máy lọc dầu 5 triệu gallon cho dầu tảo [98]

Năm 2013, Tổng thống Obama đã lên kế hoạch xây dựng ít nhất 4 nhà máy lọc dầu năng lượng sinh học có quy mô thương mại với mục tiêu thay thế đến 17% lượng dầu nhập khẩu bằng năng lượng sinh học được cung cấp ngay trong nước

Nhiều doanh nghiệp sản xuất biodiesel phát triển mạnh mẽ ở vùng khô hạn ven Địa Trung Hải như Bio Fuel System ở Tây Ban Nha hay UniVerve Biofuel ở Israel [98]

Ở Anh, vi tảo hiện đang là nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel cho sản lượng cao nhất, trung bình khoảng 15.000 gallon/mẫu Anh/năm gấp 24 lần so với nguồn nguyên liệu đứng thứ 2 là dầu cọ (635 gallon/mẫu Anh/năm) Nhưng trên thực

tế, đã có nhiều công ty sản xuất đến 180.000 gallon/mẫu Anh/năm tương đương 4.000 thùng chỉ với chi phí 25 USD/thùng hay 0,59 USD/gallon

Năm 2012, hãng cung cấp điện khổng lồ của Thụy Điển Vattenfall phối hợp

với nhà máy nhiệt điện Senftenberg của Đức đã thử nghiệm nuôi vi tảo Scenedesmus obliquus trong lò phản ứng sinh học làm bằng chất dẻo trong suốt làm nhiên liệu sinh

Các nhà khoa học thuộc đại học Bielefeld (Đức) nghiên cứu vi tảo

Chlamydomonas reinhardtii tạo khí hydro để tạo điện [98]

Các nước Châu Âu đã đẩy mạnh nghiên cứu biodiesel trong đó có biodiesel từ

vi tảo nhằm giảm thiểu sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch, giảm khí thải nhà kính nhằm hướng đến mục tiêu vào năm 2020 pha ít nhất 10% nhiên liệu sinh học vào nhiên liệu hóa thạch sử dụng trong giao thông vận tải

Năm 1990, Bộ Thương mại và Công nghiệp Quốc tế Nhật Bản (MITI) đã đầu

tư 80 triệu USD cho chương trình nghiên cứu công nghệ mới (RITE) được tổ chức Phát triển Năng lượng Mới (NEDO) triển khai trong 10 năm để mở rộng nghiên cứu

và phát triển quy mô nuôi vi tảo sử dụng khí thải CO2 từ các nhà máy năng lượng bằng các hệ thống kín (photobioreactor) và thu nhận sản phẩm có giá trị cao Cách tiếp cận nuôi cấy vi tảo quy mô lớn trên hệ thống kín được xây dựng trên quan điểm

nhằm tiết kiệm diện tích nuôi trồng hơn so với hệ thống ao hở như mô hình do Mỹ đầu tư nghiên cứu

Ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh, các nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Argentina,… đang đẩy mạnh nghiên cứu sử dụng vi tảo làm nguyên liệu thô để sản xuất biodiesel

Công ty Oilfox S.A của Argentina đã xây dựng nhà máy sản xuất biodiesel từ

vi tảo đầu tiên tại khu vực Mỹ Latinh nhằm thay thế sản xuất nhiên liệu sinh học từ dầu đậu nành Chính phủ nước này đã ban hành luật vào cuối năm 2010, tất cả các công ty xăng dầu phải pha 10% biodiesel vào nhiên liệu hóa thạch

 Việt Nam:

Hướng tiếp cận đối với biodiesel nói chung và biodiesel từ tảo nói riêng vẫn còn khá mới, và đang ở những bước đầu của việc nghiên cứu

Đề án phát triển ngành Năng lượng sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến

2025 đã được Thủ tướng chính phủ phê duyệt ngày 20/11/2007

Một số công trình nghiên cứu về vi tảo dầu đã và đang thực hiện: đề tài do Viện Công nghệ sinh học Hà Nội chủ trì – Bộ Công Thương chủ quản, kinh phí hơn

2 tỉ (2009 – 2011), đề tài “Nghiên cứu nhân nuôi vi tảo cung cấp nguyên liệu cho phát triển nhiên liệu sinh học” của Viện dầu khí Việt Nam kinh phí hơn 2 tỉ đồng, đề tài “Nghiên cứu vi tảo giàu lipid phục vụ nuôi trồng thủy hải sản” của Đại học Quốc

Tế - ĐHQG TpHCM (Quỹ Nafosted) kinh phí 900 triệu, đề tài cấp Bộ của Đại học Nông Lâm (2008 - 2011) kinh phí 200 triệu, đề tài cấp trọng điểm ĐHQG TpHCM

“Nghiên cứu và thiết lập quy trình nuôi vi tảo có hàm lượng lipid cao để sản suất biodiesel” kinh phí 400 triệu (2010 – 2013)

Nhằm góp phần phát triển hướng nghiên cứu biodiesel từ vi tảo ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành sưu tập bộ giống vi tảo có chứa lipid ở Việt Nam và tiến hành một số phương pháp phân tích định tính, định lượng lipid có trong các chủng vi tảo Tuy nhiên, khả năng tích lũy lipid trong vi tảo còn ở mức giới hạn từ 10% - 20% Chính vì thế, việc xác định những điều kiện tối ưu cho phát triển và nâng cao năng suất lipid của vi tảo là rất cần thiết được thể hiện qua luận án Đây cũng là một phần

trong đề tài NCKH trọng điểm cấp ĐHQG Tp HCM (2010 – 2013) của nhóm nghiên cứu

1.1.4 Sự phát triển của Biodiesel trên Thế Giới và ở Việt Nam

Biodiesel, tương đương với diesel, là nhiên liệu chế biến từ nguồn nguyên liệu

có nguồn gốc sinh học Biodiesel là tên gọi dành cho các nhiên liệu sinh học tái tạo được oxi hóa dựa trên phản ứng chuyển vị ester Nhiên liệu này được sản xuất từ loại dầu và chất béo hữu cơ [28]

Về mặt hóa học, biodiesel được định nghĩa là monoalkyl ester của các acid béo chuỗi dài có nguồn gốc từ lipid sinh học có thể tái tạo được Biodiesel thường được sản xuất thông qua các phản ứng của một loại dầu thực vật hoặc mỡ động vật với methanol hoặc ethanol với sự hiện diện của chất xúc tác để tạo thành (m)ethyl ester (biodiesel) và glycerin Acid béo (m)ethyl ester hay biodiesel được sản xuất từ dầu và chất béo tự nhiên Nhìn chung, methanol thường dùng cho phản ứng chuyển

vị ester hơn vì nó ít tốn kém hơn so với ethanol [28]

Biodiesel là một nguồn năng lượng hữu hiệu và có thể tái tạo do đó làm giảm

sự phụ thuộc dầu diesel, không độc, phân hủy sinh học trong nước, hạn chế bớt lượng khí thải thoát ra, giảm hiệu ứng nhà kính, không chứa chất gây ung thư và hàm lượng lưu huỳnh thấp hơn trong diesel hóa thạch Biodiesel có thể dễ dàng sử dụng

và dự trữ an toàn vì những đặc tính ưu việt tuyệt vời đối với môi trường [27], [39], [57]

Ngày nay, biodiesel được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới như Malaysia, Đức, Mỹ, Pháp, Ý và Úc, Brazil, Argentina Sản lượng sản xuất biodiesel của các nước thuộc EU (European Union) năm 2009 đạt hơn 9 triệu tấn (European Biodiesel Board, July 2010) Đức và Pháp là những nước dẫn đầu trong công nghiệp sản xuất biodiesel Nhóm các nước EU cung ứng 65% biodiesel đầu ra của thế giới Biodiesel cũng là nguồn năng lượng sinh học chính và có thị trường chủ yếu ở Châu Âu [69]

Năm 2009, biodiesel chiếm khoảng 75% năng lượng sinh học được sản xuất ở Châu Âu Sản lượng sản xuất biodiesel của thế giới trong khoảng từ 1991 đến 2009 gia tăng đáng kể từ sau năm 2000 (hình 1.1) [69]

Hình 1.2: Sự phát triển về quá trình sản xuất biodiesel trên Thế Giới [69]

Trước tiên, vào những năm 1900, Rudolf Diesel đã chứng minh rằng các động

cơ diesel có thể hoạt động với dầu đậu nành Nhiều phương pháp như nhiệt phân, xúc tác, pha trộn và vi nhũ hóa (microemulsification) đã được sử dụng để sản xuất biodiesel từ dầu thực vật cho các động cơ diesel Gần đây phương pháp chuyển ester hóa được xem là thích hợp nhất để tạo ra biodiesel từ dầu thực vật được sử dụng trực tiếp cho các động cơ diesel Biodiesel được sản xuất từ dầu đậu nành, dầu từ hạt bông vải, dầu từ hạt cải dầu, dầu từ hoa hướng dương, dầu từ hạt lanh (linseed oil), dầu từ hạt olive, dầu từ hạt đậu phộng, dầu từ cây thuốc lá, dầu từ cây cọ, từ các loại dầu ăn đã qua sử dụng và từ mỡ động vật [57], [69]

Yếu tố kinh tế chủ yếu quyết định giá đầu vào để sản xuất biodiesel là nguồn nguyên liệu để chế biến Chính vì thế, các hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu sản

xuất nông nghiệp, các loại dầu có hàm lượng acid cao, dầu ăn đã qua sử dụng và dầu

từ vi tảo để sản xuất biodiesel được xem là triển vọng nhất

Ở Việt Nam, tính đến cuối năm 2012, đã có 6 nhà máy sản xuất nhiên liệu xăng sinh học đi vào hoạt động Cụ thể, nhà máy sản xuất ethanol thuộc Công ty cổ phần Đồng Xanh, có công suất thiết kế 130 triệu lít/năm; nhà máy thuộc Công ty TNHH Tùng Lâm, với công suất thiết kế 70 triệu lít/năm; nhà máy sản xuất bioethanol Đắc Tô - Kon Tum với công suất thiết kế 65 triệu lít/năm; nhà máy sản xuất ethanol sinh học Dung Quất với công suất thiết kế 100 triệu lít/năm; nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu Bình Phước thuộc PVOIL có công suất thiết kế 100 triệu lít/năm, Ngoài ra, công ty xuất khẩu cá da trơn Agifish đã sản xuất thử nghiệm biodiesel bằng cách trộn lẫn mỡ cá da trơn với diesel để chạy động cơ diesel (máy bơm nước, máy phát điện…)

Tổng ngân sách nhà nước để thực hiện Đề án phát triển nhiên liệu sinh học lỏng trong giai đoạn 2007-2015 là khoảng 259.200.000.000 đồng, tương đương 28,8

tỷ đồng mỗi năm Ngân sách chủ yếu dành cho các nghiên cứu và phổ biến các ứng dụng cơ bản về nhiên liệu sinh học Các tổ chức, doanh nghiệp đầu tư nghiên cứu nhiên liệu sinh học và sản xuất có thể có được trợ cấp từ Chính phủ thông qua việc miễn thuế thu nhập doanh nghiệp với doanh số bán sản phẩm nhiên liệu sinh học (theo Nghị định số 24/2007/NĐ-CP), giảm thuế sử dụng đất 20 năm, và miễn thuế nhập khẩu đối với nguyên liệu và thiết bị được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học [100]

1.2 TẢO DẦU

1.2.1 Tảo dầu

Tảo dầu - Oilalgae (Oilgae) là thuật ngữ chỉ những loài tảo mà trong thành phần tế bào của chúng có chứa một lượng lipid (nghiên cứu này chỉ đề cập đến những loài vi tảo - miroalgae) Các loài vi tảo dầu có thể được phân lập từ nhiều

nguồn như nước biển, ruộng muối (Dunaliella salina, Tetraselmis, Navicular, ), ao

hồ nước ngọt (Scenedesmus, Chlorella vulgaris,…) Vi tảo chứa nhiều chất béo và

thành phần dầu tương tự dầu thực vật và có hàm lượng lipid khá cao, 40 - 60% trọng

lượng khô tế bào [9], [75], [78] Đặc biệt, ở chủng Botryococcus braunii có thể đạt

đến 80% hàm lượng lipid so với trọng lượng khô ở giai đoạn ổn định [73]

Bảng 1.2: Một số loại vi tảo dầu điển hình [89]

(% trọng lượng khô)

Tài liệu tham khảo

Ankistrodesmus sp 28-40 Ben-Amotz và Tornabene, 1985

Botryococcus braunii 25-86 Dayanada và cộng sự., 2005

Chaetoceros muelleri 24,4 Mohapatra, 2006

Chlorella emersonii 63 Gouveia và Oliveira, 2009

Chlorella minutissima 57 Gouveia và Oliveira, 2009

Chlorella vulgaris 14-56 Gouveia và Oliveira, 2009

Dunaliella tertiolecta 36-42 Tsukahara và Sawayama, 2005

Hantzschia sp 66 Sheehan và cộng sự., 1998

Monallantus salina 72 Shifrin và Chisholm, 1981

Neochloris oleoabundans 35-65 Tornabene và cộng sự., 1983

Nitzschia closterium 27,8 Mohapatra, 2006

Scenedesmus dimorphus 16-40 Becker, 1994

Vi tảo dầu được xem là nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học tiềm năng trong tương lai do có một số ưu điểm sau:

Hiệu suất dầu và nhiên liệu từ vi tảo thì cao hơn nhiều (10-100 lần) [89] so với những cây trồng năng lượng cạnh tranh Ngoài ra, vi tảo dầu còn tiêu thụ một lượng lớn CO2 [42] (để có 1 kg sinh khối khô tảo cần 1,8 kg CO2 [79], thủ phạm chính gây hiệu ứng nhà kính và biến đổi khí hậu Vi tảo không cạnh tranh đất trồng với những cây lương thực khác và đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý nước

thải Ngoài ra, vi tảo còn là nguồn cung cấp β-carotene, một số dược chất, protein

dùng cho ngành dược và công nghệ thực phẩm,….Sinh khối vi tảo còn lại sau khi chiết tách dầu có thể dùng làm chất đốt và làm phân bón hữu cơ rất tốt [69], [85]

Bảng 1.3: So sánh hiệu quả tạo biodiesel của vi tảo dầu với các nguồn sinh khối khác [22]

Vi tảo dầu dùng trong sản xuất biodiesel có một số đặc điểm sau: hình dạng

và hình thức sống rất đa dạng; chứa nhiều chất béo và dầu béo; các giọt dầu ở dạng triacylglycerol dự trữ trong tế bào có chức năng giúp tế bào chống chịu sự thay đổi của môi trường sống Vi tảo chứa 60 – 70% protein, gấp 3 lần protein thịt/cá và có thể chứa tất cả các acid amin thiết yếu; hàm lượng cellulose cao, chiếm 8 – 12 %; có

tất cả các vitamin thiết yếu, đặc biệt là β-carotene (cao hơn gấp 2 lần so với cà rốt)

và phức hợp vitamin B; hàm lượng sắt gấp 50 lần rau spinach; hàm lượng calcium gấp 5 lần so với sữa; chứa các nguyên tố dạng vết như K, Mg, Mn, và I; chứa các sắc

tố chlorophyll và phycocyanin; chất béo của vi tảo dầu đều tích lũy chủ yếu ở pha tăng trưởng và pha ổn định [12], [13], [23]

1.2.2 Quy trình tạo biodiesel từ vi tảo dầu

Quy trình tạo biodiesel từ vi tảo gồm các bước [98]:

- Bước 1: Nhân sinh khối vi tảo

- Bước 2: Khi vi tảo đã phát triển ổn định, giảm nitrogen trong thành phần môi trường, kết hợp chiếu sáng mạnh và tăng nồng độ muối trong môi trường nuôi cấy Tảo đáp ứng lại tình trạng thiếu hụt dinh dưỡng bằng cách sinh ra lipid nhiều hơn bình thường

(L/ha)

Diện tích đất (Mha)

- Bước 3: Khi hàm lượng lipid đạt yêu cầu thì tiến hành thu và sấy vi tảo Sau

đó ép và lọc dầu

- Bước 4: Dùng dung môi như: ether dầu hỏa, hexane, methanol –chloroform,

… để tách lipid khỏi protein và đường Tiếp tục ngâm xác tảo sau khi ép trong methanol để tận thu lượng lipid còn sót lại

- Bước 5: Tinh chế lipid thu được và làm bay hơi dung môi

- Bước 6: Tiến hành chuyển hóa lipid thành nhiên liệu sinh học

Hình 1.3: Quy trình tổng quát tạo biodiesel từ vi tảo dầu [98]

1.3 THÀNH PHẦN VÀ QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP LIPID Ở VI TẢO

1.3.1 Thành phần lipid trong vi tảo

Lipid trong vi tảo có thể chia thành hai nhóm chính: lipid không phân cực (acylglycerol, sterol, acid béo tự do (không ester hoá), hydrocarbon, sáp (wax), ester steryl, và lipid phân cực (phospho, phoglyceride, glycosylglyceride) Chúng là thành phần thiết yếu của tất cả tế bào sống [45], [83]

Phosphoglyceride, glycosylglyceride và sterol là thành phần cấu trúc quan trọng của màng sinh học Những lipid này duy trì chức năng cụ thể của màng tế bào

4 Tách lipid khỏi protein và đường

5 Tinh chế lipid và làm bay hơi dung môi

6 Chuyển hóa lipid thành Biodiesel Biodiesel Đường

Lipid

và là “hàng rào”bán thấm ngăn cách các tế bào với môi trường xung quanh và giữa bào quan bên trong với tế bào, là nơi xảy ra các quá trình trao đổi chất khác nhau Một số lipid phân cực có vai trò trung gian (hoặc tiền thân của chất trung gian) trong con đường tín hiệu tế bào (ví dụ như chất béo inositol, sphingolipid, sản phẩm oxy hóa của các acid béo không bão hòa đa) Các lipid không phân cực, chủ yếu là triacylglycerol (TAG), là sản phẩm lưu trữ phong phú có thể dễ dàng dị hóa để cung cấp năng lượng cho phản ứng chuyển hóa TAG được tích lũy trong nhiều loài vi tảo như sản phẩm lưu trữ Mức độ tích lũy TAG rất khác nhau và có thể được kích thích bởi các yếu tố môi trường Khi tăng trưởng của tảo chậm lại và không có yêu cầu để tổng hợp các hợp chất màng mới, các tế bào chuyển acid béo thành TAG trước khi điều kiện môi trường được cải thiện và tiếp tục phát triển [44], [45], [83]

Lipid ở vi tảo là ester của glycerol và các acid béo mạch dài C14 – C22 Trong

đó TAG là lipid dự trữ quan trọng nhất, có thể chiếm tới 80% tổng lượng lipid Các nhóm lipid chính ở vi tảo bao gồm: sulphoquinovosyl diglyceride (SQDG), monogalactosyl diglyceride (MGDG), digalactosyl diglyceride (DGDG), lecithin, phosphatidyl glycerol (PG), và phosphatidyl inositol (PI) [77] Ngoài ra còn có acid béo mạch dài, không no quan trọng như acid linoleic (C18:2), acid linolenic (C18:3), acid arachidonic (C20:4), và acid eicosapentanoic (C20:5) Những acid béo này là thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn của người và động vật [44]

Lượng lipid tích lũy trong tế bào vi tảo có thể tăng lên gấp nhiều lần thậm chí hàng chục lần so với bình thường trong tự nhiên khi đặt chúng trong những điều kiện stress thích hợp

Điều kiện nuôi cấy, giai đoạn tăng trưởng của tảo cũng ảnh hưởng đến hàm lượng lipid và chủng loại lipid Trong giai đoạn đầu tăng trưởng, tảo lục sản xuất một lượng tương đối lớn lipid phân cực, acid béo C16 và C18 Đến pha ổn định, vi tảo chuyển sang tạo lipid trung tính, acid béo C16 và C18:1 [71], [77]

Độ chiếu sáng góp phần tăng cường sự hình thành các acid béo chưa bão hòa

C16 và C18 cũng như các mono-, di-galactosyl-diglyceride, sphingolipid và phosphoglyceride Cường độ chiếu sáng yếu làm tăng sự hình thành lipid phân cực trong khi cường độ chiếu sáng cao lại làm giảm, đồng thời làm tăng tích lũy lipid

trung tính, chủ yếu là TAG Nhiệt độ thấp làm tăng tổng hợp acid béo không bão hòa

C18 [62]

Độ ẩm và hàm lượng acid béo tự do cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo biodiesel Theo Ma F và cộng sự., (1999): “Chỉ số acid nên nhỏ hơn 1 (acid béo tự

do < 0,5% (w/w)) Nếu chỉ số acid lớn hơn 1 thì cần phải sử dụng NaOH nhiều hơn

để trung hòa lượng acid béo tự do Xà phòng được tạo ra là nguyên nhân làm tăng độ nhớt, hình thành gel trong sản phẩm và gây khó khăn trong quá trình tách glycerol ra khỏi ester” [63] Do đó, Gerpen J V (2005) đã nhận định: “Nếu hàm lượng acid béo tự do nhỏ hơn 5%, phản ứng chuyển ester hóa tạo biodiesel vẫn có thể được xúc tác với kiềm, nhưng chất xúc tác phải được thêm vào nhiều hơn để bù đắp cho chất xúc tác bị mất do tạo xà phòng Xà phòng được tạo ra trong phản ứng được loại bỏ cùng với glycerol hoặc được rửa với nước Nếu hàm lượng acid béo tự do lớn hơn 5%, xà phòng ức chế quá trình tách methyl ester và glycerol và góp phần hình thành nhũ tương trong nước rửa Đối với những trường hợp này, một chất xúc tác có tính acid như H2SO4 được sử dụng để ester hóa các acid béo tự do thành các methyl ester

để tránh phản ứng xà phòng hóa làm giảm hiệu suất của quá trình” [39]

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp lipid ở vi tảo

Vi tảo quang tự dưỡng được xem như những nhà máy tế bào tuyệt vời có khả năng sử dụng ánh sáng mặt trời để từ đó chuyển CO2 thành các nguồn năng lượng sinh học tiềm năng như: các thực phẩm, thức ăn và những sản phẩm có giá trị cao Tuy nhiên, khi tảo sống trong môi trường hạn chế nitrogen, nitrogen sẽ điều khiển tích lũy lipid [74] Khi đó tất cả lượng nitrogen trong môi trường và lượng CO2 được

tế bào hấp thu sẽ được tận dụng để tổng hợp các enzyme cần thiết cho hoạt động sống và xây dựng cấu trúc tế bào vi tảo Hầu hết lượng carbon được tế bào vi tảo hấp thu trong con đường dị dưỡng sẽ được tổng hợp thành carbonhydrate hoặc lipid thay

vì protein (hình 1.4)

Các tiền chất acid béo được tổng hợp bên trong lục lạp, sử dụng nguồn carbon

cố định trong quá trình quang tổng hợp, hoặc từ nguồn carbon hữu cơ ngoại sinh Các acid béo tự do được lấy từ lục lạp và sau đó được chuyển thành các TAG trong

hệ thống lưới nội chất, tại đây chúng chuyển thành các giọt dầu trong tế bào chất (hình 1.4)

Hình 1.4: Tổng quan cơ bản về con đường chuyển hóa cố định carbon

và sinh tổng hợp TAG trong vi tảo [82]

(i) = ACCase và FAS (acetyl-CoA carboxylase và fatty acid synthase)

(ii) = fatty acid thioesterase và acyl-CoA synthetase

(iii) = các enzyme sinh tổng hợp TAG, bao gồm acyl – CoA diacylglycerol acyltransferase (DGAT) (iv) = sự hình thành giọt dầu

(v) = ADP-glucose pyrophosphorylase và starch synthase

Tảo có thể có nhiều con đường để tổng hợp TAG và những con đường chuyển hóa này có thể phụ thuộc vào môi trường hay điều kiện nuôi cấy: con đường de-novo Kennedy; con đường tiềm năng cho việc tổng hợp lipid từ nguồn dự trữ tinh bột; con đường chuyển phospholipid màng và glycolipid thành TAG [37]

Con đường tổng hợp TAG trong tế bào vi tảo gồm có ba bước chính:

(1) Carboxyl hóa acetyl-CoA thành malonyl-CoA nhờ enzyme acetyl-CoA

carboxylase (ACC) phụ thuộc vào biotin [25] ACC từ E.coli là một protein, chứa 4

tiểu đơn vị, được mã hóa bởi các gen accA, accB, accC và accD định vị ở những vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể

(2) Malonyl-CoA được tạo thành sẽ được ACP transferase chuyển cho protein vận chuyển acyl ACP tạo thành phức malonyl-ACP Phức hợp enzyme tổng hợp acid béo FAS (fatty acid synthase) xúc tác kéo dài chuỗi acyl bằng cách kết hợp các phân